260110140121_RANIA ADRIEZA_3

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3

http://slidepdf.com/reader/full/260110140121rania-adrieza3 1/18

PENETAPAN KADAR ZAT AKTIF DALAM SEDIAAN TABLET

ASETOSAL MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI (KCKT)

Rania Adrieza

Fakultas Farmasi, Universitas Padjajaran, Jatinangor, Jawa Barat, Indonesia

Abstrak

Asetosal merupakan senyawa yang memiliki sifat analgesik, antipiretik,

dan antiinflamasi ketika digunakan dalam dosis yang tinggi (500-1000 mg/hari).

Tujuan penelitian ini adalah menentukan kadar asetosal dalam tablet asetosal

untuk memastikan mutu dari setiap sediaan yang dihasilkan. Tablet asetosal

dianalisis dengan menggunakan instrumen KCKT, yang mana prinsip kerja

KCKT berdasarkan dengan kepolaran pada fase diam dan fase gerak, dimana

senyawa akan terpisah sesuai dengan tingkat kepolarannya. Dari hasil optimasi

metode, fase gerak yang digunakan yaitu metanol : air ( 30:70 ) pH 2.98 dan fase

diamnya yaitu kolom C18. Kecepatan laju alir 0.75 mL/menit dengan volume

injeksi ±10µL dan dianalisis pada panjang gelombang 275 nm dengan detektor

UV-Vis. Instrumen KCKT divalidasi dengan menghitung jumlah plat teoritis,

tinggi plat, LOQ, LOD, resolusi, standar deviasi AUC dan waktu retensi. Kadar

asetosal yang didapatkan yaitu sebesar 161,9%, dimana kadar ini tidak sesuaidengan persyaratan kadar dari Farmakope Indonesia.

Kata Kunci: asetosal, KCKT, fase gerak, kadar, tablet

Abstract

Acetosal is a compound that has analgesic, antipyretic and anti inflammation properties

when used in a high dose (500-1000 mg/day). The purpose of this research is to

determine acetocal level in acetosal tablet to ensure the quality of each tablets

produced. Acetocal tablets were analyzed using HPLC, which principle is based on the

polarity of the stationary phase and a mobile phase, where the compound will be

separated in accordance with the level of polarity. From the result of method which is

optimized, mobile phase used is methanol: water ( 30: 70 ) pH 2.98 and stationary phase

is column C18. Speed flow rate of 0.75 mL / min, with ± 10μL injection volume and

analyzed at a wavelength of 275 nm with UV-Vis detector. The HPLC been validated by

counting the number of theoretical plate , high plate ,LOQ , LOD, resolution , deviation

standart and retention time. Asetosal levels obtained is 161,9%.

Keywords: acetocal, HPLC, mobile phase, level, tablets

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


Pendahuluan

Asam asetilsalisilat adalah

obat yang berguna untuk analgesik,

antipiretik dan antiinflamasi (Kousar

et al., 2004). Sediaan asam

asetilsalisilat yang umumnya berupa

sediaan tablet telah banyak

digunakan oleh para produsen obat

dengan beberapa jenis sediaan,

bahkan dapat digunakan sebagai anti

platelet dengan mekanisme

penghambatan terhadap agregrasi

platelet (Pulcinelli et al., 2004).

High performance liquid

chromatography ( HPLC ) atau yang

sering disebut kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis

kromatografi yang penggunaannya

paling luas. Kegunaan umum HPLC

adalah untuk pemisahan dan

pemurnian senyawa obat serta untuk

analisis kuantitatif senyawa obat

dalam sediaan farmasetika.

Disamping itu, HPLC juga

digunakan untuk identifikasi

kualitatif senyawa obat berdasarkan

pada parameter waktu retensi

senyawa obat standar serta senyawa

obat dalam sampel (Gandjar dan

Rohman, 2012).

