YYO. Veı.Fak.Oerg. 5(1-2) 113-120, 1994

VAN'DA SA TILAN.SÜTLERDE AMPİsİLİN KALINTILAIUNIN TAYİNİ vE

ıSıTMANIN Al\fllİSiLiN ÜZERİNE ETKİsİ

Hülya Sağınaıılıgil ı Haluk Testercci 2 İdris Türe ı 3 Tahir Kahraman4 A1i Ertekin4

Delerminaıion of Amııicillin Residues in Milks Sold ai Van and Healing Effect on AmJlicillin

Summary: Aıııpicillin residues have been deterıııined in ıı,ilk saId in Vali ıııarkets by higlı performance liquid chroıııatograplıy. Aıııpicilfin has been derivatized to ıııeasure wilh jlııorescence de/ector. No aıııpiciIlin residile ıvere

found in 26 saıııples o/ıııilks, EJJeets of leaving aıııpicillin at + 950 C with 30, 60, 90 120 minııtes

intervol, +2(f>C and + 850 C have been exmııined Aıııpicillin eoncenlration has signifieant~y decreased with tiıııe al +950 C (at /east P<O. 05). About 12-54% lass in ampicillin eoncentration with heal were foıınt!.

Leal'ing the mııpieillin added Illi/k al +850C for one minıı/es (pasteurization) h.u/ no ejJeet on aıııpicillin concentratiol1.

Key Words: Aıııpicillin, Milk , Residue, HPLC. Henl Özet: Van ıııarketlerinde Salı/an sütlerde aıııpisilin kalmtısı yüksek

perforıııanslı sıl'l kroıııatografisi ile tayin e(li/di. Ampisi/ini jlııoresan detektörle Olçebilmek için derivalize edildi. 26 süt numunesınde aıııpisi/in ka/mtlSI bulunamadı.

Aıııpisilini +95° C '(le 30, 60, 90, J 20 dakika aralıklarla, + 2ifC ve +85"Cye ıııarıız bırakmanm etkisi incelendi, Ampisilin konsantrasyonu +95 Oc de zamanla önemli oranda azaldı (en az P< 0.05). 1s1 ile Olupisilin konsantrasyonun{la yakınşık % /2~54 arasında bir azalmanın Oll/Ştııglı sap/andı.

Aıııpisilin eklen/lliş siltleri +850 C de 1 dakika bırakıımmn (past6rizmyonun) aıııpisifin kOnSf1Iılra:.yonu ü=erine hiç bir eıkisi ,voktıı/"

Anahtar Kelime/er: Ampisilin, Süt, Kalmtı, HPLC, IsI

l:Yrd.Ooç.Or., Yüzüncü Vıl Üniversitesi, Veteriner Fakültesi,fa,rmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı, Van-TÜRKİVE

2: Yrd.Doç. Dr. , Yüzüncü Yıl Üniversitesi,Veteriner Fakültcsi.Biyokimya ve Fizyol~ii Anabilim Dalı, Van-TÜRKİYE

3:ArŞ.OÖL , Yüzüncü Yıl Üniversitesi,Yeteriner Fakültesi,Farmakol~ii ve Toksikolaji Anabilim Dalı , Van-TÜRKİYE

4:.Arş.Oör.. Yüzüncü Vıl Ün iversitesi,Yeteriner Fakültesi,Biyokimya ve Fİzyoloji Anabilim Dalı , Vaıı-TÜRKiYE

Giriş

Penisilin ve aınpisilin beta·laktam grubu antibiyoliklerdcndir.Ooğal ve sentetik olarak bulunurlar. Tüm penisilin çeşitleri 6·aminopenisillanik asit"ten türerler . Beta laktaın gunıbu antibiyotikler, 6·aminopcnisiııanik asit çekirdeğiy le

amid bağı oluşturan guruba göre dayanıklılıkları , antibakteriyel özellikleri ve farmakolojik aktiveleri farklılık gösterir. Anıpisilin benzil penisilinin yan zincirindeki (l·karbon momuna anıino gurubunun getirilmesiyle hrrzırlaııır

(2,4,8,13). Aıııpisilin mide asidine dayanıklı geniş spektrumlu bir antibiyotiktir. (4,1 i).

