21

3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan Juni 2009 sampai November 2010,

bertempat di Laboratorium bagian Preparasi Bahan Baku Hasil Perairan,

Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Laboratorium Mikrobiologi Hasil

Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Laboratorium Penelitian Kimia Organik

Departemen Kimia FMIPA IPB. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan

Pascapanen Pertanian Cimanggu Bogor. PUSLABFOR BARESKRIM POLRI

Jakarta.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat tulis, alat-alat gelas,

alat ekstraksi dan uji kimia antara lain : rotari evaporator Buchi Rotavapor R-205,

spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2800, Kromatografi Lapis Tipis silika gel 60

F 254, AAS Shimazu-7000, HPLC Varian 940-LC, GC-MS AGILENT

TECHNOLOGIES.

Bahan yang digunakan pada penelitian ini berupa lintah laut. Bahan

ekstraksi terdiri atas: kloroform, etil asetat dan etanol. Bahan analisis proksimat

antara lain: tablet kjeltab, natrium hidroksida, asam borat, larutan bromocresol

green 0,1%, larutan metil merah 0,1%, alkohol 96%, asam klorida 0,02 N dan

akuades digunakan untuk analisis protein. Asam klorida 6 N, metanol, natrium

asetat, trietilamin, pikoitosianat, asetonitril 60% dan buffer fosfat 0,1 M

digunakan untuk analisa asam amino. Asam klorida 1 N, asam nitrat, asam sulfat,

asam perklorat, molibdat-vanadat, digunakan untuk analisis mineral. Bahan untuk

analisis logam berat, seperti merkuri klorida, batu didih, vanadium pentaoksida.

Bahan analisis asam lemak berupa natrium hidroksida, metanol, natrium klorida

dan heksana. Bahan untuk uji antioksidan berupa DPPH (1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil) dan BHT (Butylated Hydroxytoluena).

22

3.3 Prosedur Penelitian

Penelitian ini dibagi dalam beberapa tahap, yaitu pengambilan dan

preparasi sampel, ekstraksi senyawa bioaktif dari lintah laut, fraksinasi senyawa

bioaktif, dan identifikasi senyawa bioaktif.

3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel

Tahap pertama penelitian ini dimulai dari pengambilan dan preparasi

sampel serta persiapan bahan dan alat untuk pengujian kandungan gizi dan

ekstraksi senyawa aktif. Sampel diambil dari pantai dan mangrove dengan tipe

sedimen berlumpur di daerah Pamekasan Madura. Lintah laut diambil ketika

kondisi air laut mulai surut. Setelah terkumpul, lintah laut dicuci dengan air laut

untuk membersihkan dari kotoran lumpur, kemudian dikeluarkan isi perutnya

dengan cara membelahnya secara melintang dari oral menuju aboral. Lintah laut

dicuci kembali sampai bersih dengan air mengalir, kemudian dikeringkan sekitar

3-4 hari dengan sinar matahari. Setelah kering lintah laut dihaluskan dengan

mortal dan blender.

Penanganan sampel segar dilakukan dengan membawa lintah laut dalam

keadaan hidup yang sudah dicuci dengan air laut, kemudian dibungkus dengan

kain basah dan dimasukkan ke dalam wadah. Melalui cara ini, lintah laut bisa

bertahan hidup sampai 5-7 hari.

Analisis yang dilakukan pada tahap ini adalah: analisis rendemen

(Hustiany 2005), analisis proksimat meliputi: kadar air, kadar abu, kadar protein,

kadar lemak dan karbohidrat (AOAC 2005), analisis asam amino (AACC 1994),

analisis asam lemak (AACC 1983), analisis mineral dan logam berat (SNI 01-

2896-1998).

3.3.2 Ekstraksi lintah laut kering

Ekstraksi lintah laut dilakukan dengan fraksinasi bertingkat dengan

berbagai perbedaan kepolaran pelarut. Bubuk lintah yang dihasilkan ditimbang

sebanyak 50 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar dan ditambahkan

dengan 100 ml kloroform. Campuran dikocok dengan bantuan shaker selama

24 jam kemudian disaring. Fraksinasi menggunakan pelarut kloroform dilakukan

3 kali atau sampai larutan berwarna jernih. Hasil penyaringan ditampung dalam

23

labu dan dievaporasi sampai pekat. Fraksi ini merupakan fraksi dengan tingkat

kepolaran rendah.

