11 Technologie de lADN recombinant Gaëlle DIRIBARNE, 2008 [email protected]

11

Technologie de l’ADN recombinant

Gaëlle DIRIBARNE, 2008

[email protected]

2

ORGANISME DONNEUR :

Extraction d'un fragment d'ADN

d'intérêt

VECTEUR(fragment d'ADN

capable de réplication autonome)

Principe

Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur

Exemple : gène associé à

une maladie

Amplification de cet ADN, expression des protéines correspondantes...

Obtention d'un ADN Recombinant

3

Définitions

• Génie Génétique ou technologie de l’ADN recombinant : ensemble des techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations.

Les cellules modifiées (ayant intégré un ADN recombinant) peuvent exprimer la protéine recombinante (par exemple une protéine d’une espèce différente, une protéine modifiée (mutée, fusionnée à une étiquette…)).

• L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un organisme donneur et celui d’un vecteur (qui peut être d'une espèce totalement différente).

• Le clonage désigne plusieurs choses :

- Une multiplication à l'identique (conservation parfaite de l'information génétique) : à l’échelle cellulaire (clonage cellulaire) ou à l’échelle de l’organisme entier (clonage reproductif).

- L’amplification d’un fragment d’ADN par des micro-organismes après son insertion dans un vecteur

4

Plan

• A/ Les principales techniques du génie génétique

• B/ La diversité des techniques du génie

génétique

• C/ Les applications de la technologie de

l’ADN recombinant

55

A/ Les principales techniques du génie génétique

6

Principe de la technologie de l’ADN recombinant

ORGANISME DONNEUR :


d'intérêt





Expression et purification des protéines correspondantes, étude du niveau d’expression et des

fonctions des protéines...

I) O

bten

tion

de l’

AD

N r

ecom

bina

ntII

) U

tilis

atio

n de

l’A

DN

rec

ombi

nant

7

I) Obtention de l’ADN recombinant

ORGANISME DONNEUR :


d'intérêt





1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur

2) Amplification du fragment d’ADN du donneur

3) Présentation d’un vecteur

4) Insertion de l’ADN dans le vecteur : - Digestion - Ligation

5) Amplification de l’ADN recombinant obtenu 6) Vérification de la construction

8


ORGANISME DONNEUR :


d'intérêt


9


L'ADN de l'organisme donneur peut être :

- de l'ADN génomique (extrait à partir d'une culture cellulaire...)

- de l’ADN complémentaire (ADNc) obtenu par

transcription réverse sur des ARN messagers

(L’ADNc comporte une information sur les régions 5' et 3'

non traduites, et ne contient pas d'introns)

10


AAAAAA 3’ARNm avec queue polyA 5’

=> Obtention d'un brin d’ADN complémentaire

Pour obtenir le deuxième brin d’ADNc, une PCR est réalisée sur l’ADN obtenu

avec une ADN polymérase (voir principe diapo 12). L’ARN peut être éliminé

par un traitement la RNase.

On peut obtenir une banque d'ADNc : clonage de tous les ADNc (cela dépend des ARNm exprimés par une cellule à un moment donné dans des conditions données)On peut aussi cloner un ADNc spécifique en choisissant une amorce à cheval sur la queue polyA et le 3' du transcrit

Pri

ncip

e d

e la

tran

scri

ptio

n ré

vers

e

TTTTT

1) Hybridation avec un

oligonucléotide complémentaire

de la queue polyA

2) Élongation de l'amorce par la transcriptase réverse

11


ORGANISME DONNEUR :


d'intérêt


2) Amplification du fragment d’ADN d’intérêt

12

2) Amplification du fragment d’ADN d'intérêt : la PCR

• Amplification du fragment d'ADN d'intérêt (gène entier ou tronqué) par PCR : Polymerase Chain Reaction

• La PCR est une réaction de polymérisation en chaîne à partir d'amorces spécifiques de l'ADN d'intérêt, grâce à l'action d'une enzyme, l’ADN polymérase dans un milieu contenant des nucléotides

13

2) Amplification du fragment d’ADN d'intérêt : la PCR

Séquence à amplifier

5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'

14

2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR

Temps

Tem

péra

ture

(°C

)

95

72

Tm

1ère étape : dénaturation

de l'ADN à 95°C (séparation des brins complémentaires)

5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'

3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'

15


Temps

Tem

péra

ture

(°C

)

95

72

Tm

5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'

3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'

Amorce

Amorce

2ème étape : hybridation des amorces (séquence de nucléotides complémentaires de l’extrêmité de la région à

amplifier) à une température Tm (spécifique de l'amorce)

(en général amorces de 15-25 nucléotides)

5’ G T C 3'

3' C G C 5'

16

Temps

Tem

péra

ture

(°C

)

95

72

Tm

5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' C G C 5'

G T C3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'

5'

3ème étape : élongation (synthèse du brin complémentaire à partir des amorces grâce à l’enzyme ADN polymérase et aux nucléotides présents dans le milieu réactionnel). Fonctionnement de l’enzyme à 72°C.

G G A A T C C A T G C G T A C G

A T A G C A G C C T T A G G T A


Fin du premier cycle de PCR : aucune molécule obtenue ne correspond au produit désiré (souligné). Un nouveau cycle de PCR (dénaturation-hybridation-élongation) commence.

17

5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'

5'G T C G G A A T C C A T G C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5' 5’G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'C A G C C T T A G G T A C G C 5'

5'G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'


5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' C G C 5' G T C3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'

5' G G A A T C C A T G C G T A C G 3’

3'A T A G C A G C C T T A G G T A

Produits du 1er cycle de PCR :

Produits du 2ème cycle de PCR : (les amorces sont en magenta)

Brin 1Brin 2

Brin 3Brin 4

Produit PCR formé à

partir du brin 1


partir du brin 2


partir du brin 3


partir du brin 4

18Temps

Tem

péra

ture

(°C

)

95

72

Tm

5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'

G T C G G A A T C C A T G C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5'

G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'C A G C C T T A G G T A C G C 5'

G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'

5'

5'

5'

1er cycle 2ème cycleMolécules obtenues à la fin du second cycle de PCR. Aucune ne représente le produit d'intérêt (souligné).


