IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA SEKUNDARNIH METABOLITASEKUNDARNIH METABOLITA

Odabir procedure za izolaciju sekundarnih metabolita zavisi odmetabolita zavisi od

Biljnog materijalaSpojeva koji se izolirajup j j j

Prije odabira metode, potrebno je utvrditi ciljPrije odabira metode, potrebno je utvrditi ciljizolacije, koji može biti:· nepoznata bioaktivna komponentap p· poznata komponenta· grupa spojeva koji su strukturno slični

2

Fitohemijski screening uključuje;

Izbor odgovarjućeg biljnog materijalaIzbor odgovarjućeg biljnog materijalaAdekvatno prikupljanje biljnog materijalaDeterminacija biljnog materijalaDeterminacija biljnog materijalaSušenjePakovanje i skladištenjePakovanje i skladištenjeEkstrakcijaSeparacijaSeparacijaIdentifikacija

3

PRIKUPLJANJE BILJNOG MATERIJALAPRIKUPLJANJE BILJNOG MATERIJALA

Potrebno je kod prikupljanja biljnog materijala Potrebno je kod prikupljanja biljnog materijala voditi računa o;

Odgovarajuća fenološka faza (količina i vrsta Odgovarajuća fenološka faza (količina i vrsta konstituenata zavisi od stepena razvoja biljke)Prikupljena biljka treba biti zdrava (npr. da nije Prikupljena biljka treba biti zdrava (npr. da nije inficirana nekim virusom, bakterijom ili gljivicom)Determinaciju biljnog materijala treba izvršiti j j g jstručno liceObavezno ostaviti voucher (reprezentativan uzorak)( p )

4

PRIKUPLJANJE BILJNOG MATERIJALAPRIKUPLJANJE BILJNOG MATERIJALA

Divlje biljke Kultivirane biljkej j jLimitirano prirodno stanište (rijetke i endemičnevrste), rašireni na velikom prostoru

Prisutni na limitiranom području

Teško dostupni Lako dostupnip p

Moguće da dođe do nedostatka matrijala zbogkonstatnog prikupljanja

Dostupni kontinuirano

Osoba koja vrši prikupljane mora biti iskusan Osoba koja vrši prikupljanje ne mora bitibotaničar botaničar

Daje pravu sliku hemijskog sastava na prirodnom staništu

Uticaj kontroliranih uslova života

Neistražen biljni materijal koji pruža mogućnostNeistražen biljni materijal koji pruža mogućnostidentifikacije novih aktivnih komponenata

5

Izolacijski proces za biljne materijale uključuje sljedećeIzolacijski proces za biljne materijale uključuje sljedećekorake:

sušenje i usitnjavanje biljnog materijala (homogenizacija)j j j j g j ( g j )

odabir i primjena prikladne metode izolacije: ekstrakcija, destilacija ili presovanjepročišćavanje ekstraktakoncentriranje (npr. uparavanjem)

š j k t k tsušenje ekstrakata

6

Sušenje biljnog materijalaobično se obavlja u prostorijama koje nisu direktno izloženej p j jsunčevoj svjetlosti

Pakuju se u papirne vrećice

Čuvaju se u sredini u kojoj su kontrolirani uslovi

7

Izolacija volatilnih sekundarnih metabolita vrši Izolacija volatilnih sekundarnih metabolita vrši se različitim metodama npr;

Headspace tehnikomD til ij Destilacijom CijeđenjemA fl ž ( fl )Anfleranž (enfleurage)

8

HEADSPACE TEHNIKAHEADSPACE TEHNIKA

Headspace tehnika je razvijena u 80-tim godinama XX vijeka zaodređivanje mirisnih komponenati prisutnih u zraku kojiokružuje različite objekte.Headspace predstavlja zrak iznad ili oko mirisnog uzorka kojiHeadspace predstavlja zrak iznad ili oko mirisnog uzorka kojisadrži volatilne spojeve.Ova metoda nije destruktivnajPrimjenjene tehnike često se kalsificiraju prema različitimprincipima uzorkovanja, na

čstatičkudinamičku

9

HEADSPACE TEHNIKA (HS)HEADSPACE TEHNIKA (HS)

Statička HS metoda se sastoji u tome da se tečni ili čvrstiuzorak stavi u vijalicu, koja se zagrijava do određenetemperature prije zatvaranja.Termin statička metoda se odnosi na zatvoreno okruženjeTermin statička metoda se odnosi na zatvoreno okruženjegdje se sakupljaju nastale volatilne komponente.

