UJI EFEKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK n-HEKSAN PEGAGAN (Centella asiatica (L) Urban) terhadap BAKTERI Escherichia coli dengan METODE BIOAUTOGRAFI

Muhammad Irfan Al Ghifary1, Prasetyorini2, Ike Yulia Wiendarlina3

1,2&3Program Studi Farmasi, FMIPA, Universitas Pakuan, Bogor.

ABSTRAK

Escherichia coli merupakan salahsatu bakteri penyebab infeksi, banyak ditemukan dalam usus besar sebagai flora normal yang dapat menyebabkan infeksi saluran kencing, gastroenteritris dan meningitis pada bayi. Tumbuhan obat tradisional dapat dijadikan alternatif pencarian zat antibakteri, karena pada umumnya memiliki senyawa aktif yang berperan dalam bidang kesehatan. Pegagan adalah salahsatu tumbuhan yang digunakan oleh masyarakat Indonesia sebagai obat tradisional, berkhasiat sebagai peluruh kencing, antibakteri, hipotensif, insektisida. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa aktif dalam ekstrak n-heksan pegagan yang memiliki aktivitas terhadap bakteri Escherichia coli. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi menggunakan pelarut n-heksan. Identifikasi senyawa aktif dalam ekstrak n-heksan pegagan dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis, menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetat (4:1). Hasil KLT dilakukan uji bioautografi dengan cara penempelan bercak kromatogram di atas media selama 30 menit, parameter yang digunakan yaitu zona jernih pada lokasi bercak kromatogram yang ditempelkan di atas media. Hasil penelitian diketahui terdapat 3 golongan senyawa yang terdeteksi dari kromatogram menggunakan pereaksi bercak yaitu steroid dengan Rf 0,51; terpenoid dengan Rf 0,55 dan 0,75; dan alkaloid dengan Rf 0,94. Hasil uji bioautografi tidak menghasilkan zona zernih, ini berarti ekstrak n-heksan pegagan tidak mampu menghambat bakteri Escherichia coli dengan metode bioautografi

Kata kunci : Pegagan (Centella asiatica (L) Urban), Escherichia coli, Bioautografi, Kromatografi Lapis Tipis.

SUMMARY

Escherichia coli is one of the main bacteria causing the infection, there were found in the normal flora of the colon which can cause urinary tract infections and meningitis in infants gastroenteritris. Traditional medicine plants can be used as an alternative antibacterial agent, because in general has active compounds that play a role in health. Centella asiatica is one of the main plants used by the people of Indonesia as a traditional medicine, efficacious as a laxative urine, antibacterial, hypotensive, insecticide. This research aims to determine the class of active compounds in the extract of Centella asiatica n-hexane which has activity against Escherichia coli. Extraction was done by maceration method using n-hexane solvent. Identification of the active compounds in the extract of Centella asiatica n-hexane was done by Thin Layer Chromatography, using a mobile phase n-hexane: ethyl acetate (4: 1). Bioautography Thin Layer Chromatography test results by attachment of the chromatogram spots on the media for 30 minutes, the parameters used were clear zone on the chromatogram were pasted spotting location on the media. The results showed that there are three classes of compounds detected from the chromatogram using the reagent spots with Rf 0.51 steroids; terpenoids with Rf 0.55 and 0.75; and alkaloids with Rf 0.94. Bioautografi test results didn’t produce zone clear, this means n-hexane extract of Centella asiatica were not able to inhibit the bacteria Escherichia coli by the bioautography method.

Keywords : Gotu kola (Centella asiatica (L) Urban), Escherichia coli, Bioautography, Thin Layer Chromatography.

PENDAHULUANInfeksi merupakan salahsatu

penyebab penyakit yang sering terjadi di daerah beriklim tropis seperti Indonesia. Infeksi dapat disebabkan oleh berbagai mikroorganisme seperti bakteri, virus, riketsia, jamur dan protozoa (Gibson, 1996) dan menyebabkan munculnya tanda-tanda dan gejala penyakit.

Escherichia coli merupakan salahsatu bakteri penyebab infeksi, yaitu suatu kuman oportunis yang banyak ditemukan dalam usus besar sebagai flora normal yang dapat menyebabkan infeksi saluran kencing yang merupakan infeksi terbanyak (80%) gastroenteritris dan meningitis pada bayi, peritonitis, infeksi lokal, kolesistitis, syok bakterimia karena masuknya organisme ke dalam darah dari uretra, kateterisasi atau sistokopi, atau dari daerah septis pada abdomen atau pelvis (Gibson, 1996).

Antibiotik digunakan untuk mengendalikan populasi dan mengatasi timbulnya infeksi atau gangguan kesehatan yang disebabkan bakteri, dalam upaya meningkatkan kesejahteraan dan kesehatan masyarakat.