Gambar 4 Bagan kerja ekstraksi lintah laut (Discodoris sp.) (Sherif et al. 2008 dengan beberapa modifikasi)

Residu dari fraksinasi kloroform kemudian dilarutkan dengan pelarut etil

asetat. Residu hasil fraksinasi dengan kloroform ditambahkan dengan 100 ml

pelarut etil asetat. Selanjutnya campuran dikocok dengan shaker selama 24 jam

dan kemudian disaring. Fraksinasi dengan pelarut etil asetat dilakukan sebanyak

3 kali atau hingga larutan menjadi jernih. Hasil penyaringan ditampung dalam

Tepung lintah laut 50 g

Maserasi dengan kloroform 100 ml, 24 jam, suhu ruang

Penyaringan

Filtrat

Evaporasi

Ekstrak Kloroform

Residu

Penyaringan

Filtrat

Evaporasi

Ekstrak Etil

asetat

Maserasi dengan etil asetat 100 ml, 24 jam, suhu ruang

Residu

Penyaringan

Filtrat

Evaporasi

Ekstrak Etanol

Maserasi dengan etanol 100 ml, 24 jam, suhu ruang

Residu

24

labu dan dievaporasi sampai pekat. Fraksi ini merupakan fraksi dengan tingkat

kepolaran sedang.

Fraksinasi terakhir menggunakan pelarut etanol. Residu hasil fraksinansi

dengan etil asetat ditambahkan dengan pelarut etanol sebanyak 100 ml.

Campuran dikocok dengan shaker selama 24 jam dan kemudian disaring.

Fraksinasi dengan pelarut etanol dilakukan sebanyak 3 kali atau hingga larutan

menjadi jernih. Hasil penyaringan ditampung dalam labu dan dievaporasi sampai

pekat. Fraksi ini merupakan fraksi dengan tingkat kepolaran tinggi.

Larutan hasil fraksinasi bertingkat tersebut dikeringkan dengan evaporator

pada suhu 40 0C. Fraksi-fraksi yang diperoleh kemudian dikeringkan dengan

freezedryer. Kandungan zat aktif pada masing-masing fraksi dihitung bobotnya.

Prosedur lengkap dari proses ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 4. Analisis

yang dilakukan pada tahap ekstraksi ini meliputi: analisis rendemen, analisis

fitokimia (Departemen Kesehatan RI 1995), dan analisis antioksidan (Blois 1958

diacu dalam Hanani et al. 2005).

3.3.3 Fraksinasi lanjutan

Fraksi yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik kemudian dipisahkan

dengan kromatografi lapis tipis. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60

F254.

Pelaksanaan kromatografi preparatif dilakukan dengan mencari pelarut

terbaik terlebih dahulu menggunakan kromatografi lapis tipis. Eluen yang

digunakan yaitu heksan, kloroform, etil asetat, metanol dan etanol. Pencarian

eluen terbaik dimulai dengan menggunakan eluen tunggal sampai dengan eluen

campuran atau perbandingan.

Sebanyak 5 ml eluen dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup,

kemudian dibiarkan beberapa menit sampai larutan menjadi jenuh. Ekstrak kasar

yang terpilih dilarutkan dalam pelarutnya, kemudian ditotolkan pada garis bagian

bawah yang ditandai pada plat kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pipa

kapiler dan dikeringkan beberapa menit. Kemudian dimasukkan ke dalam

chamber dengan posisi agak tegak, sampel yang ditotolkan berada pada bagian

bawah dan diusahakan tidak terendam oleh eluen. Kemudian chamber ditutup

dan ditunggu sampai sampel terbawa eluen pada batas atas. Plat kromatografi

25

lapis tipis dikeluarkan dan dikeringkan. Selanjutnya plat dilihat hasilnya dengan

menggunakan sinar UV 254 nm.

Setelah ditemukan eluen terbaik, dilanjutkan dengan kromatografi

preparatif. Prosedur yang dilakukan hampir sama dengan KLT namun dengan

ukuran yang lebih besar. Pembuatan preparat dengan menggunakan silika gel 60

F 254 yang dipasang pada lempeng kaca dengan ukuran 20x20 cm. Eluen terbaik

yang diperoleh disiapkan sebanyak 20 ml dan dimasukkan ke dalam chamber.

Larutan sampel ditotolkan pada plat KLT dan dimasukkan ke dalam chamber,

setelah dilihat hasilnya dengan sinar UV 254 nm, kemudian setiap fraksi atau

masing-masing Rf (Retardation factor) yang dihasilkan dikerok dan dikumpulkan.

Hasil pengerokan dilarutkan dengan pelarut yang sama dengan sampel terpilih.

Pada fraksi atau Rf yang diperoleh dicek dengan kromatografi lapis tipis (KLT).

Jika pada lempeng KLT masing-masing fraksi hanya terdapat 1 bercak, maka

dimungkinkan pemisahan sudah hampir sempurna dan diharapkan diperoleh

senyawa tunggal.

Analisis yang dilakukan pada masing-masing fraksi (Rf) yang diperoleh

yaitu analisis antioksidan dengan metode DPPH menurut Blois (1958) diacu

dalam Hanani et al. (2005).

