Teknologi dna rekombinan (GENETIC ENGINEERING)

DR.Restu Syamsul Hadi, MKes.

Awalnya manipulasi genetik secara tradisional seperti : pemuliaan selektif untuk meningkatkan nilai gizi tanaman

terlalu lambat

Pengenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme dari spesies yang berbeda (organisme transgenik)

Kloning gen untuk menentukan fungsinya Mengubah fenotip suatu organisme untuk meningkatkan sifat yang diinginkan

Rekayasa genetika dengan teknik molekuler Memungkinkan untuk menciptakan perubahan genetik lebih besar pada kecepatan yang jauh lebih cepat

Produksi bahan farmasi dalam jumlah besar

MENGAPA ILMUWAN MENGEMBANGKAN REKAYASA GENETIKA..?

Kelangsungan Hidup Manusia

Ditunjang Oleh

Teknologi

melalui

Bioteknologi

Bioteknologi Konvensional Bioteknologi Modern

Pengolahan Bahan Makanan Misalnya

Tempe Kecap Keju mikroprotein Kultur Jaringan

Rekayasa Genetik

Selective Breeding Tanaman atau hewan dengan karakteristik yang diinginkan paling banyak

digunakan untuk pemuliaan lebih lanjut

Hybridization (Crossbreeding) Menggabungkan strain yang berbeda spesies untuk menggabungkan

karakteristik terbaik dari keduanya. (burung dara + perkutut = sinom)

Recombinant DNA Technologies Transformasi

Teknik Dasar Rekayasa Genetika

Teknik perubahan genetik suatu organisme, atau keturunan, untuk menghilangkan karakteristik bahan yang tidak diinginkan atau untuk menghasilkan bahan yang baru yang diinginkan.

Penambahan, penghapusan, atau manipulasi sifat tunggal dalam organisme untuk menciptakan perubahan yang diinginkan

Definisi:

Apa Rekayasa Genetika?

Teknik Rekombinan meliputi:

-Teknik untuk mengisolasi DNA

-Teknik untuk memotong DNA.

-Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.

-Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup

sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan

dapat diekspresikan

Teknologi DNA Rekombinan

kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk

mengkombinasikan gen-gen secara buatan.

- Isolasi dan pemurnian DNA Isolasi DNA bakteri Isolasi DNA plasmid Pemurnian secara kimiawi dan enzimatis

- Berbagai jenis dan karakterisasi vektor vektor plasmid vektor yeast vektor bakteriofag

- Enzim restriksi dan ligase Jenis enzim restriksi Faktor yang berpengaruh terhadap enzim restriksi Faktor yang berpengaruh terhadap enzim ligase

Teknik Elektroforesis dan PCR Faktor yang berpengaruh dalam elektroforesis Faktor yang berpengaruh terhadap PCR

DNA sekuensing dan hibridisasi southern blot northern blot western blot

DNA rekombinan dan Transformasi Isolasi Restriksi Sel kompeten Transformasi

Rekayasa genetika, juga dikenal sebagai

teknologi DNA rekombinan, berarti mengubah gen dalam organisme hidup untuk menghasilkan Genetically Modified Organism (GMO) dengan genotipe baru

Berbagai jenis modifikasi genetik yang mungkin: memasukkan gen asing dari satu spesies menjadi

- spesies lain, - membentuk organisme transgenik; - mengubah gen yang ada sehingga produknya berubah, - mengubah ekspresi gen sehingga ditranslasikan lebih

sering atau tidak sama sekali

1. Isolasi gen

2. Insersi ke dalam host menggunakan vector

3. Perbanyak copy DNA sebanyak mungkin

4. Pemisahan produk gen yang dihasilkan

5. Ekstraksi produk gen yang diinginkan

Basic steps in genetic engineering

Menjadi petanda adanya ekspresi gen dan protein target dalam sel-sel hidup suatu organisme

Paling banyak digunakan adalah green fluorescent protein

(GFP) pertama kali diisolasi dari Victoria aequorea (ubur-ubur), dapat dilekatkan ke hampir semua protein dan yang menarik dan masih dapat menjadi fluorescent molecule.

Dapat digunakan untuk melokalisasi protein yang sebelumnya belum di-karakterisasi untuk memvisualisasikan dan melacak protein untuk lebih memahami peristiwa selular.

