Title3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA lyase（HMGCL）遺伝子におけるMLPA法を用いた新たな遺伝子診断法の確立( 本文(Fulltext) )

Author(s) 青山, 友佳

Report No.(DoctoralDegree) 博士(医科学) 連創博甲第29号

Issue Date 2015-09-30

Type 博士論文

Version ETD

URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/53645

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

の

1. HMG-CoA lyase とは

2. HMG-CoA lyase 欠損症について

3. MLPA について

4. ACAT1 遺伝子 における MLPA の とその

5. Uniparental disomy について

の

1. 症例

2. HMGCL 遺伝子の変異

3. MLPA ロ の

4. MLPA の

5. Long range PCR を いた欠 の

6. Comparative genomic hybridization (CGH) と

Single nucleotide polymorphism (SNP)

1. 患 と の遺伝子

2. MLPA を いた HMGCL 遺伝子の

3. 症例 1 についての欠 の

4. 症例 2 での CGH と SNP

謝

1

ケトン体は コ スが に で産生され、 外 に まれて

コ スの代 に となるため、血糖 に で る。ケト

ン体は血糖 が な乳幼児期に に な を ている。 染症や

な の 、 での脂肪酸のβ-酸化系が しケトン体を産生する。それ

が血 を して を 外 に れて コ スに代 る

として される。 性ケトン体代謝異常症はケトン体の産生障害と 障

害の2つに でき、産生系の異常は3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA (HMG-CoA)

lyase 欠損症、ミトコン ア HMG-CoA synthase 欠損症、 系の異常として

はβ-ケト T2 欠損症、 シ -CoA:3-ケト酸 CoA ト ンス

欠損症が る。 の異常では低ケトン性低血糖 をきたし、

の異常ではケトアシ シス をきたす。これ の が な には

に ること 、 したとして 障害をきたす 性が る。し し、

期の と な が れ な が でき、 常 が で

るため、これ 疾患の 期 は 変 で る。

には遺伝子 が で るが、な には 常の での

遺伝子 では変異が できない症例 する。そのような 、

ンを きな欠 や の 性が れる。 に れている変異

は、患 DNA を PCR で し、 ン にて イ トシ ン

スによる で るが、この を いた遺伝子 では、 のア に

ンを きな欠 や が して 、 う のア が 常で れ

PCR では 常なア が されて るため、欠 や を することが

2

できない。このように イ トシ ンス の欠 は、 できる変異は

の や bp の の や欠 けで 、 の欠 や は

できないことで る。

にケトン体代謝異常症において 1 ア の変異の されて、 う

のア の変異が にな ない患 はこれまでに している。こ

のこと 、遺伝子 の では きな欠 や を にするための

つ な が め れてきた。このような を とに、 は遺

伝子の や欠 を つ に できる たな遺伝子 として、

Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) に してきた。

この を いることで、 ンのコ の異常が にできる(1-4)。

はこれまでに T2 欠損症の 遺伝子 ACAT1 にて MLPA を いて欠

と の が で る を し、 のア での変異が されてい

な た患 の ン 3-4 の欠 を した(1)。ACAT1 遺伝子では、これま

でに Alu が する欠 や の報告がされている(5, 6)。このように、

Alu での による遺伝子の欠 は、い つ の遺伝子疾患に し

ていると れる(7)。

が国の HMG-CoA lyase 欠損症患 には、 ア の の変異が さ

れていない 2 症例が する。HMG-CoA lyase 欠損症は 生児 スス

ン の 1 疾患に されてお 、 症 の 期 と が め れる

疾患で る。そこで、本 はこの HMG-CoA lyase 欠損症の遺伝子 の

つとして本遺伝子の MLPA を し、遺伝子変異が できていないこの

2 症例に して、その となる変異を した。

3

本 は、 の を とに し

報 に した ので る。

Yuka Aoyama, Toshiyuki Yamamoto, Naomi Sakaguchi, Mika Ishige, Toju Tanaka, Tomoko Ichihara, Katsuaki Ohara, Hiroko Kouzan, Yasutomi Kinosada, Toshiyuki Fukao (2015) Application of Multiplex ligation-dependent probe amplification, and identification of a heterozygous Alu-associated deletion and a uniparental disomy of chromosome 1 in two patients with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency. International Journal of Molecular Medicine 35, 1554-1560.