Penelitian-penelitian pencarian bahan antibakteri telah banyak dilakukan terutama dari berbagai jenis tumbuh-tumbuhan. Para ilmuwan terus berusaha untuk mencari sumber antibakteri baru, terutama yang mudah tumbuh di Indonesia. Tumbuhan yang digunakan untuk obat tradisional dapat dijadikan alternatif pencarian zat anti bakteri, karena pada umumnya memiliki senyawa aktif yang berperan dalam bidang kesehatan (Salni dkk, 2011)

Tumbuhan pegagan (Centella asiatica (L) Urban) merupakan salahsatu tumbuhan yang digunakan oleh masyarakat Indonesia sebagai obat tradisional. Pegagan berkhasiat sebagai peluruh kencing (diuretika), penurun panas (antipiretik), menghentikan pendarahan (haemostatika), antibakteri, antispasma, antiinflamasi, hipotensif, insektisida, antialergi dan stimulant, ekstrak herba mempunyai daya antibakteri terhadap Staphylococcus dan Escherichia coli (Sudarsono dkk, 2002).

Metode bioautografi merupakan metode yang spesifik untuk menentukan hasil

fraksi ataupun isolat senyawa murni yang telah banyak digunakan sebagai salahsatu metode pengujian aktivitas antibakteri. Metode ini memiliki keuntungan antara lain mudah pengerjaannya, ekonomis, tidak rumit, serta dapat mendeteksi senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri (Stahl,1985).

Amicelia (2010) melakukan uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun pegagan (Centella asiatica (L) Urban) terhadap Staphylococcos aureus dan Escherichia coli dengan metode bioautografi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bercak flavonoid dan tanin dengan Rf 0,02 dan bercak saponin dengan Rf 0,57 aktif menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcos aureus, selain itu tidak ada bercak kromatogram yang aktif menghambat pertumbuhan Escherichia coli.

Untuk melakukan penelitian lebih lanjut tentang pemanfaatan pegagan sabagai antibakteri terhadap Escherichia coli yang tidak ditemukan dalam ekstrak etanol daun pegagan, maka dilakukan penelitian yang dimaksudkan untuk mengetahui aktivitas ekstrak n-heksan pegagan (Centella asiatica (L) Urban Herba) yang diduga memiliki aktivitas terhadap bakteri Escherichia coli.

BAHAN DAN METODEBahan-bahan yang digunakan antara

lain : pegagan (Centella asiatica (L) Urban), n-heksan, biakan uji Escherichia coli, NaCl fisiologis, Absence Broth, nutrient agar (NA), air suling steril, alkohal 96%, minyak imersi karbol-gentian-violet, larutan lugol, larutan fuchsin, eluen n-heksan dan etil asetat, pereaksi Liebermann-Bourchard, pereaksi vanilin-asam sulfat, pereaksi Dragendorff.

.Alat-alat yang digunakan antara lain :

rotavapor, moisture balance, grinder, ayakan mesh no.30, kurs porselen, tanur, neraca analitik, spatel, KLT (aluminium sheets silica gel GF254), pipa kapiler, gunting, penggaris, pensil, beaker glass, kertas saring, alumunium foil, lampu UV, laminar air flow (LAF), lampu spirtus, korek api, cawan Petri, pinset, ose, gelas ukur, kompor listrik, hot plate, Inkubator, labu erlenmeyer, kapas, batang

pengaduk, mikropipet, tabung reaksi, pipet tetes, rak tabung, autoklaf, oven, objek glass, cover glass, mikroskop.

METODE PENELITIANPengumpulan Bahan Simplisia

Herba pegagan yang digunakan diperoleh dari Balai Penelitian Obat dan Aromatik Bogor (BALITRO) dan determinasi herba pegagan dilakukan di Pusat Penelitian LIPI Cibinong.Pembuatan Serbuk Simplisia

Herba pegagan kering yang berasal dari Balai Penelitian Obat dan Aromatik Bogor (BALITRO) sebanyak 600 gram, digiling dengan grinder stainless steel sehingga menjadi serbuk dan kemudian diayak dengan menggunakan mesh No. 30, sehingga diperoleh serbuk simplisia. Serbuk disimpan dalam wadah bersih, kering dan tertutup rapat.Karakterisasi Serbuk Simplisia Pegagan Uji Organoleptik dan Mikroskopik

Uji mikroskopik dilakukan pada serbuk pegagan dengan menggunakan mikroskop untuk melihat fragmen pengenal dan uji organoleptik dengan menggunakan panca indera untuk mendeskripsikan bentuk, warna, bau dan rasa serbuk (Depkes RI, 2000). Penetapan Kadar Air Serbuk Simplisia

Penetapan kadar air dilakukan dengan menggunakan alat moisture balance dimana dimasukan sampel sebanyak 1 gram di dalam punch yang kemudian ditera. Ratakan sampel hingga menutupi permukaan punch lalu ditutup, dengan suhu 105ºC. Ditunggu hingga terdengar bunyi bip yang menandakan bahwa proses telah selesai. Pada layar akan tertera persen kadar air dari sampel yang diujikan secara otomatis. Kadar air simplisia pegagan tidak lebih dari 7,6% (DepKes RI, 1995).Penetapan Kadar Abu Serbuk Simplisia

Sebanyak 2,5 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam kurs platina atau krus silica, ratakan kemudian dipijarkan pada suhu 6000 C dalam tanur hingga arang habis, didinginkan, kemudian ditimbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, maka ditambah dengan air panas, disaring melalui kertas saring bebas abu. Dipijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan ke dalam krus, diuapkan, dipijarkan hingga bobot tetap, ditimbang.

Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. Kadar abu simplisia pegagan tidak lebih dari 16,6% (DepKes RI, 1995).

Kadar abu = Bobot akhir serbuk x 100 %Bobot awal serbuk

Ekstraksi Simplisia Herba PegaganPembuatan ekstrak herba pegagan

dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut n-heksan sebanyak 6 liter dan digunakan 600 gram serbuk herba pegagan. Serbuk dimasukkan ke dalam sebuah bejana, tuangi dengan 75% bagian pelarut n-heksan setara dengan 4,5 liter, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil diaduk setiap 6 jam sekali, disaring, diperas, dicuci ampas dengan pelarut n-heksan 25 % bagian setara dengan 1,5 liter, dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari setelah itu dienaptuangkan. Maserat dikumpulkan dan dilakukan pemekatan dengan alat rotavapor (Depkes RI, 2004).Rendemen Ekstrak Pegagan

Rendemen ekstrak n-heksan pegagan dihitung dengan membandingkan berat awal simplisia dan berat akhir ekstrak yang dihasilkan.Karakterisasi Ekstrak n-heksan Pegagan Uji Organoleptik

Uji organoleptik pada ekstrak n-heksan pegagan menggunakan panca indera untuk mendeskripsikan bentuk, warna, bau dan rasa ekstrak (Depkes RI, 2000). Penetapan Kadar Air Ekstrak

Penetapan kadar air ekstrak dilakukan dengan menggunakan alat moisture balance dimana dimasukan sampel sebanyak 1 gram di dalam punch yang kemudian ditera. Ratakan sampel hingga menutupi permukaan punch lalu ditutup, dengan suhu 105ºC. Ditunggu hingga terdengar bunyi bip yang menandakan bahwa proses telah selesai. Pada layar akan tertera persen kadar air dari sampel yang diujikan secara otomatis.

Penetapan Kadar Abu EkstrakPenetapan kadar abu ekstrak

dilakukan dengan sebanyak 2,5 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam kurs platina atau krus silica, ratakan kemudian dipijarkan pada suhu 6000 C dalam tanur hingga arang habis,

didinginkan, kemudian ditimbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, maka ditambah dengan air panas, disaring melalui kertas saring bebas abu. Dipijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan ke dalam krus, diuapkan, dipijarkan hingga bobot tetap, ditimbang. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.

Kadar abu = Bobot akhir serbuk x 100 %Bobot awal serbuk

Inokulasi Bakteria. Sterilisasi Alat

Alat yang digunakan pada uji efektivitas bakteri dengan cara dicuci kemudian dibungkus kertas polos terlebih dahulu, lalu dimasukkan kedalam oven dengan suhu 150ºC selama 2 jam, setelah itu alat-alat siap digunakan.b. Penyiapan Media

Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah nutrient agar (NA) dan media cair broth. Cara pembuatan media ada pada Lampiran 3. c. Inokulum Bakteri

Konsentrasi larutan bakteri yang akan digunakan untuk pengujian adalah 10-6

bakteri/ml. Inokulasi bakteri dilakukan dengan cara pembuatan stok dan inokulum bakteri, yaitu: Biakan murni untuk pengujian digunakan

biakan berumur satu hari. Biakan disuspensikan hingga homogen dengan media cair broth.

Dibuat pengenceran serial 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya dengan cara menyiapkan beberapa tabung reaksi yang berisi 9 mL larutan NaCl fisiologis. Bakteri yang disuspensikan diambil sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi pertama dan dikocok homogen maka akan diperoleh larutan dengan konsentrasi 10-1.

Larutan pada tabung reaksi pertama diambil sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi kedua yang berisi 9 mL NaCl fisiologis 0,9 % steril dan dikocok homogen, maka akan diperoleh dengan konsentrasi 10-2

dan seterusnya sampai diperoleh larutan dengan konsentrasi 10-6.

Setelah bakteri diencerkan 10-6 kemudian pipet 1 ml dan sebarkan ke permukaan media.

Pembuatan Larutan Pereaksia. Pereaksi Liebermann-Bourchard

Asam asetat anhidrat 5 mL dicampur secara hati-hati dengan 5 mL asam sulfat pekat kemudian campuran ini ditambahkan secara hati-hati ke dalam 50 mL etanol absolut, setiap pencampuran zat dilakukan dengan pendinginan.

b. Pereaksi vanilin-asam sulfatVanillin 1 gram dilarutkan asam sulfat 25 mL.

c. Pereaksi DragendorffBismuth subnitrat (Bi (NO3)3) 0,17 gram dilarutkan dalam aquades 8 mL dan asam asetat glasial 2 mL, kemudian ditambahkan potasium ioda 1,6 gram yang telah dilarutkan dalam aquades 4 mL.