Nakon što uzorak dostigne ravnotežu sagasovitom fazom, alikvot se prebacujesiringom za GC na hromatografsku analizu.

Osjetljivost statičke headspace tehnike je umikrogramskim količinama, a zavisi i odprirode volatilnih komponenata.

10

HEADSPACE TEHNIKA (HS)HEADSPACE TEHNIKA (HS)

Dinamička HS analiza koristi purge and trap (čišćenje i zamka)tehniku, provodi se povlačenjem volatilnih komponenata samaterijala strujom prečišćenog zraka ili inertnog gasa kroz cjevčicuj j p g g g jnapunjenu nekim čvrstim adsorbentom.Nakon određenog vremena cjevčica se prebacuje u jedinicu zatoplotnu desorpciju gdje se zagrijava a adsorbovane komponentetoplotnu desorpciju gdje se zagrijava, a adsorbovane komponentenošene inertnim gasom se sakupljaju u jedinici trap, u kojoj jetemperatura mnogo niža.K d k t d b g i k lj id d ljKada su sve kompnente desorbovane purge, i sakupljene idu daljena GC/MS analizu.Osjetljivost dinamičke headspace tehnike je reda veličinenanograma.

11

DESTILACIJA DESTILACIJA

Vrste destilacijaVrste destilacijadestilacije vodenom parom,vodene destilacije (hidrodestilacije)vodene destilacije (hidrodestilacije),vodeno-parne destilacije.

Sve tri metode se zasnivaju na istimteorijskim principima destilacije a razlikateorijskim principima destilacije, a razlikaje u primarnom kontaktu biljnogmaterijala i vode, tj. vodene pare.j , j p

12

CIJEĐENJECIJEĐENJE

Cijeđenjem se dobija esencijalno ulje iz svježe kore npr. limuna i narandže jer se nalazi ispod same epiderme I ova ulja se mogu narandže, jer se nalazi ispod same epiderme. I ova ulja se mogu dobiti destilacijom vodenom parom, ali zbog njihove lake dostupnosti vrši se cijeđenje na običnoj temperaturi.

Spugna-proces se sastoji u cijeđenju ulja iz svježe kore agruma na spužvu. Na kori se napravi nekoliko rezova i cijedi. Kada se spužva napuni uljem, iscijedi se u sud u kome se kasnije, stajanjem, ulje

t d j d t d i li j j N j či postepeno odvaja od mutne vode i pliva na njoj. Na ovaj način se dobije najbolje ulje, ali je metoda spora, ima mnogo gubitaka, tako da je prinos mali. Odvojeno ulje se filtrira da se dobije bistar proizvod.

Cijeli plodovi se pritišću i taru u posebno izbušenim posudama od Cijeli plodovi se pritišću i taru u posebno izbušenim posudama od nerđajućeg lima koje na unutrašnjoj strani imaju sitne, vrlo oštre iglice. Ove iglice izbuše spoljni, žuti dio kore u kome se nalaze velike šupljine sa uljem.

13

ANFLERANŽ (ENFLEURAGE)ANFLERANŽ (ENFLEURAGE)

(enfleurage) je francuski način izdvajanja esencijalnih ulja. Metoda je spora i skupa Primjenjuje se za slučajeve kada je količina je spora i skupa. Primjenjuje se za slučajeve kada je količina esencijalnih ulja tako mala, da se drugi načini ne mogu primjeniti. Princip se zasniva na tome da se koristi osobina masti da vrlo lako upijaju mirisne materije bilja na običnoj temperaturi.

