동물세포를이용한

치료용단백질생산기술

나규흠 박사는 연세대학교 생명공학과를 졸업, 동 대학 대학원에서 미생물공학으로

석사를 마친 후 성균관대학교에서 제조약학으로 박사학위를 받았다. 1989년부터 현

재까지동아제약(주) 연구소바이오텍연구원에서수석연구원으로재직중에있다.

동아제약(주) 연구소바이오텍 연구원khna@donga.co.kr

나 규 흠 수석연구원

56 BIOSAFETY Vol.8 No.2

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SCHEME

동물세포 배양은 유전자변형기술을 이용하여 인간

및 동물유래의 세포를 배양하여 호르몬, 효소, 사이

토카인(cytokine), 치료용 항체 등과 같은 고부가가

치의 재조합 당단백질뿐 아니라, 레트로바이러스 및

아데노바이러스등과같은유전자전달체혹은줄기

세포, 골수세포, 연골세포와같은치료용세포들을생산하는데사용되는

기술이다. 동물세포배양기술은1950년대바이러스백신생산등에이용된

이후계속발전하여지난20여년간치료용단백질수는기하급수적으로

늘어왔다. 박테리아, 효모및식물등에비해동물세포가생산하는재조합

단백질은 그 품질과 효능이 우수하다. 최근, 동물세포 배양기

(Bioreactor)에서 배양되는 동물세포의 생산성은 많은 사례에서 리터당

수 그램(g) 수준이며, 이는 1980년대 중반에 동일한 공정에서 측정된

생산성에 비해 100배 이상 향상된것이다. 이러한단위부피당생산성의

증가는 주로 공정제어나 배지성분의 개발에 기인한 바가 크다. 벡터 및

숙주세포 조작뿐 아니라 생산시스템의 개발을 통해 동물세포 생산성을

향상시킬여지는아직충분하다.

1986년에 tPA(Human tissue Plasminogen Activator)가 재조합 동

물세포주로는 처음으로 시판 허가를 획득한 이래, 오늘날 전체 재조합

서 론

기획 ｜ 동물세포를 이용한 치료용 단백질 생산기술

57KBCH

단백질 의약품 중 약 60~70%가

동물세포에서생산되고있으며, 또

한, 제조사들의임상파이프라인에

수백 개의 후보 단백질들이 있을

것으로 추정되고 있다. 이러한 대

부분의 재조합 단백질들은 tPA의

경우와마찬가지로 CHO(Chinese

hamster ovary) 세포주에서발현

되고있으며, CHO 세포주이외에

도 NS0(mouse myeloma),

BHK(baby hamster kidney),

Sp2/0(mouse myeloma), HEK-

293(human embryo kidney), 인

간 망막세포(human retinal cell)

등이 미국 식품의약국(FDA)의 승

인을얻어재조합단백질의생산에

사용되고있다. 오늘날바이오의약

품생산을위한동물세포배양공정

은 동물세포 현탁배양이 대다수를

차지하고 있지만, 실제 제조에는

다양한방법들이사용되고있다.

급속한 과학의

발달과 경제적

성장은 인간의

건강에 대한

욕구를증가시

켰고, 이러한 욕구는 바이오 의

약품 시장의 성장을 더욱 가속시

켰다. 수요 급증이라는 상황에서

유전자변형에의한제품의생산은

빠른 생산속도와 정확한 재현성

등의 장점으로 인하여 미생물이

이용되어 왔다. 현재까지 보고된

동물세포의 수율은 약 5g/L이며,

이것은 세균이나 효모 등에 비해

여전히 3배 정도 낮은 수율이다.

형태를 갖는 것이 무엇보다 중요

하다. 오로지동물세포만이이러한

일들을완벽하게해낼수있다(표1).

동물세포를 이용하여 재조합

단백질을생산하는데있어세포주는

단위세포당 높은 생산성, 세포내

도입된유전자의안정성, 단백질이

세포밖으로분비되는특성, 바이오

리액터의 스케일업을 위한 현탁

배양 가능 등의 특징을 가져야

한다. CHO 세포는이러한조건을

만족시키는 세포주로서 1957년

Puck 등에 의해 중국 햄스터의

난소로부터 처음 개발된 이래

재조합 단백질 생산에 가장 널리

사용되고있다. CHO 세포는다음과

같은장점을갖고있다.