3.3.4 Identifikasi senyawa aktif

Fraksi terpilih dengan nilai aktivitas antioksidan terbaik dilanjutkan

dengan melihat komponen senyawa yang terdapat di dalamnya yaitu

menggunakan GC-MS. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa dilakukan untuk

mendapatkan bobot molekul dan pola fragmentasi dari senyawa murni tersebut.

Kondisi operasi dari GC-MS disajikan pada Tabel 2.

Analisis yang dilakukan pada tahap identifikasi senyawa aktif ini yaitu

memilih senyawa yang memiliki puncak tinggi dan dicocokkan dengan senyawa

yang ada pada library GC-MS dengan kemiripan >90%.

3.4 Analisis

3.4.1 Rendemen (Hustiany 2005)

Rendemen adalah persentase bagian tubuh yang dapat dimanfaatkan.

Lintah laut utuh ditimbang beratnya baik sebelum maupun sesudah diambil

26

jeroannya, kemudian dijemur menggunakan panas matahari. Daging dan jeroan

lintah laut yang telah kering ditimbang kembali untuk mengetahui penurunan

berat setelah dikeringkan. Rendemen merupakan persentase perbandingan antara

bagian yang digunakan dengan berat utuh lintah laut segar.

%% 100x(gram)laut lintah utuh Berat

(gram)digunakan yangbagian Berat Rendemen =

Tabel 2 Kondisi dan spesifikasi operasi alat GC-MS

3.4.2 Analisis proksimat (AOAC 2005)

Analisis proksimat yang dilakukan meliputi uji kadar air dan abu dengan

metode oven, uji kadar lemak menggunakan metode sokhlet, dan uji kadar protein

menggunakan metode kjedahl.

(1) Analisis kadar air (AOAC 2005)

Analisis kadar air dilakukan dengan menggunakan metode oven.

Prinsipnya adalah menguapkan molekul air (H2O) bebas yang ada dalam sampel.

Kemudian sampel ditimbang sampai didapat bobot konstan yang diasumsikan

Kondisi GC Spesifikasi dan program pengaturan

Tipe kolom Agilent 19091J-433, tipe HP-5, 0,25 mm x 30 m x 0,25 µm Diameter 250 µm Suhu maksimum 350 0C Film thickness: 0,25 µm Model aliran: konstan Kecepatan aliran: 1 mL/menit

Instrumen GC-MS Agilent 19091J-433 Gas pembawa: helium

Injektor Pompa sampel: 6 Volume: 1 µl Ukuran Springe: 10 µl

Inlet

Mode split Suhu 270 0C Kecepatan split: 19,8 ml/menit Total aliran: 23,8 ml/menit Gas: helium Tekanan: 8,67 psi

Oven

Suhu awal 70 0C Suhu akhir 70 0C Suhu maksimum 330 0C Waktu operasi 34,67 menit

27

semua air yang terkandung dalam sampel sudah diuapkan. Selisih bobot sebelum

dan sesudah pengeringan merupakan banyaknya air yang diuapkan.

Prosedur analisis kadar air sebagai berikut: cawan yang akan digunakan

dioven terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu 100-105 0C, kemudian

didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A).

Sampel ditimbang sebanyak 2 g dalam cawan yang sudah dikeringkan (B)

kemudian dioven pada suhu 100-105 0C selama 6 jam lalu didinginkan dalam

desikator selama 30 menit dan ditimbang (C). Tahap ini diulangi hingga dicapai

bobot yang konstan. Kadar air dihitung dengan rumus:

%% 100xABCBairKadar

−−

=

(2) Analisis kadar abu (AOAC 2005)

Analisis kadar abu dilakukan menggunakan metode oven. Prinsipnya

adalah pembakaran atau pengabuan bahan-bahan organik yang diuraikan menjadi

air (H2O) dan karbondioksida (CO2) tetapi zat anorganik tidak terbakar. Zat

anorganik ini disebut abu.

Prosedur analisis kadar abu sebagai berikut: cawan yang akan digunakan

dioven terlebih dahulu selama 30 menit pada suhu 100-105 0C, kemudian

didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A).

Sampel ditimbang sebanyak 2 g dalam cawan yang sudah dikeringkan (B)

kemudian dibakar di atas nyala pembakar sampai tidak berasap dan dilanjutkan

dengan pengabuan di dalam tanur bersuhu 550-600 0C sampai pengabuan

sempurna. Sampel yang sudah diabukan didinginkan dalam desikator dan

ditimbang (C). Tahap pembakaran dalam tanur diulangi sampai didapat bobot

yang konstan. Kadar abu dihitung dengan rumus:

%% 100xABACabuKadar

−−

=

(3) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)

Analisis kadar lemak dilakukan dengan metode sokhlet. Prinsipnya adalah

lemak yang terdapat dalam sampel diekstrak dengan menggunakan pelarut lemak

non polar.