Metoda se zasniva na adsorpciji mirisnih sastojaka na prečišćenom bezmirisnom loju. Dobvena “mirisna mast” se obrađuje

d j ći t lodgovarajućim otapalom.

Na ovaj način se dobiju najfinija i najskupocjenija esencijalna ulja. Pošto se radi na običnoj temperaturi i s neutralnim materijama za Pošto se radi na običnoj temperaturi i s neutralnim materijama za upijanje, praktično se dobija prirodno esencijalno ulje, onakvo kakvo se nalazi u biljci, jer se pod tim okolnostima ekstrakcije ne mijenjaju ni organoleptičke osobine, niti fizičke i hemijske konstante.g j

14

EKSTRAKCIJAEKSTRAKCIJA

proces razdvajanja komponenata iz biljnog materijala,p j j p j g j ,na osnovu različite topljivosti u otapalu kojim se vršiekstrakcija. Ekstrakcija uključuje nekolikoistovremenih procesa:

difuzija otapala u stanice biljnog materijalaotapanje metabolita u otapaludifuzija otapala s otopljenim tvarima izvan stanicaispiranje

15

EKSTRAKCIJAEKSTRAKCIJAFaktori koji utiču na ekstrakciju su

temperatura, veličina čestica,kretanje otapala ipH-vrijednost. p j

Poželjna svojstva otapala za ekstrakciju:selektivnost za spojeve koje se žele ekstrahiratiselektivnost za spojeve koje se žele ekstrahirati,veliki ekstrakcijski kapacitet, nereaktivnost s biljnim komponentama, neškodljivost za ljude i opremu neškodljivost za ljude i opremu, potpuna hlapljivost iniska cijena.

16

EKSTRAKCIJAEKSTRAKCIJA

Često se metode esktrakcije s otapalima dijele j p jna kontinuirane i nekontinuirane postupke.

MaceracijaUltarzvučna ekstrakcijaPerkolacijaEkstrakcija po SoxhletuEkstrakcija s otaplaom pod pritiskomEkstrakcija pod refluksomEkstrakcija superkritičnim fluidima

17

MACERACIJAMACERACIJA

usitnjeni biljni materijal u pogodnom otapalu u zatvorenojposudi se ekstrahira na sobnoj temperaturi. Povremeno ilikonstantno miješanje može povećati brzinu ekstrakcijekonstantno miješanje može povećati brzinu ekstrakcije(maceracija uz miješanje ili vrtložna maceracija).

18

ULTRAZVUČNA EKSTRAKCIJAULTRAZVUČNA EKSTRAKCIJA

ovo je modificirana maceracija, gdje je ekstrakcijaj j , g j j jolakšana upotrebom ultrazvuka (visoko-frekventnipulsevi, 20 kHz)Ultrazvuk se koristi za mehanički stres na stanicestvarajući kavitacije u uzorku. Raspadanje stanica

ć špovećava topljivost metabolita u otapalu i poboljšavaekstrakciju.

19

PERKOLACIJA PERKOLACIJA

usitnjeni biljni materijal se postavlja uperkolator (cilindrični kontejner sp ( jslavinom na dnu) i natapa u otapalu.Dodatno otapalo se zatim dodaje na vrh

šbiljnog materijala i pušta da «perkolira»polako (kapajući) sa dna perkolatora.

20

EKSTRAKCIJA U SOXHLET-uEKSTRAKCIJA U SOXHLET u

Biljni materijal se postavlja u cilindar uekstrakcijskoj komori koja se postavlja iznadposude za sakupljanje, a ispod refluksirajućeghladila.Glavna prednost ove vrste ekstrakcije je

kontinuirana ekstrakcija. Svježe otapalo sekondenzira i ekstrahira biljni materijalkondenzira i ekstrahira biljni materijalkontinuirano. Otapalo s ekstrahiranim tvarimaprelazi u balon gdje se koncentrira.Nedostatak je u tome što se ekstrakt kontinuiranoNedostatak je u tome što se ekstrakt kontinuiranozagrijava na temperaturu vrenja otapala, što možedovesti termičkih razlaganja.