Beta laktam antibiyotikler veteriner ve insan hekimliğinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Pneumoni, ishal, bağırsak yangısı , meme hastalıkları, piyolonefrit, septisemi, üriner sistem hastalıklarında geniş kullanım alanı bulmaktadır (13).

Eveil hayvanların sağıtımında kullanılan beta·laktam antibiyotiklcr el. süt ve yumurta gibi hayvans.1l ürünlere geçer. Hayyansal ürünlerdeki antibiyotik rezidüleri bu antibiyotikJcre hassas kişilerde akut reaksiyonlara neden olabilmektedir. Uzun sure düşük dozda bcsinlerle alınmasıyle R·plazmıd transferi ile dirençli bakteri suşlarının ortaya çıkması mümkündür (1 ,4,12). Özellikle sütle bulunan antibiyotik kalıntıları yoğurt o ve peynir hazırlanmasını olumsuz yönde etkiler (l , i 1,12).

Anıpisilinin et ve sütle bulunmasma tolere edilebileçek düzeyinin yaklaşık 10 ng/ml olması gerektiği bildirilmiştir . Ampisi1in verilmiş hayvanların etlerinin bekletme süresİ 15 gün ve süUen atılma süresi 48 saat olarak bildirilmektedir (2. 3,4,9). Sütte bulunan ampisilinin derivatize edilerek, f1uorcsan detcktörde tayini ile, süUeki s.'1klııea yaratmayan dü,,"eyine kadar (10 ng/ml) tanısı bildirilmiştir (3).

Bu çalışmada Yan'daki marketlerden toplanan süt/erde ampisilin kalınUsının olup olmadığı ve ısıtma süresinin ampisilin kalıntısı Uzerine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır.

Mater~'al "c Metot

Numunelerin hazırlanması: Nisan·Mayıs aylarında Yan 'da halk tarafından satışa sunulan, toplam 26 adet çiğ inek süt numunelerinde aıııpisilin kalıntısı aşağıda izah edilen kolon öncesi derivati711syonla Ouorese edilerek yüksek basınçlı sıvı kromatografisinde tayin edildi (14).

Anıpisilinin ısıya dayanıklılıgını araştırmak amacıyla, i lt çiğ süt üzerine anıpisilin standardı eklendi (300 ng/nıl). Bu süt numunelerinden 6 adet Lo ar ml alınıp 30, 60, 90 ve 120 dakika +950C ısıya maruz bıraklldl.Bu numunelerden I' er ml alınıp mevcut ampisilin derivatizc edildi.

is ı uygulamadan +20oC de (oda ısısında) ilk dakikada i ml stok süt ampisilin karışımından alımırak derivatizasyon işlemi gerçekleştirildi.

114

Stok sUiten 6 adet ıo' ar ml a lınıp su banyosunda +85 0C'ye ç ıktıktan sonra i dakika tutularak pastOrizasyon işlemi uygulandı. İşlem sonrası derivalizasyon gerçekleştirildi .

Stand~rtların hll7.lrlanmlısl: Ampisilin (a- aminobezylpcnicillin, Sigma) distile suda çözdürülerek stok çözeltisi (100 ııg/m l ampisilin) hazırlandı . 300 ng/ml çalışma standardı, stok çözcltinin distile su ile sulandırmas ı yapılarak hazırlandı.

Kolon öncesi dcı-i\'lltizlısyon:

Sitrik asit Ç6zelt;si: % 37 'lik fomıaldehit (Ricadel dcHaen) su ilc % 7 'lik yapılarak formaldehit solüsyonu hazırlandı . 400 mM siırik asiı (E . Merek) solüsyonu, formaldehil solUsyonunda 10Z sitrik asi t çözdUrülerek hazırland ı ( 14).

