DESELÜLERİZE ECM’LERDE İMMÜNOJENİK KALINTI MİKTARLARININ OTOFAJİ YOLAKLARI KULLANILARAK

AZALTILABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASIArda Deniz Dokuzoğlu1, Miray Tayfun1, Prof. Dr. Adil Allahverdiyev1

1Yıldız Teknik Üniversitesi, Kimya-Metalürji Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü

A4896 A4848 N48

Series1 0.0403 0.0507 0.0964

0.01

0.03

0.05

0.07

0.09

0.11

Doku Lizatı Total Protein İçeriği

280n

m U

V Ab

sorb

ans

(Liz

at

1/20

)

Giriş; Deselülerize ekstraselüler matriks’ler (ECM), dokuda ekstraselüler matriks kaybı ve yırtılması durumunda dokulararası köprü görevi görmektedir. Aynı zamanda içerdiği glikozaminoglikanlar, proteoglikanlar ve biyolojik büyüme faktörleri gibi Hücre-ECM arası sinyal kaynakları sayesinde iyileşme oranını artırmakta ve süreci kısaltmaktadır.[1,2] Bu dokuların

kaynakları genel olarak, sığır ve domuz gibi genetik yapı ve boyut bakımından insana benzer türleden seçilmektedir.[4] Buna rağmen yapılan transplantasyon türler arasıdır ve immün cevap riski taşımaktadır.[5] İmmün yanıtın kaynakları arasında uzaklaştırılamamış canlı hücreler, nükleik asitler ve son çalışmaların göstermiş olduğu hücresel protein kalıntıları

gelmektedir.[4] Bugüne kadar kullanılmış deselülerizasyon yöntemlerini incelediğimizde hiçbirinin yeteri kadar seçici olmadığını görmekteyiz.[4,6,8] Deterjan ve benzeri moleküller içeren solventlerin kullanıldığı yöntemlerde iyileşme için gerekli biyomoleküllerin de büyük oranda azaldığını görmekteyiz. Bu ve benzeri riskler sebebiyle bu materyal genel kullanımdan hala

oldukça uzaktadır. Ancak cerrahi onay ile kullanılması mümkün olan bu materyaller eğer immün cevap oluşturma riski barındırmaz ise ve kontrollü yetiştirilmiş donör hayvanlardan temin edilirse bu materyallerin gelecekte sıradan ev ve iş kazalarında (ör. derin kesik, yanma v.b.) dahi güvenle kullanımı mümkün olabilecektir. Projemizin birincil amacı deselülerize ECM’lerin

yaygın medikal kullanımının sağlanabilmesi için öncelikli olarak aşması gereken immün cevap sorunun üstesinden gelmek için yenilikçi bir yöntem geliştirmektir. Bunları yaparken kullanılacak yöntem literatürde daha önce hiç bahsedilmemiş ve matriks üretiminde daha önce hiç denenmemiş özgün bir metodu kapsamaktadır. Projede öne sürülen hipotez, organizmalardan izole edilecek doku örneklerinin uygun süre boyunca açlık şartlarında doku kültürünün yapılması durumunda, hücrelerdeki toplam hücresel protein miktarının

azalacağıdır, dolayısıyla bu dECM’lerin daha düşük şiddette bir immün yanıta sebep olacağıdır. Araştırmada cevabı aranan soru, dokular üzerinde kültür sırasında otofaji sinyal yolaklarının etkinleştirilmesinin, dokular deselülerize edildikten ve alıcıya uygulandıktan sonra farklı türdeki alıcı üzerinde oluşan immün cevap miktarının sıradan deselülerizasyon yöntemleriyle elde

edilene kıyasla, azaltılabilmesinin mümkün olup olmadığıdır.

Ş3

Ş13

Ş2Ş1

Ş7Ş6Ş5

Ş4

Ş12

Ş11

Ş10Ş8

Ş9

Ş14

Ş15

Ek; Tüm hayvan çalışmaları Tübitak HADYEK tarafından onaylanmış ve veteriner gözetimi altında yapılmaktadır. Proje TÜBİTAK 2209/A programı kapsamında desteklenmekte ve finanse edilmektedir.