Deteksi Senyawa Ekstrak n-heksan Pegagan

Deteksi senyawa dilakukan dengan cara Kromatografi Lapis Tipis, dilakukan dua kali, yaitu untuk mendeteksi banyaknya bercak senyawa yang terkandung dalam ekstrak n-heksan pegagan dan uji bioautografi. Untuk mendeteksi bercak, larutan ekstrak ditotolkan dengan pipa kapiler pada lempeng KLT (silica gel GF254). Kemudian dimasukkan ke dalam bejana dielusi dengan eluen n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan (1 : 1) sebagai perbandingan awal yang nanti akan diuji kembali sampai mendapatkan perbandingan eluen yang tepat. Setelah cairan elusi mencapai batas rambat, lempeng plat KLT dikeluarkan lalu dikeringkan dan disemprot dengan pereaksi semprot. Bercak yang timbul diamati dan dihitung Rf dari masing-masing bercak. KLT untuk uji bioautografi dilakukan dengan cara yang sama namun lempeng tidak disemprot dengan larutan pereaksi semprot.Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak n-heksan Herba Pegagana. Pengujian Aktivitas Antibakteri

Pengujian aktivitas antibakteri ini menggunakan metode difusi kertas cakram, dimana kertas cakram dicelupkan terlebih dahulu ke dalam ekstrak pegagan dengan konsentrasi 15%, 30%, dan 45% selama 15 menit kemudian dikeringkan selama 5 menit.

Disiapkan media cair nutrient agar dengan suhu 450C, kemudian ditambahkan 0,2

ml suspensi bakteri uji, dicampur dan dihomogenkan. Didiamkan hingga media menjadi padat, lalu diletakkan kertas cakram yang telah dicelupkan ke dalam ekstrak pegagan dengan konsentrasi 15%, 30%, dan 45% di atas media agar dengan menggunakan pinset steril, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dalam inkubator, lalu diamati dan diukur dengan menggunakan penggaris atau jangka sorong Lebar Daerah Hambat (LDH) masing-masing kertas cakram terhadap pertumbuhan bakteri. LDH diukur dari diameter zona bening yang terbentuk. Pengujian ini dilakukan untuk masing-masing konsentrasi ekstrak dengan 3 kali pengulangan. b. Uji Bioautografi

Disiapkan cawan Petri sedang berdiameter 11 cm dan diisi dengan biakan bakteri Escherichia coli sebanyak 0,6 ml yang sudah diencerkan. Plat KLT yang telah kering disterilisasi menggunakan sinar UV selama 30 menit, kemudian dimasukan ke dalam cawan Petri yang telah berisi biakan bakteri Escherichia coli selama 30 menit supaya senyawa aktif berdifusi kedalam medium agar. Lempeng kromatogram diangkat dengan hati-hati ditempatkan dalam cawan Petri steril, diinkubasi selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan melihat bercak atau daerah bening yang tidak ditumbuhi oleh bakteri, nilai Rf dari tiap zona yang terbentuk di ukur dan membandingkan dengan plat kromatogram pada deteksi senyawa ekstrak. Pengujian ini dilakukan sebanyak 3 kali ulangan.c. Pengecatan Gram

Pegecatan Gram dilakukan sebagai uji kemurnian isolat bakteri Escherichia coli sebagai bakteri dalam pengujian untuk melihat bakteri yang digunakan tidak terkontaminasi oleh bakteri jenis lain.

Disiapkan cawan Petri dari setiap pengujian, diambil sebanyak satu ose bakteri dari dalam cawan Petri uji, kemudian dibuat preparat dengan film yang tipis. Preparat diberi zat warna karbol-gentian-violet selama 3 menit, dibuang cat yang berlebihan dan ditambahkan larutan lugol (tampa dicuci terlebih dahulu) dibiarkan selama 1 menit, dicuci preparat dengan alkohol 96% sampai tidak ada lagi zat warna yang luntur kemudian dicuci dengan air kran, dicat preparat dengan larutan fuchsin selama 1 menit, dicuci dengan

air kran sampai bersih dan dihilangkan sisa air mengunakan kertas saring. Diperiksa preparat menggunakan mikroskop.

HASIL DAN PEMBAHASANDeterminasi

Berdasarkan hasil identifikasi/determinasi tumbuhan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI-Bogor menyatakan bahwa tumbuhan yang dibawa merupakan tumbuhan pegagan (Centella asiatica (L.) Urb.) yang termasuk dalam suku Apiaceae. Serbuk Simplisia Herba Pegagan

Dibuat serbuk simplisia herba pegagan dari 25 kg herba pegagan basah menghasilkan 1,6 kg simplisia kering yang kemudian di grinder dan didapat serbuk simplisia herba pegagan sebanyak 1,2 kg dengan persen rendemen 75%. Karakterisasi Serbuk Herba PegaganPenetapan Kadar Air Serbuk Herba Pegagan

Penetapan kadar air simplisia dilakukan menggunakan alat moisture balance, dari penetapan diperoleh kadar air simplisia pegagan sebesar 6,84% dimana kadar air yang diperoleh telah memenuhi standar yaitu kadar air simplisia pegagan tidak lebih dari 7,6% (DepKes RI, 1995). Penetapan Kadar Abu Serbuk Herba Pegagan

Penetapan kadar abu dilakukan dengan cara pembakaran menggunakan tanur dengan suhu 6000C, dari penetapan ini diperoleh kadar abu simplisia pegagan sebesar 10,23%. Kadar yang diperoleh telah memenuhi standar yaitu kadar abu simplisia pegagan tidak lebih dari 16,6% (DepKes RI, 1995).