HPLC yang modern telah

mucul akibat pertemuan dari

kebutuhan, keinginan manusia untuk

meminimalis pekerjaan, kemampuan

teknologi, dan teori untuk memandu

pengembangan pada jalur yang

rasional. Jelas sebelum era peralatan

yang modern bahwa LC ( Liquid

Chromatography) memiliki kekuatan

pemisahan yang sangat ampuh,

bahkan untuk komponen-komponen

yang berhubungan sangat erat. LC

harus ditingkatkan kecepatannya,

diotomasasi, dan harus disesuaikan

dengan sampel-sampel yang lebih

kecil, waktu elusi yang beberapa jam

(Day & Underwood, 2002)

Dengan beberapa

karakteristik yang dimiliki asetosal

maka perlu adanya suatu

pengawasan mutu, seperti penetapan

kadar tablet asetosal menggunakan

salah satu metode yang umum yaitu

dengan instrumen KCKT. Penetapan

kadar ini dimaksudkan agar

ketepatan dosis pada tablet asetosal

tetap terjaga.

Metode

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


Alat-alat yang digunakan

dalam percobaan ini antara lain

batang pengaduk, beaker glass, gelas

ukur, injektor, kromatografi cair

kinerja tinggi, labu ukur, milipore,

mikro-pipet, neraca analitik,

perkamen, pipet volume dan bulb,

pipet tetes, spatel, sentrifuger, vial.

Bahan yang digunakan dalam

percobaan ini adalah akuades, asam

asetat glasial, asetosal baku, asetosal

sampel, dan metanol.

Pembuatan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan

adalah metanol dan aquabidest yangmengandung 1 % asam asetat dengan

perbandingan 30:70. Pembuatan

aquabidest yang mengandung 1 %

asam asetat yaitu sebanyak 10 mL

asam asetat glasial dimasukkan

kedalam labu ukur 1000 mL

kemudian ditambahkan aquabidest

hingga tanda batas. Larutan tersebut

kemudian disaring menggunakan

milipor e 0.45 µm, dengan bantuan

vakum. Selanjutnya disonikasi

dengan ultrasonic bath selama 15-20

menit.

Pembuatan Larutan Pengencer

Dibuat campuran methanol-

air = 50:50.

Pembuatan Larutan Baku

Asetosal baku pertama-tama

ditimbang sebanyak 5 mg. Kemudian

asetosal dilarutkan dalam 10 mL

larutan pengecer sehingga

didapatkan konsentrasi 500 ppm

yang dapat digunakan dengan

diencerkan kembali menjadi 10 ppm

untuk laju alir 1 mL/menit dan 20

ppm untuk laju alir 0.75 mL/menit.

Optimasi KCKT

Larutan baku dengan

konsentrasi 10 ppm (laju alir 1

mL/menit) dan 20 ppm (laju alir 0.75

mL/menit) diinjeksikan kedalam

KCKT dengan perbandingan fase

gerak yang telah ditentukan.

Parameter kondisi dihitung meliputi:

jumlah plat teoritis, tinggi plat,

resolusi, dan standar deviasi AUC

dan waktu retensi.

Pembuatan Kurva Baku

Larutan baku dibuat dengan

cara mengencerkan larutan baku 100

ppm ke dalam 6 variasi konsentrasi,

yaitu pada 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm,

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


30 ppm, 40 ppm, dan 50 ppm.

Kemudian masing-masing

konsentrasi baku diinjeksikan ke

dalam kromatografi cair kinerja

tinggi dengan perbandingan fase

gerak metanol : air ; 30 : 70 , dengan

pH 2,98, dan laju alir 0,75 mL/menit.

Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali

kemudian dibuat ke dalam

persamaan garis terhadap konsentrasi

AUC

Penetapan Kadar LOD dan LOQ

Dihitung dengan

menggunakan persamaan:

LOQ = 10

LOD = 3

Pembuatan Larutan Uji

Diambil 20 tablet asetosal

yang akan diuji kadarnya, kemudiang

ditimbang dan digerus dengan mortir

dan stamper hingga menjadi serbuk

halus. Setelah itu, timbang saksama

sejumlah serbuk setara dengan ±100

mg asetosal dan masukkan ke dalam

wadah yang sesuai. Setelah itu

ditambahkan dengan 20 mL larutan

pengencer dan dikocok kuat dengan

sonikasi selama kurang dari 10

menit. Larutan yang dihasilkan

disentifugasi dan filtrat diencerkan

kembali dalam 9 volume larutan

pengencer menjadi konsentrasi 40

ppm. Larutan disaring dengan

menggunakan milipore.