1919

T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C

G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C

G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C

G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C


G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C

G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C

5'5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

Fin du troisième cycle :

deux produits PCR

attendus apparaissent.

Ces produits vont

ensuite se multiplier de

façon exponentielle par

rapport aux produits

non souhaités.


Molécules d’ADN obtenues à la fin du 3ème cycle de PCR :

2020

T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C

G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C


G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C


G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C

G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C

5'5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'


Quatrième cycle de PCR :

8 fragments d'ADN

d'intérêt

Cinquième cycle de

PCR :

22 fragments

d'intérêt

Les deux molécules d’intérêt obtenues au 3ème cycle donnent chacune deux molécules d’ADN d’intérêt au 4ème cycle.4 fragments simple brin des autres molécules pourront donner un produit PCR souhaité au 4ème cycle.

21

• Répétition des 3 étapes : dénaturation-hybridation-élongation (la machine à PCR fait des cycles de température) => Amplification du fragment d'intérêt de façon exponentielle à partir du troisième cycle

• L’enzyme ADN polymérase ne doit pas être dénaturée à 95°C : utilisation de l'ADN polymérase de bactéries thermophiles (par exemple la Taq polymérase provient de Thermophilus aquaticus, microorganisme vivant près des sources d’eaux chaudes (50 à 80°C) ; la Pfu polymérase provient de Pyrococcus furiosus)

• Différentes enzymes peuvent être utilisées selon le degré de fidélité souhaité pour l'amplification du fragment (la Pfu est beaucoup plus fidèle mais plus lente pour l'amplification par exemple)


22


ORGANISME DONNEUR :


d'intérêt



3) Présentation d’un vecteur

Le clonage repose sur l'insertion d'un fragment d'ADN exogène dans un vecteur, ce qui permet ensuite d'exprimer l'ADN dans des cellules

23

3) Présentation d’un vecteur de clonage

• Grande diversité des vecteurs : (détaillée en B)

• Cosmides

• Bactériophages

• Chromosomes artificiels de levure (YAC) et de bactérie (BAC)

• Plasmides : très souvent utilisés, réplication dans les bactéries (exemple choisi)

• Les vecteurs utilisés en génie génétique ont souvent une origine naturelle (plasmides, bactériophages) mais ont été largement modifiés

24

3) Présentation d’un vecteur : Propriétés du vecteur

• Capacité de réplication autonome dans une cellule hôte donnée

• Possession d’un site de clonage multiple pour l'insertion du fragment d'ADN (correspond à différents sites uniques de restriction = des sites où le vecteur peut être ouvert, voir 4))

• Insertion d'un fragment d'ADN plus ou moins grand bien supportée

• Présence fréquente d’un marqueur de sélection (gène de résistance à un antibiotique, marqueur de sélection métabolique)

25

3) Présentation d’un vecteur : Exemple du plasmide

a) VecteurSite de clonage multiple : nombreux sites de restriction (voir 4)) uniques permettant l'insertion de l'ADN après le promoteur

Origine de réplication dans la bactérie

Marqueur de sélection : résistance contre l'antibiotique kanamycine

Plasmide : petite molécule extrachromosomique, d'ADN double brin circulaire, de 3 à 10 kilobases. Capable de se répliquer indépendamment du chromosome bactérien et pouvant être transféré d'une cellule à une autre.

Promoteur (pour pouvoir exprimer la protéine d'intérêt il faut cloner la séquence d'ADN en phase avec le promoteur (cf. cadre de lecture de la traduction)

26


ORGANISME DONNEUR :


d'intérêt




4) Insertion de l’ADN dans le vecteur :

27

4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur :

Définition des enzymes de restriction

• Une enzyme de restriction est une protéine capable de couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. C'est une endonucléase (coupure à l'intérieur du brin d'ADN au niveau des

liaisons phosphoesters). • Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement

connues, dont un grand nombre se retrouve naturellement chez la bactérie. En effet, les enzymes de restriction peuvent couper (et ainsi conduire à la destruction) de l'ADN étranger (notamment des virus). Cela limite les infections virales chez les bactéries, d'où le terme de restriction. L'ADN bactérien lui-même est protégé de la coupure par des modifications du type méthylation.

2828

GAATTC

CTTAAG

Exemple : site de restriction de l'enzyme EcoRI (provenant de la bactérie Escherichia coli)

5'

5'

3'

3'

5'

5'

G AATTC

CTTAA G 5'

3'5'

3'

Coupure par EcoRI

Rq : Certains sites de restriction sont des séquences palindromiques


Exemple d’une enzyme de restriction

Formation d'extrémités dites cohésives, ou bouts collants

Rq : Certaines enzymes donnent des bouts francs après coupure.Exemple : SmaI :

CCC GGG GGG CCC

29

Vecteur (plasmide)

Vecteur digéré

+Petit fragment d’ADN dégagé

lors de l’ouverture du plasmide

4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Principe

Site de restriction Enzyme1

Site de restriction Enzyme 2

Digestion par les enzymes 1 et 2Création de 2 extrêmités cohésives (ou franches) 1 et 2.

Digestion 1 heure dans le tampon adapté à

l'enzyme (cf. quantité de sels...) à la température

optimale de l'enzyme

Si l’on digère le fragment d’ADN par les

deux mêmes enzymes 1 et 2, donnant des

bouts collants, on obtient des extrémités

cohésives complémentaires avec celles du

vecteur. Ceci permet l’insertion du fragment

d’ADN dans le vecteur.

TTAAAATT

TTAA

AATT

VecteurFragment à cloner

30

5'

ADN d'intérêt


Digestion du fragment d’ADN

Le fragment d’ADN d’intérêt ne contient pas forcément les bons sites de restriction. Comment peut-on les ajouter aux extrêmités de l’ADN à cloner ? Cela se fait par PCR avec des amorces spéciales :

5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3' C G C

G T C 3'3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'

5'

Amorce avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas comportant la séquence d'un site de restriction 1

Amorce avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas comportant la séquence d'un site de restriction 2

31

G T C G G A A T C C A T G C G

C A G C C T T A G G T A C G C ADN d'intérêt

5'

5'3'

3'

Voici l'ADN obtenu après PCR, avec les sites de restriction à ses extrémités. Il pourra être utilisé pour le clonage.