ş1)Diseksiyon sonrası mide ve ince bağırsak. Ş2)Sıçan anatomik. Ş3)İnce bağırsağın 1,5 cmlik fragmentlere ayrılması ve direnaj. Ş4)kontamine dokular ve kültüre aktarılmış dokular. ş5) 0h kültür başlangıcı. Ş6) 24h

kültür sonrası dokular ş7) 48h kültür sonrası dokular. Ş8)Deselülerizasyon öncesi. Ş9) 48h açlık kültür, 48h deselülerizasyon.

Ş10)Deselülerizasyon parametreleri kontrol grubu 0h. ş11)Deselülerizasyon kontrol grubu. (48h dH2O, 48h Serum

Fiz.,48hDMEM, 48h nonsteril deterjan) ş12) (A4848)Açlık, 48h Kültür, 48h Desel. ş13) (A4896) Açlık, 48h kültür, 96h desel.

ş14) (N48) Normal 48h kültür. Ş15) 1/20 konsantre lizatların 280nm absorbans değerleri.

Metod; Aynı türde, yaşta, cinsiyette sıçanların ince bağırsakları aseptik olarak izole edilir. Dokular kültür ortamına

aktarılarak canlılığın bir süre daha devam etmesi sağlanmıştır.[10] Kültür sırasında sağlanacak ortam koşulları canlı hücreler

üzerinde bir açlık durumunu simüle etmek üzere tasarlanmıştır ve açlık koşullarında kültür edilecek hücrelerde sağkalım sinyal

yolaklarının spesifik olarak otofajinin etkinleşmesi beklenmektedir.[7,11,12] Sonrasında doku örnekleri temel

deselülerizasyon prosedürleri uygulanarak prosese devam edilir.[6,8] Yalnız deselülerize edilmiş ECM’ler, ön-işleme tabii tutulup ardından deselülerize edilmiş ECM’ler ile karşılaştırılacaktır. İki farklı yöntem ile deselülerize edilmiş ECM’lerin fare grupları

üzerinde oluşturacağı toplam immün yanıt farkını ölçebilmek için lizatlarla fare grupları immünize edilecektir. İmmünize edilen

farelerin kanında ekstraktlara karşı antikor oluşması beklenmektedir. Sıçanlardan alınan kan serumu seyreltilerek

doğrudan ELISA’da birincil antikor olarak kullanılacaktır. Plakalara sabitlemiş lizatların üzerine aynı lizatlarla immünize edilmiş

farelerin kan serumu eklenerek oluşan antikorlar ekstraktların içerisindeki antijenlerine bağlanması beklenmektedir.

[6,13] Bağlanan antikorları görünür hale getirebilmek için enzimle eşlenmiş ikincil antikorlar kullanılacaktır. Görülür hale getirilen,

antijenlere bağlanan antikor miktarları, spektrofotometrede kantitatif olarak ölçülecektir.[6] Bu dizayn ve bütçe çerçevesinde

oluşturulan olan deney grupları:a. Ekstraselüler Matriks Donörü Sıçan Grupları

(i)Negatif ön-işlem ve deselülerizasyon grubu(Cul+Glu+), (ii)Yalnız deselülerizasyon grubu(Cul-), (iii)Ön-İşlem ve deselülerizasyon

grubu(Cul+Glu-)b. Ekstraselüler Matriks Alıcısı Fare İmmünizasyon Grupları

(i)Negatif ön-işlem ve deselülerizasyon grubuyla immünize olacak grup, (ii)Yalnız deselülerizasyon grubuyla immünize olacak grup, (iii)Ön-İşlem ve deselülerizasyon grubuyla immünize olacak grup,

(iv)İmmünize olmamış kontrol grubu(Adjuvant+Antigen-)Farelerden Doku İzolasyonu; Ketamin, ksilazin anestezi altında

farelerin ince bağırsaklarının (~35cm) ileum (sondan ~22cm) bölgesi izole edilir ve dikdörtgen şeklinde 1,5cm’lik parçalara bölünür. Alınan örnekler %1 Antibiyotik-antimikotik solüsyon

içeren HBSS (Hücre izotonik taşıma ortamı) ile yıkanır.[8,10] Soğuk aküde HBSS içerisinde kültür laboratuvarına taşınır.

