(19) 한민 특허청(KR)

(12) 등 특허공보(B1)

(45) 공고 2017 11월02

(11) 등 10-1792786

(24) 등 2017 10월26

(51) 특허 (Int. Cl.)

C12Q 1/68 (2006.01) G01N 1/30 (2006.01)

(52) CPC특허

C12Q 1/6806 (2013.01)

G01N 1/30 (2013.01)(21) 원 10-2015-0043473

(22) 원 2015 03월27

심사청 2015 03월27

(65) 공개 10-2016-0115553

(43) 공개 2016 10월06

(56) 행 사 헌

US6348317 B1

Biochemistry (Moscow), Vol.76, No.11,pp.1210-1219 (2011)

Analytical Chemistry, Vol.86, No.15,pp.7925-7930 (2014)

Molecules, Vol.18, No.12, pp.15357-15397(2013)

(73) 특허

강 학 산학 단

울특별시 마포 35 (신 동, 강 학)

(72)

규

경 도 고양시 산 후곡 36, 후곡마 4단지 404동 703

경 도 포시 고산 185 6 102동 302 (당동, 한 크아 트)

(74) 리

웅, 공병욱

체 청 항 : 8 항 심사 : 신원

(54) DNA 결합 타 드 포함하는 DNA 염색

(57) 약

본 연 들 안 하게 사 할 DNA 해 상 지하여 다양한 야에 는

DNA 염색 에 한 것 다. 본 에 , DNA에 결합하는 특 타 드 단 질 하

여 DNA 염색하는 경우, 연 에게 안 하 DNA 해 상 억 하고 가역 염색 가능해지는 등

DNA 염색할 다. 라 본 DNA 염색 DNA 연 에 다양하게

다.

도 - 도4

등록특허 10-1792786

- 1 -

(52) CPC특허

C12Q 2563/173 (2013.01)

지원한 가연 개 사업

과 고 2014R1A2A2A04003870

처 미래창 과학

연 리 한 연 재단

연 사업 견연 지원사업

연 과 단 DNA 한 민감 DNA 상검

여 1/1

주 강 학 산학 단

연 간 2014.05.01 ~ 2017.04.30

등록특허 10-1792786

- 2 -

청

청 항 1

다 식 1 또는 2 시 는 DNA 결합 타 드 시그 생 질 루어진 DNA 염색 타 드:

식 1

(XY)m-(시그 생 질)

식 2

(시그 생 질)-(XY)m

상 식 1 2에 , X는 Lys 또는 Arg 고, Y는 Trp 또는 Tyr 고, X Y 는 앞 뀔

, m 1 내지 10 고, "-"는 타 드 링커 미하 , 시그 생 질 단 질 미한

다.

청 항 2

다 식 3 시 는 DNA 결합 타 드 시그 생 질 루어진 DNA 염색 타 드:

식 3

(XY)m-(시그 생 질)-(X’Y’)n

상 식에 , X는 Lys 또는 Arg 고, Y는 Trp 또는 Tyr 고, X Y 는 앞 뀔 , X’

Lys 또는 Arg 고 Y’는 Trp 또는 Tyr 고, X’과 Y’ 는 앞 뀔 , 그리고 m n 1 내

지 10 고, "-"는 타 드 링커 미하 , 시그 생 질 단 질 미한다.

청 항 3

삭

청 항 4

1 항 또는 2 항에 어 , 상 타 드 링커는 라 신, 린, 라 신 알라닌

택 는 2개 아미 산 포함하는 것 특징 하는 DNA 염색 타 드.

청 항 5

1 항 또는 2 항에 어 , 상 타 드 링커는 라 신 린 포함하는 것 특징 하는 DNA

염색 타 드.

청 항 6

1 항 또는 2 항에 어 , 상 타 드 링커는 라 신 알라닌 포함하는 것 특징 하는 DNA

염색 타 드.

청 항 7

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- 3 -

1 항 또는 2 항에 어 , 상 m n 1 내지 5 것 특징 하는 DNA 염색 타 드.

청 항 8

1 항 또는 2 항에 어 , 상 X X’ Lys 것 특징 하는 DNA 염색 타 드.

청 항 9

1 항 또는 2 항에 어 , 상 Y Y'는 Trp 것 특징 하는 DNA 염색 타 드.

