生理活性反応測定装置 (Micro Bioactivity Analyzer)

AMIS-101 データ集

株式会社 バイオエックス

2008 年 10 月

1

生理活性反応測定装置(Micro Bioactivity Analyzer) AMIS-101 は複雑な発光・発色反応を伴うことなく、酵素反応などの生理活性反応をシンプルに、リアルタイムでの定量測定が可能です。 数マイクロリットルの微量での測定が可能であり、収量の少ないタンパクの代謝機能の解析に威力を発揮します。

当データ集は本測定装置の基本性能を示すために測定例としてまとめたものですが、下記の一覧表に示す通り、幅広い範囲での応用が可能であることがわかります。

なお、当データ集に示すプロトコルはすべて精製された試薬ベースのものであり、実際のサンプルでの測定に際しては精製など各サンプルの状態に応じた前処理と試薬の設計が必要となります。具体的なプロトコルの構築に関しましてはご相談下さい。

基質 酵素 補酵素 基質検出感度(µM) 酵素検出感度(20µl中の絶対量) 検出対象 ページグルコース Glucose　Oxidase 10µg/ml(55µM) 0.5µg/ml(1ng) 過酸化水素＋グルコン酸 2グルコース Glucose Dehydrogenase NAD 20µg/ml(111µM) プロトン 3グリセロール Glycerol Kinase +Glycerophosphate Oxidase ATP 1.5µg/ml(16µM) 過酸化水素 4エタノール Alcohol Dehydrogenase NAD 10µg/ml(217µM) プロトン 5ホルムアルデヒド Formaldehyde Dehydrogenase NAD 0.3µg/ml(10µM) プロトン＋蟻酸 6アセトアルデヒド Aldehydel Dehydrogenase NAD 5ng/ml(0.1µM) プロトン＋酢酸 7ＡＴＰ Alkaline Phosphatase 5µg/ml(10µM) 0.1unit/ml(0.002unit） リン酸 8尿素 Urease 2µg/ml(33µM) アンモニア 9クレアチニン Creatinine　Deiminase 1µg/ml(8.8µM) 1μg/ml(2ng) アンモニア 10オリーブ油 Lipoprotein Lipase 100µg/ml オレイン酸 11リノール酸コレステロール Cholesterol Esterase 200µg/ml(300µM) リノール酸 12DL-BAPNA Tripsin 60µg/ml アルギニンカルボン酸 13

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1. グルコース（その１） 酵素：Glucoseoxidase 基質：Glucose

Buffer：1mM Tris-HCl pH6.8 50ｍM NaCl 反応機構

Glucoseoxidase β-D-Glucose + O2 + H2O D-Glucono-δ-lactone + H2O2

方法：①酵素 Glucoseoxidase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した。

②基質 Glucose を Buffer にて所定の濃度に溶解した。 ③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した ④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。 ⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output Analytical Curve (Linear)

-0.14-0.12-0.1-0.08-0.06-0.04-0.020 0 50 100 150 200 250 300Sec.V

100mg/dl 50mg/dl 25mg/dl 10mg/dl-50-40-30-20-100 0 20 40 60 80 100 120

mg/dl

3

2. グルコース（その２） 酵素：Glucosedehydrogenase 補酵素：NAD 基質：Glucose

Buffer：1mM PBS-KOH pH7.0 100ｍM NaCl 反応機構

Glucose Dehydrogenase

β-D-Glucose + NAD+ D-Glucose-δ-lactone + NADH + H

+

方法：①酵素 Glucosedehydrogenase を Buffer にて 1.4mg/ml に溶解した

②補酵素 NAD を Buffer にて 3.5mg/ml に溶解した

③基質 Glucose を Buffer にて所定の濃度に溶解した ④センサーA、B に①の酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した ⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した ⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。 ⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output Analytical Curve (End Point)

y = -4.0385x + 11.039R2 = 0.9975-900-800-700-600-500-400-300-200-1000 0 50 100 150 200 250mg/dlmV-1.0-0.8-0.6-0.4-0.20.0 0 50 100 150 200 250 300

Sec.V200 100 40 20 10 0

4

3．グリセロール 酵素：Glycerol Kinase, Glycerol Phosphate Oxidase 基質：Glycerol

Buffer：1mM ATP-NaOH pH7.0 反応機構

Glycerol Kinase Glycerophosphate Oxidase

Glycerol + ATP Glycerol-3-phosphate +O2 Dihydroxyacetonephosphate + H2O2

方法：①酵素 Glycerol Kinase (酵素１)を Buffer にて 0.2ｍg/ml g/ml に溶解した ②酵素 Glycerophosphate Oxidase（酵素２）を Buffer にて 0.2ｍg/ml に溶解した。

