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BIOSENSORE : definizione
ANALITA TARGET T
RA
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UTTO
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ELEM
EN
TO
BIO
LO
GIC
OSEGNALE MISURABILE
Membrana selettiva
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•1. Relevance of output signal to measurement environment•2. Selectivity and repeatability•3. Sensitivity and resolution•4. Dynamic range•5. Speed of response•6. Insensitive to temperature (or temperature compensation) •7. Insensitive to electrical and other environmental interference •8. Amenable to testing and calibration•9. Reliability and Self-Checking Capability•10. Physical robustness•11. Service requirements and price•12. Life time and Reusability
Requisiti di un biosensore
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• “A biosensor is a self-contained integrated device which is capable of providing specific quantitative or semi-quantitative analytical information using a biological recognition element which is in direct spatial contact with a transducer element.
• A biosensor should be clearly distinguished from a bioanalytical system, which requires additional processing steps, such as reagent addition.
• Furthermore, a biosensor should be distinguished from a bioprobe which is either disposable after one measurement, i.e. single use, or unable to continuously monitor the analyte concentration”.
According to a recently proposed (1999) IUPAC definition:
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Elemento biologico di riconoscimento molecolare
• Enzimi (biosensore catalitico)
-transformazione dell’analita in un prodotto misurabile -inibizione dell’ enzima da parte dell’ analita
-modifiche dell’enzima indotte dall’analita
• Antigene-anticorpo
-legame ad alta affinità con un tracciante che produce il segnale o direttamente reazione Ab-Ag senza tracciante
• DNA: -reazioni di ibridazione ad alta affinità
• Sensori Biomimetici - molecole ad alta affinità (singole catene di anticorpi,..) - polimeri imprintati •Biosensori cellulari
-inibizione della vitalità cellulare(respirazione,.. -proteine di transporto di membrana -neurorecettori (producono il signale attraverso i canali ionici -cellule (batteri, lieviti,..) geneticamente modificati per esprimere l’elemento di riconoscimento molecolare (recettore, proteina di legame,..)e un gene reporter per la trasduzione in un segnale misurabile (luc, lux, GFP,..)
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ii Il segnale che viene prodotto dalla interazione dell’ analita con l’ elemento biologico può essere:
Potenziometrico modifiche nella distribuzione delle cariche che produce un potenziale
elettrico Amperometrico movimento di elettroni in una reazione redox Calorimetrico produzione o assorbimento di calore dal processo chimico Ottico assorbimento, emissione, rifrazione, “scattering” ..della luce nella reazione Piezoelettrico variazioni di massa dovuti al legame dell’analita Foto-acustico,..……
BIOSENSORE : Trasduzione
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Principio dei biosensori
AnalyteAnalyte
Electricsignal
Enzyme
Antibody
Micro-Organism
Cell
Enzyme
Antibody
Micro-Organism
Cell
Electro-activesubstancepH Changes
Heat
Light
Mass changes
Electro-activesubstancepH Changes
Heat
Light
Mass changes
ElectrodepH electrodeSemiconductor
Thermistor
Photon counter
Piezoelectric Dv
ElectrodepH electrodeSemiconductor
Thermistor
Photon counter
Piezoelectric Dv
RECOGNITION LAYER TRANSDUCER
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Per Riassumere:
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Cenni storici del Biosensori
Concetto e principio -- Leland Clark (1956) Sensore per l’ urea -- Guibault & Montalvo (1969) Glucosio - Yellow Springs Instr. Co. (1973) Termistore enzimatico – Mosbach (1974) Electrodo a microorganismi – Divis (1975) Sensore per l’ Ossigeno a fibra-ottica – Lubbers &
Opitz (1975) Immnosensore – Liedberg et al. (1982) Elettrodo enzimatico – MediSense Inc. (1987) BIAcore – Pharmacia, Sweden (1990) Nanosensore – Vo-Dinh (2000)
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Potenziali campi di applicazione
farmaci, residui,tossine,.. negli alimenti microinquinanti nell’acqua e nell’aria monitorare un processo biologico virus, bacteria,.. ions composti organici analiti di interesse chimico-clinico e diagnostico……………
Sistemi complementari ai sistemi analitici tradizionali con l’obiettivo principale di
ottenere una risposta rapida o in tempo reale
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Biosensori Elettrochimici
Potenziometrici : Viene misurato il potenziale di una cella a valore di corrente zero.