Penetapan kadar abu berupa bahan yang dipanaskan pada temperatur dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap, sehingga tinggal unsur mineral dan anorganik, menurut Winarno (1997) terdapat 96% dari komposisi bahan pangan atau tanaman adalah air dan bahan organik, sedangkan sisanya adalah unsur mineral. Unsur mineral dikenal sebagai zat anorganik atau abu, dalam proses pembakaran bahan-bahan organik terbakar tetapi bahan anorganiknya tidak, karena itulah disebut abu. Tujuan penetapan kadar abu memberikan

gambaran kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak dan nilai maksimal atau rentang yang diperbolehkan terkait dengan kemurnian dan kontaminasi (Depkes RI, 2000).Uji Organoleptik Serbuk Pegagan

Dilakukan uji organoleptik meliputi bentuk, warna, rasa dan bau yang bertujuan untuk memberikan pengenalan awal secara objektif, serta digunakan untuk menguji simplisia secara fisik selama penyimpanan yang dapat mempengaruhi khasiat bahan. Hasil uji organoleptik serbuk pegagan: bentuk serbuk, warna hijau kelabu, rasa tidak berasa dan bau aromatis.Uji Mikroskopik Serbuk Pegagan

Dilakukan pengamatan serbuk simplisia herba pegagan secara mikroskopik dengan menggunakan mikroskop yang bertujuan untuk mengenal simplisia berdasarkan ciri-ciri anatomi (Stahl, 1985), dari hasil pengamatan didapatkan beberapa fragmen pengenal antara lain yaitu hablur kalsium oksalat, rambut penutup, serabut sklerenkim, epidermis atas dengan mesofil dan pembuluh kayu dengan penebalan spiral dan jala. Ekstraksi

Proses pembuatan ekstrak herba pegagan diperoleh dengan cara ekstraksi dengan metode maserasi, digunakan 600 gram simplisia pegagan dengan 6 liter pelarut dilakukan selama 5 hari dan tiap 6 jam dilakukan pengocokan, kemudian dilakukan penyaringan dan ampas yang diperoleh dicuci menggunakan 25% bagian pelarut, setelah itu hasil dikumpulkan dan dienaptuangkan selama 24 jam. Maserat yang diperoleh kemudian pelarutnya dipisahkan dengan menggunakan alat rotavapor dan selanjutnya dilakukan pemekatan dengan cara diuapkan menggunakan waterbath sampai diperoleh ekstrak kental (Gambar 5). Ekstrak yang diperoleh ditimbang dan dihitung persen rendemen ekstrak pegagan dan hasil persen rendemen di dapat sebesar 2,41655 %.

Gambar 1. Ekstrak Kental Pegagan

Ekstraksi merupakan penyarian zat-zat aktif dari bagian tanaman dengan tujuan untuk menarik komponen kimia yang terdapat dalam simplisia. Digunakan metode maserasi karena metode ekstraksi ini merupakan cara yang paling sederhana dan tidak memerlukan alat khusus. Pelarut yang digunakan adalah n-heksan. Dalam penggunaannya pelarut n-heksan dalam penelitian ini diharapkan kandungan zat aktif dalam simplisia yang tertarik merupakan zat aktif yang bersifat non polar, karena n-heksan merupakan pelarut yang bersifat non polar yang dapat menarik senyawa sedikit semi polar dan senyawa non polar.

Prinsip dari maserasi adalah cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan konsentrasi yang lebih rendah. Peristiwa tersebut berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Endapan yang diperoleh dipisahkan dan filtratnya dipekatkan, digunakan rotavapor untuk memisahkan cairan penyari, prinsip dari rotavapor dengan pemanasan yang dipercepat oleh putaran labu alas bulat, cairan penyari dapat menguap di bawah titik didih pelarutnya disebabkan oleh karena adanya penurunan tekanan dengan bantuan pompa vakum, uap larutan penyari akan menguap naik ke kondensor dan mengalami kondensasi menjadi molekul-molekul cairan pelarut murni yang ditampung dalam alas bulat penampung (Sudjadi, 1986).

Karakterisasi Ekstrak n-heksan Herba PegaganPenetapan Kadar Air Ekstrak n-heksan Herba Pegagan

Penetapan kadar air ekstrak herba pegagan dilakukan menggunakan alat moisture balance, dari penetapan kadar air ini diperoleh kadar air ekstrak sebesar 2,75%.