동물세포가가지는장점

그러나미생물을이용한생산에서는

단백질이 세포 밖으로 분비되지

못하고 세포 내에 단백질 덩어리

(inclusion body)로 생성되는

문제점을안고있다. 또한, 단백질의

활성에꼭필요한당쇄부가를위한

‘번역후 수식’(post-transla-

tional modification)과 같은

추가적인 과정이 없으며, 종종

단백질의 N-말단에 메티오닌

(methionine)이 붙어 나오므로

이를 별도로 제거해야 하는 등의

불편함을안고있다. 따라서완전한

생물학적 활성을 갖는 치료용

단백질을생산하기위해서는접힘

(folding), 조합(assembly), 번역후

수식등이적절하게일어나천연형

단백질과 거의 동등 수준의 분자

* 출처 : Nevalainen et al. TRENDS in Biotecnology 23, 468 (2005)

표 1·재조합단백질생산시스템비교

특 성 대장균 동물세포 식물세포

Cell growth Hours to day Weeks Months

Cost of growth medium Low to medium Low to high Medium to high

Expression level Low to high Low to high Low

Secretion capability Secretion to Secretion to Secretion toperiplasm medium medium

Post-translational modification

Protein folding Refolding usually proper folding Profer foldingrequired

N-linked glycosylation No Yes Yes

O-linked glycosylation No Yes Yes

Phosphorylation No Yes Yes

Acetylation No Yes Yes

Acylation No Yes Yes

58 BIOSAFETY Vol.8 No.2

▲형질전환이용이하고배지내에서

빠르게 성장한다 ▲높은 클로닝

효율과 안정적 핵형을 갖는다 ▲

DHFR 유전자가 결손된 변이체로

DHFR 유전자를 선별 마커로 사

용할 수 있고, MTX(methotrex-

ate)를 이용한 유전자 증폭이 가

능하다 ▲많은 병원성 바이러스

(Polio, Herpes, Hepatitis B,

HIV, Measles, Adenovirus 등)가

세포내에서잘증식하지않는등의

안전성이입증되었다▲무혈청상

태에서현탁배양이가능해혈청사

용에서 나타나는 동물유래 바이

러스의문제점, 단백질분리정제의

어려움등을극복할수있고스케일

업을통한대량배양이용이하다.

따라서, CHO 세포는 수많은 동물

세포 중 tPA(tissue Plasminogen

Activator), EPO(ErythroPoietin),

Interferon-β, CSF (Colony

하게 된다. 가장 널리 사용되는 선

별유전자로는핵산의대사에관여

하는 효소인 dihydrofolate

reductase(DHFR), 암모니아와

루타메이트(glutamate)로부터

루타민을 합성하는 효소인

glutamine synthetase(GS)이다.

두경우에서선별유전자가도입되지

않은 세포, 즉 비 형질전환 세포

(nontransformed cell)는세포의

성장에 필요한 적절한 대사산물-

DHFR의 경우 hypoxanthine과

thymidine, GS의경우 루타민이

결핍된배지내에서자랄수없고,

오로지 DHFR 유전자나 GS

유전자를 가지고 있는 형질전환

세포(transformed cell)만 살아

남게됨으로써선별이이루어지게

되는 것이다. Dihydrofolate

reductase는 핵산(nucleoside)

합성에 관여하는 효소로 DHFR

Stimulating Factor), FVIII

(FactorVIII), FIX(FactorIX), IL-

2(Interleukin-2) 등바이오의약품

생산에 가장 널리 사용되어 왔고,

고농도 CHO 세포배양기술은많은

종류의바이오의약품생산에적용

되어왔다.

동물세포를

이용한 재조합

단백질의 생산

공정은 일반적

으로 확립된

방법에 따라 이루어진다(그림 1).

먼저발현시키고자하는유전자를

전사조절에 필요한 인자와 함께

조합하여 세포 내로 넣어준다. 그

후세포선별에필요한두번째유

전자를넣어준다. 세포로유전자이

입이 완료된 후 선별 약물의 존

재 하에서 배양하면 수일 내에 선

별유전자를발현하는세포만생존

생산과정

Gene transfer

LinearizeProtein o.i.

Selector

Select

Clonal,cell lines

Transfect

Minimum 12 months

Screening Process development

Protein o.i. Se

lector

그림 1·재조합단백질생산을위한세포주제조부터세포배양공정까지의과정

* 출처 : Wurm, F.M. Nature Biotechnology 22, 1393 (2004)

기획 ｜ 동물세포를 이용한 치료용 단백질 생산기술

59KBCH

유전자를 가지고 있는 형질전환

세포는이를이용하여 hypoxan-

thine과 thymidine 같은 핵산을

합성함으로써핵산이없는배지에

서도 잘 자라게 되는 것이다.

또한, 루타민은 세포가 성장

하는데필요한필수아미노산인데,

GS 유전자가 도입된 형질전환

세포는 배지 내에 결핍된 루

타민을 이 효소를 이용하여 효과

적으로합성함으로써살아남을수

있게되는것이다. 현재까지FDA의

승인을받은치료용항체를포함한

재조합단백질치료제생산에가장

널리 사용되는 세포주로는 CHO

세포와 NS 0세포를 들 수 있는데

CHO 세포의 경우 DHFR 선별유

전자가 주로 사용되고, NS0 세포

는 GS 선별유전자를 주로 사용

한다. 세포선별후얻어진생존세

포는단일세포로서다음배양용기

로 옮겨진 다음 단일세포군 형성

을 위해 세포수를 불리기 위한 배

양이 진행된다. 궁극적으로 개별

클론들의 재조합 단백질 발현에

대한 평가가 이루어지며, 향후 배

양과 분석을 위해 높은 생산성을

갖는세포만남게되는것이다. 이

러한후보군 중 최종적으로 적합

한 생육특성과 높은 생산성을 갖

는단일세포만이선택되어재조합

단백질생산을위한생산세포주로

사용된다. 세포주선별이완료되어

생산세포주가결정되면생산요구에

따라 배양공정을 확립하게 된다.