청 항 10

삭

청 항 11

삭

야

본 DNA 결합 타 드 포함하는 DNA 염색 에 한 것 다.[0001]

경

공학 변 단 질 사 과 그에 포 생 학과 생 학 시[0002]

다. 단 질 특 단 질에 결합하여 살아 는 포 내에 단 질 에 동

실시간 시각 함 단 질 능 해할 도 해주었다. 한편, DNA 하여

단 질 하여 DNA 에 특 단 질 동 연 한 결과는 지만, DNA 시각 하 하여

DNA 체 단 질 하여 염색한 연 결과는 아직 지 보고 가 없다.

DNA 염색하 해 는 염료(fluorescent organic dye) 주 사 하고 다.[0003]

들어, 동 후 DNA 염색 해 는 Ethidium Bromide(EtBr) 사 , 미경

사 하는 경우에는 YOYO(oxazole yellow homodimer) 같 염료 사 하여 거 DNA 시각 하 도 한

다(4). 살아 는 포 경우, 포막 과할 는 SYTO 같 염료 사 하 도 한다(5).

같 삽 염료들 간단한 과 통해 DNA 염색할 다는 과, 신 - 비(signal-to-noise[0004]

ratio)가 고, 낮 해리 상 (EtBr Kd=12.2 , YOYO-1 Kd=12.1 nM) 나타낸다는 가진다(4,5).

그러나 러한 염료들 그 본질 특 상 다 과 같 단 들 다. 생체 도 질 닭에

재 돌연변 하여 실험 시 연 주 하 , 해 원

사하 라 간체(radical intermediate) 하여 DNA 산 골격 해(photocleavage)함

시료 상 실험에 사 할 없게 한다(8-12). 같 해결하 하여 많 연

들 안 하고 사 편리한 DNA 염색 질 개 해 다.

본 체에 걸쳐 다 특허 헌 참 고 그 시 어 다. 특허[0005]

헌 개시 내 그 체 본 에 참 삽 어 본 하는 야 본

내 보다 하게 다.

내

해결하 는 과

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- 4 -

본 들 연 들 안 하게 사 할 DNA 해 상 지하 다양한 야에 가[0006]

능한 DNA 염색 질 하고 연 하 다. 그 결과, 본 들 DNA에 결합하는 특 한 타

드 하고 여 에 단 질 연결하는 경우, 연 에게 안 하고 DNA 해 상 억 하

DNA 염색할 다는 것 함 , 본 하게 었다.

본 DNA 결합 타 드 포함하는 신규한 DNA 염색 공하는 다.[0007]

본 다 하 상 한 , 청 도 에 해 보다 하게 다.[0008]

과 해결 단

본 양태에 , 본 다 식 1, 식 2 또는 식 3 시 는DNA 결합 타[0009]

드 포함하는 DNA 염색 공한다:

식 1[0010]

(XY)m-(시그 생 질)[0011]

식 2[0012]

(시그 생 질)-(XY)m [0013]

상 식 1 2에 , X는 Lys 또는 Arg 고, Y는 Trp 또는 Tyr 고, X Y 는 앞 뀔 [0014]

, m 1 내지 10 다.

식 3[0015]

(XY)m-(시그 생 질)-(X’Y’)n[0016]

상 식에 , X는 Lys 또는 Arg 고, Y는 Trp 또는 Tyr 고, X Y 는 앞 뀔 , X’[0017]

Lys 또는 Arg 고 Y’는 Trp 또는 Tyr 고, X’과 Y’ 는 앞 뀔 , 그리고 m n 1 내

지 10 다.

본 DNA 염색 DNA 결합 타 드 시그 생 질 포함한다. DNA 결합 타 드는 다[0018]

과 같 양 하 띄는 아미 산과 향 고리 가진 아미 산 복 연결 다: (XY)m.

X는 양 하 띄는 아미 산 라 신 또는 아 닌 고, Y는 향 고리 가진 아미 산 트립[0019]

또는 타 신 , X Y 는 앞 뀔 다. 람직하게는 X는 라 신, Y는 트립 다.

본 어 에 , 라 신과 트립 합 DNA 염색한 결과, 하게 DNA 시각 할

었다. m 1내지 10 다. m 낮 결합 도는 낮 나 그라운드에 가

, m 결합 도는 나 그라운드에 가 가할 다. 본 어 에

, m 2 경우 그라운드 없 하게 DNA 시각 할 었다.

DNA 결합 타 드는 시그 단 질 N-말단에 할 도 고 C-말단에 할 도 , 또는 N-말단[0020]

C-말단 에 할 도 다. DNA 결합 타 드가 N-말단 C-말단 에 하는 경우, 결합 특

아 그라운드 감 시킬 다. 본 어 에 , DNA 결합 타 드

가 N-말단 C-말단 에 하고, m 2 경우 그라운드 없 하게 DNA 시각 할 었

다.