21

EKSTRAKCIJA POD REFLUKSOMEKSTRAKCIJA POD REFLUKSOM

biljni materijal se uranja u otapalo u tikvicikoja je spojena na hladilo. Otapalo sej j p j pzagrijava do ključanja. Kako otapalootparava ulazi u hladilo gdje se

ćkondenzira i vraća se u tikvicu.

22

EKSTRAKCIJA SUPERKRITIČNIM FLUIDIMAEKSTRAKCIJA SUPERKRITIČNIM FLUIDIMA

(engl. supercritical fluid extraction, SFE) – superkritični fluidi(SCFs) zamjenjuju organska otapala. Kritična tačka čiste tvari sedefiniše kao najviša temperatura i pritisak na kojima tvar možepostojati u parno-tekućoj ravnoteži.

Na temperaturama i pritiscima iznad ove tačke nastaje jedanhomogen fluid poznat kao superkritični fluidhomogen fluid, poznat kao superkritični fluid.

SCF je težak kao tekućina, ali ima svojstvo prodiranjakao gas. SCF nastaju zagrijavanjem gasova iznadkritične temperature ili komprimiranjem tekućina iznadkritične temperature ili komprimiranjem tekućina iznadkritičnog pritiska. Promjenom pritiska i temperaturemijenja se sposobnost otapanja superkritičnog CO2(visokokomprimirani CO2 (t > tk i p > pk), bezmijenjanja sastava otapala. Ekstrakcija se obično vršina 40-50 oC i pritisku 200-300 bara.

23

ANALIZA SEKUNDARNIH METABOLITAANALIZA SEKUNDARNIH METABOLITA

Volatilni sekundarni metaboliti Volatilni sekundarni metaboliti GC/MS analizom

Rt, RI, upoređivanjem spektara, , p j p

Nevolatilni sekundarni metaboliti“ukupni” spektrofotometrijski, fluorimetrijski...HPLC uz upotrebu različitih detektorap

24

GASNA HROMATOGRAFIJA (GC) GASNA HROMATOGRAFIJA (GC)

Kapilarne kolone, (dužina 25-50 m sa unutrašnjim dijametrom 0.20– 0.32 mm i debljinom filma stacionarne faze od 0.25 μm).

Stacionarna faza može biti polarna- spojevi se razdvajaju na osnovu njihove polarnosti, što rezultira različitim vremenom zadržavanja komponenata u koloni nepolarna - dolazi do separacije zbog različitih tačaka ključanja

Esencijalna ulja sastoje od terpena i njihovih derivata koji imaju slične tačke ključanja, eluiraju se u vrlo uskom rasponu na nepolarnim kolonama Da bi se prevazišao ovaj limit analitička nepolarnim kolonama. Da bi se prevazišao ovaj limit, analitička metoda se modificira primjenom sporijeg rasta temperature u pećnici, kako bi se proširio eluacioni opseg komponenata ulja.

25

GCGCOsnovni kriterij za identifikaciju kada se koriste detektori koji ne dajuinformaciju o strukturi jesu retencioni indeksi. Sistem retencionihindeksa baziran je na činjenici da je svaki analit definisan pozicijomindeksa baziran je na činjenici da je svaki analit definisan pozicijomizmeđu dva susjedna alkana u homolognom nizu.

Metoda računanja RI bazira se na logaritamskoj jednačini koju jeMetoda računanja RI bazira se na logaritamskoj jednačini koju jerazvio Kovats 1958. godine za izotermalne uslove, kao i na jednačinikoju su objavili van den Dool i Kratz 1963. godine koja nemalogaritamsku formu, a uzima u obzir temperaturno programiraneusloveuslove.