4

の

1. HMG-CoA lyase とは

HMG-CoA lyase HMGCL; EC 4.1.3.4 は のミトコン アに する

で 、ロイシンの異化 および脂肪酸β-酸化系 の HMG-CoA をア

セト酢酸に代謝すること 、ロイシンの異化およびケトン体の産生に な

を たしている Fig. 1 。ケトン体は 外 の な とな

てお 、 に、乳幼児期の血糖 には で る。 染症な で 期の

や に る には脂肪酸β-酸化が してケトン体を産生し、

にて して血糖を している。このように、HMG-CoA lyase はケトン

体の産生の に 変 な を ている(8)。

本疾患の 遺伝子 HMGCL は染色体の 1p36.1 に し、この は 25kb

で (9)、9 つの ン され、イントロン には 23 の Alu が

まれる Fig. 2 。

5

6

Fig.2 HMG-CoA lyase 欠損症の 遺伝子 HMGCL と Alu

HMGCL 遺伝子の遺伝子 とイントロン の Alu を す。Alu の は

GenBank accession no. NG_013061 の を Repeat Masker http://www.repeatmasker.

org/cgi-bin/WEBRepeatMasker にて した。Alu は トの の で

い で 、 ト の 10 を める。

SINEs(short interspersed elements)の で る。この は 300 の さが

、 で る Alu I にて 識される を こと Alu と け れ

ている。Alu は に 異 に してお 、その 化の で されてきた。

い つ の ミ に れ、 い Alu は J と Sx、 しい のは Y と

して されている。この ミ は、さ に、い つ の い系 に され

る。HMGCL 遺伝子 の Alu は い 代に された Alu Sx、Alu Jb や

しい 代に された Alu Y が している。

7

2. HMG-CoA lyase 欠損症について

HMG-CoA lyase 欠損症は、常染色体劣性遺伝の形式をとる。本疾患では、ロ

イシン由来および脂肪酸β-酸化系由来の HMG-CoA をアセト酢酸へ代謝でき

ず、ケトン体の産生が障害される。そのため、乳幼児期に嘔吐や意識障害、痙

攣等を伴う低ケトン性低血糖を引き起こす。HMG-CoA lyase 欠損症は、これま

でに、さまざまな国にて 100 症例以上の報告がされている(10)。海外における

HMGCL 遺伝子のコモンな変異としては、ミスセンス変異の

c.122G A(p.R41 )(11)や ンセンス変異の c.109G T(p.E37 )(12)が る。 本

で これまでにい つ の症例が報告されてきたが(13, 14)、 のとこ 9 症

例が されている。この 9 症例では 本 に 異 なコモンな変異は 、

また、2 症例では の 酸 にて されている のの、遺伝子 では

のア での変異が されていな た Table 1 。本 では、この変異

を するため、HMGCL 遺伝子へ MLPA の を た。

＊

＊

＊

＊

8

3. MLPA について

MLPA は とする遺伝子の ンに して 異 に する ロ

を し、 イ シ ン イ で することで ンの欠

や を な として し、 れた ントの

ンのコ を に す で る。MLPA ロ は とする

ンに イ イ する の ロ で る。こ

の ロ は、 と の した 2 本の ロ で される。 ロ は

PCR イ 、 イ イ シ ンシ ンス、ス シ

ンスの つ つ。PCR イ は 5 と 3 のシ ンス

へ する め れた で る。 イ イ シ ンシ ンス

は とする ンの へ さ るため、 に を う で る。

ス シ ンスは ン との を すために に する

Fig. 3 。この 2 本の ロ が とする ンに イ イ された

に イ シ ンされ、 化した ロ の が になる。 ロ

の には の PCR イ が 、 識された イ を

いて PCR を うことで、 化された ロ の が れる。

それ れの ンに する ロ の は め異なる さに す

るため、 ンに の さの を ることが で る。

によ 、それ れの されるシ を て、

その ンのコ を に すことができる。ア

に欠 が れ ロ は 化されないため はされず、 が れ

ロ はその 化されるため PCR 産 する。MLPA

9

を いれ 、 ンのコ の異常を にすることが となる。

MLPA が遺伝子 に する としては、 とする に 化した ロ

の できる 異性、 産 の さの によ 1 の 系で

の での が れる 性、そして、2 で が し を

れる 性な が れる。MLPA で いる ロ は、すでに、さまざ

まな疾患の遺伝子に した ロ が されてお 、 に い れてい

る。代 な疾患としては シ ン ストロ が る(2, 3, 15)。

このような症例 が い疾患に しては MLPA ロ が されているため

に を い ができる。し し、 な疾患については の ロ

はないため、 に疾患遺伝子に する ロ を して MLPA を す

る が る Fig. 4 。