본 시그 생 질 검 가능한 시그 생시킬 는 질 단 질, 단 질, 색[0021]

- 매하는 ( 컨 , 알 린 포 타아 , 시다아 , β-갈락 시다아 또는 β- 루 시다아

등), 학 질( 컨 , 틴 등), 질( 컨 , 플루 , TAMRA, Cy5, Cy3, HEX, TET, Dabsyl 또

는 FAM 등), 질 또는 학 (chemiluminescent) 질 등 포함하나 에 한 는 것 아니다.

람직하게는 시그 생 질 단 질 또는 단 질 다. 본 어 에 , 색

단 질과 색 단 질 사 하여 DNA 시각 하 다.

본 에 DNA 결합 타 드 시그 생 질 링커(linker) 통해 연결 다. 시그 생 질[0022]

에 라 DNA 결합 타 드 시그 생 질 연결시킬 는 다양한 링커가 사

다. 람직하게는 라 신, 린, 라 신 알라닌 택 는 2개 아미 산 포

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- 5 -

함하는 타 드 링커 사 하 , 람직하게는 라 신 알라닌 포함함는 타 드 링커 사 한다.

본 어 에 , 라 신 알라닌 포함하는 KKA 링커 사 하여 공 DNA 시각

하 다.

과

본 특징 약하 다 과 같다:[0023]

(a) 본 DNA 결합 타 드 포함하는 DNA 염색 공한다.[0024]

(b) 본 DNA DNA 염색 체에 안 하 , DNA 해 상 억 하고 가역 염색 가능한[0025]

특징 가지고 므 다양한 연 야에 다.

도 간단한

도 1 타 드가 연결 단 질 사 하여 단 DNA 염색한것 보여주는 미경 사진[0026]

다. 리 지 λ DNA(48.5 kb) (a)는 DNA 염색 eGFP , (b)는 색 단 질 mCherry , (c)는

염료 YOYO-1 각각 염색한 것 , (d)는 λ DNA 연쇄체(concatemer) DNA 염색 eGFP 염색한 것

다. 크 는 5 다.

도 2는 동 동 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 통한 DNA 결합 단 질

해리 상 한 도 다. 동 겔 사진 DNA 염색 단 질 DNA에 결합하는 습 나타낸 것

다.

도 3a는 MALDI-TOF 질량 통한 A, C, G, T 결합 도 트립 과 보여주는 도 다.

도 3b는 MALDI-TOF 질량 통한 라 신 아 닌 체한 경우 결합 도 보여주는 도 다.

도 4는 E. coli(BL21) 포 내에 DNA 염색 단 질에 해 DNA가 염색 것 보여주는 사진 다. (a)

는 타 드(KWKWKKA)가 연결 eGFP 하는 E. coli(BL21) 포 사진 그에 해당하는 신

나타내는 도 , (b)는 타 드 포함하지 않는 eGFP 하는 E. coli 포 사진

그 나타내는 도 다. 크 는 5 다.

도 5는 DNA 염색 단 질 사 하 해(photocleavage) 상 억 는 것 보여주는

사진 다. 크 는 5 다.

도 6 DNA 염색 단 질 사 하 가역 염색(reversible staining) 가능하다는 것 보여주는

사진 다. 비 틴(biotin) 지 λ DNA Neutravidin 개질 에 착한 것 , 가역

DNA 염색 채 (flow channel)에 는 액 pH에 해 가능하다는 것 나타낸다. 는

10 다.

도 7 DNA 염색 단 질 사 하 에도 동 한 곽 (contour length) 나타낸다는 것 보여주는

도 신 λ DNA 곽 그 연쇄체(concatemer) 나타낸 그램 시 λ

DNA 곽 (48,502 bp x 0.34 nm/bp = 16.49 ) 한다.

실시하 한 체 내

하, 실시 통하여 본 욱 상 하고 한다. 들 실시 는 지 본 보다 체[0027]

하 한 것 , 본 지에 라 본 가 들 실시 에 해 한 지 않는다는

것 당업계에 통상 지식 가진 에 어 할 것 다.