현재까지의모든동물세포를이용한

재조합치료제는원래세포밖으로

분비되거나 혹은 세포 밖으로

분비되도록 유전자를 조작하여

개발되어왔다.

재조합 세포

주의생산성은

지난 20여년

동안 급격히

증가해 왔다.

2004년에수행된실제생산공정과

1986년의전형적인바이오리액터를

이용한생산공정에서유추한자료를

비교해 보면 그 차이를 실감할 수

있다. 1986년자료를보면, 세포의

농도는일주일의회분식생산기간에

최대 약 2x106cells/ml의 농도를

기록하 고, 비생산성은10pg/cell/

day에미치지못해결국생산량은

약 50mg/l 정도 수준이었다.

2004년에수행된공정에서배양은

약 1x105cells/ml의낮은농도에서

시작하여 1x107cells/ml 이상의

세포농도로 급증하 다. 높은

세포생존율이거의 3주동안유지

생산성향상

1,000

100

10

1

0 100 200 300 400 500

100

80

60

40

20

0Viable cell concentra

tion(10E5/m

l)

Antibod

y prod

uction(mg/l)

Viability(%

)

Time(h) Time(h)

Viability

Viable cellsprocess process

A B

2004 2004 process 1986 process1986

5,000

4,000

3,000

2,000

1,000

00 100 200 300 400 500

50

40

30

20

10

00 50 100 150 200

그림 2·1986년과 2004년의세포배양공정비교

* 출처 : Wurm, F.M. Nature Biotechnology 22, 1393 (2004)

60 BIOSAFETY Vol.8 No.2

(enhencer)를 사용한다. 대개의

경우, 원하는 단백질 유전자는

인트론(intron)이 없는 cDNA로

얻어진다. 하지만 진핵세포에서

mRNA의효율적인세포질내이동

이나단백질로의번역은스프라이싱

(splicing)에 크게 의존한다. 현재

사용되는 대부분의 발현 벡터는

프로모터와 cDNA 서열 사이에

적어도하나의인트론을포함하고

있다. 코딩부위자체를변화시키는

것으로도 유전자 발현 레벨을

증가시킬 수 있다. 예를 들어, 잘

사용되지 않고 낮은 수준으로

발현되는 tRNA 코돈을 발현이

잘되는 흔한 코돈으로 바꾸어

줌으로써발현이잘되는유전자로

개선시킬수있다.

1973년 Graham과 van der Eb는

DNA와인산칼슘액에세포를노출

시키면DNA가배양된세포안으로

들어갈수있다는것을과학적으로

증명하 다. 안정한생산세포주를

제조하는 방법으로 바이러스를

이용하지않는유전자전달방법이

널리 사용되고 있는데, 그중 염산

칼슘법, 전기천공법(electropo-

ration), 리포펙틴법(lipofection),

중합체이용법등이널리사용되고

있으며, 이 방법들은 형질전환

효율이비교적높고신뢰할수있는

방법들이다. 이중어떤방법이가장

효율적인가 하는 것은 포괄적인

비교연구가없기때문에, 어느쪽이

우월하다고평가하기는힘들다.

되었으며, 축적된단백질의농도는

약 4.7g/l이며 비생산성은 90pg/

cell/day 이상이었다(그림2).

또한, 그림 2A의음 처리된부분

은 축적된 생존세포수가 1986년

에 수행된 전형적인 공정에 비해

2004년에 17배가 증가하 음을

보여주고 있다. 오늘날 배양공정

에서의 높은 생산성은 동물세포

내에서의유전자발현, 대사, 성장,

세포사멸 지연 등에 대한 과학적

지식이 축적된 결과이다. 이러한

노력의 결과 유전자 전달체, 숙주

세포 조작, 배지 개발, 스크리닝

방법및공정개발에있어획기적인

진보를 가져왔다. 여기에서 논의

되는 개념들은 공개된 자료들을

바탕으로 기술하 으므로 현재

치료용 단백질 제조사들에 의해

사용되어지는 생산공정을 정확히

반 하지 않을 수도 있다. 대량

생산공정에서높은생산성을갖고

있는 기업들은 이러한 공정에

사용된 방법들을 공개하지 않을

뿐만 아니라, 벡터 제작에서 생산

공정까지의 전 제조공정에 대해

공개를꺼리고있다.

일반적으로

재조합 세포

주를제조하기

위해사용되는

발현벡터에는

유전자 발현을 유도하기 위하여

바이러스나세포에서유래된고효율

프로모터(promoter)나 인헨서

목적단백질유전자와선별유전자는

동일벡터내에존재할수도있고,

혹은 서로 다른 벡터 내에 존재할

수도있다. 두유전자가동일벡터

상에존재할때에는하나의 poly-

cistronic mRNA로부터발현되어

진다. 이때 보다 높은 생산성의

세포주를 얻기 위해서는 목적

단백질의유전자는강한프로모터를

사용하고 선별유전자는 비교적

약한 프로모터를 사용하게 된다.