( ) ( ) ( )( ) ( )

1 , ,

, 1 ,

n n R x R nn

R n tR n

RI RI f t f tRI

f t f+

+

⎡ ⎤+ ⋅ −⎣ ⎦=⎡ ⎤−⎣ ⎦

Zavisno od funkcije f(tR), koriste se različiti RI sistemi:Logaritamska [f(tR) = log tR`], prema Kovatsu

( ) ( )⎣ ⎦

g [ ( R) g R ] pLinearna [f(tR) = tR], što odgovara prijedlogu van den Doola i Kratza.

26

Općenito sistem retencionih indeksa bazira se Općenito sistem retencionih indeksa bazira se na vezi struktura-retenciono vrijeme

(n-alkani i metilni ili etilni esteri masnih kiselina tj (n alkani i metilni ili etilni esteri masnih kiselina, tj svaka homologna serija koja predstavlja linearnu vezu između retencionih vremena i broja jkarbonovih atoma)

27

Brza gasna hromatografija, fast gas chromatography (FGC),koja ima dovoljnu moć razdvajanja u kraćem vremenu,upotrebom adekvatnih kolona i instrumentacije u kombinacijisa optimiziranim uslovima koji omogućavaju 3-10 puta bržeanalize. Ova vrsta hromatografije izvodi se u kratkim kolonama5-10 m, promjera kolone 0.10-0.18 mm, uz hidrogen kao gasnosač, i bržim temperaturnim programom.

S obzirom na brzinu izvođenja analize ovaj vid gasnehromatografije može se podijeliti nahromatografije može se podijeliti na

brzu u trajanju 3–12 min,veoma brza 1–3 min,ultrabrza manje od 1 minultrabrza manje od 1 min.

28

Najčešće upotrebljavani detektor kod analize volatilnih spojevaje spektrometar masa

Kombinovani sistem gasna hromatografija/masenaspektrometrija GC/MS, predstavlja najefikasnijiju tehniku zap j / , p j j j jseparaciju, detekciju i karakterizaciju komponenata ukompleksnim organskim smjesama.

Spektrometar masa predstavlja osjetljiv i specifičan analitičkiinstrument, a ujedno i jednu vrstu hemijskog reaktora u komese dešava različita razgradnja molekulase dešava različita razgradnja molekula.

Primjena spektrometrije masa je neophodna pri ispitivanjustrukture supstanci dobijenih sintezom ili izolacijom izbiljnog materijala,praćenju metabolizmapraćenju metabolizma,određivanju strukture metabolita.

29

Satureja montana Satureja montana L.L.

Headspace; 37 komponentataEsencijalno ulje; 66 komponenata

jj

Esencijalno ulje; 66 komponenata

80

100 1191.25e6[SM-HS] TIC #1

[8P07SM] TIC #2

CH3CH3

20

40

60

40 60 80 100 120 140 160

41 5165 77

91

103

134

0.50e6

0.75e6

CH3

p-cimen

60

80

100 135

CH3

OH

(37.1 %)

(15.5%)

10.00 20.00 30.00 40.00 50.00

0.25e6

0.25e6

Headspace

Esencijalno ulje

20

40

40 60 80 100 120 140 160 18

41 51 65

77

91

107 115

121

150CH3 CH3 karvakrol

60

80

100 135

0.50e6

0.75e6CH3

OH

(59.1%)

( )

20

40

40 60 80 100 120 140 160

39 51 6577

91

107

115

121128

150

+

1.25e6

CH3 CH3

OH

timol

(20.1%)

30

Određivanje ukupnih fenolaOdređivanje ukupnih fenolaFolin-Dennis (redukcija smjese fosfovolframatno-fosfomolibdatnogreagensa u prisustvu fenolskih hidroksilnih grupa tirozina, što rezultirastvaranjem plavog produkta)

Folin-Ciocalteu (Dodatak litijum sulfata sprječava formiranjeprecipitata koji bi interferirali u kvantifikaciji utičući na intenzitet bojeprecipitata koji bi interferirali u kvantifikaciji utičući na intenzitet bojenastalih kompleksa. Folin-Ciocalteu reagens je po hemijskom sastavuheksavalentni fosfomolibdo/fosfovolframatni kiseli kompleks)