SrOlıdardın veya sOtteki aıııpisilinin deriııatizasyon işlcmi: ımı . standart (veya süt) çözeltisi ü7,erine ı ml Sitrik asit çözeltisi konuldu. Üzerine 100 frl HCI0 4 ( EMerek ) eklendi ve karışım 80 oC su banyosunda i saat tutularak derivalizasyon tamamlandı. Örnekler 4000 rpm de 15 dakika sa ntrifüj edildikten sonra ve 0.45 ıım selüloz membrandan geçirilerck filtre edildi. 20,ıI numune C 8 kolonuna enjekte edildi .

Mobil fıız: Mobi l faz 20 mM HCı04 + Metanol (55:45 vlv) (E. Merek) karışııııından hazırlandı ve pHı bir cam elektrotla 1.7' ye ayarinnd ı . Mobil faz (Millipere 0.45 ,ım geçiri lerek) fıltre edildi ve kullanmadan önce vakum ile çözünmUş gazlarıııdan arındırıldı. _

Kromatograri: Mobil faz LC-ıo AD model HPLC pompa (Sehiınadzu ,

Japonya) ile i miL min akış hızında iı.okratik olarak kullanıld ı . Numuneler Rheodyne 7124 enjeksiyon ( 20-ml yükleme kapasiteli) "alfına veri ldi. RF-IOA model fluoresan detektör (Shimadzu, Japan) ile 346 nın eksilasyon ve 422 nm emisyonda okıındu . Nuıııuneler Cg kolonda(l50x4.6 mm, Shimadzu. Japan) ve oda ısısında ayrıldı.Sonuçlar C-R6A model Chronıatopac integrator (Shimadzu) tarafından hesaplandı.

Sonuç ve Tartışııııı

Van ımırketlerinde halk tarafında n piyas.:ıya arı edilen çi~ 26 süt numunesinde ampisilin yeni ve hass.:1s bir metodla a raştırılm ı ştır. Hiç bir siit numunesinde ampisilin rezidüsüne rastlanmamıştır . Ampisilinin sütle tanınmasında VV detektör uzun zamandan beri kullanılmaktadır ( 6, LO. i I, 15 ). Bu çalışmada sütte bulunan .. mpisilin derivati7.c edilip fiuoresmı özellik kazandırılarak. ampisiliniıı tanı sınırı artırılm ı şt ır (14). Bu metod ampisilihi 10 ng/ml sınırına kadar okııyabilmektedir.

Standart ve Stiı örneklerine ait kromatogmm pikieri şekil I' de gÖıiilnıektedir. Ampisilin için ıutuhna zamanı 4. i dakika olarak bulundu . Bu da numunelerin en geç 4-5 dakika anısırıda problemsiz olarak tekrar okuıımasına izin vermektedir.

Deınet ve arkadaşları (7), Konya yöresindeki mandıralClrdalı topladıklan

sütlerde pcnisil in G . V ve anıpisilin kalıntı analizi yaptıkicın ça lı şma l arı nda.

115

likit kroınatografısi He UV dedektörde ayrım ı yapıla n süt örnek lerinde mnpisilin ve penisilin V kalıntısının bulunamamasına ka rşılık 50 adet süt örneginin ahısında pcnisilin G potasyum (0.38;, 12.032, 0.443, 6.048, 1.291. 3.445 )lgikg ) bu lundu~nu bildirmektcdirler.

Aınpisilin katılan sütlerde ampisilinin ısıtmayla meydana gelebilecek degişim le ri Şekil 2'de gösteri lmiştir. Kaslarda penisilin G rezidülerinin - 20 OC de LO günlük bir saklamada kayboldu~ bildirilmektedir. 10 gün sonra yaklaşık % 50 oranında bir kayıba u~radıgı belirtilmektedir ( 2). PaslOrizasyo n ve ı sıtmanın süttcki antibiyotik kalıntıları yok etmedigi ve sülün lOOoc ye kadar ısıtılmas ı ile peni.iiliniri % 50 , teırasiklinin % 90, streptomisinin % 66, oranında tahrip oldugu buna karşılık kloraınfenikolün ıs ıya dayanıklı oldugu bildirilmcktedir (16).