Dapat digunakan untuk melihat proses perkembangan

Fluorescent proteins are a useful tool in biotechnology

Tikus transgenik dapat digunakan untuk mempelajari sistem kekebalan tubuh dan penyakit genetik

Babi : Faktor VIII pada pembekuan darah, organ-organ untuk

transplantasi Hewan lain : hormon pertumbuhan IL-2 (kanker), albumin

Hewan Transgenik

Tanaman tahan hama

jagung (gen toksin dari Bacillus thuringiensis yang dapat membunuh serangga)

Tanaman tomat

Golden rice (beta-carotene)

Plant-based vaccines

Organisme rekombinan

Tanaman tahan hama

Jagung Bt (mengandung gen toksin dari Bacillus thuringiensis yang membunuh hama)

Golden rice (mengandung beta-carotene)

Tanaman sebagai vaksin

Genetically Modified Organisms

Genetic engineering of Bt-resistant corn (Bt-corn)

Bt-transgenic plants are resistant to insects, no need for spraying insecticide

Clone Bt toxin gene from bacteria and express in plants

Tanaman jagung tidak perlu lagi insektisida, serangga/ulat akan mati bila

memakan jagung

Contoh penerapan rekayasa genetika pada tanaman Golden Rice mengandung gen untuk menghasilkan vitamin A

Biji beras (endosperm) kekurangan senyawa essential seperti vitamin A dan precursornya (-carotene). Defisiensi Vitamin A dapat meyebabkan kebutaan dan penurunan sistem imun tubuh.

Rekayasa genetika manusia berarti mengubah gen dalam sel manusia yang hidup

Misalnya pada penderita penyakit paru-paru yang disebabkan oleh gen yang cacat dalam sel paru-paru. Dengan cara memperbaiki gen-gen memungkinkan akan sembuh .

Mengubah gen dalam sel hidup dengan menempatkan gen baru yang diinginkan ke virus yang diperbolehkan untuk masuk ke sel-sel manusia dan yang memasukkan gen baru ke dalam sel bersama dengan sebelumnya

HUMAN GENETIC ENGINEERING

HUMAN GENETIC ENGINEERING

Rekayasa genetika yang menargetkan gen di organ tertentu dan jaringan tubuh orang yang ada tanpa mempengaruhi gen dalam gamet (telur atau sperma).

Percobaan transfer gen somatik sedang menjalani uji klinis, dengan hasil yang beragam sampai saat ini. Suatu hari nanti mungkin akan dapat digunakan dengan efektif

"Somatic "genetic engineering

Rekayasa genetika yang menargetkan gen dalam gamet (telur, sperma, atau embrio sangat awal)

Perubahan yang mempengaruhi setiap sel dalam tubuh individu yang dihasilkan, dan diwariskan kepada semua generasi berikutnya

"Germ line" genetic engineering

[note: The term "somatic" comes from the Greek "soma" for "body." The term "germline" refers to the "germ" or "germinal" cells, the eggs and sperm.

Insulin (diabetics) Factor VIII (males w/hemophilia A) Factor IX (hemophilia B) Human growth hormone Erythropoietin (anemia) Angiostatin/endostatin(anti-cancer drugs) leptin

Produk DNA Recombinant untuk terapi pada manusia

Inserting gene in correct cells

Inserting gene so it is expressed correctly

Orientation

Regulation Controlling virus vector

Ethical issues

Kesulitan pada Rekayasa Genetika Manusia

Teknik KLONING GEN

Dari Bahasa Yunani - klon, ranting Kumpulan turunan suatu individu yang

dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)

Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya

Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

Kloning - definisi

Kloning DNA

Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan

memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)

yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan

DNA yang kompleks.

Kloning Gen

Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut

Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)

Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut

Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut

Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut

Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan

Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

Tujuan mengklon Gen

DNA kromosom

cDNA (complementary DNA) yang disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)

DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan

PCR

Sumber DNA untuk diklon

Enzim endonuklease restriksi

Enzim ligase

Vektors

Inang (Host)

Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang

Bahan / Alat untuk Mengklon

Memotong DNA Menggunakan enzim

endonuklease restriksi Ujung lengket (sticky ends)

Ujung tumpul (blunt ends)

Penamaan enzim EcoRI E = genus (Escherichia) co = species (coli) R = strain

I = # of enzyme

Penyambungan (pasting) DNA

Pembentukan ikatan-H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)

Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA

Vektor untuk Mengklon

Diperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan

DNA ke dalam sel agar DNA tersebut

dapat disimpan dan diperbanyak di

dalam sel tersebut

Vektor untuk Mengklon

1 Vektor berupa plasmid

2 Vektor berupa bakteriofaga

3 Cosmid

4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)

& YAC (Yeast Artificial Chromosome)

DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad

Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain

1. Plasmid

Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu

membawa potongan DNA lain ke dalam sel

bila memiliki:

Replikator (origin of replication)

Penanda (Marker) yang mudah diseleksi (misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)

Situs untuk mengklon (potongan DNA yang

memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi

sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di

dalam daerah replikator atau penanda

Vektor untuk Mengklon

Plasmid yang Dimiliki oleh

Escherichia coli

Berasal dari plasmid alami E. coli

Potongan DNA tambahan

Potongan DNA tambahan

Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain

Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan

Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan"

Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai

Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)

1. Memiliki origin of replication dari inang yang

dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara

independen terhadap genom inang.