Penetapan kadar air merupakan pengukuran kandungan air yang berada di dalam bahan, dengan tujuan memberikan batasan minimal atau rentang tentang besarnya kandungan air di dalam bahan dan nilai maksimal atau rentang yang diperbolehkan terkait dengan kemurnian dan kontaminasi (Depkes RI, 2000). Air yang tersisa dalam simplisia pada kadar tertentu dapat merupakan media pertumbuhan kapang dan jasad renik, menurut Ferdiaz et al., (1992) batas kadar air minimal mikroba masih dapat tumbuh adalah berkisar antara 14%-15%.Penetapan Kadar Abu Ekstrak n-heksan Herba Pegagan

Penetapan kadar abu dilakukan dengan cara pembakaran menggunakan tanur dengan suhu 6000C, dari penetapan ini diperoleh kadar abu ekstrak 1,43%. Uji Organoleptik Ekstrak n-heksan Herba Pegagan

Dilakukan uji organoleptik meliputi bentuk, warna, rasa dan bau yang bertujuan untuk memberikan pengenalan awal secara objektif, serta digunakan untuk menguji simplisia secara fisik selama penyimpanan yang dapat mempengaruhi khasiat bahan. Hasil uji organoleptik ekstrak n-heksan: bentuk kental, warna hitam, rasa tidak berasa dan bau aromatis.Deteksi Senyawa Ekstrak Pegagan

Deteksi senyawa ekstrak pegagan dilakukan dengan cara kromatografi lapis tipis. Dalam pemeriksaan kandungan zat di dalam ekstrak dilakukan pencarian perbandingan antar eluen agar pemisahan dapat terjadi secara optimal. Digunakan sebagai perbandingan awal eluen n-heksan dengan etil asetat yaitu (1:1), noda bercak merambat terlalu jauh dan hanya menghasilkan 2 bercak, kemudian dilanjutkan dengan perbandingan (3:1) dari sini didapat hasil dengan 6 bercak tetapi pemisahannya masih terlalu jauh, dicoba perbandingan eluen sampai dengan perbandingan (6:1). Eluen dengan

perbandingan (6:1) diperoleh 6 bercak dengan 5 bercak berkumpul di bawah, dengan melihat bercak yang dihasilkan dari perbandingan (1:1), (3:1), (4:1), (5:1) dan (6:1) didapat hasil yang paling optimal mengalami pemisahan yaitu dengan perbandingan eluen (4:1), perbandingan ini yang digunakan untuk deteksi senyawa dan pengujian golongan senyawa antibakteri. Hasil pemisahan kandungan senyawa dalam ekstrak pegagan didapatkan kromatogram seperti yang disajikan pada Gambar 2 dan Tabel 1.

1 2 3 4 5 6Gambar 2. Hasil pemisahan kandungan golongan senyawa ekstrak pegagan secara kromatografi lapis tipis (Eluen n-heksan dan etil asetat, perbandingan (4:1))

Hasil pemisahan digunakan fase diam aluminium sheets silica gel GF254 dengan ukuran panjang 13 cm, diameter 1,5 cm dan jarak pengembangan 10 cm, jarak penotolan 2 cm dari bawah dengan fase gerak eluen campuran n-heksan dan etil asetat dengan perbandingan (4:1).

Deteksi bercak hasil pemisahan ditentukan secara kimia yaitu dengan menyemprotkan lempeng KLT menggunakan pereaksi bercak, digunakan 3 pereaksi bercak. Tabel 1. Hasil pemisahan kandungan golongan senyawa ekstrak pegagan secara kromatografi lapis tipis

Sampel Jumlah bercak

No. bercak Rf

Ekstrak n-heksan

Pegagan6

1 0,232 0,283 0,514 0,555 0,756 0,94

Dari hasil deteksi bercak golongan senyawa diperoleh 3 bercak yang memberikan hasil positif. Pereaksi bercak Liebermann-Bourchard dapat mendeteksi bercak golongan senyawa triterpenoid ditandai dengan warna noda bercak merah atau ungu dan mendeteksi golongan senyawa steroid ditandai warna noda bercak biru atau hijau, tetapi pada pemeriksaan

dengan menggunakan pereaksi bercak Liebermann-Bourchard tidak terbentuk noda bercak warna merah atau ungu, yang menandakan adanya golongan senyawa triterpenoid. Tabel 2. Hasil pereaksi penampak bercakPereaksi bercak

Golongan senyawa

Hasil analisis Hasil

Liebermann-

Bourchard

TriterpenoidWarna bercak merah

Negatif

Steroid

Rf 0,94 warna bercak hijau

Positif

Dragendroff Alkaloid

Rf 0,51 warna bercak Orange

Positif

Vanilin asam sulfat

Terpenoid

Rf 0,55 dan 0,75

warna bercak

biru

Positif

Uji Aktitivitas Antibakteri Ekstrak n-heksan Herba Pegagan Terhadap Bakteri Escherichia coliUji Kemurnian Isolat Bakteri Escherichia coli

Uji ini bertujuan untuk menegaskan bahwa bakteri uji yang digunakan telah murni. Isolat bakteri uji yang di peroleh diamati morfologi selnya dengan pengecatan Gram. Pengecatan Gram dilakukan untuk membedakan bakteri yang bersifat Gram positif atau Gram negatif dan bentuk sel.