10

11

4. ACAT1 遺伝子 における MLPA の とその

Mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase (T2) EC 2.3.1.9 は におい

て、脂肪酸β-酸化 生 るアセトアセ CoA をアセ CoA に代謝して

外 にてケトン体を する と、イ ロイシンの 代謝に 。こ

のため、T2欠損症では 染 の や な でケトン体の産生が すると、

外 がケトン体を できないため血 に してアシ シスをきたす。

T2 欠損症は常染色体劣 遺伝の形式をとる。この疾患の 遺伝子で るACAT1

の は 27kb 、12 の ンにて されイントロンには 33 の Alu

を つ。これまでに報告されている ACAT1 遺伝子変異には、イントロン 1

と 4 に する Alu での による ン 2-4 を

モ 性の欠 や(6)、イントロン と 9 に する Alu での

による ン 8-9 を モ 性の (5)が報告されている。

このような ンの きな欠 や を するための として

ACAT1 遺伝子での MLPA の を た。ACAT1 遺伝子の 12 の ン

に して する MLPA ロ は、GenBank accession no. NG_009888 の

ンの を にして イ イ シ ンシ ンスを した。

イ を 、 常コントロ DNA、 ン 2-4 を モ 性

の欠 の患 DNA、 ン 8-9 を モ 性の の患 DNA、この 2

症例のDNAを 1:1で し ロ 性の欠 と を した ン を

し、それ れ MLPA を た。その 、 常コントロ のコ

は 2 コ とな にコ の できた。また、 ン 2-4 の モ

性の欠 ではコ は 0 コ に、 ン 8-9 の モ 性の では 4

12

コ とな 、それ れのコ が に できた。さ に、 ロ

性の欠 と を した ン では、 ン 2-4 のコ は 1 コ 、

ン 8-9 のコ は 3 コ とな た。 モ 体の と欠 および

ロ 性の欠 と の が とな 、ACAT1 遺伝子においての

MLPA が できた。さ にこの MLPA を いて、 イ トシ ン

スでは ACAT1 遺伝子の ン 7 に c. 602C>T (p.A201V)変異が のア

で されているが、 う のア での変異が されていない患 に

ついて を た。その の 、 ン 3 と 4 のコ は 1 コ

とな 、 ン 3-4 の欠 が れた。さ に Long range PCR を いて欠

の の を たとこ 、イントロン 2 と 4 の Alu での

で ることが にな た(1)。ACAT1 遺伝子において し

た MLPA にて、 イ トシ ンス では が な ロ 性の

ンの欠 を にできた。

はこの T2 欠損症に する MLPA の と ロ 性の ン

3-4 の欠 およびその の の ロ トに 、 の の

に する の 、 の に 変 た。

13

5. Uniparental disomy について

本 ではUniparental disomyによ 引き起こされるHMG-CoA lyase 欠損

症が にな た。Uniparental disomy の 生 について する。

1 のア の 2 本と が の 由来する を Uniparental disomy

と う。 由来する のは Maternal uniparental disomy、 の

のを Paternal uniparental disomy と される。Uniparental disomy には、さ

にUniparental heterodisomyとUniparental isodisomyの 2 つの イ が

る。Uniparental heterodisomy は 1 の 染色体は の 1 の染色体

本 には 性で るが、Uniparental isodisomy は の の染色体の

2 化によ て てお 、その染色体に異常が すると モ とな 、

常染色体劣性遺伝性疾患が 症する 性が で る。 トにおいて

Uniparental disomy は染色体 よ て引き起こされる。 れる な

には gamete complementation、 trisomy rescue、monosomy duplication、

somatic crossing over な が る(16, 17)。gamete complementation は、

2 本の染色体を つ 子と nullsomy の 子との 体によ 生 る。

trisomy rescue は染色体 によ の の染色体を 2 本 け 、

には 3 本の染色体が するが、その の で な染色体

が する。 の 2 本の染色体の が すれ 常となるが、2 本

に た には Uniparental disomy を引き起こす。monosomy duplication

は染色体 によ 由来の染色体を たず、 う の に由来する染

色体が の で され、 2 本のア を つ となる。

somatic crossing over は 染色体に変異が た に、その を し

14

て変異の る 染色体の が な 、 な isodisomyとして れる Fig.