Dokuların Kültürü ve Ön-İşlem; Tekrar HBSS ile yıkanan örnekler %1 Antibiyotik-Antimikotik solüsyon, %0,5 Gentamicin, %0 Glikoz içeren DMEM içerisinde 37°C sıcaklıkta, %5 CO₂, %95 hava ortam

şartları altında petri kabında 48 saat ve petri başına 8 parça olmak üzere kültür edilir. [10] negatif kontrol grubu için ise aynı şartlarda ekstra olarak medium %0,45 Glikoz içermektedir. 24

saatte bir mediumun yarısı yenilenir.Deselülerizasyon; Doku örnekleri %70 etanol ile dezenfekte

edildikten ve serum fizyolojik ile yıkandıktan sonra %1 Triton X-100, %0.5 Sodium Deoxycholate karışımı içeren deselülerizasyon

solventi içerisinde 30-48 saat orbital shaker üzerinde çalkalanarak hücrelerden arındırılacaktır.[6,8]

DNA Sayımı; Hiçbir işleme uğramamış, sadece deselülerizasyon uygulanmış ve hem ön-işlem hem deselülerizasyon uygulanmış

dokulardan DNA sayımı yapmak için kesit alınacaktır. DNA sayımında DAPI boyama kullanılacaktır.[8] İmmünofloresans mikroskopta alınan görüntüler bilgisayarda ImageJ yazılımı

yardımıyla sayılacaktır. Deselülerize ECM’lerin Homojenizasyonu ve Ekstraksiyonu; Deselülerize ECM’ler sıvı azotla dondurulup seramik havanda parçalanır (Mortar-Pestle). Elde edilen deselülerize ECM tozu

modifiye RIPA çözeltisi içerisinde (500mg:1,5ml) ekstrakte edilip 14.000rpm 30dk santrifüjde çöktürülür ve işlem 2 kez tekrarlanır.

Süpernatantta çözünmüş proteinler örneklerin ekstraktı olarak kullanılır. Ekstraktın protein konsantrasyonu, toplam potein

miktarı tayin kiti (BCA Assay Kit) kullanılarak ölçülür.

Buna ek olarak 280nm UV spektroskopide 20 kat seyreltilerek total protein miktarı tahmin edilir. dECM

(deselülerize ECM) ekstraktlarının bir kısmı (kuyu başına 20ug) ELISA’da plakalara sabitlenmek üzere saklanır.[6]

İmmünizasyon; Deselülerize ECM ekstraktları erişkin sıçanlara 1. gün 25-35 ug CFA (Complete Freund Adjuvant) ile birlikte 4., 8.,

11., 14. günler 20 ug IFA (Incomplete Freund Adjuvant) ile birlikte olmak üzere 5’er kez intraperitonal olarak enjekte edilecektir. İmmünize edilen farelerin kuyruk veninden kan alınıp serumu ayrıştırılarak analizlerde kullanılmak üzere saklanacaktır.[6,13]

Doğrudan Bağlantı ELISA; Deselülerize ECM ekstraktları 96-kuyu PS plakalara 0.05 M karbonat/bikorbonat pH 9.6 tampon çözeltisi kullanılarak 24 saat oda sıcaklığında sabitlenecektir. Seyreltilmiş serum ve ikincil antikor standart protokoller kullanılarak antijene

bağlanacaktır. Plakalar, 15 dakika renklenmeye bırakılacak ardından spektrofotometrede absorbans değerleri okunacaktır.

[6,13]

Sonuçlar ve Tartışma; Projemizin analiz (DNA sayımı, ELISA, Validasyonlar), histokimya ve immünizasyon aşamaları sürmeye

devam etmektedir ve sonuç bu analizlerden bağımsız olarak düşünülemez. Bununla birlikte şu ana kadar gelinen noktada dahi

kayda değer bir çok çıktı elde edilmiştir. Çalışma kapsamında literatürde daha önce başarılamamış veya bahsedilmemiş olan erişkin sıçan/fare ince bağırsak organoid/doku kültürünün yeni

bir yöntemle gerçekleştirilmesi hedeflenmiştir. Kritik konsantrasyonda antibiyotik-antimikotik karışımı kullanımı, aseptik operasyon ve 6 tekrarlı antibiyotikli doku yıkamasını

içeren bu girişim normal kültür şartları uygulanan (DMEM High Glu. %5CO2, 37°C) grup için başarısız olmuş, kültürlerde 12 saat içinde maya kolonizasyonu, pH ve renk değişimi gözlenmiştir. Bu

sebeple bu grup deney dışı bırakılmıştır. Bununla birlikte aynı işlemler açlık ortamında (DMEM w/o Glu, pyr, Phenol %5 CO2,