Hasil dari pengecatan Gram menunjukan bakteri yang di uji benar dan murni bakteri Escherichia coli, terlihat pada Gambar 8 dari pengecatan bakteri uji berwarna merah dan berbentuk batang yang merupakan ciri dari bakteri Escherichia coli. Hasil dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Pengecatan Gram bakteri Escherichia coli pembesaran 10 X 100

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif, pengecatan Gram dapat membedakan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif berwarna biru yang disebabkan kompleks warna Kristal violet-iodium tetap dipertahankan, sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah karena kompleks warna tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat dan kemudian mengambil zat warna kedua yang berwarna merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan tersebut disebabkan perbedaan struktur, terutama dinding sel kedua kelompok tersebut (Waluyo, 2008).Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak n-heksan Pegagan Terhadap Bakteri Eschirichia coli

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan untuk mengetahui daya aktivitas antibakteri dari ekstrak n-heksan pegagan terhadap bakteri Escherichia coli dengan menggunakan metode Difusi Kertas Cakram. Dilakukan 3 kali pengulangan dalam pengujian dengan menggunakan 3 konsentrasi ekstrak yaitu 15%, 30% dan 45% dan dengan menggunakan kontrol positif kotrimoksazol. Hasil lembar daerah hambat ekstrak n-heksan pegagan dan kontrol positif dapat dilhat pada Gambar 4.

A

BGambar 4. A. Uji aktivitas ekstrak n-heksan pegagan terhadap Escherichia coli. B. Kontrol positif dan negatif

Hasil pengamatan dan pengukuran lebar daerah hambat yang terbentuk disekitar kertas cakram menunjukan kecilnya aktivitas dari masing-masing konsentrasi ekstrak n-heksan pegagan yaitu dengan lebar daerah hambat sebesar 1 mm, ini menunjukan ekstrak n-heksan pegagan memiliki aktivitas antibakteri sangat kecil terhadap bakteri Escherichia coli. Dari pengujian lebar daerah hambat kemudian dilanjutkan dengan pengujian aktivitas antibakteri dengan menggunakan metode bioautografi.Uji Bioautografi

Pengujian bioautografi dilakukan menggunakan plat KLT yang telah ditotolkan ekstrak dan di elusi, setelah itu dilakukan pengujian aktivitas antibakteri. Setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam hasil positif

ditandai oleh zona bening, kemudian diukur zona bening dibandingkan dengan kromatogram yang tidak diujikan untuk melihat bercak yang dapat menghambat aktivitas bakteri. Hasil uji bioautografi dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Hasil uji bioautografi

Dari hasil uji bioautografi terlihat tidak adanya noda bercak pada plat KLT yang beraktivitas pada bakteri Escherichia coli di tandai dengan tidak adanya zona bening yang terbentuk.

Beberapa sumber mengatakan pegagan dapat beraktivitas terhadap bakteri Escherichia coli, Dzulkarnain dkk, (1996) dalam tinjauan kepustaka tanaman obat bersifat antibakteri di Indonesia, pegagan memiliki daya aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli. Januwati dan Yusron, (2005) komponen minyak atsiri seperti sitronelal, linalool, neral, menthol, dan linalil asetat. Dengan adanya komponen tersebut dalam minyak atsiri pegagan, tanaman ini memiliki potensi sebagai sumber bahan pengobatan terhadap anti penyakit yang disebabkan tujuh jenis bakteri Rhizobacter spharoides, Escherichia coli, Plasmodium vulgaris, Micrococcus luteus, Baccillus subtilis, Entero aerogenes dan Staphyllococcus aureus.

Digunakan ekstrak n-heksan pegagan untuk mengetahui golongan senyawa semi polar dan non polar yang memiliki daya aktivitas, dalam pengujian digunakan plat KLT sebagai media pengujian antibakteri. Deteksi golongan senyawa mengunakan plat KLT didapat 3 golongan senyawa yakni alkaloid, terpenoid dan steroid, dari hasil yang diperoleh tidak satupun golongan senyawa yang dapat beraktivitas terhadap bakteri Escherichia coli, ini kemungkinana dikarnakan konsentrasi yang terdapat pada plat KLT blum cukup untuk menghambat

Letak PenotolanEkstrak

pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan mungkin dikarenakan oleh kandungan zat senyawa dalam ekstrak pegagan tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri dalam keadaan terpisah dan ketebalan membran luar dari suatu bakteri akan mempengaruhi ketahanan bakteri terhadap suatu jenis senyawa tertentu (Jawetz, dkk, 2001), Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif yang memiliki dinding sel yang lebih kompleks terdiri atas 3 lapis peptidoglikan berada diantara selaput luar dan selaput dalam dinding sel (Gupte, 1990).

Kesimpulan Didapatkan tiga golongan senyawa yang

terdapat dalam ekstrak n-heksan pegagan dari hasil deteksi kromatografi lapis tipis yaitu steroid, alkaloid dan terpenoid.