5 。このように、Uniparental disomy の 症 は で る。

Fig.5 Uniparental disomy の 生

Uniparental disomy の 生 について す。 の染色体を 色および 色にて

し、 色は 2 つのア を して色を し変 て る。染色体の の 色

で した 色の インは変異を す。 常に染色体が される には、 ずつの

子が 体とな 体 を形 する。gamete complementation では、 2

の によ 生 た 2本の染色体が する 子と nullsomy の 子との 体

によ uniparental heterodisomy を生 る。trisomy rescue では 2 の に

染色体 によ の 2 本の染色体を け 、 にはト ミ の 体

となるが、その 、 の で な染色体が れる。2 本を け い

の 2 本の染色体の が れれ uniparental disomy にはな ないが、1 本

を け い 染色体が れるとuniparental heterodisomyを引き起こす。monosomy

duplication は 2 の染色体 による nullsomy の 子と 常な 体

の で生 、resucue のため 1 本の染色体が の で されて 染

色体を つ uniparental isodisomy となる。somatic crossing over は の体 に

おける 染色体の と の に生 る。この は な isodisomy として

れる。

15

の

本での HMG-CoA lyase 欠損症はこれまでに 9 症例の報告が るが、う 2

症例は の 酸 にて されている のの、遺伝子 では のア

での変異が されていない。本 では、この変異を にするため、

また の 症例の遺伝子変異 のためにHMGCL遺伝子へのMLPA を

し、この 2 症例の遺伝子 を た。

16

1. 症例

症例 1

13 児、血 ではない 生まれた。生 2 に低ケトン性

低血糖症をきたした。また、6、8、13 の で を生 、13

に 酸 にて 3-methylglutaconate 、3-hydroxymethylglutarate、

3-hydroxy-3-methylglutarate が され、HMG-CoA lyase 欠損症と

された。患 は 、て や を している。遺伝子 では

ン に c. 31C>T (p.R11 )が されたが、 う のア の変異が

されていな た。

症例 2

8 児、 は血 ではない。 は生 3 、上 を起

こし嘔吐と意識障害が生 た。 酸 と血 アシ ン によ

HMG-CoA lyase 欠損症と された。 は 4 で 、その

10 以上の低ケトン性低血糖 を生 た。 、 常に している。遺伝

子 では ン 3 に c. 242G>A (p.W81 )が モ 体のように され

たが、 はこの変異を てお ず、 由来のア の変異が されて

いないと れた(13)。

17

2. HMGCL 遺伝子の変異

本 の遺伝子 は 等 の を て した。

変異 に いる DNA は 血 、Sepa Gene Kit (Sanko Junyaku Co.,

Ltd., Tokyo, Japan)によ を た。変異の は、 ンとイントロ

ンの を を する 5’ と 3’ の イ セ ト Table 2 を

いて し、PCR および イ トシ ンス を いて を た。

Tabl

e 2.

Am

plifi

catio

n pr

imer

for H

MG

CL

exon

s.

Exon

Fo

war

d

prim

er

Sequ

ence

Rev

erse

prim

er

Sequ

ence

Pr

oduc

t siz

e

(bp)

1 H

L1s

5'-G

TGG

AG

CC

AG

CTT

CG

GA

AG

T-3'

H

L1as

5'

-GG

GA

GG

GTC

CA

GG

AC

TCC

AA

CG

-3'

324

2 H

L2s

5'-A

TGA

ATT

CG

GTC

TCC

CTG

GG

AA

TTG

-3'

HL2

as

5'-T

AA

CTT

GTG

CA

GA

GG

AA

TCA

CA

TC-3

' 27

5

3 H

L3s

5'-A

TGA

ATT

CTG

CA

TTTT

GA

GG

CTG

TTT-

3'

HL3

as

5'-T

TTG

CTG

CA

AC

AC

AG

TGC

TATG

-3'

325

4 H

L4s

5'-A

TGA

ATT

CC

TGC

TCTT

GG

TGA

TGA

CT-

3'

HL4

as

5'-G

ATC

AC

AG

AG

CA

GTG

AG

TGG

CA

-3'

314

5 H

L5s

5'-G

AA

CC

CA

GG

AG

GTG

GA

GG

TTG

CA

-3'

HL5

a

5'-A

TAA

GC

TTG

AA

CG

GTA

CA

GA

GG

AA

AG

GA

-3'

329

6 H

L6s

5'-C

TGG

CA

CTG

AA

TTG

TAC

CA

T-3'

H

L6as

5'

-GG

GTG

AA

TGA

ATG

AA

GTC

AG

GA

-3'

336

7 H

L7s

5'-A

AC

TGA

GTG

CG

TCA

TAC

CC

AG

A-3

' H

L7as

5'

-CA

GA

GC

TGTA

CA

CTT

CA

CA

TCTG

-3'