Séquence du site de restriction de l'enzyme 1

Séquence du site de restriction de l'enzyme 2


Digestion du fragment d’ADN

32


Digestion du vecteur

Vecteur (plasmide)

Vecteur digéré

+Petit fragment d’ADN dégagé

lors de l’ouverture du plasmide



Digestion par les enzymes 1 et 2Création de 2 extrêmités cohésives (ou franches) 1 et 2.

Le fragment d’ADN doit être cloné

dans le vecteur digéré. Le petit

fragment dégagé peut se réinsérer

dans le vecteur digéré à la place du

fragment d’ADN à cloner. Il est donc

nécessaire de séparer les deux

produits de la digestion du vecteur et

de purifier le vecteur digéré pour la

suite du clonage.

33

4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du

vecteur : Purification du vecteur digéré

• L’électrophorèse est une méthode de séparation des particules chargées électriquement par migration différentielle sous l’action d’un champ électrique. Elle s’applique aux : protéines, peptides, acides aminés, acides nucléiques, nucléotides

• La migration dépend de la charge et de la géométrie des particules

• L’électrophorèse peut se faire en veine liquide ou sur un support homogène, poreux et relativement inerte (papier, gels…)

34

Solution d'électrolytequi recouvre le gel(assure la conduction électrique)

Gel d'agarose

Les fragments de restriction sont visualisés sur gel d'agarose par électrophorèse :ci-contre le dispositif utilisé

Dépôt des échantillons dans les puits du gel

+

Générateur électrique

-

4) Insertion de l’ADN dans le vecteura) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification

du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose

cham

p él

ectri

que

Principe : migration des fragments d'ADN dans un champ électrique, séparation en fontion de leur taille

35

Fragments de restriction : vecteur digéré et bout dégagé par la restriction

Dépôt dans le puits du gel

-

+

Particule de gel

Migration des fragments d'ADN entre les particules de gel selon le gradient électrique(les acides nucléiques sont globalement négatifs, déplacement vers le pôle +)

Les fragments d'ADN migrent de façon inversement proportionnelle à leur taille : les plus gros fragments migrent peu tandis que les petits fragments migrent beaucoup



Principe de l’électrophorèse :

36

Révélation du gel par incubation avec un intercalant d'ADN (fluorescent)

1

1 : bande du vecteur digéré2 : petit fragment extrait du vecteur lors de la digestion

2

Il est possible de récupérer la bande 1 : on découpe la bande sur le gel, on extrait l'ADN de l'agarose et on le purifie sur une colonne (fixation de l'ADN sur la colonne, lavage, puis élution de l'ADN purifié) => on récupère ainsi l'ADN du vecteur digéré, utilisé pour le clonage.Cette purification sur gel permet aussi d’éliminer en partie les traces de vecteur non digéré. Si le fragment d’ADN dégagé à éliminer est très petit, une purification sur colonne peut être suffisante.

Marqueur de poids moléculaire : fragments de taille connue (obtenus par exemple après digestion enzymatique de l'ADN du bactériophage Lambda) => cela permet de déterminer la taille des bandes d'intérêt par comparaison au marqueur



37

5'

3' 5'

3'

Fragment d‘ADN à cloner

5'

3' 5'

3'

=> Création d'extrémités collantes complémentaires. Insertion du fragment d’ADN dans le vecteur ouvert purifié, hybridation au niveau des extrêmités complémentaires. Il reste à lier ces deux morceaux d’ADN de façon covalente.

4) Insertion de l’ADN dans le vecteurb) Ligation du fragment d’ADN dans le vecteur

Vecteur (plasmide)

Vecteur digéré

+Petit fragment d’ADN dégagé lors de l’ouverture du plasmide



Digestion du vecteur et du fragment d’ADN à cloner par les enzymes 1 et 2

38

• La ligase est une enzyme capable de former des liaisons covalentes (formation de liaisons

phosphoester) entre deux molécules d'ADN (au niveau d'une zone d'hybridation des molécules d'ADN)

Fragment d'ADN d’intérêt inséré dans

le vecteur

5' P

3' 0H

P 5'

OH 3'

-P-0--0-P-

Ligase

Liaison phosphoester

Après ligation, on obtient un plasmide recombiné

4) Insertion de l’ADN dans le vecteurb) Ligation du fragment d’ADN dans le vecteur

• Intérêt d'utiliser deux enzymes différentes lors de la digestion :

• insertion orientée de l’ADN à cloner dans le vecteur

• limitation de la religation du vecteur sur lui-même

39


ORGANISME DONNEUR :


d'intérêt





5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu

40

5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Transformation des bactéries

1) Mélange de plasmides et de bactéries compétentes sur glace

(les bactéries compétentes ont été traitées pour faciliter l'entrée d'ADN : leur paroi a été fragilisée par un traitement au chlorure de calcium)(utilisation de Escherichia coli en général : utilisation facile, croissance rapide)

2) Choc thermique à 42°C : les plasmides vont pénétrer dans les bactéries

4) Étalement sur boîte (pour la sélection)

3) Ajout de milieu nutritif aux bactéries, croissance 1h à 37°C(cela permet l'expression des protéines de résistance aux antibiotiques pour la sélection ultérieure)

41

Mélange de bactéries transformées contenant le plasmide d'intérêt et de bactéries non transformées

Étalement des bactéries sur une boîte contenant un milieu gélosé et un antibiotique : seules les bactéries transformées pourront se multiplier car le plasmide porte un gène de résistance contre l'antibiotique

Colonie de bactéries transformées

Il faut sélectionner les bactéries transformées (celles comportant le plasmide recombiné)

5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Sélection des bactéries transformées

42

• Ensemencement d’une colonie de bactéries transformées dans du milieu liquide + antibiotique une nuit à 37°C

=> Multiplication des bactéries et donc amplification du nombre de plasmides recombinés (cf. présence d'une origine de réplication bactérienne sur le plasmide, l'antibiotique assure une pression de sélection pour que les bactéries conservent le plasmide)

• Il faut ensuite récupérer le plasmide

5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Extraction du plasmide recombiné

43

• Les bactéries sont lysées par un détergent en milieu alcalin afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique. L'ADN génomique et les protéines sont précipités par de l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique.