28

Prosedur analisis kadar lemak sebagai berikut: labu lemak yang akan

digunakan dioven selama 30 menit pada suhu 100-105 0C, kemudian didinginkan

dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (A). Sampel

ditimbang sebanyak 2 gram (B) lalu dibungkus dengan kertas saring, ditutup

dengan kapas bebas lemak dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi sokhlet yang

telah dihubungkan dengan labu lemak yang telah dioven dan diketahui bobotnya.

Pelarut heksan atau pelarut lemak lain dituangkan sampai sampel terendam dan

dilakukan refluks atau ektraksi lemak selama 5-6 jam atau sampai palarut lemak

yang turun ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut lemak yang telah digunakan,

disuling dan ditampung setelah itu ekstrak lemak yang ada dalam labu lemak

dikeringkan dalam oven bersuhu 100-105 0C selama 1 jam, lalu labu lemak

didinginkan dalam desikator dan ditimbang (C). Tahap pengeringan labu lemak

diulangi sampai diperoleh bobot yang konstan. Kadar lemak dihitung dengan

rumus:

%% 100xB

AClemakKadar −=

(4) Analisis kadar protein (AOAC 2005)

Analisis kadar protein dilakukan dengan metode kjeldahl. Prinsipnya

adalah oksidasi bahan-bahan berkarbon dan konversi nitrogen menjadi amonia

oleh asam sulfat, selanjutnya amonia bereaksi dengan kelebihan asam membentuk

amonium sulfat. Amonium sulfat yang terbentuk diuraikan dan larutan dijadikan

basa dengan NaOH. Amonia yang diuapkan akan diikat dengan asam borat.

Nitrogen yang terkandung dalam larutan ditentukan jumlahnya dengan titrasi

menggunakan larutan baku asam.

Prosedur analisis kadar protein sebagai berikut: sampel ditimbang

sebanyak 0,1-0,5 g, dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 100 ml, ditambahkan

dengan 1/4 buah tablet kjeltab, kemudian didekstruksi (pemanasan dalam keadaan

mendidih) sampai larutan menjadi hijau jernih dan SO2 hilang. Larutan dibiarkan

dingin dan dipindahkan ke labu 50 ml dan diencerkan dengan akuades sampai

tanda tera, dimasukkan ke dalam alat destilasi, ditambahkan dengan 5-10 ml

NaOH 30-33% dan dilakukan destilasi. Destilat ditampung dalam larutan 10 ml

asam borat 3% dan beberapa tetes indikator (larutan bromcresol green 0,1% dan

29

larutan metil merah 0,1% dalam alkohol 95% secara terpisah dan dicampurkan

antara 10 ml bromcresol green dengan 2 ml metil merah) kemudian dititrasi

dengan larutan HCl 0,02 N sampai larutan berubah warnanya menjadi merah

muda. Kadar protein dihitung dengan rumus:

%,% 100xD

100 x 00714 x C x A)B(nitrogenKadar −=

FKxnitrogenkadar proteinKadar %% =

Keterangan: A = volume HCl untuk titrasi blanko B = volume HCl untuk titasi sampel (ml) C = normalitas HCl yang digunakan (0,02374 N) D = bobot sampel (mg) FK = faktor konversi (6,25 untuk produk perikanan)

3.4.3 Analisis asam amino (AACC 1994)

Komposisi asam amino ditentukan dengan High Performance Liquid

Chromatography (HPLC). Sebelum digunakan, perangkat HPLC harus dibilas

dulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan

syringe yang akan digunakan juga harus dibilas dengan akuades. Analisis asam

amino menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu (1) tahap pembuatan

hidrolisat protein; (2) tahap pengeringan; (3) tahap derivatisasi; dan (4) tahap

injeksi serta analisis asam amino.

(1) Tahap pembuatan hidrolisat protein

Tahap preparasi sampel adalah pembuatan hidrolisat protein. Prosedurnya

sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 0,2 gram dan dihancurkan. Sampel

yang telah hancur ditambahkan dengan HCl 6 N sebanyak 5-10 ml, kemudian

dipanaskan dalam oven pada suhu 100 0C selama 24 jam. Hal ini dilakukan untuk

menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel agar tidak mengganggu

kromatogram yang dihasilkan, selain itu pemanasan dilakukan untuk

mempercepat reaksi hidrolisis. Setelah pemanasan selesai, hidrolisat protein

disaring dengan milipore berukuran 45 mikron.