473

8 H

L8s

5'-A

TGA

ATT

CG

GC

AA

CA

GA

CG

ATT

GG

G-3

' H

L8as

5'

-GA

GC

CA

CTG

CG

CC

TGG

CTA

AC

C-3

' 36

6

9 H

L9s

5'-C

CTG

GTG

TTG

AG

GG

CA

TAC

C-3

' H

L9as

5'

-TG

CC

AG

GA

GA

GA

CC

TCTG

TGTA

-3'

300

19

3. MLPA ロ の

MLPA ロ の イ イ シ ンシ ンスに いるHMGCL遺伝

子 9 つの ンの には、NCBI イトのReference Sequence: NG_013061

を いた。この を に、 トで る Human MLPA probe design

program(18)を いて ロ の を た。 ンに するこの MLPA

ロ は、4 の をつけて 104 136 の異なる さに して

した Table 3 。

Tabl

e 3.

MLP

A p

robe

s for

HM

GC

L ge

ne.

Exon

Prod

uct

leng

th

(bas

e)

P

rimer

nam

e Le

ngth

Pr

obe

sequ

ence

1 10

4 M

LPA

-HM

GC

LEX

1L

50

GG

GTT

CC

CTA

AG

GG

TTG

GA

5016

TGG

ACTG

CC

GC

GG

GG

GAT

TCTG

GG

CC

AAG

AT

MLP

A-H

MG

CLE

X1R

54

50

47G

GC

AGC

AATG

AGG

AAG

GC

GC

TTC

CG

CG

GC

GAT

CTA

GA

TTG

GA

TCTT

GC

TGG

CA

C

2 10

8 M

LPA

-HM

GC

LEX

2L

52

GG

GTT

CC

CTA

AG

GG

TTG

GA

9872

CAC

CTC

ATC

TATG

GG

CAC

TTTA

CC

AAAG

CG

GG

T

MLP

A-H

MG

CLE

X2R

56

99

05G

AAAA

TTG

TGG

AAG

TTG

GTC

CC

CG

AGAT

GG

ACTT

CTA

GA

TTG

GA

TCTT

GC

TGG

CA

C

3 11

2 M

LPA

-HM

GC

LEX

3L

54

GG

GTT

CC

CTA

AG

GG

TTG

GA

1292

5 GAA

GC

AGG

ACTC

TCTG

TTAT

AGAA

ACC

ACC

AGC

TT

MLP

A-H

MG

CLE

X3R

58

12

960 TG

TGTC

TCC

TAAG

TGG

GTT

CC

CC

AGG

TGAG

CC

CTA

TCTA

GA

TTG

GA

TCTT

GC

TGG

CA

C

4 11

6 M

LPA

-HM

GC

LEX

4L

56

GG

GTT

CC

CTA

AG

GG

TTG

GA

1373

0 TTC

CTG

GC

ATC

AAC

TAC

CC

AGTC

CTG

ACC

CC

AAAT

TT

MLP

A-H

MG

CLE

X4R

60

13

767 G

AAAG

GC

TTC

GAG

GC

AGC

GG

TAAG

AGG

ATAG

CTT

GTT

TCTA

GA

TTG

GA

TCTT

GC

TGG

CA

C

5 12

0 M

LPA

-HM

GC

LEX

5L

58

GG

GTT

CC

CTA

AG

GG

TTG

GA

1619

3 TTG

TTC

CAT

AGAG

GAG

AGTT

TTC

AGAG

GTT

TGAC

GC

AAT

MLP

A-H

MG

CLE

X5R

62

16

232 C

CTG

AAG

GC

AGC

GC

AGTC

AGC

CAA

TATT

TCTG

TGC

GG

GG

TCTA

GA

TTG

GA

TCTT

GC

TGG

CA

C

6 12

4 M

LPA

-HM

GC

LEX

6L

60

GG

GTT

CC

CTA

AG

GG

TTG

GA

1963

6 TCAT

TCC

TCC

CC

TGTC

TTC

CC

ACAG

GTA

CG

TCTC

CTG

TGC

T

MLP

A-H

MG

CLE

X6R

64

19

677 C

TTG

GC

TGC

CC

TTAT

GAA

GG

GAA

GAT

CTC

CC

CAG

CTA

AAG

TTC

TAG

ATT

GG

ATC

TTG

CTG

GC

AC

7 12

8 M

LPA

-HM

GC

LEX

7L

62

GG

GTT

CC

CTA

AG

GG

TTG

GA

2215

2 TAC

TCAA

TGG

GC

TGC

TAC

GAG

ATC

TCC

CTG

GG

GG

ACAC

CAT

TG

MLP

A-H

MG

CLE

X7R

66

22

195 G

TGTG

GG

CAC

CC

CAG

GG

ATC

ATG

AAAG

ACAT

GC

TATC

TGC

TGTT

CTA

GA

TTG

GA

TCTT

GC

TGG

CA

C

8 13

2 M

LPA

-HM

GC

LEX

8L

64

GG

GTT

CC

CTA

AG

GG

TTG

GA

2593

0 TCTA

GAT

GG

GAG

TGAG

TGTC

GTG

GAC

TCTT

CTG

TGG

CAG

GAC

TTG

MLP

A-H

MG

CLE

X8R

68

25

975 G

AGG

CTG

TCC

CTA

CG

CAC

AGG

GG

GC

ATC

AGG

AAAC

TTG

GC

CAC

AGTC

TAG

ATT

GG

ATC

TTG

CTG

GC

AC

9 13

6 M

LPA

-HM

GC

LEX

9L

66

GG

GTT

CC

CTA

AG

GG

TTG

GA

2797

5 CTC

AGG

CTA

CC

TGTA

AAC

TCTG

AGC

CC

CTT

GC

CC

ACC

TGAA

GC

CC

TG

MLP

A-H

MG

CLE

X9R

70

28

022 G

GG

ATG

ATG

TGG

AAAT

AGG

GG

CAC

ACAC

AGAT

GAT

TCAT

GG

ATG

GG

GTC

TAG

ATT

GG

ATC

TTG

CTG

GC

AC

Left

prim

er se

quen

ce (5

'-3'),

GG

GTT

CC

CTA

AG

GG

TTG

GA

; Rig

ht p

rimer

sequ

ence

(5'-3

'),

TCTA

GA

TTG

GA

TCTT

GC

TGG

CA

C;

Hyb

ridiz

atio

n se

quen

ces a

re sh

own

in it

alic

s.

21

4. MLPA の

MLPA の は MRC-Holland の MRC-Holland BV, Amsterdam,

The Netherlands に いて した。 スト ン は患 DNA、

ンス ン にはHMGCL遺伝子に異常のない 常 DNAを 3 体 いた。

変性

DNA は TE にて し 20ng/ l とした。これを 96well トへ 5 l

ずつ した。 トを イ にセ トし98 5 にてDNA

変性を た。 、 イ が 25 にな たことを して、

トを した。

イ イ シ ン

HMGCL 遺伝子へ した ロ と P200-A1 ロ を probe mix

と SALSA MLPA buffer の 1.5 l の を、変性さ た DNA l に し

3 l した。 イ に トをセ トし、95 1 の 変

性の 、60 16-20 で イ イ シ ンを た。

イ シ ン

イ シ ンミ スは 1 ン た Ligase Buffer A および B を 3

l、Ligase-65 を 1 l、 25 l にて 、 上にて した。 イ

イ シ ン ロ を し、 トはセ トしたまま イ

を 54 に た。 イ 上で イ シ ンミ スを

22

well へ 32 l ずつ ン によ した 、54 15 の

イ シ ン を た。 、98 5 の 20 にて 、

イ した。

PCR:

