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8/18/2019 10. Cinética enzimática
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CinéticaenzimáticaNELSON & COX
CAPÍTULO 6
8/18/2019 10. Cinética enzimática
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Cinética de las
reacciones enzimáticas Estudio de velocidad de
reacción enzimática ymodo en que cambia enrespuesta a cambiosexperimentales.
Concentración del sustrato([S]), factor clave encinética enzimática.
[S] cambia durante lareacción convirtiéndose enproducto (P)
Nelson & Cox, 2009
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Cinética de Michaelis -
Menten Estudio de cinética de
reacciones catalizadas porenzimas.
Propusieron que E se combinade forma reversible con Sformando un complejo ES(paso rápido).
Después el complejo ES sedescompone dejando E y P(paso lento).
Parámetros importantes parael estudio de la cinética deMM: [S], V max, Km, V 0
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Cinética de Michaelis -
Menten Efecto de [S] sobreV o de lareacción enzimática.
V o : cantidad de productoformado en la unidad de
tiempo a [S] determinada.Permite medir en unmomento determinado [S]o [P] formado.
V max: cantidad máxima deproducto formado a unaconcentracióndeterminada de enzima.
Nelson & Cox, 2009
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Cinética de Michaelis -
Menten Enzima existe en forma libre (E) o asociada (ES).
Enzima saturada, aumento en [S] no causa efectoen velocidad de reacción.
Velocidad global de reacción proporcional a [ES]
S S S + E E E E E E E E = ES ES ES = P P P + E E E E E E EE E E E E E E E E E E E E
S S S S S + E E = ES ES = P P E E + S S S S S = ES ES ….
S S S S S S
A baja [S] velocidad de reacción proporcional a [S]
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Cinética de Michaelis -
MentenMeseta observada(V max), efecto de
saturación de E.
Cinética de saturación.
Nelson & Cox, 2009
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Cinética de Michaelis -
MentenA bajas [S], aumento de [S]promueve aumento ≈lineal en V o.
Superado el punto mediode la cinética, aumentosde [S], provocan aumentosmenores de V o respecto aincremento de [S]. Luegose alcanza un punto endonde no se observancambios significativos enV o a pesar del incrementode [S]
K m: constante de Michaelis[S] necesaria para que V 0corresponda a ½ de V
max
.Nelson & Cox, 2009
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Cinética de Michaelis -
Menten
Interpretación de KmKm función compleja que refleja diversas constantes de velocidadimplicadas en reacción. En pocos casos refleja grado de afinidad de
enzima por sustrato. Nelson & Cox, 2009
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Constante de especificidad (Km/Kcat)
Valores de km y Kcat reflejan condiciones celulares de trabajo deenzimas.Km tiende a ser similar a la concentración celular normal del sustratoque modifica.Relación Km/kcat (constante de especificidad), es la constante develocidad para la conversión E + S en E + P.Constante de especificidad de 108 o 109, perfección catalítica.
Nelson & Cox, 2009
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Gráfica de dobles
recíprocos: Lineweaver - Burk Evalúa valores de V 0 a
diferentes [S], bajocondiciones
constantes (T, presión).
Partiendo de losvalores de V 0establecidos, permitecalcular losparámetros cinéticosKm y V max.
Nelson & Cox, 2009
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Gráfica de dobles
recíprocos: Lineweaver - Burk Transformación
algebraica deecuación MM.
Utiliza los inversos delos datos cinéticos.
Ecuación de la recta.
1 = Km 1 + 1
Vo Vmax [S] Vmax
y = m x + b
Nelson & Cox, 2009
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TransformaciónLineweaber – Burk Calcular Km y Vmax para la siguiente serie de
datos cinéticos.
S (M) Vo (mM/s)0.0012 3.10.0034 6.80.0071 10.30.0093 13.4
0.0128 15.30.0199 20.3
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Transformación
Lineweaber – Burk S (M)
Vo(mM/s)
0.0012 3.1
0.0034 6.8
0.0071 10.3
0.0093 13.4
0.0128 15.30.0199 20.3
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Transformación
Lineweaber – Burk S (M) S (mM)
Vo(mM/s)
0.0012 1.2 3.1
0.0034 3.4 6.8
0.0071 7.1 10.3
0.0093 9.3 13.4
0.0128 12.8 15.30.0199 19.9 20.3
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Transformación
Lineweaber – Burk S (M) S (mM)
Vo(mM/s) 1/S mM = X
1/Vo mM/s= Y
0.0012 1.2 3.1 0.83333333 0.32258065
0.0034 3.4 6.8 0.29411765 0.147058820.0071 7.1 10.3 0.14084507 0.09708738
0.0093 9.3 13.4 0.10752688 0.07462687
0.0128 12.8 15.3 0.078125 0.06535948
0.0199 19.9 20.3 0.05025126 0.04926108
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Transformación
Lineweaber – Burk y = 0.342x + 0.0402R² = 0.9962
0
0.050.1
0.15
0.2
0.250.3
0.35
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
1
/ V o m M / s
1/S mM
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Reacciones con dos omás sustratos
Nelson & Cox, 2009
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Inhibición enzimática
Inhibidor: agente molecular que interfiere lacatálisis.