실시[0028]

실험재료 실험[0029]

시험 질 시약[0030]

든 DNA 프라 리고(Oligo)는 Bioneer(Daejeon, Korea) 사 하 다. 든 들 New[0031]

England Biolabs(Ipswich, MA) 사 하 다. λ DNA는 Bioneer T4 GT7 DNA는 Nippon

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Gene(Tokyo, Japan) 사 하 다. E.coli 균주는 Yeastern(Taipei, Taiwan) 것

사 하 다. 틴 지 청 알 민(Biotin-labled bovine serum albumin) Sigma(St. Louise,

MI) , Neutravidin Pierce(Rockford, IL) , BSA는 New England Biolabs , 에폭시

(Epoxy)는 Devcon(Riviera Beach, FL) , N-trimethoxymethylsilylpropyl-N,N,N-trimethylammonium

chloride (50% Methanol) Gelest(Morrisville, PA) 각각 사 하 다. Ni-NTA 아가 진과

럼 Qiagen(Venlo, Netherlands) , Non-SDS TBE-PAG Komabiotech(Seoul, Korea) 각각 사

하 다. 타 어 지 않 시약 Sigma사 사 하 다.

DNA 염색 단 질 비 [0032]

DNA 염색 단 질 해 pET-15b(Novagen, Germany) 사 하 다. 단 질[0033]

eGFP(pEGFP-N1, Clontech, USA) 양쪽 끝에 DNA 결합 타 드 연결하 하여, 포워드 프라 (5’-ATG

TTG CAT ATG AAA TGG AAA TGG AAA AAA GCG ATG CGT-3’) 리 프라 (5’-ATG TTG GGA TCC TTA TTT CCA

TTT CCA TTT TTT CGC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3’) 사 하 , 들 프라 에는 한 NdeI

BamHI에 해 지는 열 포함하도 하 다. 합 DNA 염색 eGFP DNA 브클

닝 pET-15b vector에 삽 하여 단 질 하 다. 단 질 해

하여 E. coli BL21(DE3) 균주 질 하 다. 질 단 니 택하여 LB 지에 앰

피실린(ampicillin)과 함께 하 다. 후 OD 600nm에 도가 0.8 지 37˚에 양한

다 , IPTG 도 1 mM가 도 어주고, 실 보다 낮 도에 24시간 상 양하 다. 양

포들 12,000 X g, 10 원심 리 하여 집하 다. 후 단 질 해 (50 mM Na2HPO4, 300mM

NaCl, 10mM Imidazole, pH 8.0) 지 씻어 다 , 울트라 니 (ultrasonication) 1 시간

동안 포벽 포막 해하 다. 후 원심 리 포 쇄 (cell debris) 거하 다. 포

단 질 리하 하여 Ni-NTA 아가 진(agarose resin) 포 (crude extract)과

후 4˚C에 6 시간 동안 시 다. 진에 착 단 질들 하 크 마 그래피 한 럼에 채운

다 , 단 질 척 (50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, pH 8.0) 차 척하 다.

후 단 질 (50 mM Na2HPO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazole, pH 8.0) 하 다. 실험에 사

DNA 염색 eGFP단 질 도는 10 ㎎/㎖ 었다. 동 한 DNA 염색 mCherry(pmCherry-N1,

Clontech, USA) 단 질 하 실험에 DNA 염색 mCherry 단 질 도는 6 ㎎/㎖ 었다. 든 단

질 50% w/w 리 /TE 사 하여 실험에 당한 도 하여 사 하 다.

실험에 필 한 커 슬립 [0034]

1. 커 슬립 개질 비 [0035]

DNA 염색 단 질 하여 DNA 염색하는 실험에 필 한 커 슬립 다 과 같 과 통해 하[0036]

다. 리 커 슬립 Teflon rack에 끼우고 piranha etching solution(30% v/v H2O2/H2SO4)에 2시간 동안

담가 후, 3차 차 씻어낸 후, 같 산 척 (acid cleaned surface) 단 질

에 사 하 다.

리 양 하 개질하 하여 산 척 액(50% 탄 에 N-trimethoxymethyl[0037]

silylpropyl-N,N,N-trimethyl ammonium chloride 200 ㎕ 200 ㎖ 3차 에 어 )에 담그고 65 °C

에 12시간 동안 었다. 개질 2주 안에 비하 다.

2. 마 크 채 나 슬릿 비 [0038]

4 마 크 채 450 nm 나 슬릿 한 실리 웨 (silicon wafer) 리 그래피 통하여[0039]

하 다. SU-8 2005 포 지 트(Microchem, Newton, MA) 실리 웨 핀- (spin-coating)한

후, 킹(baking)하여 350 nm UV에 시 만들었다. 후 다시 킹한, 쇄 웨

SU-8 (developer, Microchem) 하 다. 같 한 마 크 채 상 처

리 하지 않고 사 하 다(soft lithography).