3 13 5 10H O P O WO M O H O⎡ ⎤2 2 5 3 3 2

2 2 5 3 3 2

3 13 5 103 14 4 10H O P O WO MoO H OH O P O WO MoO H O

× × × ×⎡ ⎤⎢ ⎥× × × ×⎣ ⎦

( )( ) ( )( ) 765Mo VI žut ArOH Mo V plav nmλ+ →( )( ) ( )( ) 765Mo VI žut ArOH Mo V plav nmλ+ → =

31

REDUCIRAJUĆA MOĆ REDUCIRAJUĆA MOĆ

eng. Reducing power (RP) odnosi se na praćenje redukcije nekih prelaznih metala koji se mogu kompleksirati i na taj način stvoriti obojeni kompleks, a koji ima različitu boju u oksidovanoj i redukovanoj formi.

Smjesa K Fe(CN) i FeCl u kiseloj sredini se koristi za određivanje ukupnih Smjesa K3Fe(CN)6 i FeCl3 u kiseloj sredini se koristi za određivanje ukupnih fenola u biljnom materijalu, ali i kao antioksidacijska metoda. Fenolski spojevi reaguju sa ovom smjesom dajući obojeni produkt reakcije, čiji intenzitet je proporcionalan količini prisutnih fenola, a koji su odgovorni za intenzitet je proporcionalan količini prisutnih fenola, a koji su odgovorni za antioksidacijsku aktivnost.

Reakcija se izvodi u prisustvu viška Fe3+ iona. Ova redoks reakcija poznata je pod nazivom berlinsko plavo, brza je, ekonomična i jednostavna. Uklanjanje atoma hidrogena sa fenolske hidroksilne grupe je prvi korak reakcije, što rezultira stvaranjem fenoksil radikala ArO•, koji nakon toga može stvarati dimere ili može reagovati sa drugim radikalommože stvarati dimere ili može reagovati sa drugim radikalom.

32

Određivanje ukupnih flavonoidaOdređivanje ukupnih flavonoidaTaloženje sa formaldehidom + Folin CiocalteuMetoda sa AlClMetoda sa AlCl3

OH

OH

O Al+

O

OOH

OGlu

R

OOH

Glu

AlCl3

OOH

O Ram

OO

O Ram

Al2+

Rutin

33

Metoda sa 2,4-dinitrofenilhidrazinom

Princip ove metode zasniva se na reakciji aldehida i ketona sa 2,4-dinitrofenilhidrazinom. Flavoni i izoflavoni sa dvostrukom vezom između C2-C3, nedaju pozitivnu reakciju, dok flavanoni npr. naringin, naringenin ihesperetin formiraju hidrazone čiji je maksimum apsorpcije nahesperetin, formiraju hidrazone čiji je maksimum apsorpcije na495 nm.

Zbog selektivnosti reakcija flavonoida saAlCl3 i 2,4-dinitrofenilhidrazinom, bilo bi dobro određivatisadržaj specifičnih grupa flavonoida po obje metode, a njihovasad aj spec č g upa a o o da po obje etode, a j o asuma bi dala realniju vrijednost za sadržaj ukupnih flavonoida.

34

METODE ODREĐIVANJA ANTOCIJANINAMETODE ODREĐIVANJA ANTOCIJANINA

pH - diferencijalna metoda, bazira se na mjerenjuapsorpcije na jednoj valnojdužini, obično između 490-550 nm, što je daleko oduobičajene valne dužine nakojoj se nalazi maksimumapsorpcije za ostale fenole, a koji apsorbuju u UV području. Mjerenje se vrši pri različitompH; pri pH 1 su u oblikupH; pri pH 1 su u oblikuobojenih oksonijum soli, dokpri pH 4.5 su prisutni kaobezbojni hemiketalibezbojni hemiketali

35

VANILINSKI TEST VANILINSKI TEST Ovaj test specifičan je za proantocijanine, flavan-3-ol idihidrokalkone koji imaju jednostruku vezu na pozicijamaj j j p jC2-C3.