이럴 경우 형질전환 효율은 감소

하지만 높은 생산성을 갖는 세포

주를얻을확률이높아지게된다.

형질전환을하기전에미리플라스

미드를 절단하여 선형화시키면

형질전환 효율을 증가시킬 수

있지만, supercoil된플라스미드는

핵속에서1∼2시간후에DNA 분해

효소(nuclease)에 의해 절단되어

선형화될수있다. DNA 연결효소

(ligase)는이러한개별플라스미드

DNA 몇 가닥을 하나로 연결하고

재조합 효소(recombination

enzyme)는이렇게연결된중합체나

연결되지않은하나의플라스미드를

비상동성 재조합(nonhomolo-

gous recombination)이라는과정을

통해 숙주세포 DNA 내에 무작위

적으로 삽입시킨다. 따라서 한

부위에종종여러개의플라스미드

중합체가삽입되는것은숙주세포

DNA에삽입되기전에플라스미드

DNA끼리 연결되었다는 것을

의미하는것이다.

DNA 전달과염색체내삽입

기획 ｜ 동물세포를 이용한 치료용 단백질 생산기술

61KBCH

유전자삽입시전사가활발히일어

나고있는고활성부위를찾는것이

무엇보다도중요하다. 활성부위를

찾지 못하게 되면, 플라스미드

DNA는 무작위적으로 삽입될 것

이고, 소위좋은부위에삽입된것

들을찾기위해수백개의클론들을

스크리닝해야할것이다.

몇몇선두업체

들이세포배양

을 위한 질좋

은 산업용 배

지를공급한다

고는 하지만, 재조합 단백질 생

산을 주도하는 업체들은 그들 자

체의 배지조성 최적화를 위해서

막대한 노력을 기울이고 있다. 일

반적으로 하나의 제조과정에는 각

단위공정에적합한여러가지조성

의 배지가 필요하게 된다. 매 3일

∼5일 간의 계대배양을비롯한성

장단계에서의배지는생산용배지와

는다른조성을가지고 있다. 회분

식(6∼8일)이나 유가식(10∼21일)

배양에서 생산단계는 보통의 계대

배양 기간보다는 훨씬 길다. 이때

배지개발이매우중요하고각공정

과세포주에적합한배지개발이이

루어져야한다.

과거에는 우태아혈청(fetal bovine

serum)을 1∼20%의 농도로 첨가

하여동물세포를배양하는것이관

행이었으나, 오늘날대부분의대량

배양공정은 무혈청(serum-free)

배지에서 수행되고 있다. 최근에

개발된 배지조성은 혈청에서 제공

되던펩타이드나성장인자혹은단

백질·지질·탄수화물·화학물질

등의복합물없이도우수한세포배

양 성능을 나타낸다. 배지에서 혈

청을제거하는이유는혈청자체의

불확실성과소유래바이러스나프

리온(prion)과 같은 외인성 물질

및비용적인측면때문이다.

배지와마찬가지로숙주세포도진

화를 거듭하고 있다. 고생산성 세

포주들은 세포생존율을 감소시키

는 향인자들에 대한 저항력을

높이거나 세포성장을 촉진시키는

유전자를지니도록유전적으로보

강된 세포주들이다. 재조합 숙주

세포의 성장률, 생존율 및 생산성

등이유전공학기술을통해얼마나

향상될 수 있는지는 대학 등 학술

기관에서 배포한 보고서를 보면

알 수 있다. 예를 들어, 발암 유전

자, 세포주기조절유전자(cyclins),

성장인자 유전자(IGF-I), 항세포

사멸 유전자 등을 세포 내에 삽입

하면 우수한 생산세포주를 만들

수있다. 불행히도, 산업체연구소

들은 이러한 역의 결과들을 발

표하지 않았는데, 이것은 아마도

지적재산권과관련이있는듯하다.

(그림 2)에서 한주 간에 10만

cells/mL로부터1,000만 cells/mL

이상으로빠르게성장하는세포주

는 최근까지 문헌에 보고된 어떤

세포보다도놀랄만큼건강한세포

주이다. 흥미로운것은이한주동

안에는 생산성이 매우 낮았다는

것이다. 결국, 성장곡선은 양분

의 공급부족 및 젖산이나 암모니

아 같은 세포의 대사산물로 정점

에 다다르게 된다. 그후 세포사멸

의 유도와 세포생존율의 급락과

같은배양환경의변화가초래되는

데, 그림에서는 세포사멸이 거의

2주간 지연되었고, 그 기간 동안

세포는 아주 안정적으로 높은 생

산성을 유지할 수 있었다. 그러나

이와 같은 현상은 탄수화물, 아미

노산, 지질, 핵산 전구체 및 금속

이온 등의 주입이 적절히 이루어

졌을때에만가능한일이다.