850C de i dakika ısıya maruz bırakılarak pastörize edilen ampisilinli sütlerde bu çeşi t bir ı s ınııı ampisilin üzerine bi r etkisinin ohnadıgı ortaya çıkmıştır.

Ampisilinli sütlerin 950C de 30, 60, 90 ve 120 dakika ı s ıya maruz bırakılmaları sonucunda kalıntı konsantrasyonlarını il zamana bagımlı olarak ııı.a ldı g,ı

belir lenmiştir (Şckil 2). Ort.1 lama aıııpisilin de~crlcri Tukcy's testi ( 5 ) ile karşılaştırıldıklarında za manlar arasında önemli fa rklılıklar oldugu tesbit edi ı nıiştir

(P<O.O;). Bu azalma +20oC de başlangıç dakikada okunan değcrlere oranla sırasıyla % 12.7, % 35.8, %46.6 ve %54.7 oranlarındaoldu~saptanmı ştı r.

Sonuç olarak, Van marketlerinde halk ta rafından sat ı şa ar.l edi len 26 çig süt numunesinde ampisi1 in kalıntısına rastlanmamıştır. Ampisilin p<ıstöri7--<ıs)'on

ısısına karşı dayanıklı olmasıııa karşın , ısımn uzun süre uygulanma sıyle ampi silin miktarında aı.ılma belirtenm i ştir. Pratik olarak kısa süreli ısıtmanın aınpisilin

üzerine etkisi olmadıgıııdaıı , halk 5.-ıglıg 1 aç ı smdan sütlerde aınpi siliıı rezidüsünün belirtilen ıo!e"!.ns dilzeyini aşmaması l aı.ıınd ır. Bu nedenle ilgili kurumlarca, periyodik aralıklarla sütlerin bu antibiyotik kalıntılarının mevcudiyeti kontrol edilmelidir.

116

'" (A) (B) (c)

Şekil ı .Standard (30011g/1111) deriyatize edilmiş ampisi lin (A), ampisilin .eklenmiş

süt numunesi (JOng/ml) (B) ve Va n yöresinde s.ıtıla n ampisilin kalııuıs ı ihtiva etmeyen SUl numune (c) kromatograınları . Numuneler CR kolonunda 20 mM HC104 + Meta ııo! (55 :45 vlv) mobil fanyle i7...okratik olarak ayrılmışlardır . Ta nılar fluoresans dcdcktörde (Eks:346 nm ve Ems:422 nm) gerçekleştirilmiştir.

250

O

O 200

T

E '~T '-QD c: 150

" .-- ~

'" "-~ =: 100 <

• 95°C de Sütle 50 O 85°C de S ütle

O 200C de Sütle

O O 60 120

Da k ika

Şekil 2. Ampisilinin süt1erde +20, +85 (pastörizasyon) ve +950 C de, ıamanla meydana gelen degişimleri .

ı ı 8

Kaynaklar

l.Berger, K. and Petz, M. (1990): In ResidJ/es of Velerinary Drııgs in Food. N. Haagsma,A.Ruiter, P.R, C7-cdik E:yserberg(Eds), Prooceeding of the Euro Residue Conrerencc, Noordwijerhout, The Nelhedands, 118-122.

2. Roison, J. O. (1992): Chroıııaıographic Mcthods of Analysis for Penici/lins in Food-Aniıııal Tissııes and Their Sigııificance in ReglılolOJY Progmıııs for Residue Reduction and Avoidance., Journsl of Chromalograı)hy ,624 , 171-194.

l. Bo;,on, J. O. K, Kcng, L. J . Y. and Mac NcH, J. D. ( 1994): Analysis of Penicillin G in Milk by Liquid Chroıııatography. J. AOAC [nternal .• 77: 565-570.

4. ROOlh, N. M. and Mc Donaıd, L.E., (1982): Vererinmy Pharıııacology and Therapeulic. The low3 State University, Ames, lA, USA.