• L'ADN plasmidique est alors précipité (volume double d'éthanol ou isopropanol), lavé puis redissous dans un tampon adéquat. Cette étape peut être réalisée avec des colonnes de purification d’ADN.

5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :Extraction du plasmide recombiné

44

I) Obtention de l’ADN recombinantORGANISME DONNEUR :


d'intérêt




Obtention d'un ADN Recombinant amplifié

6 ) Vérification de la construction

Les bactéries poussant sur le

milieu+antibiotique

possèdent un plasmide avec

le gène de résistance à

l’antibiotique. Mais ce

plasmide contient-il l’insert

cloné ? Il peut y avoir

religation du vecteur sur lui-

même. Nécessité d’un crible

pour trouver les clones

positifs ayant intégré l’ADN à

cloner.

45

6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR

Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui-même (2) => il faut distinguer ces deux populations

PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose

1 2

46

Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui-même (2) => il faut distinguer ces deux populations

PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose :Résultats du gel d’agarose :

(1) (2)

Aucun produit détecté pour le vecteur seul (2), mais un produit visible pour le plasmide recombiné (1)

6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR

47

Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur :

(ex : MscI)

12

6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction

48

(1) (2)1) Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur puis

2) Analyse des produits de restriction sur gel d'agarose

On obtient des cartes de restriction différentes :une seule coupure et donc une seule bande pour le vecteur seul (2), deux coupures et donc deux bandes pour le plasmide recombiné (1)

6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction

49

ADN de séquence connue

ADN de séquence

inconnue, à séquencer

6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de

la méthode de Sanger

Didésoxyribose : formation d'une liaison phosphoester impossible, blocage de l'élongation de la chaîne synthétisée

Pnucléotide

Et de nucléotides didésoxyribose.

5’-P-polynucléotide

Choix d'une amorce

Synthèse du brin complémentaire par une ADN polymérase

La synthèse du brin complémentaire est faite en présence de nucléotides désoxyribose,

Désoxyribose : formation possible d'une liaison phosphoester (élongation de la chaîne synthétisée)

P nucléotide

5’-P-polynucléotide

50

• Réaction de synthèse du brin complémentaire de l'ADN à séquencer à partir d'une amorce, et en présence de nucléotides et d'un didésoxynucléotide => formation de fragments de différentes tailles, dont la synthèse est bloquée au niveau du didésoxynucléotide intégré :

A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A

amorce

ADN à séquencer

5'

3'

ddTT-A-ddTT-A-T-C-G-ddTT-A-T-C-G-T-A-A-ddTT-A-T-C-G-T-A-A-T-ddTT-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT

5'

5'

5'

5'

5'

5'

Brins formés en présence de didésoxy-thymine (ddT) dans le milieu réactionnel



51

• Les didésoxynucléotides sont marqués : radioactivité ou fluorescence.

• Analyse des différents brins formés sur gel ultra-résolutif (détection d'une différence d'un nucléotide)

1

2

3

45

6ddT 1T-A-ddT 2 T-A-T-C-G-ddT 3 T-A-T-C-G-T-A-A-ddT 4 T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT 5 T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 6

5'

5'

5'

5'

5'

5'



52

T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-T

A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A

ddT ddA ddG ddC

ADN à séquencer :

Lecture du brin complémentaire :

Une réaction de synthèse différente pour chacun des didésoxynucléotides, analyse sur gel pour chaque réaction, lecture du brin complémentaire (en partant des plus petits fragments vers les plus gros)

12

34

3'

5'



53

ADN à séquencer :

Lecture du brin complémentaire : 5'G-T-C-T-T-A-A-C-G-T-C-T-C-A

3'C-A-G-A-A-T-T-G-C-A-G-A-G-T

Automatisation des résultats de séquençage : les didésoxynucléotides sont marqués avec des fluorescences différentes, cela permet de faire une seule réaction et une seule lecture. Le séquenceur détecte la fluorescence et repère la taille des fragments d'ADN.

On obtient des courbes de fluorescences qui sont interprétées en terme de nucléotides avec un indice de confiance (ici barre verte : confiance maximum)

6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Automatisation du

séquençage

54

II) Utilisation de l’ADN recombinant

Obtention d'un ADN Recombinant amplifié

Utilisation de l’ADN recombinant, notamment

pour comprendre le fonctionnement des gènes

Quelques exemples :

- Production et purification de la protéine étudiée en grandes quantités (pour des

analyses structurales, recherche de protéines associées, de modifications post-

traductionnelles…)

- Etude de l’expression des gènes, quantitative et qualitative ; temporellement et

spatialement

- Etude de la fonction des gènes (fabrication de protéines mutantes…)

1) Production de protéines recombinantes

1) Production de protéines recombinantesa) Protocole : contraintes et solutions

55

• Expression des protéines dans des bactéries E. coli dépourvues de protéases (préservation de la protéine produite)

• Les cellules sont cultivées en grandes quantités (dans des fermenteurs pour la production de protéines à l'échelle industrielle)

• Problème : avec un fort taux de croissance et une synthèse très importante des protéines recombinantes, les cellules meurent rapidement, ce qui limite alors l'expression des protéines recombinantes

• Pour résoudre ce problème : découplage entre une phase de croissance (multiplication des bactéries, et donc amplification du gène de la protéine d'intérêt) et une phase d'expression (transcription du gène qui conduira à la synthèse de la protéine)

56

• Une cellule hôte procaryote présente certaines contraintes :

• nécessité d'un promoteur procaryote pour que la bactérie

puisse transcrire le gène d'intérêt (il faut donc travailler avec

un vecteur adéquat)

• la bactérie ne fait pas d'épissage. Ce problème est évité

par une construction à partir d'un ADNc (comme il est obtenu à

partir d'un ARNm mature, il est dépourvu d'introns)

• Cependant, culture facile et croissance rapide des bactéries

(contrairement aux cellules eucaryotes comme levures et ovules)

1) Production de protéines recombinantes a) Protocole : contraintes et solutions

57

1) Culture des bactéries dans du milieu nutritif + antibiotique nécessaire à la sélection => à 37°C, jusqu'à une densité optique de 0,6 environ (cela correspond à la phase exponentielle, les bactéries sont en pleine croissance)

0) Transformation de bactéries compétentes par le plasmide d'intérêt, culture à partir des colonies obtenues