나 슬릿 하 하여 450 nm 하드 리 그래피 (etching pattern) 하 , 4 ㎛ [0040]

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마 크 채 어 같 식 얹어 하 다. 후 만들어진 다양한 에

Polydimethylsiloxane(PDMS) Sylgard 184 Elastomer(Dow corning, MI, USA) 사 하 다.

3. (Flow Cell)[0041]

DNA 한 쪽 끝 고 한 후, 체 해 DNA 게 펴주 해 만들었다. 우 , 커[0042]

슬립 슬라 드 래 에 100 ㎛ 도 양 프 고 하 다. 미경 슬라 드 래 에

는 하여 다 아몬드 드릴 내었다. 든 래 는 피란하 액(Piranha

solution) 척하 다. 란색 펫 (Yellow pipette tip) 하여 시료 에 착하 고,

브 연결하고 에폭시(epoxy) 주 막아 시료 실 지하는 한편 한 압 가해지도

하 다. 규격 약 3 x 17 x 0.1 mm (L x W x H) , 피는 5.1 ㎕ 도 었다. 실험

에 사 액 한 도(0.150 mL/min = 8.3 mm/sec) 하 해 Syringe pump NE-1000(New Era

Pump Systems Inc., Wantagh, NY) 사 하 다.

4. 단 질 개질 비 [0043]

미 체 리 단 질 개질하 해 틴-BSA(1 mg/mL, 10mM Tris, 50mM[0044]

NaCl, pH8.0) 하 다. BSA가 착 도 5 동안 시킨 다 , Neutravidin 액(0.25 mg/mL 10mM

Tris, 50mM NaCl, pH8.0) 주 하고 실 에 5 동안 아 었다. 뉴트라비 (neutravidin) 에

착 도 5 도 시킨 다 , BSA 약 1% 하여 에 주 하고 다시 실 에 5 동안 아

었다.

DNA 염색 단 질 한 DNA 단 염색[0045]

상 한 단 질 10 /㎖ 도 하고, 염색하고 하는 타겟 DNA 한 다 (0.2 ng/,[0046]

1X TE, pH 8), DNA DNA 염색 단 질 1:1 v/v 비 후, 브에 5 동안 실 에

시 다. 끝난 DNA 염색 단 질-DNA 샘플 상 한 마 크 채 ( 4 )에

주 닥 에 어 신 게 한 후, 미경 찰하 다.

미경 DNA 시각[0047]

미경 해 역 향 학 미경(Olympus IX70, Tokyo, Japan)에 63x 100x Olympus UPlanSApo oil[0048]

immersion 연결하 , 고체 (LBX488 SLIM 532, Oxxius, Lannion, France) 사 하

다. 빛 multimode optical fiber(BFH-22-550, Thorlabs, Newton, NJ) 통해 집 었고, 각

과 하는 notch filter(Semrock, Rochester, NY) 사 하여 가 EMCCD 라 들어 는 것 지

하 다. 미경 사진 EMCCD 지 라 (Qimaging Rolera EM-C2,Surrey,BC,Canada) 통해 16

bit TIFF 식 하 , 프트웨어 Image Pro Plus(Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) 사

하 다. 미지 보 과 해 ImageJ 프트웨어 들 개 한 Java plug-in 사 하

다.

DNA 염색 단 질 해리상 : EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)[0049]

52-mer 리고뉴클 티드(5’ CTA CTA GCA CAA TCG ACT GTA CGG ACC GAT CGA GTC ACT AGC AGT CTA GCA A[0050]

3’) 그것 상보 열 하 브리다 (hybridiztion)하여 가닥 DNA(double strands DNA)

만들었다. 해 동 한 도 리고뉴클 티드 브에 다 , 끓는 에 담그고 다시 상

에 아 었다. 만들어진 가닥 DNA 1 x TE 사 하여 0.5 ng/㎕(31.4 nM) 하 다. DNA

염색 단 질 50% v/v 리 / 1 x TE 사 하여 각각 74 nM, 740 nM, 1.48 , 3.7 , 7.4 ,

14.8 , 37 , 74 148 도가 도 하 다. 각각 한 단 질, 가닥 DNA 50% v/v 리

/ 1 x TE 체 피가 10 ㎕ 도 샘플 브에 다 , 각 샘플 6 x

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후 0.5 x TBE 4-20% polyacrylamide precast gel (TBE-PAG)에 하 다. 151 V에 75 동안 동