외부유전자를

도입한세포를

선별하는 시

스템은 여러

가지가 있다.

Neomycin, hygromycin, puro-

mycin 같은 항생제 내성을 갖는

세포를 선별하는 방식도 있지만,

아직까지도 가장 널리 사용되는

방법은 DHFR 활성이 제거된

CHO 세포에 DHFR 유전자를 도

입한 후 DHFR 활성을 얻게된 세

포주만을 선별하는 방식이다. 세

포주선별방식을정하는데있어서

주요 고려대상은 선택성, 즉 선별

력이다. 선별력이 높은 방식을 사

용할 경우 특정 유전자가 제대로

발현되는 세포를 선별할 수 있을

뿐 아니라, 대부분 고농도로 발현

되는세포주를선별할수있다. 따

숙주세포조작과배지최적화

유전자증폭과세포주선별

62 BIOSAFETY Vol.8 No.2

라서 선별력이 높으면 높을수록

후보세포주를선별하는데필요한

작업량이줄어든다.

DHFR 시스템은DHFR 활성을억

제하는MTX(Methotrexate)를후

보세포주에처리하는방식을통해

도입 유전자를 증폭시킨다. MTX

에 노출된 세포들은 2∼3주 내에

거의대부분죽게되고, DHFR 유

전자와함께도입유전자가증폭되

어고발현된소수의세포들만이살

아남게 된다. 처리하는 MTX 농도

를단계적으로높여주면세포 염새

체 사이에 삽입되어, 들어가있는

외부유전자가DHFR 유전자와함

께 증폭되면서 외부 유전자가 수

백 개에서 수천 개 카피로늘어난

세포주도 생겨나게 된다. 보통 이

런 식으로 증폭된 세포들은 증폭

되지 않은 세포보다 많은 양의 재

조합단백질을생산하지만, 생산성

이 증가하는 폭(최고 10~20배)은

개개클론들마다다르다.

NS0 세포에 GS를 도입하는 방식

등을 통해 모세포에서의 단백질

발현량을 충분히 늘릴 수 있다면

유전자 증폭과정은 꼭 수행하지

않아도무방하다. GS는세포를키

우면서어쩔수없이생기는유해

물질인 암모니아와 루타메이트

(glutamate)를 결합하여 루

타민(glutamine)을 만드는 효소

이다. 따라서이GS 시스템은배지

내의해로운암모니아수위를낮추

어 주는 동시에 불안정한 아미노

산인 루타민을 공급하는 두 가

지의장점을가지고있다. GS만을

비가역적으로 억제하기 위해서는

MSX(Methionine Sulphox

Imine)을 사용한다. 10~100uM

정도의 MSX 농도 상에서저항력

을 가져 살아남는 NS0 세포의 경

우 GS 유전자와 재조합 발현유전

자가 함께 증폭되어 나타난다. 유

전자 증폭과정을 거치면서 각각

클론들의단백질발현량은엄청난

차이가생기게된다.

따라서고발현세포주를선별하는

과정은 수백 개의 클론을 대상으

로추려내야하는매우지루하고도

고된 작업이다. 클론을 선별하는

방법 중 가장 널리 사용되는 방법

은 멀티웰 플레이트(Multi-well

Plate)를 사용하여 한계 희석하는

방식이다. 또는 유리나 금속으로

된 클로닝 고리를 사용하여 물리

적으로 클론들 사이를 떨어뜨린

다음 세포에 효소처리를 하고 마

이크로피펫(Micropipette)을 사

용해 세포들을 클로닝 고리에서

떼어내는 방식도 있다. 군집을 형

성한 세포들 위로 면봉을 스치듯

이 클론을 분리해내는 방법도 있

지만, 요즘 실제 산업용으로는 이

러한 전통적인 방식 대신에 세포

정렬(sorting)이나 로봇을 사용해

서 세포주를 선별하는 방법이 사

용되고 있다. 이러한 방법들은 후

보 세포주들을 선별하는 데에 드

는노동력을크게줄여준다.

기획 ｜ 동물세포를 이용한 치료용 단백질 생산기술

63KBCH

고농도가필요한단일클론항체의

경우 이미 선별 초기상태에서 생

산성이20 pg/cell/day 이하인클

론들은 제외된다. 높은 생산성을

가지는세포주들을선별하기위해

서 여러 번의 형질전환 과정을 거

치기도 하는데, 이는 한번 형질전

환을 진행하 을 때 제대로 외부

유전자가 도입되는 세포의 수가

많지 않기 때문이다. 한 형질전환

플레이트에서 안정된 세포주를

500에서 1,000개 정도 만들기도

힘들다. 생산 세포주를 선별할 때

에는 세포의 성장속도도 같이 고

려되어야 한다. 보통 세포주가 매

우 높은 생산성을 가지고 있으면

느리게 자라게 되지만, 빠르게 자

라고 높은 생산성까지 가지고 있

다면산업적으로생산규모를늘리

는작업이수월해진다.