(2) Tahap pengeringan

Hasil saringan diambil sebanyak 30 µl larutan pengering. Larutan

pengering dibuat dari campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamim

dengan perbandingan 2:2:1. Setelah ditambahkan dengan larutan pengering,

30

dilakukan pengeringan dengan gas nitrogen untuk mempercepat pengeringan dan

mencegah oksidasi.

(3) Tahap derivatisasi

Larutan derivatisasi sebanyak 30 µl ditambahkan pada hasil pengeringan.

Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antara larutan metanol, pikoiotisianat,

dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses derivatisasi dilakukan agar

detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Selanjutnya

dilakukan pegenceran dengan cara menambahkan 10 ml asetonitil 60% atau buffer

fosfat 0,1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring kembali

menggunakan milipore berukuran 0,45 mikron.

(4) Injeksi ke HPLC

Hasil saringan diambil sebanyak 20 µl untuk diinjeksikan ke dalam HPLC.

Penghitungan konsentrasi asam amino dilakukan dengan cara membandingkan

kromatogram sampel dengan standar, pembuatan kromatogram standar

menggunakan asam amino yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel.

Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino:

Temperatur : 27 0C (suhu ruang)

Jenis kolom : pico tag 3,9 m x 150 µm

Kecepatan alir eluen : 1 ml/menit

Tekanan : 3000 psi

Fasa gerak : - Asetoniril 60%

- Buffer fosfat 0,1 M

Detektor : UV

Panjang gelombang : 256 nm

Derivatisasi : pre-column derivatization

Tipe injeksi : on column injection tanpa septum

Program : isokratik (kecepatan aliran eluen konstan)

Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus:

)g(sampelBobot 100xBMxFBxCx

standarareaLuassampelareaLuasaminoasamiKonsentras

µ=

31

Keterangan : C = konsentrasi standar asam amino (5 µg) FP = faktor pengenceran (10 ml) BM = bobot molekul dari masing-masing asam amino (g/mol)

3.4.4 Analisis asam lemak (AACC 1983)

Analisis asam lemak dilakukan melalui tahap ekstraksi, derivatisai, injeksi

dan pembacaan sample melalui kromatogram. Pada tahap ekstraksi, sampel

dilarutkan dengan heksan. Terlebih dahulu diperoleh asam lemak dengan metode

sokhlet dan ditimbang sebanyak 0,02 g lemak dalam bentuk minyak.

Tahap derivatisasi dilakukan dengan cara menambahkan NaOH sebanyak

5 ml ke dalam metanol lalu dipanaskan selama 20 menit pada suhu 80 0C, setelah

itu larutan didinginkan. Larutan yang telah dingin ditambahkan sebanyak 5 ml

pada sampel. Sampel dipanaskan pada suhu 80 0C selama 20 menit, diangkat dan

didinginkan. Sampel ditambahkan 2 ml NaCl jenuh dan 5 ml heksan

dihomogenkan kemudian dipipet lapisan heksan dan dimasukkan ke dalam tabung

reaksi atau eppendorf. Sebanyak 2-5 µl sampel diinjeksikan ke dalam

kromatografi gas. Asam lemak yang ada dalam metil-ester akan diidentifikasi

oleh flame ionization detector dan respon yang ada akan tercatat melalui

kromatogram. Kondisi alat GC pada saat analisis adalah sebagai berikut:

Temperatur kolom : 200 0C

Temperatur initial : 150 0C

Temperatur final : 180 0C

Kecepatan alir : H2 = 2,5 Kgf/cm3 dan N2 = 50 Kgf/cm3

Batas tekanan : 3000 psi

Fase gerak : N2

Fase stasioner : serbuk diethyl glicol sukcinat (DEGS)

Detektor : flame ionization detector (FID) suhu 250 0C

Jenis kolom : pico tag 4 m x 5 mm

Kecepatan suhu : 5 0C/menit

Analisis kuantitatif asam lemak dapat dihitung dengan rumus:

100x pelarut) si(Konsentra100

sampel iKonsentrasmg/lemak)(lemak Asam−

=

32

3.4.5 Analisis mineral dan logam berat (SNI 01-2896-1998)

Mineral yang dianalisis pada sampel lintah laut (Discodoris sp.) meliputi:

kalsium, kalium, magnesium, besi, fosfor, selenium, seng, kadmium, merkuri dan

timbal yang dianalisis dengan metode spektrofotometer serapan atom.

(1) Analisis mineral kalsium, magnesium, kalium dan seng (SNI 01-2362-1991)

Prinsip penentuan kadar kalsium, magenesium, kalium dan seng adalah

dengan proses pelarutan sampel dengan asam klorida, kemudian diukur

absorbansinya dengan AAS.

