Upload
others
View
2
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ODREĐIVANJE ANTOCIJANINA U CRNOM ODREĐIVANJE ANTOCIJANINA U CRNOM GROGROŽŽĐU PRIMJENOM HPLC METODE S ĐU PRIMJENOM HPLC METODE S
ELEKTROKEMIJSKIM DETEKTOROMELEKTROKEMIJSKIM DETEKTOROM
Ivana Novak,dipl.ing.Ivana Novak,dipl.ing.
PrehrambenoPrehrambeno--tehnolotehnološški fakultet,Osijekki fakultet,Osijek
POLIFENOLIPOLIFENOLI
predstavljaju veliku grupu prirodnih
spojeva vrlo raširenih u biljnom svijetu
glavni nutritivni izvori polifenola su: voće,
povrće, sjemenke, te napici kao što su
čajevi, voćni sokovi, vino i kava
O
A C2
3
456
7
8
2’
3’
4’
5’
6’
B1’
DifenilpropanDifenilpropan
podjela polifenola:� ne-flavonoidi
� fenolne kiseline
� stilbeni
� flavonoidi
� flavoni
� flavanoli
� flavonoli
� flavanoni
� izoflavoni
� antocijanidini
značaj flavonoida:� primjena u prehrambenoj industriji
� pozitivno djelovanje na ljudsko zdravlje
U samim biljkama antocijanini djeluju:
- antibakterijski,
- antifungalno,
- kao agensi koji privlače insekte koji
sudjeluju u oprašivanju biljaka,
- pružaju zaštitu od štetnog UV
zračenja
Biološke funkcije flavonoida pripisuju se
njihovoj izvanrednoj antioksidacijskoj i
antiradikalskoj aktivnosti.
GROGROŽŽĐE ĐE kao izvor polifenolakao izvor polifenolacrne sorte grožđa predstavljaju iznimno bogat
izvor flavonoida
oko 70% polifenola dolazi u sjemenci dok oko
30% dolazi u kožici grožđa
Polifenolni spojevi identificirani u
grožđu su:
� flavan-3-oli (katehin i epikatehin),
� polimeri (procijanidini) i oligomeri
(tanini) flavan-3-ola,
� flavonoli (kvercetin, miricetin),
� antocijanidini.antocijanidini.
Antocijanini – u kožici grožđa
Sadržaj antocijanina u grožđu kreće se od 12 do 30 mg/g
ANTOCIJANINIANTOCIJANINI
predstavljaju najrašireniju i najznačajniju grupu prirodnih
biljnih pigmenata
odgovorni su za širok spektar boja u biljkama i biljnim
proizvodima, uključujući narančastu, crvenu, ljubičastu i plavu
antocijanini su po svom
kemijskom sastavu glikozidi
antocijanidina
antocijanin = antocijanidin + šećerO
OH
OH
OH
R1
OH
R2
+
Osnovna struktura Osnovna struktura antocijanidina antocijanidina --flavilijev kationflavilijev kation
Cijanidin-3-O-glukozid
Euroazijske vrste grožđa (Vitis vinifera) sadrže sljedeće antocijanine:
+
O-Gluc
OH
OH
OH
OH+
O-GLuc
OH
OCH3
OH
OH
Peonidin-3-O-glukozid
+
O-Gluc
OH
OH
OH
OH
OH
Petunidin-3-O-glukozid
+
O-Gluc
OCH3
OH
OCH3
OH
OH
Malvidin-3-O-glukozid
antocijanini određuju boju vina
koncentracija antocijanina u vinu određena sadržajem antocijanina u grožđu i tehnološkim postupkom proizvodnje vina
sadržaj antocijanina u grožđu ovisi o :
� vrsti grožđa,
� klimatskim faktorima,
� uvjetima uzgoja vinove loze,
� sastavu tla,...
i povećava se tijekom zrenja grožđa.
Indikator zrelosti grožđa – “phenolic maturity”
SPEKTROSKOPSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINASPEKTROSKOPSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINA
antocijanini intenzivno apsorbiraju u vidljivom dijelu spektra, što je posljedica efikasne delokalizacije i rezonancijske stabilizacije u aromatskom π elektronskom sustavu molekula
maksimum apsorbancije antocijanina je oko 520 nm
Cijanidin-3-glukozid
Malvidin-3-glukozid
25
50
75
100
125
150
175
mAU
200 300 400 500 nm
191.91 603.20
25
50
75
100
125
150
175
mAU
200 300 400 500 nm
191.91 603.20
Peonidin-3-glukozid
Delfinidin-3-glukozid
Spektri antocijanina
ELEKTROKEMIJSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINAELEKTROKEMIJSKA SVOJSTVA ANTOCIJANINA
antocijanini podliježu elektrokemijskoj oksidaciji
Mehanizam elektrokemijske oksidacije antocijanina
+
R3
OH
R1
OH
OHR
2
� elektroaktivne fenolne skupine
� elektroketrokemijska svojstva antocijanina utvrđena su primjenom elektrokemijskih metoda cikličke voltametrije, diferencijalne pulsne voltametrije i pravokutno valne voltametrije
� elektrokemijske metode daju podatak o:
�mehanizmu elektrokemijske oksidacije spojeva
� elektrokemijskim svojstvima spoja
� antioksidacijskoj aktivnosti spoja
Veća sposobnost otpuštanja elektrona=niži oksidacijski potencijal=veća antioksidacijska aktivnost
Za separaciju i kvantifikaciju antocijanina u prirodnim uzorcima najčešće se koriste metode visokodjelotvorne tekućinske kromatografije (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) u kombinaciji s:
� UV/Vis,
� PDA,
� masenim detektorom.