또 하나 중요하게 고려될 사항은

세포주를 장기간 동안 계대배양

했을 때 안정성을 가지는지에 대

한 문제이다. 생산에 사용되는 모

세포주가안정한지에대해판단할

때는 세포가 원래 가지고 있는 유

전적특성과생리학적인불균일성

에 대해서도 충분히 분석이 이루

어져야한다. 이작업은수개월이

걸리기도 하는데, 최근 논문에서

GS-NS0 시스템으로 만들어진

세포주들이생산에안정성을가진

다고보고된바있다. 몇몇세포주

에 대해서는 배양하는 동안 MTX

를 선택 약물로 계속 투여하는 것

이세포주를‘안정’하게유지시키

는 듯 보이지만, 유전학적으로 보

았을 때 이러한 선택 약물이 있는

상태에서는 세포질이 불균일해지

고, 모세포주의 조절과정 상에서

원치 않는 변화가 일어날 수 있다

고알려져있다. 따라서적당한세

포주가 선별되면 선택 약물을 제

거하는편이유리하다.

세포주에 대한

안전관리는 바

이오의약품 생

산에 있어 가

장 근원적인

요소로서 이에 대한 철저한 관리

없이는우수한품질의바이오의약

품 생산이 불가능하다. 바이오의

약품의 성공적인 개발을 위해서

는 효율적인 세포은행 (Cell

Bank) 구축이 필수적이다. 1963

년 세포은행협회(Cell Culture

Committee)에서 최초로 MCB

(Master Cell Bank)와 WCB

(Working Cell Bank)의 이분화

된 시스템이 제시되었고 오늘날

생산세포주의 확립시 보편적으로

사용되고있다. MCB는최초의클

론으로부터 직접 혹은 최초의 클

론에서유래된예비세포은행으로

부터제조된단일구성의세포들로

서 WCB의 제조에 사용된다.

MCB는 제품개발의 첫 단추로써

제품의임상개발뿐아니라궁극적

으로 시장에 출시된 후 수 십년간

균일한 제품이 공급될 수 있게 하

는 제품 개발과정의 중요한 부분

을 이룬다. 한편, WCB는 MCB

바이알(혹은 앰플) 한개 또는 그

이상으로부터유래한균질한세포

들로서 생산공정 중의 제조용 종

세포(Seed Cell)로서 공급되며

MCB가 주로 초기 임상개발에 사

용되는데반해, WCB는제품개발

의 후반부와 출시된 제품의 생산

에 사용된다. 세포유래 생물공학

제제의 질을 저하시키는 원인인

제조공정상오염이나불균일한생

산성은 제조공정 중 외부로부터

바이러스, 세균, 마이코플라즈마,

미세먼지 등의 외래 오염원의 혼

입에기인될수도있으나, 그제제

를제조하는데사용되는생산세포

주 자체의 특성에서 비롯될 수 있

다. 이러한 세포 기질(Cell sub-

strate)의 특성이나 이와 관련된

여러 인자들이 제품의 질이나 안

전성에 향을 미칠 수 있으므로,

제품의효과적인품질관리를위해

세포기질과관련된규제와평가가

동시에 이루어져야 한다. 따라서

바이오 의약품을 제조하기 위해

사용되는 동물세포주의 기원 및

유래를조사하고생산에사용되는

세포은행들의 특성분석이 실시되

어야 한다. 이러한 세포은행의 특

성분석을 위해서는 형태 분석, 동

종효소 분석 및 유전형 분석 등을

통한 확인시험과 생산 전후의 재

조합 발현 구조체의 코딩서열, 제

한효소지도, 유전자카피수등의

핵산 분석이나 생산물 분석 등을

통한유전적안정성이수행되어야

한다. 또한 세균, 곰팡이, 마이코

세포주은행

64 BIOSAFETY Vol.8 No.2

플라즈마, 외인성 바이러스, 종특

이 바이러스, 레트로바이러스 시

험 등 매우 광범위한 시험을 수행

하여세포은행이외래성미생물과

바이러스등의세포오염원으로부

터 오염되지 않았다는 것을 검증

해야한다(표2).

포유동물 세포

에서 재조합

단백질을 생산

하는 방법은

부착 세포배양

과 현탁세포배양의 두 가지 방식

이 있다. 이 중 현탁 세포배양이

더일반적으로사용되고있다.