Amperometrici : Si misura l’Intensità di corrente dovuto ad un processo Ox-red.
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Elettrodo di riferimento
Elettrodo indicatore
Risultato:Differenza di
potenzialeProcessore di segnale
Biosensori potenziometrici
I corrente = 0
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Ecell = Eind – Eref + Elj semplificata: Ecell = K + Eind
ISE(elettrodo indicatore)
Elettrodo di riferimento (esterno)
Membrana[ai]campione
Elettrodi ionoselettivi ISEElettrodi ionoselettivi ISE
Equazione di Nernst
Ecell = K + 2.3 RT log [ai]campione
zF
log [ai]campione
Ecell
Curva Standard
Dove:
E = Potenziale elettrochimico K = costanteR = Costante dei gas (8.314 joules/(mole)(°K))T = Temp. assolutaZ = Numero di elettroni trasferitiF = Costante di Faraday (96,487 coulombs/mole di elettroni)ai = Attività della specie ionica (ai = Cifi; dove C è la
concentrazione dello ione ed f ilcoefficiente di attività .
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Elettrodo per il Sodio Elettrodo per il Sodio
Esempi di elettrodi ionoselettivi
Elettrodo a vetroElettrodo a vetro
Variazione di carica dovuta al legame di H+ alla membrana
Risultato: variazione di potenziale
ISFET
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ElettrodoElettrodo per il Potassio per il Potassio
Valinomicina
ElettrodoElettrodo per la CO per la CO22
Esempi di elettrodi ionoselettivi
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(a) Membrana semi-permeabile (b) Biocatalizzatore (c) Membrana di vetro (d) Probe per il pH (e) Potenziale elettrico generato(f) Elettrodo interno Ag/AgCl (g) HCl diluto(h) elettrodo esterno di riferimento
Esempio di biosensore potenziometrico
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Vantaggi
•Disponibilità di un elevato numero di enzimi utilizzabili.
•Elevata tecnologia disponibile e conoscenze scientifiche
•Facile installazione, misure semplici e dirette .
•Diverse configurazioni ( Statica, a flusso , micro ).
•Facile automazione e applicabilità
•Bassi costi.
Svantaggi
•Scarsa selettività di alcuni biosensori.
• Il numero di biosensori disponibili è molto limitato
Vantaggi e svantaggi dei Biosensori Potenziometrici
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Immagini di alcuni Biosensori ISFET
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Elettrodo di riferimento
Elettrodo dilavoro
Risultato:Intensità di
correnteProcessore di segnale
Biosensori amperometrici
Differenza di potenzialeprefissata
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Il biosensore amperometrico più semplice utilizza l’elettrodo ad ossigeno di Clark.Questo è costituito da un catodo di Pt al quale l’O2 si riduce ed un elettrodo di riferimento Ag/AgCl.
.
Ag anodo 4Ag0 + 4Cl- 4AgCl + 4e- Pt catodo O2 + 4H+ + 4e- 2H2O
Collegamentoamplificatore
Filo di Agricoperto con AgCl
Tubo di plexiglas
Membrana permeabile
all’O2
introduzione elettrolita
KCl 100 mM
Elettrodo ad Ossigeno
Filo di Pt forgiato per essere sigillato da vetro ed avere una
superficie piatta esposta all’analita
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Biosensori amperometrici di I generazione
I biosensori amperometrici di prima generazione monitorano il consumo di O2 o la produzione di H2O2 associate
all’ossidazione di un substrato da parte di un enzima ossidasi
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La glucosio ossidasi catalizza la seguente reazione in due passaggi:
Glucosio + FAD + H2O ———> Acido gluconico +FADH2
FADH2 + O2 ———> H2O2 + FAD
La glucosio ossidasi è immobilizzata sulla membrana a gas del sensore così l’elettrodo di lavoro compete con l’enzima per l’ossigeno molecolare.