kolona
detektor obrada podataka
mobilna faza
pumpa
injektor
-Shematski prikaz tekućinskog kromatografa
ELEKTROKEMIJSKI DETEKTORELEKTROKEMIJSKI DETEKTOR
protočna ćelija wall-jet tipa, u kojoj je:
� radna elektroda elektroda od staklastog ugljika,
� referentna elektroda je ISAAC elektroda (in situ Ag/AgCl),
� protuelektroda je Pt žica
inletOutlet
Referentna elektroda
Radna elektroda
Pomocna elektroda
RADNA RADNA
ELEKTRODAELEKTRODA
signal pobude
konst. električni
napon
signal odzivastruja
RR O + neO + ne--
detekcija elektroaktivnih supstanci
OSJETLJIVOSTOSJETLJIVOST
Granice detekcijeGranice detekcije
- najmanja količina analita u uzorku koja se može detektirati
Granice kvantifikacijeGranice kvantifikacije
- najmanja količina analita u uzorku koja se može kvantificirati
7·10-112 ·10-111.2·10-83.7·10-8kuromanin1.7 ·10-115.3 ·10-111.7·10-85·10-8mirtilin1.5 ·10-114.5 ·10-111·10-83·10-8peonidin2.5 ·10-117.5 ·10-113.6 ·10-81·10-8oenin
LOQLODLOQLOD
Elektrokemijski detektorPDA detektorUzorak
Granice detekcije (LOD) i kvantifikacije (LOQ), izražene u mol L-1, dobivene primjenom PDA i elektrokemijskog detektora
Detekcija analita u tragovima
4 6 8 10 12
0.25 mAU
Time (min)
0.1 nA
6 8 10 12 14 16 18 20 22
oenin
4 mAU
petunidinmyrtillin
Time (min)
(A)
(B)
kuromanin
peonidin
1 nA
(A)
(B)
Kromatogrami dobiveni (A) elektrokemijskim i (B) PDA detektorom za otopine kuromanina koncentracija 5·10-10
M (─), 1·10-9M (─),1·10-8M (─)
Kromatogrami ekstrakta kožice grožđa vrste tinta roriz, razrijeđenog 100-puta. (A) Kromatogram snimljen elektrokemijskim detektorom pri potencijalu +0.5 V, (B) kromatogram snimljen PDA detektorom, pri valnoj duljini 520 nm
PREDNOSTI PRIMJENE ELEKTROKEMIJSKIH DETEKTORA U PREDNOSTI PRIMJENE ELEKTROKEMIJSKIH DETEKTORA U KVALITATIVNOJ I KVANTITATIVNOJ ANALIZIKVALITATIVNOJ I KVANTITATIVNOJ ANALIZI
� visoka osjetljivost
� selektivnost
� selektivna detekcija elektroaktivnih spojeva odabirom radnog potencijala (multi-channel elektrokemijski detektori)
� linerana ovisnost visine pika o koncentraciji elektroaktivne vrste
� dobra reproducibilnost
� cijena
Kromatogrami meda dobiveni primjenom multi-channel elektrokemijskog detektora kod potencijala: (a) +900 mV, (b) +700 mV, (c) +600 mV, (d) +400 mV.Pikovi: (1) galna kiselina, (2) protokatehinska kiselina, (3) , vanilinska kiselina, (kafeinska kiselina), (siringična kiselina), (6) p-kumarinska kiselina
PRIMJENA:PRIMJENA:
� MEDICINADetermination of total cholesterol in serum by high performance liquid chromatography with electrochemical detection (K. Hojo et.al.)
� FARMACIJASensitive quantification of chosen drugs by reversed-phase chromatography with electrochemical detection at a glassy carbon electrode (A. Chmielewska et.al.)
� PREHRAMBENA INDUSTRIJAApplication of HPLC with electrochemical detection for the determination of low lewels of antioxidants (M. Škrinjar et.al.)
Determination of phenolic acids in vegetable oil using HPLC coupled with electrochemical detection (I. Bernweiser et.al.)(I. Bernweiser et.al.)
� EKOLOGIJAFast separation and sensitive detection of carcinogenic aromatic amines by reversed phase m-liquid chromatography coupled with electrochemical detection (M. Shelke et.al.)
Cilj istraživanja:
� optimizacija HPLC metode za analizu antocijanina u kožici grožđa
� u metodi su korišteni PDA i elektrokemijski (amperometrijski) detektor
Za analizu su korištene 4 vrste grožđa (jaen, tinta roriz, touriga nacional, alfrosheiro) uzorkovane u regiji Dão, Portugal.
ZAHVALAZAHVALA
NACINALNOJ ZAKLADI ZA VISOKO NACINALNOJ ZAKLADI ZA VISOKO ŠŠKOLSTVO, KOLSTVO, OBRAZOVANJE OBRAZOVANJE
I TEHNOLOGIJSKI RAZVOJ REPUBLIKE HRVATSKE I TEHNOLOGIJSKI RAZVOJ REPUBLIKE HRVATSKE