| 1 | 부착세포배양

에리스로포이에틴(Erythropoietin,

Epogen , 암젠)은 연 매출 10억

달러를 넘는 블록버스터 약품이

된 최초의 동물세포 유래 재조합

표 2·세포주특성분석항목

Concern Assay MCB WCB PPCB*

Microbial ContaminationSterility + + +

Mycoplasma + + +

IdentificationCell growth and morphology + + +

Isoenzyme + + +

Adventitious Viruses

In vitro assay for adventitious + + +viral contaminants

In vivo assay for adventitious viral + + +contaminants

Reverse transcriptase + - +

RetrovirusesExtended XC plaque + - +

Extended mink S+L- focus + - +

TEM + - +

Specific Rodent VirusHamster Antibody Production + - -

Mouse Antibody Production + - -

Other ConcernsBovine virus assay + - -

Porcine virus assay + - -

Copy number + - -

Gene sequence + - +

Genetic CharacterizationRestriction enzyme map + + +

Isozyme analysis + + +

Insertion sites + - -

Northern blot + - -

Specific growth rate + + -

PerformanceSpecific productivity + + +

Cell viability + + -

Product expression stability - + -

주) PPCB : Post-Production Cell Bank * 출처 : BioReliance, www.bioreliance.com

세포배양형식

기획 ｜ 동물세포를 이용한 치료용 단백질 생산기술

65KBCH

단백질이다. 전체 용량의 10∼

30% 되게 배지를 넣어준 롤러 용

기(roller bottle)에 CHO 세포를

넣어주고세포가바닥에부착할수

있도록천천히회전시킨다. 세포는

늘 배지에 젖어 있어야 하고 산소

는용기내공간부분에서공급된다.

몇일간의세포성장을통해세포가

포화상태에 이르면 배양상등액으

로부터생산이이루어진다. 작업하

는 롤러 용기의 수가 규모를 결정

하기 때문에 이 공정은 스케일업

(scale-up)이 용이하다. 리터당

50-200 리그램(mg) 범위의 생

산이 가능하며 연간 킬로그램(kg)

단위의 단백질을 생산할 수 있다.

단위 부피당 세포농도가 최적화된

교반 탱크 반응기 공정보다 훨씬

낮기 때문에 리터당 그램 단위의

생산공정개발은어렵다. 오늘날의

Epogen 공정은 로봇기반 생산공

정으로, 세포 접종, 배지 교환, 상

등액 수거 등의 주요 조작공정이

무균실내에서사람의접촉이없이

로봇에의해이루어지고있다.

또한, 부착세포는 교반탱크 내에

서 현탁상태로 유지되는 마이크

로캐리어(microcarrier)라고 하

는 고분자 구면에 부착시켜 배양

할 수 있다. 이 공정은 바이오리

액터 상에서 스케일업이 용이하

다. 마이크로캐리어를 이용한

CHO 세포배양은 난포자극 호르

몬(follicle stimulating hor-

mone)과 바이러스 백신 생산에

널리이용되어왔다.

| 2 | 현탁세포배양

CHO 세포는 현재 단일세포 현탁

배양에 대한 타고난 능력으로 재

조합 단백질의 대량생산에 가장

널리 사용되고 있다. 그외 현탁배

양이 잘 되는 세포주로는 마우스

골수종 유래 NS0, BHK(baby

hanster ovary), HEK-293 및

인간 망막유래 PER-C6 등이 있

다. 혈액유래세포(NS0)를제외하

고는대부분의세포주들은부착의

존적 특성을 유지하기 때문에 현

탁배양 적응에 많은 노력이 필요

하다. 1980년대에는 부착세포를

현탁배양으로적응시키는것이어

려웠으나, 현재는 상업적으로 이

용가능한배지조성의개발로적응

이훨씬수월해졌다. 하지만, 현탁

배양 적응을 위해 여러 가지 조성

의 배지를 스크리닝하는 노력은

여전히 필요하다. 일반적으로, 한

세포주가현탁배양용배지에서 6

계대 이상 성장해야 하고, 계대배

양 3~4일 내에 세포농도가 최소

2 X 106 cells/ml에 도달해야만

스케일업에대해고려할수있다.

단순 회분식 생산공정이나 유가식

생산공정에서 큰 규모로의 스케일

업은 바이오리액터에서 배양된 내

용물을미리예열된5~20배의신선

한배지를포함하는대용량의바이

오리액터에희석시킴으로써이루어

진다. 보관중인세포를녹이는것에

서부터 시작하여 생산용기에 담기

까지의전과정은파종(seed train),

66 BIOSAFETY Vol.8 No.2

접종(inoculum train), 생산의 3단

계로구성되어있다. 파종단계는대

개정해진기간동안에생산에사용

될신선한세포를공급하도록작은

규모로 이루어진다. 접종단계는 파

종단계의작은용량의세포주현탁

액으로부터 시작하여 최종 생산단

계에사용될충분한양의세포수를

생산하도록그규모가확장된다. 한

세포주에 최적화된 공정조건이 다

른세포주에적용되기는매우어렵

다. 이는 각 동물 세포주들은 각기

서로다른특성을갖고있기때문인

데, 예를들어, 포도당소비율, 젖산

생성률, 스트레스신호에대한민감

도등이서로다르기때문이다.

생산라인의 생산능력과 생산성이

배양종료시점을주로결정하기도

하지만, 또다른중대요소는생산

된제품에대한품질요소이다. 생

산기간 동안 변화된 배지조성과

세포가 배출하는 효소에 의한 분

해로 인해 초기 합성되어 축적된

제품의 품질이 향을 받을 수 있

다. 또한, 에너지원 및 전구체로

사용되는 양원이 감소함으로써

생산된 제품의 분자조성이 변할

수도있다. 하지만재현성있는생

산공정은 최소한의 분자 변이를

갖는, 즉일정한기준내의단백질

을 지속적으로 생산해 낼 수 있는

공정이다.