Penetapan Kadar Asetosal

Disuntikkan secara terpisah

masing-masing ±10µL larutan baku

dan larutan uji ke dalam

kromatografi, kemudian ukur respon

dari puncak utama yang dihasilkan

pada kromatogram. Masukkan nilai

AUC yang didapat dalam persamaan

kurva baku dan hitung konsentrasi

yang didapatkan.

Hasil

Dari metode penentuan kadar asetosal dengan metode KCKT didapatkan hasil

sebagai berikut:

Tabel 1. Hasil Optimasi Fase Gerak

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


Tabel 3. Berat 20 Tablet Asetosal

No Berat No Berat No Berat No Berat

1 0,2756 6 0,2666 11 0,2809 16 0,2866

2 0,2759 7 0,2518 12 0,2619 17 0,2615

3 0,2738 8 0,2693 13 0,2721 18 0,2763

4 0,2722 9 0,2809 14 0,2612 19 0,2874

5 0,2888 10 0,2617 15 0,2802 20 0,2615

Data Sampel

Tabel 4. Hasil Pengukuran Kadar

Injeksi ke- AUC Retensi Kadar (ppm)

1 2,3451 10,0170 46,7736

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


2 3,7023 10,0800 70,584

Rata-Rata 3,0237 10,0485 58,6788

% Rata-rata kadar asetosal = 161,9%

Pembahasan

Tujuan percobaan kali ini

yaitu menentukan kadar sampel

dengan menggunakan instrumen

KCKT. Sampel yang digunakan

yaitu tablet asetosal. Asetosal

merupakan senyawa obat yang

memiliki sifat analgesik, antipiretik,

dan antiinflamasi, dimana telah

digunakan secara luas di masyarakat.Dengan itu, perlu dilakukan

penetapan kadar dari sampel tablet

asetosal itu sendiri.

Sebelum dilakukan penetapan

kadar, dilakukan optimasi fase gerak

(methanol:air) dengan 10 kondisi

(Metanol:air (30:70) dengan laju alir

1 mL / menit; Metanol:air (30:70)

dengan laju alir 0.75 mL / menit;

Metanol:air (25:75) dengan laju alir







1mL / menit; Metanol:air (33:67)



1 mL / menit; dan metanol:air

(35:65) dengan laju alir 0.75 mL /

menit) dan validasi terhadap

instrumen KCKT terlebih dahulu.

Fase gerak merupakan campuran

pelarut yang dapat bercampur

keseluruhan berperan dalam daya

elusi dan resolusi. Daya elusi dan

resolusi ini ditentukan oleh polaritas

keseluruhan pelarut, pelarut fase

diam, dan sifat komponen-komponen

sampel. Optimasi metode KCKT

diawali dengan pemililhan fase diam,

dimana fase diam yang dipilih

merupakan kolom C18 karena

sampel yang dan fase gerak yang

sifatnya polar sehingga dipilihlah

kolom yang bersifat non-polar.

Selanjutnya, dilakukan optimasi

terhadap fase gerak berdasarkan

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


kesesuaiannya terhadap parameter-

parameter yang ada. Parameter

kondisi yang dihitung meliputi

jumlah plat teoritis (N), tinggi plat

(H), LOQ, LOD, nilai resolusi,

%SRD dan waktu retensi (Rt).

Fase gerak yang umumnya

digunakan yaitu asetonitril dan dapar

fosfat, namun penggantian fase gerak

menjadi methanol dan air pada

percobaan ini didasarkan karena

beberapa hal. Dapar fosfat tidak

dipilih karena memberikan hasil

yang tidak stabil, dimana dapar

fosfat cenderung menyebabkan

pengkristalan di sekitar pompaKCKT sehingga tekanan alat

cenderung meningkat dan

menghasilkan hasil kromatogram

yang kurang baik. Metanol dipilih

menggantikan asetonitril karena

memiliki kepolaran yang hampir

sama.