Prosedur analisis kadar mineral kalsium adalah sebagai berikut: sampel

yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 g, kemudian dihancurkan dan

dimasukkan ke dalam gelas beaker 100 ml yang telah dibilas dengan HCl 1 N.

Sampel ditambahkan dengan 25 ml HCl 1 N dan disimpan selama 24 jam. Setelah

penyimpanan, sampel dikocok dengan shaker dan disaring dengan kertas

whatman no 1.

Ekstrak sampel dipipet sebanyak 1 ml, ditambahkan 2 ml larutan

lantanium oksida dan ditambahkan HCl 1 N sampai volume menjadi 10 ml,

kemudian ditera dengan penambahan akuades sampai volume menjadi 50 ml.

Larutan diukur absorbansinya dengan AAS masing-masing pada panjang

gelombang 422,7 nm untuk kalsium, 285,2 untuk magnesium, 766,5 nm untuk

kalium dan 213,9 nm untuk seng.

(2) Analisis mineral besi (SNI 01-2896-1998) Prinsip penentuan kadar besi adalah proses pelarutan bahan dengan larutan

asam campur terdiri dari asam nitrat, asam sulfat, dan asam perklorat, kemudian

dilanjutkan dengan proses pemanasan.

Prosedur analisis mineral besi adalah sebagai berikut: sampel yang telah

kering ditimbang sebanyak 1-2 gram kemudian dihancurkan. Larutan asam

campuran disiapkan yang dibuat dari HNO3, H2SO4, dan HClO4 dengan

perbandingan 5:1:2. Sampel yang telah hancur ditambah 10 ml larutan asam

campuran, kemudian dipanaskan di dalam ruang asam menggunakan api kecil

selama 2 jam. Kemudian api dibesarkan sampai larutan menjadi jernih dan

33

didinginkan. Larutan ditambahkan akuades sampai volume 50 ml dan disaring

dengan kertas saring pencucian asam whatman no 1.

Ekstrak dipipet sebanyak 10 ml, ditambahkan 1 ml hidrokuinon dan 1 ml

orto-phenatrolin kemudian ditambahkan sodium sitrat sampai pH 3,5. Larutan

diencerkan dengan akuades sampai volume 50 ml dan dipanaskan dalam water

bath selama 1 jam. Larutan deret standar diperlukan dengan pereaksi yang sama

dengan ekstrak sampel. Absorbansinya diukur dengan AAS pada panjang

gelombang 248,3 nm.

(3) Analisis mineral tembaga (SNI 01-2896-1998) Prinsip penentuan kadar tembaga adalah dengan proses pengabuan pada

suhu 450 0C dengan penambahan asam nitrat (HNO3). Prosedur analisisnya

sebagai berikut: sampel ditimbang sebanyak 25 g dalam gelas piala 250 ml yang

terlebih dahulu dicuci dengan HNO3 6 N. Sampel dikeringkan di dalam oven

pada suhu 110-125 0C selama 8-24 jam. Selanjutnya sampel dipindahkan ke

dalam tungku pada suhu 350 0C selama 1-2 jam untuk mencegah terjadinya proses

pembakaran cepat yang menyebabkan sampel dapat terhambur ke luar. Suhu

dinaikkan hingga 450 0C selama 12-24 jam. Apabila sampel abu belum putih

sempurna, maka ditambah 0,25-1 ml HNO3 pekat, kemudian diuapkan di atas hot

plate. Sampel dipanaskan kembali pada suhu 450 0C di dalam tungku selama

30-60 menit sampai abu benar-benar putih.

Abu dilarutkan dalam 2 ml HNO3 pekat, kemudian diencerkan dengan

akuades hingga 25 ml dan dididihkan di atas hot plate. Larutan disaring dengan

kertas saring no 42 yang terlebih dahulu dicuci dengan HNO3 10% dan akuades,

filtratnya ditampung dan diencerkan dengan akuades hingga 50 ml.

Absorbansinya diukur dengan AAS pada panjang gelombang 324,7 nm.

(4) Analisis mineral merkuri (SNI 01-2896-1998) Prinsip dari penentuan kadar merkuri mengikat sampel dengan campuran

H2SO4 dan HNO3 dan dioksidasi dengan H2O2. Merkuri yang teroksidasi

dikembalikan lagi ke valensi dasarnya melalui penambahan larutan pereduksi

dengan cara mereaksikan merkuri dengan SnCl2 dalam keadaan asam untuk

membentuk gas atomik merkuri. Merkuri dalam keadaan dasar ini diaerasikan ke

udara dan dibentuk dengan AAS tanpa nyala pada panjang gelombang 256,3 nm.

