13_Cromatografia3

5/25/2018 13_Cromatografia3

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Tecniche Cromatografiche

Seconda parte


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Cromatografia per interazione idrofobica

(HIC)

un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione diproteine, le separa sulla base della loro idrofobicit disuperficie.

I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioniidrofobiche, sottraendo le molecole dacqua ordinate

le proteine tendono cos ad interagire fra loro (salting out).

Nella HIC queste regioni cos esposte tendono ad interagirecon una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici. una cromatografia che vantaggioso applicare ad esempio

dopo il frazionamento con ammonio solfato. Leluizionepu essere fatta con forza ionica decrescente oppure

per spiazzamentocon detergenti non ionici (Tween 20, Triton

X-100). Potenziali svantaggi: in alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare

denaturazione. non predicibile, pu applicarsi bene ad alcune proteine

ma non ad altre.


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LIGANDO Porzioneidrofobica

Proteina

LIGANDO

Porzione

idrofobica

Proteina

Molecole d'acqualegate in modo ordinatoalla superficie idrofobica

Molecole d'acqua

liberate in seguito allainterazione idrofobicaalla superficie idrofobica

O O CH3

OH

OO

OH

CH3

OO

OH CH3

CH3

CH3

OO

OH

Butil Sefaroso

Octil Sefaroso

Fenil Sefaroso

Alchil Sefaroso


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Cromatografia di affinit

OH

OH

OH

O

OH O

OH

OH

OOH

Resina

Braccio spaziatoreLigando


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Cromatografia

di affinit

Un ligando ad alta affinitper la proteina legato allamatrice

La proteina di interesse silega al ligando e vieneimmobilizzata sulla colonna

Le altre proteine vengonolavate via.

La proteina di interesseviene eluita usando unasoluzione di ligando.


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Metodi di eluizione nella cromatografia di affinit


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Cromatografia di affinit

VANTAGGI

Alta affinit, costanti di

dissociazione nellordine del

mM, nM o anche pM.

Legame tutto o nulla:

Possibili molte variazioni

(affinity tags)

SVANTAGGI

Lingombro sterico spesso

abbassa la capacit

Il braccio spaziatore pu

avere influenza sul legame Leluizione pu richiedere un

eluente specifico


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Affinity tags

Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione diproteine ricombinanti. Alla proteina di interesse legato un tag chepresenta affinit con un ligando:

TAG GST

MBP

biotina

Poli-His

Proteina A

LIGANDO Glutatione

Maltosio

Avidina

Nichel, Zinco

Anticorpi

Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati percromatografia di affinit con i ligandi legati alla colonna.

Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tagattraverso proteolisi specifica.


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Purificazione di anticorpi monoclonali


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Cromatografia di affinit con anticorpi


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Proteine di fusione (es. GST, glutatione-S-transferasi)


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Immobilized metal ion Affinity Chromatography

(IMAC)


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Matrici attivate per immobilizzare

uno specifico ligando


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Protocollo generale di purificazione proteine


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Obiettivi:

Cattura Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio

Purificazione intermedia Eliminare la maggior parte dei contaminanti

Polishing Ottenere la massima purezza possibile


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AC: affinity chromatography

IEX: ion exchange

HIC: hydrophobic interaction chromatography

GF: gel filtration

RPC: reverse phase chromatography


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Desalting


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Esempio: purificazione in due passaggi di una cellulasi.

Cattura e purificazione intermedia mediante IEX


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Esempio di cattura mediante HIC


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1) Cattura IEX su resina Q2) Purificazione con HIC

3) Polishing per GF


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Gas cromatografia

(Cromatografia di ripartizione gas-liquido)


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Schema a blocchi di un gascromatografo


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Schema di iniettore


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Colonna


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Rivelatore a ionizzazione di fiamma


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Esempioseparazione gas-cromatografica di

urina di paziente con elevata aciduria


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Accoppiamento di gascromatografo con spettrometro di

massa (sorgente a ionizzazione diretta)

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