2) Induction de l'expression des protéines par activation de la trancription du gène de la protéine

3) Récupération des protéines

1) Production de protéines recombinantes a) Protocole

58

La transcription du gène codant pour la protéine d’intérêt est contrôlée à l’aide de promoteurs inductibles :

• Promoteurs thermosensibles (changement de l’expression suivant la température)

• Promoteur de l’opéron lactose

1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel

59

Présentation de l’opéron lactose :

P LacI T CAP P O LacZ TLacY LacA

P : promoteurT : terminateurO : opérateurCAP : site de fixation de CAP (récepteur de l'AMPcyclique), activateur de la transcription

Répresseur de l'opéron lactose : en se fixant sur l’opérateur, il bloque la transcription de LacZ, LacY et LacA

Bétagalactosidase(clivage du lactose en glucose + galactose)

Perméase (pompage du lactose dans la cellule)

Transacétylase


Gène régulateur Gènes de structureSites de contrôle

4) Lactose, beaucoup de glucose dans le milieu : => Transcription basale

P LacI T CAP P O Gènes de structure

3) Lactose, peu de glucose dans le milieu : => Transcription active

LacI


Analogue de lactose

CAP Polymérase

Fonctionnement de l'opéron lactose dans la bactérie :


1) Absence de lactose, beaucoup de glucose dans le milieu : => Absence de transcription


LacI

2) Absence de lactose, peu de glucose dans le milieu : => Absence de transcription


LacICAP

60

61

Pour les clonages,remplacement du gène LacZ par la séquence du gène de la protéine d'intérêt.Utilisation d'IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), un analogue de lactose : l'IPTG se lie avec le répresseur, l'empêchant alors de se fixer sur l'opérateur. Cela permet l'activation de la transcription

P LacI T CAP P O Gène de la protéine d'intérêt T

Modification de l'opéron lactose pour les clonages :


LacI

LacI IPTG

Transcription active

Les protéines sont dans le cytoplasme des bactéries, qui ont aussi une paroi.Il est donc nécessaire de lyser les bactéries pour récupérer les protéines.

Etape de sonication (destruction mécanique par des ultrasons) et ajout d’un détergent (lyse chimique)

62

1) Production de protéines recombinantes c) Extraction des protéines

Prélèvement d’un échantillonde l’extrait bactérien, supposé

contenir nos protéines

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide

dénaturant

Le gel de polyacrylamide est une matrice inerte formant beaucoup de liaisons croisées à travers lesquelles migrent les protéines. Il joue le rôle d'un tamis moléculaire. La taille des pores peut être ajustée suivant la taille des protéines que l'on souhaite visualiser.

63

1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS

Prélèvement d’un échantillonde l’extrait bactérien, supposé

contenir nos protéines

Dénaturation des protéines par mélange

avec du tampon de charge, et chauffage

5min à 95°C

Le tampon de charge (Laemmli) contient notamment : - du glycérol qui augmente la densité de l’échantillon et facilite son dépôt dans les puits du gel

- un colorant, qui facilite le suivi de la migration des échantillons sur gelET SURTOUT :

- des agents réducteurs : destruction des ponts disulfures des protéines,

- un détergent anionique SDS (sodium dodécylsulfate) : fixation sur les régions hydrophobes de la protéine, cela provoque alors son dépliement => la protéine est soluble dans la solution de détergent

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant

64


La charge intrinsèque de la protéine est masquée par les charges négatives du SDS. Les protéines vont donc migrer vers le pôle positif lors de l'application d'une tension. Les grandes protéines, quoi que plus chargées négativement migrent moins loin car elles sont davantage retenues par le maillage du gel. Les protéines sont alors fractionnées selon leur masse moléculaire.

Rq : Cette méthode est très puissante : elle permet d'analyser des protéines insolubles dans l'eau, protéines membranaires, protéines de gros agrégats... Elle apporte des informations sur la composition des sous-unités d'un complexe protéique.

Prélèvement d’un échantillonde l’extrait bactérien, supposé contenir

nos protéines

Dénaturation des protéines

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant

65


+

Générateur électrique

Solution d'électrolyte

Solution d'électrolyte

Gel d’acrylamide dénaturant

Dépôt des échantillons dans les puits du gel

-

Migration des

protéines selon leur

taille

Plus lourd

Plus léger

Electrophorèse en conditions dénaturantes (destruction des structures tertiaires et quaternaires), migration des protéines inversement proportionnelle à leur masse


• Toutes les protéines fortement exprimées peuvent être détectées par leur coloration dans le gel (au bleu de Coomassie ou avec du nitrate d'argent pour des protéines moins concentrées). C’est une détection globale de toutes les protéines fortement exprimées.

• Des protéines en plus faibles quantités peuvent être détectées par Western Blot après transfert sur membrane (ex : membrane de nitrocellulose). Cette détection est spécifique.

67

1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines :

Coloration ou transfert sur membrane

Les protéines se déplacent selon le champ électrique, elles passent du gel à la membrane. Le transfert se déroule pendant une à 2 heures. Le même principe est utilisé pour le transfert des acides nucléiques (qui peuvent aussi être transférés en une nuit par capillarité, en absence de champ électrique)

Gel Membrane

-

+Générateur électrique

68


Transfert sur membrane

Principe du transfert sur membrane :

Papiers buvard imbibés de tampon

Papiers buvard imbibés de tampon

Détection des protéines sur la membrane par WESTERN BLOT : reconnaissance spécifique de la protéine qui nous intéresse à l'aide d'un anticorps dirigé contre cette protéine.