Biosensore amperometrico per il glucosio
glucosio
Membrana permeabile
all’O2
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Tipica risposta del biosensore amperometrico per il glucosio
Biosensore amperometrico per il glucosio
•Misure batch
•Misure in flusso
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Biosensore amperometrico per il glucosio
•Misure FIA (flow injectio analysis)
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La stessa reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi può essere utilizzata per monitorare la produzione di acqua ossigenata.
L’acqua ossigenata è ossidata all’elettrodo di lavoro secondo la seguente reazione:
H2O2 —-——> O2 + 2H+ + 2e-
L’enzima è immobilizzato e tenuto il più vicino possibile l’elettrodo di lavoro. E’ prodotta una corrente proporzionale alla concentrazione del metabolita da analizzare.
Un fattore limitante di questi sensori è che sono dipendenti dalla solubilità dell’ossigeno nelle soluzioni campione.
Biosensore ad acqua ossigenata
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Si utilizzano dei “mediatori” che trasferiscono gli elettroni direttamente all’elettrodo bypassando la riduzione dell’ossigeno.
I ferroceni rappresentano il gruppo di mediatori più utilizzati .
Biosensori amperometrici di II generazione
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Biosensori amperometrici di III generazione
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Biosensori Amperometrici
Vantaggi
1. Non influenzato dal drift dell’elettrodo di riferimento2. Risposta lineare.3. Sono più sensibili di quelli potenziometrici. E’ possibile
miniaturizzarli
Svantaggi
1. La corrente amperometrica consuma l’analita e la sua diffusione influenza la risposta.
2. La misura amperometrica viene eseguita ad un particolare potenziale di lavoro dove altre sostanze potrebbero reagire ed interferire.
3. Il materiale all’anodo si consuma riducendone il tempo di utilizzo, paricolarmente quando si utilizzano film sottili di Ag/AgCl .
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Sensori Piezoelectrici
Microbilancia al quarzo QCM
Sistemipiezoelettrici
Cristallo di quarzoElettrodo
d’oro
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Microbilancia al quarzo (QCM)
Modifiche nell’intorno del cristallo
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Biosensori Piezoelettrici
Transduttore: microbilancia cristallo di quarzo (QCM)
probe immobilizato
DNA Target, Ag, Ligando
Si forma un duplex, Ab-Ab, Complesso lig-recettore
la massa aumenta
Cala la frequenza di risonanza del cristallo
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Biosensori Piezoelettrici
La relazione tra massa m e frequenza f è data dalla nota relazione di Sauderbery:
Dove: -Δf è la variazione di frequenza (Hz),-Δm è la variazione di massa della sostanza assorbita sulla superficie (g),- K è una costante che dipente dalla densità e dal tipo di cristallo (taglio), -A è la superficie (cm2)
Cris
tallo
di
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arz
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Oscilla
tore
10
MH
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Analita in soluzione
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Biosensori Piezoelettrici
Sensitive coating
elemento biospecificoimmobilizzato
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Tecniche di immobilizzazione
1)Immobilizzazione fisica: operativamente semplice ma meno stabile.
2)Immobilizzazione chimica: operativamente complessa, ma più stabile
Schema di reticolazione conBSA-gluteraldeide
Schema di reticolazione su membranecarbossiliche con carbodimmide
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L’obiettivo è quello di minimizzare interazioni aspecifiche e quindi sviluppare un immunosensore specifico e con il vantaggio di non utilizzare un tracciante e quindi misurare direttamente l’interazione Ab—Ag
Si può utilizzare per esempio: sistema avidin-biotin, thiol-dextran, DSP, silanizzazione e assorbimento.