OCH3OOH

OH

OH

H+

OHO

+

OH

OH

OH

OOH

OH

OOH

OH

Flavan-3-olvanilin

O

OH

OH

CH3

OOH

OH OH

OH

OH O

OH

CH3

OH OH

OH

OH

prelazni spoj crveno obojeni produkt reakcije

36

HPLCHPLC

Najčešće korištene kolone pri analizi prirodnih produkata sukolone obrnutih faza gdje su porozne čestice silika gelapresvučene nepolarnim materijalom, a najčešće korištenaotapala za eluiranje su polarne prirode kao što su vodaotapala za eluiranje su polarne prirode kao što su voda,metanol, acetonitril, izopropanol.Dodatkom mravlje, sirćetne kiseline, trifluoroacetatne kiseline,amonijum acetata ili fosfatnog pufera u mobilnu fazu mogućeje optimizirati separaciju.Uobičajeno kolone imaju dijametar 1 0–4 6 mm i dužinu 30–Uobičajeno kolone imaju dijametar 1.0–4.6 mm i dužinu 30–250 mm, dok veličina čestica stacionarne faze varira od 2–7mm.

37

HPLCHPLC

Čestice u slučaju obrnutih faza su presvučene ugljikovodicima čija dužina lanca može biti od C4–C18. Separacija na obrnutim fazama je najefikasnija tehnika za separaciju fenolskih spojeva i to na C18 stacionarnim fazamai to na C18 stacionarnim fazama.Razdvajanje je moguće izvršiti u izokratskom i gradijentnom režimu.

Izokratski režim podrazumjeva ravnomjernu mobilnu fazu tokom razdvajanja, a separacija je dobra za polarnije spojeve. Gradijentno eluiranje se bazira na modifikaciji organskog otapala, a najčešće acetonitrila i metanola tokom analize. Ovakav režim rada je pogodan kada se fenoli nalaze u širokom rasponu polarnosti. Obično je potrebno više vremena da se stabilizira kolona i može doći do promjena na baznoj liniji usljed promjena sastava mobilne faze.

38

HPLC HPLC

Mora se voditi računa i o pH vrijednosti mobilne faze, gdjemože doći i do parcijalne disocijacije, što rezultira dodatnimpikovima, širenju i asimetriji pikova, zbog koeluiranja kiseleforme i baznog konjugovanog oblikaforme i baznog konjugovanog oblika.

Najčešće korišten pH otopine za razdvajanje fenolskih spojevaj p p j j p jje 2.5–3, kada se razdvajaju kisele forme, a 5–7, kada sefenolski spojevi razdvajaju u disociranom obliku.

39

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOSTANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

U zdravom organizmu postoji ravnoteža između nastajanjaU zdravom organizmu postoji ravnoteža između nastajanja slobodnih radikala i antioksidativne odbrane samog organizma

Slobodni radikali nastaju pucanjem veza unutar molekula u stanicama našeg organizma, pod uticajem različitih faktora, kao što su: pušenje, izloženost ionizirajućem zračenju, UV zrakama, p j , j j , ,zagađenom zraku, kao posljedica metaboličkih procesa te upala

Slobodni radikali u lančanoj reakciji stvaraju nove nestabilne molekule, štorezultira stvaranjem sve većeg broja slobodnih radikala koji oštećujuj g j j jstanice organizma.

40

Antioksidansi neutraliziraju slobodne radikale donirajućij jim svoj elektron te na taj način prekidaju lančanureakciju «krađe» elektrona drugim molekulama,doniraj ći im s oj elektron antioksidansi ne postajdonirajući im svoj elektron, antioksidansi ne postajunestabilni

41

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOSTANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

Oksidativni stres predstavlja pretjeran debalans reaktivnihoksigenovih ili nitrogenovih vrsta, npr. superoksid anion,hidrogen peroksid, hidroksil radikal ili peroksinitrit, u odnosu naantioksidativni kapacitet što vodi oksidaciji različitihantioksidativni kapacitet, što vodi oksidaciji različitihbiomolekula, kao što su enzimi, proteini, DNA i lipidi.

