Upload
roxana-sarbu
View
89
Download
1
Embed Size (px)
DESCRIPTION
1330261384_imunofluorescentaindirectametodascreeningpentrudetectareaanticorpilorantinuclear
Citation preview
Imunofluorescena indirect-
metod screening pentru
detectarea anticorpilor
antinucleari
Biol. Monica Cristina Gheorghiu
Dr. Mihaela Blaj
Departamentul de Imunologie
BIOCLINICA S.A. Timisoara
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Definiie:
Bolile autoimune constituie un grup heterogen de afeciuni caracterizate de prezena anticorpilor circulani orientai mpotriva constituenilor celulari
Importana clinic:
Fiecare boal autoimun sistemic are un spectru de anticorpi antinucleari specifici
2
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
OBIECTIVE
Evaluarea sensibilitii i specificitii tehnicilor ELISA/EIA versus IFI
Imunofluorescena indirect este considerat metoda gold standard pentru determinarea
anticorpilor antinucleari(ACR)
3
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
07.04.2009 - 10.06.2010
IFI
2851
EIA
184
IB
184
4
MATERIAL I METOD
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Tehnici folosite pentru detectarea anticorpilor antinucleari (AAN)
5
AA
N s
cree
nin
g
IFI indirect
EIA n faz solid
AA
N c
on
firm
are
EIA, IB n faz solid
ID, CIE, RIA n faz fluid
Hemaglutinare pasiv
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
IFI
NOVA LITE Hep-2 ANA
NOVA LITE
Crithidia luciliae
(dsDNA)
EIA
ORGENTEC antigene singulare
ORGENTEC
mixturi de antigene
IB EUROIMMUN
Profile autoimmune
disease
6
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
IFI pe substrat Hep-2
descrie pattern-uri noi, asociate cu boli autoimune (35 de pattern-uri nucleare i citoplasmatice corespunznd la peste 100 de antigene diferite)
7
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Diferitele tipuri de pattern-uri de pe substratul Hep-2 se asociaz cu boli autoimune i structuri
biochimice
8
Pattern Structuri
biochimice Boal
autoimun
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
9
Ag Ac
Ag Ac
Ag Ac conjugat
conjugat
Principiul IFI
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
10
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
5 regiuni principale ale celulelor Hep-2
11
Membran nuclear Nucleoplasm Nucleoli
Fusul mitotic Citoplasm
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
diluia productor
1/40
diluia literatur
1/80
1/160 diluia utilizat
1/160
12
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
13
Pro
cen
t p
ozi
tivi
40
35
30
25
20
15
10
5
0 1/40 1/80 1/160 Titru
Corelaia dintre diluie i procentul de anticorpi antinucleari pozitivi
date proprii date literatura (ACR)
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
14
Principiul EIA i IB
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
EIA
alternativ viabil, uor de efectuat i standardizat
pot fi determinate cantitativ 8-14 antigene (din cele peste 100 de autoantigene identificabile pe Hep-2)
antigenele determinate sunt: ADN nativ, histone, nucleozom, Sm, U1-snRNP, SS-A/Ro (Ro-52 i Ro-60), SS-B/La, Scl-70, Jo-1, centromer, gp-210, sp 100
15
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
IB
este o metod calitativ
se identific simultan mai multe tipuri de anticorpi
nRNP-Sm, Sm, SS-A, Ro-52, SS-B, SCL-70, Pm-SCL, Jo-1, centromer, PCNA, ds-DNA, histone, nucleozom
16
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
474
2377
Rezultate IFI
pozitive
negative
17
REZULTATE
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
50 50 50
18
IFI EIA IB
NEGATIVE
Probe IFI negative lucrate EIA i IB
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
2377
290
184
Probe pozitive IFI lucrate EIA i IB
IFI
IFI
IFIEIA
IFIIB
19
158
121
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
5% 12%
23%
19%
26%
11% 4%
Repartizarea pacienilor pe grupe de vrst (ani)
0-20
21-30
31-40
41-50
51-60
61-70
>70
20
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
86%
14%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Distribuia pacienilor n funcie de sex
femei
brbai
21
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
LES, AR sero-negativ
S. Sjgren, S. antifosfolipic Ciroz biliar primitiv
Lamine A, B, C
Membran nuclear linear Membran nuclear punctat
Gp210, p62 din porul nuclear
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
LES, AR
23 Constitueni ai cromatinei: ADN dublu catenar, histone, nucleozomi
Omogen
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Conectivit mixt de esut conjunctiv
24 Constituieni ai granulelor intercromatinice: hnRNP
Matrice nuclear
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Conectivit mixt de esut conjunctiv, LES
Constituieni ai spliceozomei: antigen Smith (Sm), U1-RNP
Dens ptat (Sm)
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
S. Sjgren, LES, dermatomiozite
26
SS-A SS-B
Fin ptai Fin ptai
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Scleroderma, S. Raynaud
27
Granulaii foarte fine (Scl 70)
Topoizomeraz I