Setelah dioptimasi, fase gerak

yang dipilih yaitu dengan kondisi

perbandingan metanol:air (30:70)

dan laju air 0,75 ml/menit. Fase

gerak dengan kondisi ini yang paling

mendekati dengan parameter-

parameter yang telah disebutkan di

atas. Dimana N > 2500; Tf = 1; k’ =

1-10; Rt = yang paling singkat;

%RSD < 2% (Meyer 2004; Gandjar

dan Rohman, 2007). Pertama, nilai

resolusi sebesar 1,007 yang mana

merupakan nilai resolusi tertinggi

dari semua kondisi yang

diujicobakan, nilai ini juga paling

mendekati parameter yaitu Rs≥1,5

sehingga hasil ini menjadi

pertimbangan utama untuk pemilihan

fase gerak tersebut. Kedua, %SDRT

yang cukup rendah yaitu sebesar

0,431%. Hasil ini sesuai dengan

parameter yaitu <2%. Namun untuk

jumlah plat teoritis tidak sesuai

dengan parameter yaitu 1238,99

sedangkan seharusnya N > 2500.

Selanjutnya, dilakukan

pengujian validasi metode analisis

KCKT yang meliputi linearitas, batas

deteksi (LOD) dan batas kuantitasi

(LOQ). Linieritas merupakan

kemampuan suatu metode analisa

untuk menunjukkan hubungan secara

langsung atau proporsional antara

respon detektor dengan perubahan

konsentrasi analit. Linieritas ini

ditentukan dari hasil kurva baku,

dimana percobaan ini menggunakan

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


larutan baku dengan variasi

konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm,

40 ppm, 60 ppm, dan 80 ppm.

Didapatkan persamaan kurva baku

garis y = 0,057x-0,321. Selanjutnya

LOD & LOQ masing-masing sebesar

0,1158 ppm dan 0,386 ppm. LOD

sendiri merupakan jumlah analit

terkecil yang masih bisa dideteksi

namun tidak perlu dapat terukur dan

LOQ merupakan jumlah analit

terkecil yang yang masih bisa diukur

dengan akurat (tepat) dan presisi

(teliti)/reprodusible. Hasil optimasi

dan validasi tersebut sudah

memenuhi persyaratan yang ada.

Selanjutnya penetapan kadar

asetosal dengan instrumen KCKT.

Ada beberapa hal yang perlu

diperhatikan saat menginjeksikan

larutan sampel ke dalam KCKT

antara lain setiap larutan yang akan

diinjeksikan haruslah bersih dari

pengotor dengan cara disaring

dengan micropore, karena adanya

pengotor dapat merusak kolom yang

ukurannya sangat kecil serta dapat

menyebabkan kromatogram yang

tidak bagus.

Gambar 2. Hasil kromatogram

penetapan kadar asetosal

Hasil kromatogram diatas

menunjukkan hasil yang tidak terlalu

bagus. Hal itu dapat dilihat dari 2

peak yang tida terpisah secara

keseluruhan sehingga seperti

berhimpitan. Hasil ini dapat

disebabkan karena beberapa hal,

selain mungkin adanya pengotor,dapat pula karena kemiripan

kepolaran antar senyawa yang

dipisahkan, ataupun karena larutan

asetosal telah terhidrolisis karena

terlalu lama dalam penggunaannya.

Perhitungan kadar tablet

asetosal yang didapat yaitu sebesar

161,9%, hasil ini tidak sesuai dengan

persyaratan yang tercantum pada

Farmakope Indonesia IV bahwa

tablet asetosal seharusnya

mengandung asam asetilsalisilat

sebesar 95%-105%. Artinya, kadar

yang didapat pada percobaan ini

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


melebihi kadar yang seharusnya.

Kesalahan ini terjadi karena

beberapa hal yang juga

menyebabkan tidak bagusnya hasil

kromatogram.

Simpulan

Kadar asetosal yang didapatkan

adalah sebesar 161,9% yang

didapatkan dengan hasil optimasi

metode KCKT fase gerak berupa

metanol : air (30:70) dengan laju alir

0,75 mL/menit. Hasil kadar asetosal

dalam tablet yang didapatkan tidak

sesuai dengan persyaratan

Farmakope Indonesia, dimana

rentang kadar yang diperbolehkan

adalah 95%-105%.