진행한 다 , EtBr 사 하여 5 동안 염색하 다. 동 도가 느린 DNA 미지 UV

transilluminator (WUV-M20, Daihan Scientific Co., Korea)에 CCD 라(WGD-20, Daihan Scientific Co.,

Korea) 하여 쳐하 다. 각 Fraction Bound Bound protein/Free DNA intensity profile

나타내었 , ImageJ Gel Analyze 하여 하 다. 단 질 도에 Apparent 해리상 (Kd) 값

다 공식 하여 계산하 다:

Kd = (1-f)/f X [Protein]total (f: fraction bound)[0051]

DNA 염색 단 질 DNA 열특 [0052]

DNA 염색 단 질 DNA 열특 하여 MALDI-TOF 질량 행하 다. DNA 리고뉴클[0053]

티드 티드 결합 후 MALDI-TOF 질량 진행하 다. 실험에 사 한 든 리고뉴클 티

드는 TE 에 100 도 하 , 티드는 3차 에 100 도 하여 사 하 다. 티드

결합 해 타 드 결합 20 피에 진행 었다. 10 리고뉴클 티드 10

티드 샘플 브에 어 20 피 맞 다 , 실 에 30 간 시 다. 료 샘

플 매트릭 액(130 mM 2, 5-Dihydroxybenzoic acid(DHB))과 1:1 v/v 비 다 , Bruker MTP

384 polished steel MALDI sample support target plate 에 었다. 실 에 결 샘플과 Matrix

Bruker Autoflex™ Speed(Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA) 하여 linear positive ion

mode 하 다. 1000 Hz, 500 laser shot 합 질량 트럼 얻 었다.

DNA 염색 단 질 한 in vivo에 DNA 염색[0054]

DNA 염색 단 질 하여 in vivo에 직 DNA 염색하 하여, 상 DNA 염색 단 질[0055]

비과 에 DNA 염색 단 질 단 질 질 시킨 E. coli BL21(DE3) 균주 하 다.

포 OD 600nm 2.0 과할 지 양한 다 , IPTG 도 1 mM가 도 어주었다. IPTG

어주고 한 시간 지난 포 1㎕ 취하여 22 x 22 mm 커 슬립에 다 다 특 한 처리 없

미경 찰하 다.

DNA 염색 단 질에 한 해 상 [0056]

DNA 염색 단 질에 해 해 상 어나는지 하 하여 다 과 같 커 슬립 하[0057]

다. 사각 (20 x 20 mm) 는 아크릴 지 고 에 커 슬립 다 , 한쪽 리

한 가 리 하여 도포함 , 실험 행 할 한쪽 리 시킴과 동시에

도 한 액(50 mM EDTA) 러나 지 않도 하 다. 또한 DNA 동 한 극 만들 해 아크릴

고 에 리 사각 각 향 착하 다. 비 커 슬립에 상

한 450 nm PDMS 나 슬릿 린 다 , DNA 염색 eGFP 단 질과 T4GT7 DNA 액

후, 리 통해 가 도 도 약 400 ㎕ 50 mM EDTA 액 주 에 채워 었다. DNA

하여 마 크 채 사 어 는 나 슬릿 사 에 들어갈 도 하 하여

30 V 압 하에 양 극 향 할 는 가 착 하 다. DNA 나 슬

릿 사 에 들어가게 한 다 , 사하여 해 상 어나는지 찰하 다.

가역 염색(Reversible Staining)[0058]

뉴트라비 (neutravidin) 비한 다 , 220 pM λ DNA overhang oligo(5`-pGGGCGGCGACCT-[0059]

TEG-biotin-3`) 미 체 주 한 후, 실 에 5 동안 아 었다. 여 에 λ DNA, T4 DNA 리가아

(ligase) 주 하고 다시 실 에 30 동안 시 다. 상 한

하여 DMA 한쪽 끝 닥에 고 한 후, 체 하여 DNA 게 펴 다 , DNA 염색 eGFP

DNA 염색하여 시각 하 다.

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가역 염색 가능한지 하 하여, pH 하 다 과 진행하 다. 우 , DNA에 결합[0060]

한 DNA 염색 eGFP 리하 해 50 ㎕ TE (pH 11) 주 하여 pH 여 주었다. DNA DNA 염

색 eGFP가 리 상태에 다시 가역 염색 가능한지 하 하여 200 ㎕ TE (pH 8) 20

㎕/min 주어 pH 낮 DNA 가 염색 는지 하 다.