Immobilizzazione di una proteina
Sviluppo di immunosensori
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Segnale Elettrico
Pro
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Risultato
Riconoscimentomolecolare
Biosensore Ottico
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Biosensore Ottico: Principi
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Biosensore Ottico: Principi
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Biosensore a fluorescenza
Es: biosensori basati su esteri del boro
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Biosensore a fluorescenza
DETERMINAZIONE DI SUBSTRATI ENZIMATICI
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Fiber-optic cholesterol sensor
Biosensore a fluorescenza
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T. Vo-Dingh et al., Sensors and Actuators B, 2001
Sistema ottico per misure intracellulari
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Sistemi ottici basati di misura della luce evanescente
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Biosensori a risonanza di superficie plasmonica (SPR)
SPR, fenomeno che avviene quando la luce è riflessa da un film sottile di un metallo
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Biosensori a SPR: applicazioni
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Biosensore ottico ad onda evanescente
n1 > n2
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Substrati analizzabili con biosensori enzimatici
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Biosensore calorimetrico
Q = –(n/M)/ΔΗ ΔΤ= Q/Cs=-n ΔΗ/M Cs
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Biosensori a DNA
DNA a doppia elica
Elettrodo di
lavoro
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Tipi di biosensori a DNA
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Biosensori piezolelettrici a DNA
Quartz crystal microbalance (QCM) transducers
Immobilized DNA probe
Target DNA
Form duplex---mass increase
Decrease in crystal’s resonance frequency
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Immobilizzazione del DNA sulla QCM
Immobilizzazione di DNA-biotina su di un elettrodo QCM modificato
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ii
Il DNA probe viene immobilizzato su di un cristallo piezoelettrico di quarzo ricoperto di streptavidina.
La Streptavidina viene legata covalentemente ad uno strato monolayer costituito da 11-mercaptoundecanolo.
Probe: oligonucleotide biotinilato
Oro
11-mercaptoundecanolo
Destrano
Biotina(Strept)avidina Strept)avidina
Tempo (sec)
Fre
qu
en
za H
z(Strept)avidina
Probe biotinilato
Attivazione con EDC e NHS
Immobilizzazione del DNA sulla QCM
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Biosensori Cellulari: potenziale d’azione
Potenziale di azione dato dalla differenzadi concentrazione di specie ionicheattraverso la membrana cellulare
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• Misura del potenziale d’azione con un elettrodo
Biosensori Cellulari: potenziale d’azione
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ii Valutazione della sensibilità ad un agente tossico
Biosensori Cellulari: potenziale d’azione
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Nutriente O2
CO2 + H2O
Schema della respirazione di cellule di lievito (Saccharomyces cerevisiae) immobilizzate, microfotografia al SEM.
Esempio di confronto tra curve respirometriche
IAR%= 1-ppm(O2)E ppm(O2 )B 100
Respirazione di cellule
Biosensori Cellulari: biosensori respirometrici
• Misura della variazione di O2 con elettrodo di Clark
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ii ASSEMBLAGGIO BIOSENSORE(Dettaglio dell’ancoraggio delle cellule sull’estremità del sensore)
Prelievo delle cellule Prelievo delle cellule immobilizzate in terreno immobilizzate in terreno
agarizzatoagarizzato
(A) cappuccio elettrodo di Clark; (B) soluzione interna; (C) membrana gas permeabile; (D) dischetto con le cellule immobilizzate; (E) e (F) supporti per l’ancoraggio del dischetto.
(A) cappuccio elettrodo di Clark; (B) soluzione interna; (C) membrana gas permeabile; (D) dischetto con le cellule immobilizzate; (E) e (F) supporti per l’ancoraggio del dischetto.
Biosensori Cellulari: biosensori respirometrici
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Biosensori Cellulari
Receptor
Responsive
Element LUCIFERASE
AnalyteAnalyte
SignalSignal
BiosensorBiosensor
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The Bacterial Process:
Catalyst: LuciferaseDecanalFMNH2 O2
Decanoic acid, FMN*, H2O, Light, (490 nm)
The Firefly Process:
Catalyst: LuciferaseLuciferin, ATP, O2 Oxyluciferin, AMP+Ppi, Light (560 nm)
Biosensori bioluminescenti
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Bioluminescence decreases in direct proportion to the level of toxicity present
Light output is directly proportional to the metabolic activity of a cell
Increasing Toxicity
LightOutput
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Active Cell
Damaged Cellfollowing exposure
to toxin
Normal levels of FMNH2due to Active RespirationBioluminescent cells
Reduced levels of FMNH2due to Reduced Respiration Bioluminescence Reduced or stopped
Biosensori bioluminescenti
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Multidisciplinarietà dei biosensori
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Biosensori futuri
Elemeno di bioriconoscimento
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Ultime pubblicazioni sui biosensori
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World Biosensor Market
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