S. Cochran, W.G. aııd Cox, C.M. (19S0): Experiıııeıııal Designs, .John Wilcy & Sons, New York, USA. Jlp.ı-uıl.

6.Cullor, .I.S., Enennam, A.V., Perani, L., Dcllingcr, J., Smith, \V. L., Thomı)son, T., Payne, 1\"1. A., Jensen, L., Guterbock. W. and M. N. (1994): Peıformance of Varioııs Tesıs Used Lo Screen Antibiotic Residııes in Milk ,')aıııples from IndMduol Aniıııa/s, J. AOAC Internaı., 77, 862-870.

7.Demet, Ô., Acct, A .• Traş, B., Raş. A. L. \"c Eğilmez, i. (1992): Konya'da Faoliyeı GGs/eren Çeşitli Mandıralardaıı Top/anan Süt Orneklerinde Penisilin G. A/IIpisilin ve Penisilin V Kalll1tılarlııl/1 Araştırılması. S.Ü. Vct. Fftk. Dcrg., 8: 33-35.

8. Fallow, A., Booth, R F. G. and Beli, L.D. (1982): App/ications of HPLC in Biocheıııistry. LLL Laboratoıy Techııiques iıı Biocheıııisıry aml Molecl/lar B/ology. Ed by. R.I1. Durdon and P.H. Van Kniııpcnbcrg. Eısh·icr Scicnce I'ub. Amsfcrdam. Ncthcrland , 7: 296-305.

9. Ka)'a, S. ve Şahal, 1\"1. (1990): Besinleriıııb/eki ilaç Kalmıılan, Bıınlara ilişkin Tolerans Düzeyleri. ilaç Verilıııiş Hayvanlarda ll.vu/lllcls/ Gereken Kesim Öncesi Beklelıııe ilC Sülün KlIllanma Süreleri. Tarımda Kıı~;nak Tarımsal Kalkınma Vakfı \'a)'., Ankııra., 1-2: 22-28.

ıo. Lftl, .J., I'aliwal, K, Groycr, i). K. and Gupta, it. e. (1994): Deterıııination of A/IIpicil/in in Serıııl/ by l1igh-Peıforl1lance Liquid Chroıııarography with Precolulııl1 Deriııalizotion. J . Chromatognıph)'.,655:142-

146. 1 ı. Moats, W. (1994): Deterıııil1olion of Ampicillin and AIIIQxicil.'in in

Milk with aıı Aııloıııaletl Liqııid ChrolllOfogrophic Cleanup. J. AOAC Int., 77: 41-4S.

12. Riviere, J. E. ,Cr.ıı.igmill, A. L. and Sıındıof. S. E. (1991): HClndbook ofCoıııparative PlıamlOkokineıics and Residl/es of Vererinmy AntiıııicrobiCllS, j3-Lnktam Antibiolics. e.R.e. Press, Boca Baton. Fi. 3, 37-173.

13.Şanh, \'. ,·e K.ıı.yıı, S. (1991): Veteriner Farıııokoloji. KeJ/loıerap6tiklcr.

Bi rinci Baskı, 553-624 Medisan Ya)'ıne,' i, Ankara.

119

 

14.l'estertti, H., Yöruk, 1.11., Kahraman, T., Dülger, n. and Ekin S. (1995): Fluoreıııetric Deterıııination of Aıııpicillin in Mıik with Precolumn Derivatizalion by High Perforıııance Liquid Chroıııatography. Y.Y.Ü. Vet. Fak. Derg 6(1 -2) . (Bask ıda).

15.Tyczko\\'ska, K. L, Voyksner, R. D., Slraub, R. ... and Aronson, A. 1... (1994): Siıııu/toneus .Hultiresidue Anolysis of foLoktoll/ Antibiotıcs in Bovine Mi/k by Liquitl Chroll/mography with Vltravioleı Detection and Conforlllnlion by Elecırospray .""ass Specıroıııetry, J. AOAC Internaı., 77:1122-1131.

16.Vautier, H. E. and Pastigo. C.D. (1986): Bovine ıııastitis and onfibıotic in Illi/k. R/sc to public hea/ık. World Anim. Re"., 60, 41-42.

120