Polymerase mix は 1well た SALSA PCR Primer Mix 2 l、SALSA

Polymerase 0.5 l、 を 7.5 l の とし、 は 上にて した。

イ シ ン産 の た well に Polymerase mix 10 l を

ン によ した。 トを イ にセ トして PCR を

た。PCR は 95 30 、60 30 、72 1 を 35 イ い、72

20 の 、15 にて た。

Hi-Di Formamide mix はHi-Di Formamide 9 l、Gene Scan-500 Size Standard

0.3 l で 1 た 9.3 l を した 、PCR 産 を 0.7 l て

した。86 で 2 イン ト 、 して シ

ス ABI 3130xl (Applied Biosystems, Warrington, UK)にて を い、

した ンに する DNA を した。

ント

Gene Mapper V.4.0 にて ント を た。 ンの

が す が ンのコ を する。さ に、これ の

23

を Excel 2003 にて した。HMGCL ロ と P200-A1 ロ

を とに した は、P200-A1 ロ での に する HMGCL

ロ の の を め 化した。さ に、 ロ につい

て スト ン 患 DNA と ンス ン 常 DNA の

を し、 シ を し ン の 化を い、コ

を た。

5. Long range PCR を いた欠 の

症例 1 は、イントロン 1 と 4 の にて欠 が れたため、3 つの イ

アを して の を た。 ント A は、センス

イ にはイントロン 1 の g.6421-6445 に した In1s1 とアン センス

イ には ン 5 の g.16255-16231 に した Ex5as を いて し

た。 ント B は、センス イ にはイントロン 1 の g.8701-8725

に した In1s3 とアン センス イ には Ex5as を いて した。

ント C は、センス イ には In1s3 とアン センス イ は

イントロン 4 の g.15110-15088 に し した Table 4 。 イ

に いた HMGCL 遺伝子の は GenBank accession no. NG_013061 に

き した。

PCR の は、94 1 、64 2 、72 2 の に 40 イ い、

イ 75 5 にて さ た。PCR には Takara PCR thermal

cycler と には Takara r-Taq (Takara Shuzo Co., Ltd., Shiga, Japan)を

い、 ロ ン には pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, WI,

24

USA)

6. Comparative genomic hybridization (CGH) Single nucleotide

polymorphism (SNP)

2 Agilent SurePrint G3

Hmm CGH + SNP 180K Microarray Kit Agilent Technologies, Santa Clara, CA,

USA DNA

Feature Extraction version 9 (Agilent Technologies)

Agilent Genomic Workbench version 6.5 (Agilent Technologies)

Table 4. Amplification primer of deletion breakpoint characterization.