Antioksidativni ˝kapacitet˝ označava učinkovitost, snagu,potencijal i aktivnost neke čiste hemijske supstance da spriječioksidaciju neke druge supstanceoksidaciju neke druge supstance.

42

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOSTANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

Pro-oksidans je supstanca koja može izazvati oksidativna

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOSTANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

oštećenja na različitim biološkim biomakromolekulama kao što su nukleinske kiseline, lipidi, proteini itd.

Antioksidans je supstanca koja može efikasno reducirati pro-oksidans, pri čemu kao produkti nastaju supstance koje p p j p jnemaju štetno djelovanje.

Antioksidansi se definišu kao spojevi koji mogu odgoditi, inhibirati ili spriječiti oksidaciju „hvatanjem“ slobodnih radikala i smanjiti oksidativni spriječiti oksidaciju „hvatanjem slobodnih radikala i smanjiti oksidativni stres.

43

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOSTANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOSTOdređivanje (antioksidativne aktivnosti) AOA

Metode bazirane na prenosu elektrona eng Electron Transfer (ET)

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOSTANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

Metode bazirane na prenosu elektrona, eng. Electron Transfer (ET)

/ /ROO AH ArOH ROO AH ArOH⋅ − + ++ → +

2 3

3 2

/ /AH ArOH H O A ArO H O

ROO H O ROOH H O

+ + ⋅ ⋅ +

− +

+ ↔ +

+ ↔ +

Metode bazirane na prenosu atoma hidrogena, eng. Hydrogen AtomTransfer (HAT)

/ /ROO AH ArOH ROOH A ArO⋅ ⋅ ⋅+ → +

44

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOSTANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOSTANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOSTANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

Svaki antioksidans prati različit uticaj koncentracije, pa seantiradikalska aktivnost definiše kao količina potrebnogantioksidansa da smanji početnu koncentraciju radikala na50% ili kao ekvivalenti nekog standarda50% ili kao ekvivalenti nekog standarda.

Rezultati se izražavaju kao (inhibiciona koncentracija) IC50,Rezultati se izražavaju kao (inhibiciona koncentracija) IC50,minimalna koncentracija potrebna da izvrši 50%-tnuinhibiciju radikala.

45

METODEMETODE

Neke od najčešće upotrebljavanih metoda za Neke od najčešće upotrebljavanih metoda za određivanje antioksidacijske aktivnosti su;

DPPH (1 1-difenil-2-pikrilhidrazil)DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)

ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina)

ORAC (Oxygen radical absorbance capacity)ORAC (Oxygen radical absorbance capacity)

RP (Reducing power)

46

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST -- DPPHDPPHANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST DPPHDPPH

DPPH (1,1‐difenil‐2‐pikrilhidrazil)( )% / 100AA A A A⎡ ⎤= − ×⎣ ⎦λ max = 517 nm

IC50

( )0 0% / 100tAA A A A⎡ ⎤= ×⎣ ⎦

47

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST -- ABTSABTSANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST ABTSABTS

ABTS S

N

NH4+ + SO3

-

N NS SO3

- + NH4

+

(2,2'‐azino‐bis(3‐etilbenztiazolin‐6‐sulfonska kiselina)λ max = 743 nm

N

C2H5

N

H5C2

-e- +e

-

ABTS

max 

( )0 0% / 100tAA A A A⎡ ⎤= − ×⎣ ⎦

S

N

NH4+ + SO3

-

C H

N N

N

S SO3- + NH4

+

.+ABTS

( )⎣ ⎦ C2H5 H5C2

O

CH3

OH

CH3 CH3

COOH

CH3Trolox

S

N+

NH4+ + SO3

-

N N

N

S SO3- + NH4

+

CH3

O

COOH+

48

C2H5 H5C2H OCH3

CH3

CH3

.+ABTSH

49

Slijedeće predavanje;Slijedeće predavanje;

TERPENI

...50