1) Saturation des sites non spécifiques par incubation avec du lait (les protéines du lait vont se fixer sur la membrane, ce qui limite la liaison des anticorps sur des sites non spécifiques)

Membrane

Protéine d'intérêt

69


Détection des protéines par Western blot

2) Incubation avec l'anticorps primaire spécifique de la protéine :Reconnaissance de la protéine par l'anticorps

Anticorps primaire spécifique de la protéine

3) Lavages de la membrane (les anticorps non fixés sont éliminés)

Membrane


Anticorps primaire spécifique de la protéine

4) Incubation avec l'anticorps secondaire, qui reconnaît l'anticorps primaire. Une enzyme est fixée sur l'anticorps secondaire

Anticorps secondaire spécifique du premier anticorps

Enzyme fixée sur l'anticorps

70



5) Lavages de la membrane (les anticorps non fixés sont éliminés)

Membrane


Exemple d'image obtenue sur film photosensible

Signal de notre protéine

La lumière émise peut être détectée sur

un film photosensible, ou par une

caméra

Marqueur de poids

moléculaire (kDa)

40

60

71



6) Révélation du Western Blot : le substrat de l'enzyme est ajouté. La réaction enzymatique transforme ce substrat en un produit luminescent

Substrat de l'enzyme

La réaction enzymatique donne un produit luminescent

Les électrophorèses sur gel d'acrylamide sont aussi utilisées pour la séparation des acides nucléiques de petite taille ; pour des fragments plus grands, un gel d’agarose est utilisé. La révélation se fait après transfert sur membrane :

• Pour les ADN : on révèle les ADN sur la membrane à l'aide de sondes ADN complémentaires marquées radioactivement (ou chimiquement). On parle de SOUTHERN BLOT.

Le Southern Blot a été inventé par Edward M. Southern en 1975.

Cette méthode a ensuite été appliquée à d'autres molécules que les

ADN (Western Blot pour les protéines et Northern Blot pour les ARN)

• Pour les ARN : on révèle les ARN sur la membrane à l'aide de sondes ADN complémentaires de la séquence de l'ARN étudié, marquées radioactivement (ou chimiquement). On parle de NORTHERN BLOT.

72

1) Production de protéines recombinantes e) Détection des acides nucléiques

Remarque : Comment marquer une molécule d’ADN pour obtenir une sonde ?

73

1) Production de protéines recombinantes e) Détection des acides nucléiques

Fragment d’ADN de restriction purifié5’

5’3’

3’

Dénaturation et hybridation avec un mélange

d’oligonucléotides de 6 nucléotides

5’

3’

3’

5’

PCR avec ADN polymérase en présence de

nucléotides marqués : soit radioativement, soit

chimiquement (détection avec un anticorps

spécifique du groupement chimique)

5’

3’

3’

5’

5’

5’ 5’

Obtention de petits ADN marqués, complémentaires

de différentes zones sur les 2 brins de l’ADN

considéré

74


Les protéines recombinantes sont exprimées en

grandes quantités, mais sont mélangées avec les

protéines bactériennes. Il est donc nécessaire de

purifier la protéine d’intérêt.

2) Purification des protéines

75

Une technique de séparation des protéines est la chromatographie. Elle

nécessite une phase stationnaire et une phase mobile, la séparation se fait en

fonction de l’affinité des protéines pour chacune des phases. Exemple d’une

chromatographie sur colonne :

Phase stationnaire

2) Purification des protéinesa) Chromatographie

1) Solutés(mélange) 2) Passage

continu d’une phase mobile (solvant)

3) Séparation des composants de l’échantillon suivant leur affinité pour la phase mobile et la phase stationnaire

- Chromatographie de partage (en phase inverse) : phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire. Séparation selon le degré de polarité des composés.

- Chromatographie d’échange d’ions : phase stationnaire chargée positivement ou négativement. Séparation suivant la charge des composés.

- Chromatographie d’exclusion : support poreux. Séparation en fonction de la taille : les grosses molécules sortent très vite de la colonne tandis que les plus petites, qui peuvent traverser les pores sont retardées et sortent plus tard.

- Chromatographie d’affinité : séparation selon des propriétés de forme. C’est la technique la plus puissante car elle repose sur des interactions spécifiques.

2) Purification des protéinesa) Chromatographie

+++

-

-

-

-

+

++

Flux de solvant

Molécules chargées négativement retenues sur les billes chargées positivement

Flux de solvant

Petites molécules retardées par la traversée des billes poreuses ; grosses molécules non retardées

76

Cette technique est spécifique de la protéine étudiée. Des anticorps reconnaissant la protéine sont fixés à des billes (phase stationnaire).

billes

anticorps

Dépôt de l’extrait cellulaire sur la colonne (phase d’accrochage sur les anticorps)

77Protéine d’intérêt

Chromatographie d’affinité : - Immunopurification : utilisation de l’interaction Anticorps/Ligand

2) Purification des protéinesb) Chromatographie d’affinité

Après lavages (élimination des molécules interagissant de façon peu spécifique), les protéines d’intérêt peuvent être éluées (par exemple avec un peptide compétiteur).

L’immunopurification permet de purifier une protéine spécifique, mais il faut disposer d’un anticorps suffisamment efficace et spécifique. De plus, on n’a pas toujours de systèmes d’élution efficaces.

78

Etiquette (molécule de fusion, par exemple peptide de fusion)

Protéine d'intérêtProtéine

d'intérêt fusionnée à une étiquette

On utilise aussi d’autres systèmes de chromatographie d’affinité reposant sur des interactions ligand/récepteur du ligand et l’utilisation d’une protéine recombinante fusionnée à une étiquette.


Protéine d'intérêt avec une étiquette


Protéines bactériennes

Peptide de fusion

Des groupements (récepteurs du ligand) fixés sur la colonne interagissent avec le peptide de fusion. Toutes les autres protéines, non retenues sur la colonne sont éliminées.

Dépôt de l'extrait cellulaire sur la colonne

Rétention de la protéine d'intérêt

Protéines non retenues sur la colonne

Lavages pour éliminer les

éventuels contaminants 79


Ajout d'un agent permettant l'élution (un compétiteur)

Protéines d'intérêt éluées

Après élution on obtient les protéines d'intérêt fusionnées.Un clivage peut être effectué entre la protéine d'intérêt et le peptide de fusion. Un nouveau passage sur colonne d'affinité permet de retenir les peptides de fusion et de récupérer les protéines purifiées

Clivage spécifique

Rétention de la protéine de fusion sur la colonne

Protéine d'intérêt purifiée

80


Conclusion : Utilisation des protéines recombinantes :- Avec de grandes quantités de protéine purifiée, possibilité d’analyser la structure 3D par diffraction des rayons X ; possibilité d’analyser les modifications post-traductionnelles de la protéine au spectromètre de masse- Possibilité de co-purifier des protéines associées à la protéine étudiée si les lavages ne sont pas trop stringents

La protéine est digérée pour obtenir un ensemble de peptides. Dans le spectromètre de masse, les peptides sont fragmentés, et la masse des fragments obtenus est mesurée. L’ensemble des masses des différents fragments est caractéristique d’une molécule donnée. Cette technique permet d’identifier des molécules, mais aussi de détecter des modifications sur une protéine connue

Billes

Anticorps Protéine d’intérêt

Protéines

associéesSéparation des protéines sur gel ; études par Western blot pour des protéines connues ou par spectromètre de masse pour des molécules inconnues

81

82


Différents types cellulaires sont caractérisés par l’expression de protéines

différentes.