③基質 Glycerol を Buffer にて所定の濃度に溶解した ④センサーA、B に①の酵素１溶液を 9 マイクロリットル投入した ⑤センサーA、B に②の酵素２溶液を 9 マイクロリットル投入した ⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。 ⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。 Output Analytical Curve (End Point)

-140-120-100-80-60-40-200 0 0.2 0.4 0.6 0.8mg/dl

mV-0.12-0.10-0.08-0.06-0.04-0.020.00 0 100 200 300 400 500 600SEC

V1.6mg 3.2mg 6.5mg

5

4．エタノール 酵素：Alcohol Dehydrogenase 補酵素：NAD 基質：Ethanol

Buffer：1mM K-PBS pH7.0 NaCl 50mM 反応機構

Alcohol Dehydrogenase Ethanol + NAD

+ Acetoaldehyde + NADH + H+

方法：①酵素 Alcohol Dehydrogenase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した ②補酵素 NAD を Buffer にて 1.8mg/ml に溶解した。

③基質 Ethanol を Buffer にて所定の濃度に溶解した ④センサーA、B に①の酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した ⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した ⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。 ⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。 Output Analytical Curve (End Point)

-500-400-300-200-1000 0 50 100 150 200 250

g/lmV-0.5-0.4-0.3-0.2-0.10 0 100 200 300Sec.

V200 150 100 50 25

6

５．ホルムアルデヒド 酵素：Formaldehyde Dehydrogenase 補酵素：NAD 基質：Formaldehyde

Buffer：1mM Tris-HCl pH8.5 反応機構

Formaldehyde Dehydrogenase

Formaldehyde + NAD+ Formic Acid + NADH + H

+

方法：①酵素 Formaldehide Dehydrogenase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した ②補酵素 NAD を Buffer にて 1.8mg/ml に溶解した。

③基質 Formaldehyde を Buffer にて所定の濃度に溶解した ④センサーA、B に①の酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した ⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 9 マイクロリットル投入した ⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。 ⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。 Output Analytical Curve (Linear)

-14-12-10-8-6-4-200.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6Formaldehyde mM-80-70-60-50-40-30-20-100 0 2 4 6 8 10 12

minmV0.5mM 0.2mM 0.1mM 0.05mM 0.01mM

7

6．アセトアルデヒド 酵素：Aldehyde Dehydrogenase 補酵素：NAD 基質：Acetaldehyde

Buffer：1mM K-PBS pH7.0 反応機構

Aldehyde Dehydrogenase Acetaldehyde + NAD

+ Acetic Acid + NADH + H

+

方法：①酵素 Aldehide Dehydrogenase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した ②補酵素 NAD を Buffer にて 1.8mg/ml に溶解した。

③基質 Acetaldehyde を Buffer にて所定の濃度に溶解した ④センサーA、B に①の酵素溶液を 7.5 マイクロリットル投入した ⑤センサーA、B に②の補酵素溶液を 7.5 マイクロリットル投入した ⑥AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に③の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 5μリットル加えて測定した。 ⑦（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。 Output Analytical Curve (End Point)

y = -101.89x + 1.9694R2 = 0.9952-450-400-350-300-250-200-150-100-500 0 1 2 3 4

g/lmV-0.4-0.3-0.2-0.10.00.1 0 100 200 300 400Sec.

V3 2 1 0.5 0.3

8

7．ATP(アデノシン三燐酸) 酵素：Alkaline Phosphatase 基質：ATP(Li)

Buffer：10mM Mops-Tris pH7.4 2mM MgCl2 反応機構 Alkaline Phosphatase

ATP ADP, AMP + Pi

MgCl2

方法：①酵素 Alkaline Phosphatase を Buffer にて 60u/ml に溶解した

②基質 ATP Li 塩を Buffer にて所定の濃度に溶解した ③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した ④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。 ⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output Analytical Curve (Linear)