DNA 염색 단 질에 한 DNA 곽 향 [0061]

상 가역 염색에 사 DNA 들 지 상 한 다 , ImageJ 프 그램 하여 DNA 곽[0062]

하 다. 295개 단 DNA 하 다.

실험결과[0063]

DNA 염색 단 질 한 DNA 단 염색[0064]

DNA 염색 단 질 하여 DNA 단 염색하 다. 한 DNA 결합 타 드 라 신과[0065]

트립 합에 링커(라 신-알라닌, KA) 연결시킨 KWKKA 사 하 , 링커 단 질 N-말단에

연결시 DNA 염색 단 질 하 다. 동 동 (Electrophoretic mobility shift

assay) 통하여 한 결과 KWKKA가 연결 단 질 DNA 결합 하 지만, 미경 하여

염색 여 하 에는 하지 못한 결합 가지고 는 것 나타났다. 라 결합 도

해 아미 산 복 늘리는 업 하 다. 같 아 어는 KKKKK, KWKKKK, KWKKKWK 같

라 신 다 개 고 한 후 트립 갯 늘리 타 드들 결합 한 (12, 15)

얻 것 , 트립 개 가 늘어나 결합 상 갖는다는 상 하 다. 러한 아 어

탕 결합 도 가진 단 질 (KW)5KKA-eGFP 하 다. (KW)5KKA-eGFP

하여 DNA 염색한 결과, 미경에 거 단 DNA 시각 하는 공하 나, DNA

다 역에 같 , 단 질 집체 는 질들 상에 다 나타났다. 러

한 해결하고 (KW)5KKA 타 드 eGFP C-말단에 가 착하여 (KW)5KKA-eGFP-AKK(WK)5

갖는 단 질 하 다. 는 하나 단 질 양 하 보다 많 띄게 하여 원하지 않는 단 질-단

질간 상 하 한 것 었다. 그러나 (KW)5KKA-eGFP-AKK(WK)5 갖는 단 질

하는 경우, 상 같 사라 나 DNA 가 시각 지 않는 상 나타났다.

는 타 드 게 늘 주는 것 해 생하는 과량 양 하가 단 질 DNA에 지 못하도

해하는 과 생시 것 었다. 라 보다 가 짧아진 (KW)2KKA 단

질 양단에 연결시 (KW)2KKA-eGFP-AKK(WK)2 갖는 단 질 하 다. (KW)2KKA-eGFP-

AKK(WK)2 갖는 단 질 사 하는 경우, 없 하게 DNA 염색하여 시각 할 었

다(도 1).

DNA 염색 단 질 해리상 [0066]

DNA 염색 단 질 해리상 하 하여, EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay) 행하[0067]

다(도 2). DNA 염색 단 질 해리 상 Kd는 14.7 도 었는 , 는 EtBr 12.1 비슷한

값 , YOYO-1 12.1 nM 보다 값 었다.

DNA 결합 타 드 DNA 열특 [0068]

상 DNA 단 염색에 DNA 염색 체 고 지 못한 상 견하 는 (도 1), 는 DNA 염색[0069]

열 특 어날 는 가능 시해 주는 것 었다. 연 결과에 하 KWKn 타

드는 티민(T), 아 닌(A), 시 신(C) 결합 도 나타내는 것 보고 었다(12, 15). 라

통해 KWK 타 드는 AT가 한 열(AT-rich sequence)에 도 갖는다고 할 었

, 하 해 MALDI-TOF 질량 실험 행하 다. 결과, 상과 하는 도

할 었다(도 3a). 라 신 트립 루어진 타 드 각각 A: A9, B: C9, C: G9 D: T9

리고뉴클 타 드 결합시 하 다. 상 (relative intensity) 비 하 A D에 ,

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아 닌과 티민 열 가진 DNA에 해 타 드가 강하게 결합하는 결과 나타내었다. E는

타 드 트립 알라닌 체한 것 었는 , D 비 하여 상 결합 도가 낮 것 알

었다. F는 체 열 알라닌 것 었는 , DNA 결합하지 않는다는 것 알 었다.

같 결과 통해 라 신과 트립 포함한 타 드는 DNA 도가 다는 것과 DNA 염

열 T에 한 도가 가 다는 것 알 었다.