34

Prosedur analisisnya sebagai berikut: sampel yang telah dihomogenkan

ditimbang sebanyak 5 g dan dimasukkan ke dalam labu. Leher labu dibilas

dengan 5 ml akuades. Ditambahkan 20 buah batu didih, 10-20 mg V2O5, dan

20 ml H2SO4 dengan HNO3 dengan perbandingan 1:1. Labu dihubungkan dengan

kondensor dan digoyang-goyang hingga tercampur. Air dingin dialirkan melalui

kondensor selama pencampuran dilakukan, kemudian dipanaskan dengan api kecil

sampai mendidih (sekitar 6 menit) dan diakhiri dengan pemanasan kuat (api besar)

selama 10 menit. Selama reaksi berlangsung, labu terus digoyang-goyang. Alat

pemanas dimatikan dan kondensor dicuci dengan 15 ml akuades. Ditambahkan 2

tetes H2O2 melalui kondensor ke dalam labu dan dicuci dengan 15 ml akuades.

Larutan dalam labu didinginkan pada suhu kamar dengan cara menempatkan

dalam gelas yang berisi air. Labu diangkat dari kondensor dan leher labu dibilas

dengan akuades. Labu dibilas hati-hati dengan akuades kemudian ditera sampai

volume 50 ml.

Larutan blanko dan kurva standar disiapkan lalu ditambahkan 100 ml

larutan pengencer ke dalam masing-masing labu. Larutan pengencer dibuat

dengan cara sebanyak 50 ml HNO3 dan 67 ml H2SO4 dipipet ke dalam labu ukur

1000 ml yang berisi 300-500 ml akuades kemudian ditera sampai volume

1000 ml. Out put pompa diatur sampai mencapai kira-kira 2 liter udara/menit

dengan mengatur kecepatan pompa lalu ditambahkan 20 ml larutan pereduksi ke

dalam masing-masing labu. Larutan pereduksi dibuat dengan cara dipipet 50 ml

H2SO4 dan ditambahkan 300 ml akuades kemudian didinginkan pada suhu kamar.

Sebanyak 15 g NaCl, 25 g SnCl2, dan 15 g hidroksil aminasulfat ditimbang,

kemudian semua bahan dilarutkan dalam larutan H2SO4 sampai volume 500 ml.

Gas inlet adapter dihubungkan dan dilakukan aerasi selama 1 menit. Absorpsi

larutan blanko dan larutan standar dicatat lalu diplotkan dalam kurva.

Larutan sampel dipipet 25 ml dari labu, kemudian ditambahkan dengan

75 ml larutan pengencer. Out put pompa diatur sampai mencapai kira-kira 2 liter

udara/menit dengan mengatur kecepatan pompa lalu ditambahkan 20 ml larutan

pereduksi yang telah dibuat ke dalam larutan yang akan diperiksa. Gas inlet

adapter dihubungkan dan dilakukan aerasi selama 1 menit. Absorpsi larutan

sampel dicatat. Berdasarkan kurva tersebut dapat ditentukan konsentrasi merkuri

35

pasa sampel yang diperiksa. Bila didapat konsentrasi merkuri dalam sampel yang

diperiksa menyimpang dari kurva, maka dilakukan penentuan kembali dengan

memakai volume larutan standar yang lebih kecil. Kadar masing-masing mineral

dalam bahan dihitung dengan rumus:

x WSlopeVxAbsppm)(mineralKadar =

Keterangan : Abs : absorbansi yang terbaca pada AAS V : Volume pengenceran Slope : slope regrsi kurva dari masing-masing mineral W : bobot sampel (g)

3.4.6 Analisis fitokimia (Departemen Kesehatan RI 1995)

Analisis fitokimia dilakukan untuk menentukan komponen bioaktif yang

terdapat pada serbuk ekstrak kasar lintah laut. Analisis fitokimia yang dilakukan

terdiri dari alkaloid, steroid/triterpenoid, saponin, flavonoid, fenol hidrokuinon,

molisch, benedict, biuret, ninhidrin.

(1) Alkaloid Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N

kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi dragendorf, meyer

dan wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi meyer terbentuk

endapan putih kekuningan, dengan pereaksi wagner membentuk endapan coklat

dan dengan pereaksi dragendorf membentuk endapan merah sampai jingga.

Pereaksi meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 HgCl2 dengan 0,5 g

kalium iodida lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml

dalam labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna.

Pereaksi wagner dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian

ditambahkan 2,5 g iodin dan 2 g kalium iodida, kemudian dilarutkan dan

diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi ini

berwarna coklat.

Pereaksi dragendorf dibuat dengan cara 0,8 g bismut subnitrat

ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur

dengan larutan yang dibuat dari 8 g kalium iodida dalam 20 ml air. Sebelum

36

digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran

20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi berwarna jingga.

(2) Steroid/triterpenoid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi.