-3.0-2.5-2.0-1.5-1.0-0.50.0 0 1 2 3 4 5 6ATP (mM)-50-45-40-35-30-25-20-15-10-50 5 10 15 20 25 30

minmV5.2mM 3mM 2mM 1mM 1mM(2) 0.5mM 0.2mM

9

８．尿素 酵素：Urease 基質：Urea

Buffer：1mM Tris-HCl pH8.0 50mM KCl 反応機構 Urease (NH2)2CO + H2O + 2H

+ 2NH4+ + CO2

方法：①酵素 Urease を Buffer にて 0.075mg/ml に溶解した

②基質 Urea を Buffer にて所定の濃度に溶解した ③センサーA、B に①の酵素溶液を 15 マイクロリットル投入した ④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 5μリットル加えて測定した。 ⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output Analytical Curve (End Point) y = 42.613x + 7.5385R2 = 0.9981

0501001502002503003504004505000 2 4 6 8 10 12mg/dl

mV-0.100.10.20.30.40.5

0 50 100 150Sec.V

10mg/dl 8mg/dl 5mg/dl 3mg/dl 2mg/dl

10

９．クレアチニン 酵素：Creatinine Deiminase 基質：Creatinine

Buffer：1mM Tris-HCl pH7.5 50mM NaCl 反応機構

Creatinine Deiminase

Creatinine + H2O + H+ N-Methylhydrantoin + NH4

+

方法：①酵素 Creatinine Deiminase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した

②基質 Creatinine を Buffer にて所定の濃度に溶解した ③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した ⑤AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。 ⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。 Output Analytical Curve (End Point)

y = 4.2517x - 0.0238R2 = 0.997701020304050

0 2 4 6 8 10 12mg/dl0.000.020.040.060.080.100.120 100 200 300Sec.

V 10mg/dl 7mg/dl 5mg/dl 3mg/dl 1mg/dl

11

10．オリーブ油 酵素：Lipoprotein Lipase 基質：Olive Oil

Buffer：5mM K-PBS pH7.0 反応機構

Lipoprotein Lipase によるオリーブ油の加水分解の結果生じるオレイン酸を検出 方法：①酵素 Lipprotein Lipase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した

②基質オリーブ油を Buffer にて所定の濃度に溶解し、超音波処理を行った。 ③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した ④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。 ⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output Analytical Curve (Linear)

-10-8-6-4-20 0 20 40 60 80 100 120

mg/mlX E-05-0.03-0.025-0.02-0.015-0.01-0.0050 0 100 200sec.

V10mg/ml 5mg/ml 1mg/ml0.5mg/ml 0.1mg/ml

12

11．リノール酸コレステロール 酵素：Cholesterol Esterase 基質：Cholestryl Linoreate

Buffer：1mM Tris-HCl pH7.5 反応機構

Cholesterol Esterase による Cholestryl Linoreate 分解反応の結果生じるリノール酸を検出 方法：①酵素 Cholesterol Esterase を Buffer にて 0.1mg/ml に溶解した ②基質 Cholestryl Linoreate を IPA に溶解し Buffer にて所定の濃度に希釈し、過熱して IPA を蒸発させた後超音波処理を行った。 ③センサーA、B に①の酵素溶液を 18 マイクロリットル投入した ④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に②の基質を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。 ⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output Analytical Curve (Linear)

-0.09-0.08-0.07-0.06-0.05-0.04-0.03-0.02-0.010.00 0 50 100 150 200 250 300Sec.V

300mg/dl 200mg/dl 100mg/dl 50mg/dl 10mg/dly = -0.0914x - 0.1788R2 = 0.9765-40.00-30.00-20.00-10.000.00 0 100 200 300 400

mg/dl

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12．DL-BAPNA（合成基質） 酵素：Tripsin 基質：Nα-Benzoyl, L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride （DL-BAPNA） Buffer：2.5mM Tris-HCl pH8.3 反応機構

酵素 Tripsin による 基質 Nα-Benzoyl, L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride （DL-BAPNA）の分解反応の結果生じるをアルギニンカルボン酸を検出 方法：①酵素 Tripsin を Buffer にて 1mg/ml に溶解した。 ②基質 DL-BAPNA を Buffer にて所定の濃度に溶解した。 ③センサーA、B に②の DL-BAPNA 溶液を 18 マイクロリットル投入した ④AMIS-101 にセンサーをセットし、温度が安定したらセンサーA に①の酵素溶液を、センサーB に Buffer（Reference）を各 2μリットル加えて測定した。 ⑤（センサーA の出力）― (センサーB の出力)を反応による出力とした。

Output Analytical Curve (End Point)

-0.6-0.5-0.4-0.3-0.2-0.10 0 50 100 150 200 250 300 350

SECV0.5 0.25 0.125 0.0625 0

-0.60-0.50-0.40-0.30-0.20-0.100.00 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6mg/mlV

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