Uji efektifitas ekstrak n-heksan herba pegagan melalui metode bioautografi tidak menghasilkan daya aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli

Saran Perlu dicari kandungan minyak atsiri dari

pegagan dengan cara destilasi uap. Perlu dilakukan ekstraksi dengan pelarut

semi polar untuk menarik senyawa-senyawa semi polar yang berkemungkinan berfungsi sebagai antibakteri.

Perlu dilakukan uji bioautografi dengan mengunakan metode Bioautografi agar overlay dan Bioautografi langsung.

DAFTAR PUSTAKAAmicelia O., 2010, Uji Aktivitas Antibakteri

Ekstrak Etanol Daun Pegagan (Centella asiatica (L) Urb) Terhadap Staphylococcus aureus dan Eschericia coli Dengan Metode Bioautografi, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta.

BPOM RI., 2010, Serial Data Ilmiah Terkini Tumbuhan Obat Pegagan (Centella asiatica (L) Urban), penerbit: BPOM RI., Jakarta.

Clark J. 2007. Kromatografi Lapis Tipis. http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1

/kromatografi_lapis_tipis/. Di akses pada tgl 05-05-2012.

DepKes RI. 1977. Materia Medika Indonesia, Jilid 1. Jakarta.

,RI. 1986. Sediaan Galenik. Direktorat Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta.

_____. RI. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Direktorat Jendral Pengawas Obat dan Makanan. Jakarta.

,RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta.

,RI. 2004. Penetapan Kadar Air. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta.

Dzulkarnain B., Sundari D, dan Chozin A. 1996. Tinjauan Kepustakaan Tanaman Obat Bersifat Antibakteri di Indonesia. Pusat Penelitian dan Pengembangan Farmasi. DepKes RI, Jakarta.

Eni K., Estie. Dan Darmono, 2008, Sensitivitas Metode Bioautografi Kontak dan Agar Overlay dalam Penentuan Senyawa Antikapang, Fakultas Farmasi UP, Jakarta.

Ferdiaz, D. N. Andarwulan, H. Wijaya, dan N. L. Puspitasari. 1992. Teknik Analisis Sifat Kimia dan Fungsional Komponen Pangan. PAU Pangan dan Gizi, IPB, Bogor.

Fitri Kusuma S.A., 2010, Escherichia coli, Makalah, Fakultas Farmasi UNPAD, Bandung.

Gembong T., 2005, Taksonomi Tumbuhan Obat-obatan, Cetakan kedua, penerbit: Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Gibson, J. M., 1996, Mikrobiologi dan Patologi Modern untuk Perawat,

Cetakan Pertama, Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Gupte, S., 1990, Mikrobiologi Dasar, Ed.3, Bina Aksara, Jakarta.

Handika D.Y., 2009, Analisis Komponen Antibakteri Ekstrak Etanol Rimpang Jahe (Zingiber officinale Rose) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichya coli dan Bioautografinya, Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiya, Surakarta.

Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Terjemahan Padmawinata K, Soediro I, Niksolihin S. Terbitan Pertama. Institut Teknologi Bandung. Bandung.

http://id.wikipedia.org/wiki/Pegagan senin, 31-10-2011 jam 05.13WIB

Jawezt, E. Melnick, J.L and L.A. Adel berg, 1986. Mikrobiologi Kedokteran (Medical Microbiolgy). 20th Edition. Alih bahasa; Edi Nugroho dan R.F Maulany. Penerbit Buku Kedokteran, EGC, Jakarta.

Jawetz, E., J.C. Melnick dan E.A. Adelberg, 2001. Mikrobiologi Kedokteran, Salemba Medika, Jakarta.

Rohman A., 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Graha Ilmu, Yogyakarta

Roth H.J. dan Blascke G., 1988. Analisis Farmasi. Diterjemahkan oleh Sarjono K. dan Slamet I. Yogyakarta: Penerbit UGM

Salni, Hanifa M. dan Ratna W.M., 2011. Isolasi Senyawa Antibakteri dari Daun Jengkol (Pithecolobium lobatum Benth) dan Penentuan Nilai KHM-nya, Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Sriwijaya, Sumatera Selatan.

Stahl E., 1985. Analisis obat secara kromatografi dan mikroskopi. Diterjemahkan oleh Padmawinata K dan Sudiro I. Bandung: Penerbit ITB.

Sudarsono P., Gunawan D., Wahyuono S., Donatus I.A. dan Purnomo, 2002. Tumbuhan Obat II Hasil Penelitian, Sifat-sifat, dan Penggunaan, Pusat Studi Obat Tradisional – UGM Sekip Utara, Yogyakarta

Sudjadi, Drs., 1986. Metode Pemisahan. UGM Press, Yogyakarta

Sunatmo T. I., 2007. Eksperimen Mikrobiologi dalam Laboratorium. Ardy Agency, Jakarta.

Supardi, I., dan Sukamto, 1999. Mikrobiologi Dalam Pengolahan Dan Keamanan Pangan, Penerbit Aumni, Bandung.

Waluyo L. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. UMM Press. Malang.

Winarno, F. G. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia. Jakarta.