L’expression différente des gènes (codant notamment pour des protéines

homéotiques) dans un embryon joue un rôle clé dans la mise en place du

plan d’organisation de l’organisme.

Suivant les conditions, les besoins en différentes protéines changent

(exemple du stress).

Comment étudier l’expression des gènes, à la fois d’un point de vue

quantitatif et qualitatif, et d’un point de vue spatial et temporel ?

3) Etude de l’expression des gènes

- Par Western blot : pas de quantification absolue. On peut obtenir des données comparatives qualitatives entre différentes conditions. Un gène de ménage est souvent utilisé comme référence.

- Par dosage : méthodes spectroscopiques, immunologiques, enzymatiques

- Indirectement par Northern blot : information sur la quantité d’ARN messager correspondant à la protéine (Rq : une augmentation des ARNm peut provenir d'une augmentation de la

transcription ou d'une augmentation de la stabilité des ARNm). Le Northern blot fournit des informations plus quantitatives qu’un Western blot (moins de problème de saturation du signal)

83

3) Etude de l’expression des gènesa) Quantification des protéines dans un extrait cellulaire

Le niveau d’expression d’un gène peut être quantifié à l’aide de gènes rapporteurs : remplacement de la portion codante du gène considéré par un gène rapporteur :

- gène d'une enzyme (mesure enzymatique)- gène d'une protéine fluorescente (mesure de la fluorescence)

Exemple : Remplacement de la séquence codante du gène étudié par la séquence codante d’une enzyme : la luciférase.

Mesure de l'activité enzymatique in vitro avec ajout du substrat. Ce sont des données relatives, qui doivent être comparées à une référence.

3) Etude de l’expression des gènes :b) Les gènes rapporteurs

luciférine (substrat de l'enzyme)

Séquences

promotrices

Séquence

codante du

gène d’intérêt

Séquence

de la

luciférase

Luciférase

Réaction enzymatique => Emission d'un photon (quantification possible par spectrophotométrie)

84

85


On obtient des informations sur le niveau d’expression d’un gène dans une cellule à un moment donné, pour des conditions données (résultats quantitatifs contrairement au Western blot)A

ctiv

ité lu

cifé

rase

1 2 Gène X quatre fois plus exprimé dans la condition 1 que dans la condition 2

Exemple : niveau

d’expression d’un gène X

sous deux conditions

différentes (1et 2)

86


Ce genre de construction permet également d’analyser ce qui contrôle l’expression des protéines : Exemple :

Séquence codante du gène X

Séquence codante du gène rapporteur

1 2 A B C DCellules

Séquences promotrices

La séquence régulatrice 1 active l’expression du gène X dans la

cellule A, la séquence 2 active l’expression de X dans la cellule C

87


Il est possible d’obtenir des animaux transgéniques exprimant les

séquences promotrices d’un gène étudié fusionné à un gène

rapporteur.

La révélation du produit du gène rapporteur sur des embryons à

différents stades apporte des informations spatiales et

temporelles sur l’expression du gène étudié.

Stade 1 : pas d’expression du gène

Stade 2 : expression postérieure du gène

Exemple :

Comment localiser notre protéine dans des cellules ?Deux possibilités :

1) Regarder la protéine endogène par immunofluorescence

2) Construire une protéine fusionnée à une protéine fluorescente

Dans les 2 cas, l'observation est faite avec un microscope à

fluorescence. On peut regarder la localisation de la protéine d'intérêt

dans des cellules en culture ou des coupes de tissus. Dans tous les

cas, les cellules sont préalablement fixées (elles sont alors

immobilisées et les macromolécules sont stabilisées et bloquées en

l'état). 88

3) Etude de l’expression des gènes :c) Localisation des protéines

Pour localiser des protéines endogènes dans une cellule (ou sur une coupe de tissu), une technique proche du Western blot est utilisée : l'immunofluorescence

Cellulefixée sur lamelle et perméabilisée

noyau

protéine étudiée

Analyse du signal fluorescent par observation au microscope à fluorescence => localisation de la protéine d'intérêt

lavages lavages

Détection de la protéine par un anticorps spécifique (anticorps primaire) après incubation avec de la BSA (bovine serum albumine, pour saturer les sites de liaison non spécifiques)

noyau

Reconnaissance de l'anticorps primaire par un anticorps secondaire fusionné à un fluorophore

89

3) Etude de l’expression des gènes :c) Localisation des protéines : immunofluorescence

On peut fusionner une protéine fluorescente à l'extrêmité C-terminale ou N-terminale de la protéine d'intérêt. Des plasmides contenant les protéines fluorescentes existent, et contiennent des sites de restriction permettant de cloner la protéine d'intérêt.

Ex : fusion à la GFP (Green Fluorescent Protein). La GFP est une protéine issue d'une méduse Aequorea victoria, capable d'émettre une fluorescence verte après excitation par une lumière bleue.

protéine d'intérêt

GFPExcitation par lumière bleue

Emission de fluorescence verte

Localisation des protéines dans une cellule par observation au microscope à fluorescence

90

3) Etude de l’expression des gènes :c) Localisation des protéines : fusion à une protéine

fluorescente

Les ARN et ADN peuvent être localisés dans une cellule ou une coupe de tissus grâce à l'hybridation in situ (FISH en anglais, pour Fluorescent in situ hybridization) : Utilisation d'une sonde fluorescente d'ADN complémentaire de l'ARN ou ADN étudié et visualisation sur un microscope à fluorescence.

Pour l'ADN chromosomique : les chromosomes sont préalablement exposés à un fort pH ce qui détruit les appariements de bases de l'ADN. La sonde complémentaire de la région étudiée a alors accès à l'ADN.