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Ciroz biliar primitiv,
LES
28
Puncte nucleare Multiple puncte nucleare
P80-coilin Sp-100, PML
Ciroz biliar primitiv,
Hepatite cronice active
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
S. Sjgren, F. Raynaud, Scleroderma/
Polimiozita overlap, LES, AR Scleroderma
29
PM-Scl, Th/ To, Nucleolin Constituieni nucleolari: U3RNP
Nucleolar omogen (PM-Scl) Nucleolar clumpy
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Scleroderma F. Raynaud, Scleroderma
Constituieni nucleolari: RNA pol.I NOR-90, RNA pol I, ASE-1
Nucleolar ptat (ARN polimeraza I) Nucleolar ptat cu puncte mitotice
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Scleroz sistemic, LES, Conectivite de esut nedifereniate
31
RNA-helicaza II
Nucleolar dens ptat
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
LES
32
DNA polimeraza ciclina
PCNA
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Scleroderma, F. Raynaud, S. Sjgren, Ciroz biliar primitiv
33
Centromer
Proteine ale centromerului A, B, C
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Infecie cu Mycoplasma pneumoniae LES
34
Numa 235 HsEg5
Spindle pole pattern (NUMA) Spindle fibre pattern
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Polimiozit, LES Ciroz biliar primitiv
35
Constituieni ai ribozomilor: aminoacil tRNA sintetaza, Ribo-P0, P1, P2
Proteine M1-9, piruvat dehidrogenaz (M2)
Granulaii dense perinucleare
(ribozomi)
Reea granulo-filamentoas
(mitocondrie)
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Miozite, Polimiozite LES, AR, S. Sjgren, atrofia cerebral
36
Complex de nucleoproteine Constituieni ai aparatului Golgi: golgina, giantina
SRP Granulaii perinucleare la un pol al nucleului (aparatul Golgi)
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Polimiozite, dermatomiozite
37 Histidil t-RNA sintetaza
Granulaii fine perinucleare (Jo-1)
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
56% 26%
9% 9%
Aspectul pattern-ului
Aspect ptat
Aspect omogen
Aspect nucleolar
Alte aspecte
38
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
14
8
44 42
19
6
0 4
21 18
0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Antigene nucleare determinate EIA
39
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
11
6
39 37
15
4 3 0
3 3
19 18
8
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Antigene nucleare determinate IB
40
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
14
8
44 42
19
6
0
4
11
6
39 37
15
4 3 0
3
EIA
IB
41
Concordana antigenelor nucleare solubile din EIA i IB cu aspectul ptat din IFI
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
16
17
18
19
20
21
ds-DNA
nucleozom
21
18
19
18 EIA
IB
42
Concordana antigenelor nucleare din EIA i IB cu aspectul omogen din IFI
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Real
pozitivi
Real
negativi
Fals
pozitivi
Fals
negativi
EIA 184 50 0 26
IB 184 50 0 63
43
Date EIA i IB
Imunofluorescena indirect-metod screening
pentru detectarea anticorpilor antinucleari
Sensibilitate Specificitate
EIA
88% 100%
IB 66% 100%
44
Sensibilitatea i specificitatea obinute cu metodele
EIA i IB
CONCLUZII
1. IFI poate fi folosit cu succes ca metod screening pentru detectarea anticorpilor antinucleari punnd la dispoziie ntregul spectru antigenic
2. Evideniaz anticorpii orientai mpotriva unor antigene nc nedescoperite, neizolate
3. Un rezultat pozitiv, nsoit de titru i aspectul pattern-ului orienteaz spre boala autoimun sau spre autoanticorp
4. ELISA i IB pot fi folosite pentru confirmare i monitorizarea bolilor autoimune
5. Intruct aspectele de tip nucleolar i puncte nucleare nu au nc corespondent n ELISA, pledeaz pentru folosirea IFI ca metod screening
45
46
Anticorpi antinucleari (depistajIFI)
Se repeta Anticorpi antinucleari (depistajIFI), daca suspiciunea
persista (2-3 luni)
Auto-anticorpi anti Jo1
Aspect mitocondrial
Aspect aparat Golgi
Aspect ribozomal
Aspect de tip Jo1
Auto-anticorpi anti mitocondrii
Aspect omogen
Aspect inelar
Aspect puncte
nucleare
Aspect PCNA
Aspect de tip
centromer
Aspect nucleolar
Aspect dens patat
Aspect fin patat
Antigene nucleare solubile
Auto anticorpi anti-Sm
Auto anticorpi anti-RNP
Auto anticorpi anti-SSA
Auto anticorpi anti SSB
Auto anticorpi
anti Scl 70
Auto antic. anti RNA Pol (III)
Fara specificitate
ADN nativ si sau
cromatina
Profil antigene nucleare solubile
Profil antigene specifice hepatice
Anticorpi antinucleari titrare (aspect, titru)
Posibile granulatii citoplasmatice
Nici o afectiune, remisiune, tratament
Polimiozite % de LES
Ciroza biliara primitiva
Proteina P ribozomala
slab
Scleroza sistemica
progresiva, Scleroderma
overlap, S. Raynaud
S. Crest, Scleroza
sistemica, Fenomene Raynaud
Marker pentru LES
Ciroza biliara primitiva
Posibil LES activ, Artrita
reumatoida (AR), Lupus indus
medicamentos
Marker LES
Conectivita mixta de
tesut (MCTD)
S. Sjogren, LES
LES neonatal, S. Sjogren
Marker scleroderma
Scleroderma mai ales difuza
cutanata
LES, MCTD, AR, EBV, Hepatita cronica
47