Fragment Primer Sequence Position

A In1s1 5'-ACGA ACGGTGGTA A AGAGGCA ACAG-3' g.6421-6445

Ex5as 5'-TTGGCTGACTGCGCTGCCTTCAGGA-3' g.16255-16231

B In1s3 5'-GTGATGATTCCAGGAGGTCAGA GGA-3' g.8701-8725

Ex5as 5'-TTGGCTGACTGCGCTGCCTTCAGGA-3' g.16255-16231

C In1s3 5'-GTGATGATTCCAGGAGGTCAGA GGA-3' g.8701-8725

In4as1 5'-GAGAGGCATAGGACAGA TTCTCC-3' g.15110-15088

25

1. 患 と の遺伝子

症例 1 は ン に c. 31C>T (p.R11 )の ロ 性の変異を した。

し し、 に した は 変異を てお ず、 のア での変

異は にな な た(Fig. 6)。また、 の DNA は が で

変異の はできな た。症例 では のア に、 ン 1 を

な欠 を つ 性が れた。

*

26

症例 2 では ン 3 に c. 242G>A (p.W81 )が モ 性のように さ

れた。し し では、 は p.W81 の ロ 性に変異が したが、

には p.W81 の変異が しな た(Fig. 7)。このこと 、症例 2 につ

いては 由来のア での ン 3 を 欠 を た。

*

27

2. MLPA を いた HMGCL 遺伝子の

HMGCL 遺伝子への MLPA は、9 つの ンでのコ が でき

できた。3 つのコントロ てにおいて、 ンに の ン

が れたこと 、患 とその でのコ が とな た。

症例 1 と の では、 ン 2-4 のコ が 1 コ を した。その

の ンのコ は 2 コ で た。このこと 、 け

い ア に ン 2-4 を きな欠 が された。

症例 2 の にて、患 は p.W81 モ、 が p.W81 へ ロ、 が

常と の遺伝形式が ないこと 、 由来の遺伝子 の欠 を い

MLPA を た 、その変異を ン 3 の な ず、 ての

ンのコ は患 と と に 2 コ で 、 で た。この

を するには、この患 の HMGCL 遺伝子 が Paternal uniparental

disomy で る 性を た Fig. 8 。

28

29

3. 症例 1 についての欠 の

症例 1 の DNA を いた Long range PCR は、その ント

4kb の欠 が にな た Fig. 9A 。さ に、シ ンスの

は、この欠 は g.9326 g.13806 ( NG_013061) の に し、4481

bp に な欠 で ることが した。また、この欠 の はイン

トロン 1 の Alu の を 、 う はイントロン 4 の Alu が

しない で ることが できた Fig. 9B 。

30

A

6.2 kb4.2 kb3.4 kb2.6 kb

Size marker

Frag

men

t A

Frag

men

t B

Frag

men

t C

Patient 1

31

4. 症例 2 での CGH と SNP

HMGCL のコ と SNP ロ イ を にするために、CGH

SNP ア イを いた イ ロア イ を た。ア イ CGH は、

のコ を す。1 染色体の Log2 は 0 を し、コントロ と コ

に異常はな た。SNP は で されないア の を して

いる。 は、 てで 0 2を しLoss of heterozygosity (LOH)を した。

2 つの 、CGH ア イでは HMGCL 遺伝子 を 1 染色体のコ

には異常はな たが、SNP では HMGCL の する 染色体

てにおいて LOH で た Fig. 10 。このこと 、この患 は 1 染色体

の Paternal uniparental isodisomy で ることが にな た。

32

33

本の HMGCL 欠損症 2 症例について、 ン シ ンスを いた遺伝

子 では、それ れの患 に変異を したが、さ に した の

ではその変異の遺伝形式が の で していな た。

トの HMGCL 遺伝子 は 25kb のな に 23 の Alu を する遺

伝子で る。そこで、 はこの 2 つの症例の変異は Alu での

によ 引き起こされる ロ 体の欠 で るとの を てた。

これ の変異を するためには、HMGCL 遺伝子の ンのコ を

る が た。このこと 、本 ではHMGCL遺伝子においてMLPA

を いた たな の を た。