Daftar Pustaka

Day, R.A & A.L.Underwood. 2002.

Analisis kimia Kuantitatif.

Jakarta: Erlangga.

Depkes RI. 1995. Farmakope

Indonesia Edisi IV. Jakarta:

Depkes RI.

Gandjar, I. G. & Rohman, A. 2012.

Analisis Obat secara

Spektroskopi dan

Kromatografi. Yogyakarta:

Pustaka Pelajar.

Meyer, V. R. 2004. Practical High-

Performance Liquid

Chromatography 5th Edition.

Wiley: Chinchester.

Pulcinelli F M et al.2004. Inhibition

of Platelet Aggregation by

Aspirin Progressivel

Dyecreaseisn Long-Term

Treated Patients. J. Am Coll

Cardiol. 004(43):979-84.

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


Lampiran

Optimasi Sistem

Perhitungan Optimasi untuk Metanol : Air (30 : 70) dengan laju alir 0,75 mL/menit

Perhitungan pengenceran dari 100 ppm menjadi 20 ppm

1 ml dari yang 100 ml + 4 ml pengencer

Larutan Rt AUC

Baku 1.1 9.627 0.8369

Baku 2.1 9.613 0.8393

Baku 3.1 9.680 0.8153

Rata-rata 9.64 0.8305

Larutan Rt AUC

Baku 1.2 10.887 0.8265

Baku 2.2 10.873 0.8641

Baku 3.2 10.973 0.8538

Rata-rata 10.911 0.8481

Perhitungan Standar Deviasi

SD1 - Rt

(x - xi) (x – xi)2

(9.64 - 9.627) = 0.013 0.000168

(9.64 –

9.613) = 0.027 0.000729(9.64 – 9.680) = -0.04 0.0016

Jumlah 0.002497

√ ( )( )

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


√

SD2 - Rt

(x - xi) (x – xi)

(10.911 - 10.887) = 0.024 0.000576

(10.911 – 10.873) = 0.038 0.001444

(10.911 – 10.973) = -0.062 0.003844

Jumlah 0.005864

√ ( )( )

√

Perhitungan Nilai AUC

AUC1

(x - xi) (x – xi)

(0.8305 – 0.8369) = 0.0064 0.00004096

(0.8305 – 0.8393) = -0.0088 0.00007744

(0.8305 –

0.8153) = 0.0152 0.00023104Jumlah 0.00034944

√ ( )( )

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


√

AUC2

(x - xi) (x – xi)

(0.848 – 0.8263) = 0.0215 0.00046225

(0.848 – 0.8641) = -0.0161 0.00025921

(0.848 – 0.8538) = -0.0058 0.00003364

Jumlah 0.0007551

√ ( )( )

√

Perhitungan Plat Teoritis

Plat Teoritis = ( )

Puncak 1 Injek 1 Puncak 2 Injek 1

(

)

582.527

( )

Puncak 1 Injek II

() 511.629

Puncak 2 Injek II

( )

Puncak 1 Injek III Puncak 2 Injek III

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


() 455.253 (

)

Perhitungan Tinggi Plat

HETP =

Puncak 1 Injek 1 Puncak 2 Injek 1

Puncak 1 Injek II

Puncak 2 Injek II

Puncak 1 Injek III Puncak 2 Injek III

Perhitungan Lebar Kromatogram

Lebar Puncak 1 Injeksi 1 Lebar Puncak 2 Injeksi 1

0.8369 = 0.864

0.8265 = 0.5525


0.8393 = 0.848

0.8641 = 0.5605

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3



0.8153 = 0.8025

0.8538 = 0.5435

Perhitungan Nilai Resolusi

Injeksi I

() ()

Injeksi II

() ()

Injeksi III

() ()

Perhitungan Nilai LOD&LOQ

Perhitungan bobot asetosal dalam tablet

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


Perhitungan Kadar Asetosal

Kadar Asetosal

Kadar I

Kadar II

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


Rata-rata Kadar

% Kadar

8/16/2019 260110140121_RANIA ADRIEZA_3


Documents

260110140121_RANIA ADRIEZA_3