동물세포를 이

용한 치료용

단백질의 대랭

생산에 사용되

는 현탁 배양

방법으로는일정량의배지로만세

포를 배양하는 회분식(batch), 농

축된 배지를 추가적으로 공급해

배양기간을 늘려주는 유가식

(fed-batch), 새배지를연속적으

로 배양기에 공급하고 배양액을

연속적으로 제거하는 연속식

(continuous perfusion) 배양공

정으로나눌수있다(표3).

오늘날 높은 생산성을 갖는 대부

현탁배양방법

* 출처 : Butler, M. Applied Microbiology Biotechnology 68, 283-291 (2005)

표 3·각세포배양방법의장단점

배양방식 장 점 단 점

Roller bottleEasy to handle Time-consuming because of multiple unitsDirect transfer from lab to production No monitoring of the process

Inhomogeneous

HomogeneousEasy to scale-up Gradients during the run

Batch Fed-batch Partially controllable Accumulation of toxic metabolitesDepleted nutrients replaceable Decrease of viability during the runPlant is flexible for various products

High cell densityControllable Long and complicated validation procedure

Continuous perfusionAdjustment od culture conditions Less flexibilityNo gradients Plant is designed for special productReal steady state possibleSmall-scale core reactor

기획 ｜ 동물세포를 이용한 치료용 단백질 생산기술

67KBCH

68 BIOSAFETY Vol.8 No.2

분의공정들은배지성분들을조금

씩 혹은 반연속적으로 첨가해 주

는 유가식 배양방식이다. 이러한

유가식 공정의 개발을 위해서는

세포주와 생산물에 대한 정확한

이해가요구되고이러한공정개발

은 3상 임상과 발매 이후에 제품

을공급하는공정에적용되곤한다.

제조를 위한 또 다른 방법은 연속

식 생산공정이다. 연속식 공정은

회분식이나유가식배양보다훨씬

고농도로 세포를 배양할 수 있고,

몇주혹은몇개월간의배양기간

동안반복적으로생산물을수확할

수 있다. 반응기 용량의 몇 배에

해당하는 신선한 배지를 매일 배

양액에 첨가하는 대신 동일한 양

만큼 반응기에서 빼내 수확하는

시스템이다. 연간 시장에서 약

150그램을 필요로 하는 혈액응고

제8인자(FactorⅧ, Kogenate,

Bayer)는 현탁배양 BHK 세포주

를연속식배양공정으로생산하고

있다. 연속식 배양을 통해 수확되

는 혈액응고 제8인자는 현재까지

바이오리액터에서 생산되는 분자

량이가장큰단백질(2,322 amino

acids)이다. 이과정은6개월간의

매우정교하게조절되는고난이도

공정으로 혈액응고 제8인자와 같

이 불안정한 단백질을 고품질로

재현성 있게 생산해내는 최선의

방법이다.

재조합 단백질

의약품은 지난

20년간바이오

산업의 핵심

사업 역을

구축해 왔고, 그 시장규모는 2010

년에는 530억달러에이를것으로

전망되고 있다. 특히, 동물세포를

이용한 치료용 항체 시장은 2004

년 85억 달러에서 시작하여 연평

균 21%씩 성장하여 2010년에는

260억달러로단백질치료제시장

을 앞설 것으로 보인다. 동물세포

는 현재까지 허가된 제품 수와 생

산성 측면에서 미생물계를 능가한

다. FDA에서 허가된 재조합 단백

질의 60~70%는 CHO 및 NS0 등

동물세포에 의해 생산되고 있고,

이러한현상은논문을통해서도잘

나타나고 있다. 복잡하고 수식된

단백질들을 생산하기 위해서는 생

산에 사용되는 동물세포주에 대한

생물학적 이해를 돕는 과학기술이

선도되어야 한다. 이러한 이해를

통해단순한회분식배양에서도높

은세포수를얻는수있는것이다.

그동안제품의품질을유지하면서

생산성을 높이는 방법, 배지 중에

동물유래 성분을 제거하는 일, 대

용량 배양에서 오염을 줄이는 일,

배지 중에 이산화탄소와 암모니아

를 제거하는 방법 등에 대한 연구

가폭넓게진행되어왔고, 어느정

도는 가시적인 성과를 거두고 있

다. 반응기에서 세포를 고농도로

배양하기위한노력은계속될것이

고, 이는보다높은생산성을이끄

는원동력이될것이다. 기억해두

어야할 것은 세포농도가

10x106cells/ml일 때 세포의 직경

은 보통 10~15um 이므로 반응기

에서세포가차지하는체적은전체

의 약 2~3%에 해당한다는 것이

다. 그에반해미생물배양은세포

체적이전체의30% 이상을차지하

고 있다. 따라서 동물세포 배양에

서는세포량을증가시킬여지가충

분히남아있다고할수있다.

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참고문헌

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