症例 1 は、 の p.R11 変異を け いでいたが、 け い

変異は ン シ ンスでは できな た。MLPA を いた症例

と の では ン 2-4 のコ が 1 コ で 、 した 欠

が にな た。し し、この の欠 は Alu による

によ 引き起こされる欠 ではな た。欠 の はイント

ロン 1 に る Alu Sx で 、 う はイントロン 4 の Alu は し

ない で た。この の には はな 、この欠 を引き起

こす は にはな な た。

症例 2 では p.W81 モ 性の変異に たが、 は p.W81 ロ 性

の変異で たが、 はこの変異が め れな た。この は

の遺伝形式が ず、患 の変異は けの上での p.W81 モ 性

の変異で ると れ、この変異を するために MLPA を いてコ

34

の を た。し し、MLPA では、患 、 、 に HMGCL 遺

伝子の ンのコ は 常で ることが にな た。PCR と MLPA

の 、この患 は HMGCL 遺伝子 が のア を 2 つ つ

Uniparental disomy ではない と たな を てた。この変異を するため

CGH+SNP ア イ を たとこ 、この患 は HMGL 遺伝子 の で

な 、1 染色体 体の Paternal uniparental isodisomy で ることが

にな た。

本症例で生 た 1 染色体の 2 コ の 症 は monosomy duplication が

れる。これは、 2 の に生 た の染色体 によ

nullsomy の 子が生 、 の異常遺伝子を つ 子と することで の

遺伝子の monosomy とな 、さ に体 の monosomy rescue によ

由来の 染色体が 2 化することによ て起きたと れる。 染

色体の または 体の Uniparental disomy によ 生 る疾患に、 症

(19)、 欠損症(20)、Pelizaeus-Merzbacher-like (21)、Stargardt

(22)、 ン 体欠損症(23)、Rhizomelic chondrodysplasia punctata type

2(24)、CD45 deficient severe combined immunodeficiency(25)な の報告が

、1 染色体が する Uniparental disomy は、その によ て引き起

される疾患が き 異な ている。

本 では、HMGCL 遺伝子の PCR 、MLPA 、CGH+SNP ア イの

、症例 2 が の 1 染色体 体の で ることを にした。

の る 、本 での症例は Uniparental disomy によ 引き起される HMGCL

欠損症の めての報告で る。

35

本 にて HMGCL 遺伝子へ した MLPA は、 常の遺伝子 では

めて が な ロ 体の遺伝子変異の識 ができ、さ なる遺伝子

の 上に がることを した。また、MLPA は CGH のように

体を できる ではないが、 の遺伝子の ンのコ を

でき、 ンを 欠 、 の に つことが にな た。

、 し される患 での遺伝子 を にする の つとなるで

う。

36

謝

本 の および の に た 、 いた きました

報 に よ 謝いたします。

けでな としての まで ていた けたことを、 の

にてし していきたいと てお ます。

本 および の 等、 に た いた きました

系 児 に 謝いたします。

では し いつ たた い を て いた きました。 識や

は のこと、 することの さや に る としての

な 生 ことはとて 、 とて できたと てお

ます。

また、本 の に し、 および を ました

報 、 、

に 謝いたします。

本 を めるに た いた いた患 さ と 、 を さ

れて る の 生 、 を いた き イ ロア イ に

て Uniparental disomy という を いて さいました 子

本 に お し上 ます。

37

遺伝子 において 系 児 の

さ 、 の さまには 変お にな ました。 の に

た な で けていた きました。 よ お し上 ます。

この をお して、 の を に けて れた と の

そして の 生 を して れた と 2 の 、 と

に 謝の意を したいと います。

本 が 代謝異常症の患 さ とその への の となること

を い謝 といたします。

38

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その の

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