Importancia en el campo farmacológico yconocimiento de mecanismos enzimáticos deacción.
Inhibición reversible e irreversible.
Moduladores moleculares:
Inhibidores Potenciadores
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Inhibición reversible
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Inhibición competitiva
Inhibidor: análogo químico del sustrato, fijación de I y S mutuamenteexcluyentes.Efecto de I disminuye por incrementos en [S].Altera únicamente Km (Km en presencia de I llamada “Km aparente”), el
valor de Vmax no se altera por presencia del inhibidor. Nelson & Cox, 2009
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24/42In
h i b i c i ó n c o m
p e t i t i v a
Representación
de gráfica dedobles recíprocosde efecto deinhibidorcompetitivo.
Se altera el valorde la pendiente,pero el interceptosigue igual.
¿Efecto enparámetroscinéticos?
Nelson & Cox, 2009
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Inhibición competitiva
Vo = Vmax [S]αKm + [S]
α = 1 + [I]
KIKI =
[E] [I]
[EI]αKm = valor de la Km en presencia de inhibidor (Kmaparente), refleja la forma en que inhibidor (a través de suconstante o Ki) afecta la Km normal de la reacción.
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Inhibición acompetitiva
S e I se une a E en sitios diferentes, I se une a complejo ES, no a E libre.Efecto de I: disminuir valores de Km y Vmax de la reacción.
Incrementos en [S] no disminuyen efecto de inhibidor. Nelson & Cox, 2009
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27/42In
h i b i c i ó n a c o
m p e t i t i v a
Representación de
gráfica de doblesrecíprocos de efectode inhibidoracompetitivo.
El valor de lapendiente no sealtera pero el delintercepto sí, ¿efectoen parámetroscinéticos?
¿Por qué disminuyetanto Km comoVmax si no alterapendiente?
Nelson & Cox, 2009
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Inhibición acompetitiva
Vo = Vmax [S]
Km + α’[S]
α' = 1 + [I]
K’IK’I=
[ES] [I]
[ESI]
α'Km = valor de la Km en presencia de inhibidor (Kmaparente), refleja la forma en que inhibidor (a través de suconstante o Ki) afecta la Km normal de la reacción.
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Inhibición mixta
I se une a E en sitio diferente al sitio de unión de S, pero I se puede unir a Elibre o complejo ES.
Altera tanto Km como Vmax. Nelson & Cox, 2009
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I n h i b i c i ó n m i x t a
Cinética deMichaelis – Menten
Vo = Vmax [S]
αKm + α’[S]No competitiva
clásica
α = α’
No se afectaKm solo Vmax
Nelson & Cox, 2009
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Efectos de inhibidoresreversibles sobre constantescinéticas
Nelson & Cox, 2009
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Determinando el tipo de
inhibiciónSuccinato(sustrato)
mM
Malonato (inhibidor) mM
Concentración de inhibidor
0 0.5 1.0
[S] Vo mM/s Vo mM/s Vo mM/s
0.05 0.33 0.20 0.14
0.10 0.50 0.33 0.25
0.20 0.67 0.50 0.400.40 0.80 0.67 0.57
0.50 0.83 0.71 0.63
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Determinando el tipo de
inhibiciónSuccinato(sustrato)
mM
Malonato (inhibidor) mM
Concentración de inhibidor
0 0.5 1.0
1 / [S] 1/Vo mM/s 1/Vo mM/s 1/Vo mM/s20 3.030 5.000 7.14210 2.000 3.030 4.0005 1.492 2.000 2.500
2.5 1.250 1.492 1.7542 1.204 1.408 1.587
Colocar todos los datos en la misma dimensional.Obtener los inversos de [S] y Vo (en presencia y ausencia
de inhibidor).
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Determinando el tipo deinhibición
y = 0.1016x + 0.9928R² = 0.9999
y = 0.2002x + 1.0043R² = 0.9999
y = 0.308x + 0.9639R² = 0.9999
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 5 10 15 20 25
1 / V o ( m M )
1/[S]
1/Vo no I
1/Vo I 0.5
1/Vo I 1
Notar que aunque el valor del intercepto no “exactamente igual”, enla gráfica se puede observar que la variación es tan pequeña que seconsidera despreciable. Esto se refleja en valores de V max tan cercanos
que se consideran iguales.
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Determinando el tipo de
inhibición En ausencia de inhibidor
Vmax 1.008 Km 0.101
Inhibidor 0.5 mM
Vmax 0.996 Km 0.199
Inhibidor 1 mM
Vmax 1.038 Km 0.319
¿Tipo de inhibición?
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Inhibición irreversible
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Inhibición irreversible
I se combinan o destruyen una porción de laenzima indispensable para su función.
Pueden formar asociaciones no covalentes muyestables o covalentes.
Permiten identificar aminoácidos con funcionescatalíticas clave en sitio de unión.
Inactivadores suicidas o basados enmecanismo.
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P e n i c i l i n a
Nelson & Cox, 2009
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P e n i c i l i n a
Nelson & Cox, 2009
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8/18/2019 10. Cinética enzimática
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Inhibidores de proteasa
del VIH
Nelson & Cox, 2009
8/18/2019 10. Cinética enzimática
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Efecto del pH