37°C) tekrarlandığında kültürde kolonizasyon, pH ve renk değişimi, makromorfolojik değişim ve nekroz gözlenmemiştir. Dokular kontaminasyon gözlenmeden 72 saat boyunca kültür

edilebilmiştir. Sonraki çalışmalarda pirüvat ve kreatin varlığında bu kültürün normal şartlara yakın olarak gerçekleştirilme olasılığı incelenmelidir. 48 saat kültürü yapılan doku örnekleri A48 önadını

alarak 48 ve 96 saatlik deselülerizasyon işleminden geçirildi(A4848, A4896). Bununla birlikte ön-işlem uygulanmadan

doğrudan 48 saat deselülerize edilen dokular(N48) da kontrol grubu olarak kullanıldı. Örneklerin eş kütleli lizatları 280nm’de

total protein incelemesine tabi tutuldu. Oransal bir fikir vermesi beklenen inceleme sonucunda beklenen sonuçlara çok uygun

sonuçlar elde edildi[Ş15]. Bu sonuçlar ileriki çalışmalar ile (BCA assay) desteklenebilirse hipotezimizin öne sürdüğü, sağkalım

sinyal yolaklarının aktive edilmesinin (özellikle otofaji) hücresel protein kalıntılarının azaltılması için alernatif bir yol olabileceği fikrini doğrulayacaktır. Gözlemlediğimiz bu azalmanın sebebinin

hücresel proteinlerin açlık durumunda hücrelerce peptidlere parçalanması ve deselülerizasyon sırasında peptidlerin ortamdan görece daha kolay uzaklaştırılabilmesi olduğunu düşünmekteyiz.

1)Stephen F. Badylak et al. Biomaterials Science Third Edition (2013) 1316–1331. 2)Stephen F. Badylak et al. Acta Biomaterialia 5 (2009) 1–13 3)Alexander Huber et al. Biological Scaffolds for Regenerative Medicine. Principles of Regenerative Medicine Second Edition (2011) 623–635 4)Peter M. Crapo et al. An overview of tissue and whole organ

decellularization processes. Biomaterials 32 (2011) 3233-3243 5)Siba Haykal et al. The effect of decellularization of tracheal allografts on leukocyte infiltration and of recellularization on regulatory T cell recruitment. Biomaterials 34

(2013) 5821-5832 6)Ulrike Böer et al. The effect of detergent-based decellularization procedures on cellular proteins and immunogenicity in equine carotid artery grafts. Biomaterials 32 (2011) 9730-9737 7)Félix Moruno et al. Regulation of Autophagy by Glucose in Mammalian Cells. Cells (2012) 1, 372-395; doi:10.3390/cells1030372 8)Oliveira AC et al. (2013) Evaluation of Small Intestine Grafts Decellularization Methods for Corneal Tissue

Engineering. PLoS ONE 8(6): e66538. doi:10.1371/journal.pone.0066538 9)Ruina Maa et al. Structural integrity, ECM components and immunogenicity of decellularized laryngeal scaffold with preserved cartilage. Biomaterials 34 (2013)

1790-1798 10)Zan-Min Song, Simon J.H Brookes, Tim O Neild, Marcello Costa. Immunohistochemical and electrophysiological characterization of submucous neurons from the guinea-pig small intestine in organ culture.

Journal of the Autonomic Nervous System 63 (1997), 161–171. 11)Nicholas A Graham, Martik Tahmasian, Bitika Kohli, Evangelia Komisopoulou, Maggie Zhu, Igor Vivanco, Michael A Teitell, Hong Wu, Antoni Ribas, Roger S Lo, Ingo K

Mellinghoff, Paul S Mischel and Thomas G Graeber. Glucose deprivation activates a metabolic and signaling amplification loop leading to cell death. Molecular Systems Biology (2012) 8: 589; doi:10.1038/msb.2012.20.

12)Byron Deorosan and Eric A. Nauman. The Role of Glucose, Serum, and Three-Dimensional Cell Culture on the Metabolism of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International (2011) Article ID 429187, 12

pages; doi:10.4061/2011/429187 13)Brown MC et al. (2011) Impact of Immunization Technology and Assay Application on Antibody Performance – A Systematic Comparative Evaluation. PLoS ONE 6(12): e28718.

doi:10.1371/journal.pone.0028718