Anhidrida asetat sebanyak 10 tetes dan asam sulfat pekat sebanyak 3 tetes

ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif sampel mengandung

steroid dan triterpenoid yaitu terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama

kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.

(3) Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil

selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan

sampel mengandung saponin.

(4) Flavonoid Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil

alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume sama) dan

4 ml alkohol, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung

flavonoid, yaitu terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil

alkohol.

(5) Fenol hidrokuinon Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang

dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3

5%. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa fenol, yaitu terbentukya

larutan berwarna hijau atau hijau biru.

(6) Molisch Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 2 tetes pereaksi molisch dan

1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Hasil uji positif sampel

mengandung karbohidrat ditandai oleh terbentuknya kompleks berwarna ungu

diantara 2 lapisan cairan.

(7) Benedict Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi

benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif

37

sampel mengandung gula pereduksi yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau,

kuning atau endapan merah bata.

(8) Biuret Larutan sampel sebanyak 1 ml ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 4 ml.

Campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif sampel mengandung

senyawa peptida yaitu terbentuknya larutan berwarna ungu.

(9) Ninhidrin Larutan sampel sebanyak 2 ml ditambahkan beberapa tetes larutan

ninhidrin 0,1%. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil

uji positif sampel mengandung asam amino, yaitu terbentuknya larutan berwarna

biru.

3.4.7 Analisis aktivitas antioksidan (DPPH) (Blois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005) Ekstrak lintah laut dari hasil ekstraksi bertingkat dan hasil pemurnian

dilarutkan dalam metanol dengan konsentrasi 200, 400, 600 dan 800 ppm.

Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dan kontrol positif,

dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentrasi yang

sama dengan sampel. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat dengan

melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM.

Masing-masing sampel uji dan pembanding diambil 4,50 ml dan

direaksikan dengan 500 µl larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi yang berbeda

dan telah diberi label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC

selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan

spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 517 nm. Absorbansi dari

larutan blanko juga diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan

blanko dibuat dengan mereaksikan 4,50 ml pelarut metanol dengan 500 µl larutan

DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Nilai persentase aktivitas antioksidan dihitung

dengan rumus:

%% 100xblanko Absorbansi

sampel Absorbansi - blanko AbsorbansiInhibisi =

38

Nilai persentase inhibisi diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada

persamaan regresi linear untuk mencari nilai IC50 (inhibitor concentration 50%).

3.5 Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah

menggunakan rancangan acak lengkap faktorial untuk aktivitas antioksidan

ekstrak kasar dengan 2 perlakuan yaitu jenis pelarut (kloroform, etil asetat dan

etanol) dan bagian lintah laut (daging dan jeroan) dengan 2 kali ulangan. Model

matematis rancangan percobaan tersebut menurut Steel dan Torrie 1995 adalah:

ijkijijijijk )( Y εαββαµ ++++=

Keterangan :

Yijk : Nilai pengamatan pada suatu percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ke-i dan ke-j

µ : Nilai tengah populasi αi : Pengaruh perlakuan jenis pelarut ke-i (kloroform, etil asetat, dan etanol) βij : Pengaruh perlakuan bagian lintah laut ke-j (daging dan jeroan) (αβ)ij: Pengaruh interaksi jenis pelarut ke-i, dengan bagian lintah laut ke-j εijk : Pengaruh galat pada percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi

perlakuan jenis pelarut dan bagian lintah laut

Rancangan yang digunakan pada analisis aktivitas antioksidan hasil

fraksinasi, yaitu menggunakan rancangan acak lengkap biasa. Perlakuan yang

digunakan adalah fraksi dengan 2 kali ulangan. Model matematis rancangan

percobaan tersebut. Model matematis rancangan percobaan tersebut menurut Steel

dan Torrie 1995 adalah:

ijiij P Y ε++= µ

Keterangan :

Yij : Nilai pengamatan (respon) dari faktor perlakuan fraksi ke-i dan ulangan ke-j

µ : Nilai rata-rata yang sesungguhnya Pi : Pengaruh perlakuan fraksi ke-i εij : Pengaruh galat pada perlakuan fraksi ke-i dan ulangan ke-j

39

Gambar 5 Diagram penelitian

Lintah laut

Pemisahan

Pengeringan

Analisis Proksimat Kadar air, abu, protein, lemak, karbohidrat

Jeroan lintah laut kering

Daging lintah laut kering

Analisis Mineral dan logam berat

Analisis asam amino dan asam lemak

Pengeringan

Ekstraksi

Ekstrak kasar

Fraksinasi lanjut KLT

Identifikasi GC-MS

Analisis: Antioksidan Fitokimia

Antioksidan terbaik

Jeron Daging

Senyawa aktif

Antioksidan terbaik

Antioksidan terbaik