Pour l'ARN : pas d'exposition à un fort pH pour que l'ADN reste bicaténaire et ne fixe pas la sonde. Fixation douce pour que l'ARN soit conservé dans une forme exposée.

91

3) Etude de l’expression des gènes :d) Localisation des ARN et ADN

Les sondes utilisées sont souvent de l'ADN. Elles sont fluorescentes.Autrefois les sondes étaient marquées radioactivement. On peut également trouvé des sondes avec un marquage chimique, détecté ensuite par des anticorps.

Protocole : les sondes sont dénaturées. Elles sont incubées avec les cellules fixées et perméabilisées en présence d'ARNt et de BSA pour saturer les sites non spécifiques. Des lavages permettent d'éliminer les sondes non fixées, avant l'observation microscopique.

92

3) Etude de l’expression des gènes :d) Localisation des ARN par Hybridation

Fluorescente In Situ (FISH)

Conclusion : Etude de l’expression des gènes :

93

Les analyses se font de plus en plus à une échelle globale.Exemple : les puces à ADN permettent de comparer l’ensemble des ARNm présents dans 2 échantillons différents :

Collection de molécules d’ADN, spécifiques de gènes,

ampifiées par PCR , puis fixées sur une lame de verre

ARNm issus de l’échantillon

1 marqués par un

fluorochrome rouge

ARNm issus de l’échantillon

2 marqués par un

fluorochrome vertHybridation sur la lame, lavages, et

analyse des signaux fluorescents

Les spots rouges correspondent à des gènes beaucoup plus exprimés dans l’échantillon 1 que dans l’échantillon 2Les spots verts correspondent à des gènes beaucoup plus exprimés dans l’échantillon 2 que dans l’échantillon 1Les spots jaunes correspondent à des gènes exprimés de la même façon dans les deux échantillons et les spots noirs à des gènes non exprimés dans les deux échantillons

94


4) Etude de la fonction des gènes/protéines

Approche génétique classique : point de départ, des

mutants avec un phénotype intéressant ; puis recherche

des gènes impliqués

Approche génétique inverse : développée grâce à la

technologie de l’ADN recombinant ; il est possible de

cibler une mutation dans une séquence donnée.

Cette version mutante peut être transférée dans une

cellule pour son étude (voir partie B).

4) Etude de la fonction des gènes/protéinesa) Approche génétique classique

95

Mutagenèse aléatoire :par insertion (d’un transposon…), chimique…

Crible pour identifier un phénotype intéressant

Recherche du/des gènes impliqués

- Test de complémentation entre mutants pour savoir si ce sont ou non les mêmes gènes impliqués- Localisation du gène impliqué :

- Séquençage autour de l’insertion après avoir récupéré le fragment correspondant - Test de liaison (position relative par rapport à d’autres gènes connus ou séquences particulières)

- Recherche d’homologies de séquence ; étude de l’expression du gène spatiale et temporelle

Comment est obtenue une version mutée d’un gène ? - Par PCR mutagène (PCR en présence d’un déséquilibre entre les différents nucléotides et d’un tampon différent) => mutations aléatoires dans la séquence - Par mutagenèse dirigée : PCR avec des amorces particulières => insertion d’une mutation à un endroit précis (exemple : modification d’un acide aminé particulier)

Exemple : Séquence à muter :cag cgc gat ttc Q R D F => remplacement de l'aspartate par une alanine : Séquence de l'amorce: cag cgc gCC ttc Q R A F

ADN matrice à muter :le plasmide entier avec la séquence du gène d’intérêt à muter

amorces utilisées pour la PCR

Zone de mésappariement de l'amorce avec la matrice, correspondant à la mutation à introduire

On fait une PCR sur un plasmide entier avec des amorces présentant un mésappariement (mutation à introduire) avec la matrice

4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse

96

A la fin de la PCR de la mutagenèse dirigée on se retrouve avec un mélange de plasmides initiaux sans la mutation et de plasmides contenant la mutation

plasmide initial

plasmide avec la

mutation

Le plasmide initial est méthylé car il a été amplifié dans une bactérie (méthylation de séquences d'ADN spécifiques).

Afin de sélectionner les plasmides avec la

mutation, traitement par une enzyme qui coupe

des séquences d’ADN particulières seulement si

elles sont méthylées, puis transformation dans

des bactéries. Seul le plasmide muté, non

digéré, pourra se répliquer dans les bactéries.

4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse

97

4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse : différents

types de mutants

98

- Mutation avec gain de fonction : souvent liée à la surexpression du gène (le gène peut être placé sous le contrôle d’un promoteur puissant, et sur un plasmide multicopies)- Inactivation de gène (knockouts)- Mutation effet dominant négatif :Pour une protéine entrant dans la formation d’un complexe, une mutation peut conduire au dysfonctionnement total de ces protéines, y compris des protéines non mutantes :

4 protéines associées en complexe,protéines actives

4 protéines mutantes associées en complexe, protéines inactives

1 protéine mutante dans le complexe, toutes les protéines sont inactivées

4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse : utilisation

des mutants

99

- Etude des phénotypes des mutants- Complémentation fonctionnelle :(expériences sur des mutants conditionnels)

Si restauration de la fonction X : complémentation

fonctionnelle (identification d’un gène équivalent à

celui muté chez la levure dans un autre organisme)

Rq : ce test peut aussi mettre en évidence des gènes suppresseurs

Levures thermosensibles mutantes pour un gène X

Banque d’ADNc d’un autre organisme eucaryote, dans un vecteur levure, avec un marqueur de sélection

Transformation des levures, étalement sur milieu sélectif à température permissive (la mutation du gène X ne s’exprime pas)

Incubation à température permissive :toutes les cellules se développent

Incubation à température non permissive (la mutation du gène X s’exprime) : seules les cellules ayant une protéine qui complémente le défaut de X poussent

100

II) Utilisation de l’ADN recombinant : Conclusion

Gène ou ADNc

Protéine

Clonage dans un vecteur d’expression

Production et purification de protéine recombinante

A partir de la séquence partielle en acides aminés,

synthèse d’une sonde ADN, hybridation sur banque

d’ADN génomique ou ADNc

Documents

11 Technologie de lADN recombinant Gaëlle DIRIBARNE, 2008 [email protected]