한편, DNA 결합 타 드 라 신 양 하 띠는 다 아미 산 체하는 경우에도 결합 가지는지[0070]

하고 하 다. 라 신 아 닌(Arg, R) 체하여 MALDI-TOF 질량 실험 행하 다(도

3b). T9 리고뉴클 타 드 RWRWRR, RRRRRR 결합시 한 결과, KWKWKK, KKKKKK 같

결합 도 가지고 는 것 하 다. 러한 결과는 본 DNA 염색 단 질 결합 타

드 라 신 에도 아 닌 사 하는 것 가능하다는 것 보여주는 것 다.

DNA 염색 단 질 한 in vivo에 DNA 염색[0071]

DNA 염색 단 질 하여 in vivo에 도 DNA가 염색 는지 하 하여, 리아 포(E.coli[0072]

BL21)에 DNA 염색 단 질 (KW)2KKA-eGFP-AKK(WK)2 하여 실험 행하 다. 사

한 eGFP 비 하 , DNA 염색 단 질 라나는 포에 고 한 나타내었다(도 4).

DNA 염색 단 질 리아 포 양 끝과 가운 지 과 같 또는 격리 역에 역

(localization) 어 었다. 같 결과는 색 단 질 연결 DNA 합 (DNA polymerase)

하여 리아 DNA 시각 한 리아 DNA 사진과 하는 것 , 본 DNA 염색

단 질 in vivo에 도 DNA 공 염색할 다는 것 보여주는 것 다.

DNA 염색 단 질에 한 해 상 [0073]

DNA 염색 단 질 사 하는 경우에도 DNA 염색 질에 같 해 상 어나는지 [0074]

하 하여, DNA 염색 단 질에 해 염색 DNA 10 간 에 시킨 후 찰하 다. 찰결

과, DNA 염색 단 질에 해 염색 DNA는 상 없었 나, YOYO-1에 해 염색 DNA는

각난 것 찰하 다(도 5). DNA 염색 염료는 에 해 게 DNA 단

도하는 , 는 체가 없 많 여 - (excitation-emission) 과 거 DNA 골격 주 에

학 킬 다. 하지만 본 DNA 염색 단 질 경우, DNA 결합

하는 ( 타 드)과 내는 (eGFP) 공간 리 어 에 해에 한 험 어

들게 다. 같 본 DNA 염색 단 질 해(photocleavage) 험 어들므

DNA 염색 질 는 한계가 었 시간에 걸 상 가능하게 할 다는 가지고 다.

가역 염색(Reversible Staining)[0075]

DNA 염색 단 질 사 하여 가역 염색 가능한지 하고 하 다. 해 pH 단계[0076]

변경하 DNA 염색 상태변 하 다(도 6). 찰결과, 건 pH 8 에 , DNA 염색 단

질 시각 DNA는 곧 어 pH가 11 액 미경 상에 암 었 나, 후 pH 8

액에 아 는 DNA 염색 단 질 채 내 주 다시 DNA가 염색 는 것

하 다. 같 염색-탈색 차 복에도 하고 동 한 결과 나타내었다. 러한

결과는 본 DNA 염색 단 질 사 하는 경우, 액 pH 하는 간단한 과 만 가역

염색 가능하다는 것 보여주는 것 다. 라 러한 특징 하여 찰 끝난 단 질 새 운

단 질 체하는 사 한다 지 찰 필 한 실험에 큰 할

것 다.

DNA 염색 단 질에 한 DNA 곽 향 [0077]

DNA 염색 단 질에 해 DNA 곽 가 변하는지 하 하여 한쪽 끝 고 어 는 λ DNA[0078]

곽 (full contour length) 미 체 (microfluidic flow) 하여 찰하 다(도 7).

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찰결과, λ DNA 단량체 가 약 16.5 나타났는 , 는 할 는 값 16.49

(48,502 bp x 0.34 nm/bp = 16.49 ) 하는 것 었다. 러한 결과는 YOYO-1 등 염색하는 경우 는

다 게 DNA 염색 단 질 DNA 곽 에 향 미 지 않는다는 것 나타내는 것 다. 는 트립

돌 고리(indole ring)는 염 사 에 삽 (partially inserted into stacked bases)

에 트립 삽 DNA 곽 에 향 미 지 않 것 다.

상 본 특 한 상 하 는 , 당업계 통상 지식 가진 에게 어 러한[0079]

체 단지 어 뿐 , 에 본 가 한 는 것 아닌 하다.

라 , 본 실질 는 첨 청 항과 그 등가 에 하여 다고 할 것 다.

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도

도 1

도 2

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도 3a

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도 3b

도 4

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도 5

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도 6

도 7

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