2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel

pembawa plasmid tersisipi DNA asing

ketahanan terhadap antibiotik ganda

penapisan biru-putih

3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple

cloning sites, MCS)

4. Mudah diisolasi dari sel inang.

Vektor berupa Plasmid

Multiple Cloning Site (MCS)

Vektor berupa Plasmid

Keunggulan:

Kecil, mudah pengerjaannya

Strategi seleksi mudah

Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran

kecil (< 10kbp)

Kelemahan:

Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan

DNA ukuran besar (> 10kbp)

Vektor berupa Plasmid

2. Bakteriofaga (l phage)

Lengan kiri:

Protein penyusun kepala

& ekor

Lengan kanan:

Sintesis DNA

Pengendalian

Lisis inang

Daerah yang dihilangkan:

integrasi & eksisi

Pengendalian

Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)

Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)

Keunggulan:

Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA

ukuran besar (10 - 23 kbp)

Seleksi berdasar ukuran

Kelemahan:

Lebih sulit pengerjaannya

Vektor berupa Bakteriofaga

Keunggulan: Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA

berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)

Seleksi berdasar ukuran

Pengerjaan seperti plasmid

Kelemahan: Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan

plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)

3. Vektor Cosmid

Vektor Cosmid

Replikasi dimediasi oriS dan oriE

parA and parB mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam sel

Menggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR

4a. Vektor BAC

Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

4b. Vecktor YAC

telomere telomere centromere

URA3 ARS HIS3

replication

origin

markers

large

inserts

Keunggulan: Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan ukuran

sangat besar (100 - 2,000 kbp)

Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa nukleotida total genom

Kelemahan: Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran sangat

besar

BACs dan YACs

BACs : Bacterial Artificial Chromosomes

YACs : Yeast Artificial Chromosomes

Ukuran DNA yang disisipkan

Ukuran vektor

Situs enzim restriksi yang tersedia

Jumlah salinan (copy number)

Efisiensi kloning

Kemampuan untuk menapis DNA sisipan

Rencana penelitian selanjutnya

Memilih Vektor

Isolasi vektor kloning (plasmid bacterial) & DNA sumber gen

Pemotongan DNA sumber gen

& vektor kloning menggunakan

enzim restriksi yang sama

Penyisipan potongan DNA

sumber gen ke dalam vektor

kloning yang telah dipotong

menggunakan enzim restriksi

yang sama; potongan

disambung dengan bantuan

enzim DNA ligase

Cara Mengklon DNA (1)

Vektor kloning yang telah

tersisipi potongan DNA

dimasukkan ke dalam sel

inang (transformasi sel

inang)

Penapisan sel pengklon

(dan gen yang

dimasukkan)

Identifikasi sel pengklon

pembawa gen yang

dikehendaki

Cara Mengklon DNA (2)

Memasukkan plasmid (yang

merupakan vektor yang telah disisipi

gen) ke dalam sel inang

Transformasi Sel Inang

PRA-INKUBASI Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi kompeten" untuk menerima plasmid .

Transformasi

INKUBASI

Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E. coli kompeten.

Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.

Transformasi

KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK) Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun

kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) kepada suhu

42 oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya

plasmid menembus membran dan dinding sel.

Transformasi

PENYEMBUHAN (RECOVERY) Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun

kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi

untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah

mengalami cekaman dan kejutan. Masa

penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu

generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45 menit)

Transformasi

PENAPISAN (SCREENING) Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan

ditapis pada medium padat yang mengandung

senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa

oleh plasmid.

Transformasi

Koloni E. coli yang membawa plasmid dengan penanda gen pendar

fluor (pGLO)

E. coli yang Membawa Plasmid pGlo

Medium pertumbuhan diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin

Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya

Penapisan Klon

Manfaat

Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat dibidang ilmu

pengetahuan maupun dibidang terapan.

Contoh:

Bidang Kesehatan:

Insulin manusia

telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan

untuk mengobati penyakit diabetis.

Merekdagang: HumulinR

Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk

mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).

Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi

secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri