04 Genetica Pba 2

4.1 Lneas genticamente estandarizadas

4.1.1 Introduccin

La posibilidad de contar con lneas de roedores de laboratorio que estn genticamente defini-das ha sido uno de los principales avances de la ciencia de los animales de laboratorio. Comoveremos a continuacin, las lneas consanguneas son el prototipo de las lneas genticamenteestandarizadas, debido a que su constitucin gentica est fijada en forma casi definitiva. Hacems de 80 aos que se cuenta con lneas consanguneas de ratones, ratas y cobayos, todas degran valor porque permiten hacer experimentos eliminando la variabilidad de origen gentico.Como podemos observar en las siguientes citas, la importancia de las lneas consanguneas fuereconocida hace tiempo por algunos de los pioneros de la gentica del ratn:

It is the conviction of many geneticists that the use of inbred mice in cancer research hasmade possible many contributions of a fundamental nature that would not have beenmade otherwise (L.C. Strong, 1942).

The introduction of inbred mice into biology is comparable in importance with that of theanalytical balance into chemistry (H. Gruneberg, 1952).

the development of inbred strains has constituted probably the greatest advance in allcancer research (W.E. Heston, 1963)

Empezando por la oncologa experimental, en la dcada de 1940, y siguiendo con la inmuno-loga en 1960, el uso de las lneas consanguneas de ratn ha ido creciendo en forma sosteni-da a lo largo de los aos. Actualmente, ms del 90% de los trabajos cientficos publicados enestas dos reas usan lneas consanguneas. El uso de las mismas ha sido esencial en la elabora-cin de algunos trabajos (en particular en inmunologa) que fueron laureados con premiosNobel. Por ejemplo, P. Medawar y F. Burnet (1960) por el descubrimiento de la intoleranciainmunolgica; B. Benacerraf, J. Dausset y G. Snell (1980) por sus estudios sobre la gentica dela histocompatibilidad; N. Jerne, G. Khler y C. Milstein (1984) por el descubrimiento de losanticuerpos monoclonales y P. Doherty y R. Zinkernagel (1996) por la restriccin al complejomayor de histocompatibilidad.

4.1.2 Lneas consanguneas (inbred strains)

Una poblacin es consangunea cuando sus progenitores comparten uno o varios antecesorescomunes. En otras palabras, la consanguinidad (o endocra) es el acoplamiento entre indivi-duos emparentados. En el orden de los roedores, la consanguinidad es muy frecuente en el

CAPTULO IVLas lneas genticamente estandarizadas

y los controles de la pureza gentica

estado salvaje, debido a que viven en territorios relativamente pequeos y las migracionesson poco frecuentes. Las poblaciones de roedores de laboratorio son tambin relativamenteconsanguneas debido a que su tamao es limitado y el apareamiento entre animales empa-rentados es muy frecuente. A principios del siglo XX, en los Estados Unidos, dos grupos inde-pendientes de investigadores empezaron a criar cobayos (Cavia porcellus) y ratones (Musmusculus) aplicando un sistema de acoplamientos consanguneos a lo largo de varias genera-ciones. Estos trabajos posibilitaron la creacin de una serie de lneas de animales que hoy lla-mamos lneas consanguneas, endocriadas o endogmicas (del ingls, inbred strains). Una l-nea (o cepa) consangunea es aquella que resulta del acoplamiento sistemtico e ininterrum-pido entre hermanos y hermanas (en ingls, full-sib mating), por ms de 20 generaciones (lascuales se numeran F1, F2, F3 etc.). Para asegurar la consanguinidad de la lnea, es muy impor-tante que todos los animales desciendan de un nico par de progenitores. En el caso de nodisponer de hermanos de ambos sexos, se puede recurrir a una cruza excepcional (slo unavez) del tipo padre/madre x cra.

Durante el desarrollo de una lnea consangunea nos podemos encontrar con el fenmenodenominado depresin endogmica en el cual se observa una baja en la fertilidad y una me-nor adaptacin al medio, obstculos que llevan, a veces, a la prdida de la lnea. La depresinendogmica se debe al hecho que, por azar, durante el desarrollo de la consanguinidad, cier-tos alelos desfavorables son puestos al estado homocigota; en las poblaciones salvajes, los in-dividuos en cuestin son contra-seleccionados y desaparecen. En el ratn y la rata, la depre-sin endogmica no es tan severa como en otras especies de mamfero y ocurre solamenteen las primeras generaciones de la endocra, desapareciendo completamente una vez queuna lnea consangunea ha sido establecida. De hecho, es relativamente sencillo derivar lneasconsanguneas a partir de ratones salvaje capturados en la misma rea geogrfica.

Por un lado, la prctica sistemtica de la consanguinidad disminuye la frecuencia de los genoti-pos heterocigotas y, paralelamente, el nmero limitado de progenitores genera una progre-sin hacia el estado homoallico (una sola variante allica presente), donde algunos alelos (enprincipio al azar) son fijados en ese grupo de animales. De esta forma, cada lnea consangu-nea representa una coleccin nica de genes (alelos) imposible de repetir. El aumento de laconsanguinidad es la principal consecuencia de la cruza entre hermanos y la podemos medirpor el coeficiente de consanguinidad (F) (no confundir con el nmero de generaciones de laconsanguinidad: F1, F2, F3). El coeficiente F es la probabilidad de que dos alelos en un locusdado (en un individuo) sean idnticos por descendencia, es decir que ambos sean la rplicade un mismo alelo ancestral. Para considerar a un lnea como consangunea, sta debe tenerpor lo menos un F = 98,7%, valor alcanzado en la generacin nmero 20 de endocra. Estevalor alcanza el 100% (todos los loci homocigotas) en aquellas lneas con ms de 150 genera-ciones, como es el caso de la mayora de las lneas clsicas de laboratorio (Figura 4.1).

Se ha calculado que a, partir de la cuarta generacin de endocra, el 19% de los loci en estadoheterocigota pasan a ser homocigotas (para uno u otro alelo) en cada generacin; por eso seconsidera que despus de la generacin 20, la cantidad de loci que an no se han fijado en elestado homocigota es menor al 1,3%. Este pequeo porcentaje de loci heterocigotas se llama

106 MANUAL DE GENTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO

heterocigosis residual. Se llega as a una situacin donde encontramos dos fuerzas actuandoen sentidos opuestos: la prctica sistemtica de la consanguinidad, disminuyendo la variabili-dad dentro de la poblacin, y la aparicin de mutaciones espontneas, generando diversidadpor la introduccin de alelos nuevos. Cuando ocurre una mutacin en un animal (asumiendoque sea neutra en trminos de seleccin natural), luego de varias generaciones de endocra,existe un 25% de probabilidad de que sea fijada (reemplazando al alelo original) y un 75% deque sea eliminada de la colonia. Esta nocin fundamental nos permite comprender por ques indispensable continuar los acoplamientos consanguneos en forma constante (an despusde la generacin F20) cuando se mantiene una lnea consangunea. De no ser as, las mutacio-nes no son eliminadas y la heterocigosis aumenta.

4.1.2.1 Caractersticas de las lneas consanguneas

Las principales caractersticas de las lneas consanguneas son: (i) isogenicidad, (ii) homocigosis,(iii) individualidad, (iv) uniformidad fenotpica y (v) estabilidad gentica a largo plazo.

La isogenicidad, o igualdad gentica, es sin dudas la caracterstica ms importante de estas l-neas. El hecho de que todos los individuos pertenecientes a una lnea sean idnticos gentica-

LAS LNEAS GENTICAMENTE ESTANDARIZADAS Y LOS CONTROLES DE LA PUREZA GENTICA 107

Figura 4.1. Coeficiente de consanguinidad. El grfico muestra el aumento del coeficiente de consanguinidad (F) en distintossistemas de acoplamiento. A, retrocruzas usando lneas consanguneas; B, acoplamientos hermano x hermana; C, acoplamientos entremedio hermanos; D, acoplamientos al azar usando menos de 10 parejas iniciales; E, acoplamientos al azar usando 80 parejas iniciales.Como puede observarse, luego de 20 generaciones de acoplamientos hermano x hermana el coeficiente F es mayor a 98% y la lneapuede ser considerada consangunea (del ingls, full inbred). Adaptado de Festing MF. Inbred strains in biomedical research, MacmillanPress, London: Oxford University Press, New York, 1979.

mente, facilita el intercambio de tejidos, como ser clulas del sistema inmune o clulas tu-morales (en trminos de histocompatibilidad se habla de animales singeneicos). En el casodel ratn, esto permiti el gran desarrollo de la oncologa y la inmunologa experimentalesa partir de los aos 1940. El alto porcentaje de homocigosis (mayor al 98%) es otro rasgoparticular de estos animales. Por lo tanto, los individuos que pertenecen a una lnea consan-gunea no son equivalentes a una coleccin de gemelos idnticos (monocigticos), ni tam-poco a un grupo de animales clonados, ya que stos son heterocigotas en muchos de susloci.

La asociacin de los caracteres fijados en cada lnea particular genera una individualidad con respec-to a sus cualidades, rasgo que habr que tener en cuenta a la hora de la eleccin de una lnea paraun trabajo de investigacin. En este aspecto, algunos autores dividen a las lneas consanguneas enaquellas de uso general y las de uso especial (o particular). Aunque no existe una definicin formalde una lnea de uso general, son aquellas lneas que se encuentran ampliamente distribuidas y sonusadas en diferentes disciplinas, ms que en un tipo de estudio particular. La sensibilidad a ciertas en-fermedades infecciosas, la tendencia a desarrollar enfermedades autoinmunes (como el lupus y ladiabetes) y la susceptibilidad a los carcingenos son slo algunos ejemplos de la gran utilidad de es-tas lneas como animales de laboratorio de uso particular. Cada lnea consangunea tiene entoncessu rango particular de caractersticas, incluyendo el tipo de tumores espontneos, la habilidad paraaprender, la vida media, la produccin de leche, la agresividad y la susceptibilidad a los agentes infec-ciosos. Por esto mismo, la seleccin de la lnea ms apropiada es una parte crtica del diseo y la pla-nificacin de un experimento. Para obtener detalles de las caractersticas individuales de cada lneavisitar la pgina de Internet http://www.informatics.jax.org/external/festing/search_form.cgi. Desdehace unos pocos aos existe un proyecto internacional conjunto abocado a establecer una colec-cin de datos fenotpicos proveniente de las lneas consanguneas ms comunes y de aquellas ge-nticamente ms divergentes. Este proyecto se conoce como Mouse Phenome Database (MPD)y su pgina de Internet es http://aretha.jax.org/pub-cgi/phenome/mpdcgi?rtn=docs/home.

Dado que se trata de animales genticamente idnticos, la uniformidad fenotpica de las lneasconsanguneas es otro rasgo importante que nos permite afirmar que la variabilidad en los par-metros experimentales se debe exclusivamente a factores no genticos (ambientales o metodo-lgicos). Esta uniformidad nos permite lograr precisin estadstica con muchos menos animalesque los necesarios al trabajar con grupos no consanguneos. Finalmente, la uniformidad hace po-sible la comparacin de resultados experimentales entre animales de diferentes laboratorios yadems, debido a su relativa estabilidad gentica, a lo largo del tiempo.

El nmero de lneas consanguneas censadas es actualmente 478 para el ratn y 234 para larata, lo que da una idea de la enorme cantidad de informacin y bibliografa que se maneja.Se puede acceder a la ltima versin de estas listas a travs de Internet (Mouse Genome Infor-matics, The Jackson Laboratory, http://www.informatics.jax.org/strains) y (International MouseStrain Resources IMSR, http://www.jax.org/pub-cgi/imsrlist). Para aquellos lectores interesados,existe un cuadro muy completo con la genealoga de las lneas consanguneas del ratn quefue publicado originalmente en Nature Genetics (2000) y puede ser obtenido en forma gratui-ta a travs del Internet: http://www.informatics.jax.org/mgihome/genealogy/.


4.1.2.2 Las lneas consanguneas estndar

Los primeros intentos de crear animales consanguneos se realizaron en el ao 1906 utilizan-do cobayos. Las lneas 2 y 13 desarrolladas en ese entonces por Sewall Wright y George M.Rommel todava se encuentran disponibles. Como ya hemos visto en el Captulo III, las pri-meras cruzas consanguneas de ratones fueron comenzadas por Clarence C. Little en 1909 ytuvieron como consecuencia la creacin de la lnea DBA. En ese mismo ao, Helen D. Kinginici las primeras lneas consanguneas de rata, las cepas albinas WKA y PA, en el Wistar Insti-tute. En el ao 1918 Little se mud al Cold Spring Harbor Laboratory, en el estado de NewYork, donde comenz las cruzas que daran origen a las lneas de ratones ms famosas, inclu-yendo C57BL/6, C57BL/10, C3H, CBA y BALB/c, muchas de las cuales tienen en la actualidadms de 150 generaciones de endocra (F150 +). Adems del cobayo, la rata y el ratn, existenunas pocas lneas consanguneas de hmster Sirio, jerbo y rata del algodn (ver Captulo III).

La Tabla 4.1 muestra las diez lneas consanguneas de rata y ratn ms utilizadas en la actualidad.A pesar de la existencia de cientos de lneas consanguneas, el 70-80% de los trabajos de experi-mentacin se realizan usando estas diez lneas ms populares. La lnea de ratn ms popular esBALB/c, debido a su uso en la produccin de anticuerpos monoclonales y al hecho de que esuna excelente lnea de uso general. Las lneas C3H, C57BL/6, CBA y DBA/2 tambin son muyaceptadas como lneas de uso general. C57BL/6 fue histricamente la lnea ms popular y actual-mente es la lnea ms usada como fondo gentico en la creacin de lneas congnicas (incluyen-do transgenes) y es la lnea elegida por el International Mouse Sequencing Consortium para la se-cuenciacin del genoma murino. La lnea FVB y las distintas sublneas de 129 han adquirido granpopularidad en las ltimas dos dcadas debido a que son las ms adecuadas para la produccinde ratones transgnicos y knock-out, respectivamente. Como ejemplo de lnea de uso particulartenemos a la lnea AKR, de gran utilidad en estudios de cncer linftico, debido a su alto porcen-taje de linfomas espontneos. La lnea Fischer 344 (F344) es sin dudas la lnea consangunea derata (de uso general) ms empleada, seguida por la lnea LEW, muy usada en inmunologa. Un


Tabla 4.1. Uso de las lneas consanguneas. Top ten ranking de las lneas consanguneas de ratn y rata de laboratorio. El orden demrito est basado en el nmero de animalarios que mantienen cada lnea en todo el mundo, incluyendo las respectivas sublneas. No se in-cluyeron en este clculo las lneas congnicas. Adaptado de Festing MF. International Index of Laboratory Animals, 6th edition, 1993.

ejemplo de lnea de uso particular lo constituyen las ratas SHR (spontaneously hypertensive rat),esenciales en los estudios de hipertensin (ver Captulo IX).

4.1.2.3 Las lneas consanguneas salvajes

En los ltimos 25 aos, los genetistas del ratn han estado desarrollando una gran variedadde lneas consanguneas a partir de animales atrapados en estado salvaje (ver Captulo III). En-tre las lneas ms utilizadas podemos nombrar:

las lneas MAI/Pas (origen: Austria, 1981) y PWK/Ph (origen: Repblica Checa, 1974) de-rivadas de animales de la especie Mus musculus musculus.

la lnea CAST/Ei (origen: Tailandia, 1971) derivada de ratones Mus musculus castaneus.

la lnea MOLC/Rk (origen: Japn, 1969) derivada de ratones Mus musculus molossinus

las lneas SEG/Pas y SPRET/Ei (origen: Espaa, 1978) derivadas de la especie Mus spretus.

Hoy en da se encuentran disponibles muchas lneas de origen salvaje que ya han pasado las40 generaciones de endocra e incluso algunos laboratorios (The Jackson Laboratory, Bar Har-bor, Estados Unidos) ofrecen estos animales en forma comercial (ver http://jaxmice.jax.org).

4.1.2.4 La divergencia gentica y la existencia de sublneas

Como hemos visto, la aparicin constante de mutaciones, fenmeno que acta en sentidoopuesto a la consanguinidad, genera diversidad gentica por la introduccin de nuevos alelos(ver Captulo VII). Debido a la presencia de estas mutaciones espontneas y a un mnimo gra-do de heterocigosis residual se puede generar, con el tiempo, la divergencia de las lneas ensublneas (subcepas). Una lnea consangunea se considera dividida en sublneas cuando exis-ten diferencias genticas, conocidas o probables, en ramas separadas de la misma, segn lossiguientes casos: (i) cuando una lnea se separa en ramas diferentes antes de la generacinF40, por el fenmeno de heterocigosis residual; (ii) cuando la rama de una lnea ha sido man-tenida separada de otras por ms de 100 generaciones, contando desde los ancestros comu-nes y (iii) cuando se descubren diferencias genticas con otras ramas de la misma lnea, ya seapor mutaciones o contaminacin gentica. Si la contaminacin es reciente sera convenientere-nombrar la lnea, en vez de hablar de una sublnea. Esto sucedi con una colonia de rato-nes de la lnea A, contaminada en los laboratorios Glaxo y renombrada como lnea A2G. Lomismo sucedi con la ex sublnea C57BL/Ks: debido a las diferencias genticas que presenta-ba con C57BL/6 y C57BL/10, como consecuencia de una contaminacin gentica (probable-mente con DBA), fue renombrada en 1994 como C57BLKS.

A modo de ejemplo, la lnea BALB/c, que fue iniciada por BAGG en la dcada de 1910(BALB/c viene de Bagg ALBinos), presenta ms de 10 sublneas que son relativamente dife-rentes unas de otras. Por ejemplo, la sublnea BALB/cJ, originaria del Jackson Laboratory, es


mucho mas agresiva que la BALB/cAnN, originaria de los Institutos Nacionales de la Salud delos Estados Unidos (NIH). Adems, la sublnea BALB/cJ es menos susceptible a los plasmoci-tomas inducidos por pristane, por lo que la sublnea BALB/cAnN es mejor para la produc-cin de anticuerpos monoclonales. Estas sublneas tienen mas de 60 aos de separacin (Figura 4.2).

Las diferencias acumuladas por mutaciones pueden tener, adems, consecuencias patolgicaspara una lnea, como ocurre en la sublnea C3H/HeJ. La misma porta en el cromosoma 4 unamutacin que la hace insensible a la estimulacin por lipopolisacridos de bacterias gram ne-gativas. Esta mutacin se nombr como Lpsd (del ingls, defective lipopolysaccharide response)y ahora se sabe que es una delecin en el gen toll-like receptor 4 (Tlr4Lps-d). En cambio, otrassublneas de C3H, como la C3H/HeN, portan el gen normal (Tlr4Lps-n), hecho que las hace 20veces ms susceptibles a las endotoxinas bacterianas. Otro ejemplo lo constituyen las sublne-as CBA/J y CBA/CaJ; la primera porta la mutacin rd (retinal degeneration) y por lo tanto que-da ciega dentro del primer mes de vida, la segunda no porta dicha mutacin y por lo tanto suvisin es normal.

El conjunto de sublneas de 129 merece un prrafo aparte ya que se trata del origen de lamayora de las lneas de clulas embrionarias (ES cells) empleadas en la construccin de rato-nes knock-out. Tienen la particularidad de formar un grupo heterogneo de sublneas segre-gando diferentes colores de pelaje. Las sublneas 129X1/SvJ (resultante de una contaminacingentica) y 129P3, son albinas (o chinchilla), mientras que otras sublneas son de color agut,


Figura 4.2. Lnea consangunea BALB/c. El diagrama muestra la historia genealgica de los ratones de la lnea consanguneaBALB/c. El grupo actual de sublneas de BALB/c fue formado bsicamente por cuatro ramas principales: las colonias iniciadas por H. B.Andervont, J. P. Scott, E. Green y W. H. Murphy en los Estados Unidos. Adaptado de Morse III, H. Origins of Inbred Mice. AcademicPress, New York, 1978.

en particular las que pertenecen al denominado grupo Steel (129S1, 129S2, 129S3, 129S4,129S5, 129S6, 129S7 y 129S8). Debido a estas variantes y a problemas de contaminacin ge-ntica, se ha revisado (y modificado) toda la nomenclatura de este grupo de sublneas, la in-formacin completa puede obtenerse de Internet en Mouse Genome Informatics(http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/strain_129.shtml).

La divergencia de las lneas consanguneas es por lo tanto un fenmeno lento pero insidioso einevitable. Uno de lo medios ms eficaces para impedir este proceso es el establecimiento debancos de embriones congelados, los cuales abastecern, a intervalos regulares, la formacinde nuevos ncleos reproductores (ver Captulo II).

Nomenclatura de las lneas consanguneas

La nomenclatura de las lneas es indispensable y debe ser seguida en forma rigurosa debido a quenos aporta mucha informacin. Las siguientes reglas de nomenclatura fueron tomadas del Interna-tional Committee on Standardized Genetic Nomenclature for Mice (para obtener versiones actualiza-das consultar el sitio http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/strains.shtml). Las reglas denomenclatura para la rata son similares a la del ratn, tanto para las lneas consanguneas comopara los loci y alelos (ver http://rgnc.gen.gu.se/#rgnc2).

Los smbolos de lnea. Las lneas consanguneas deben designarse con letras maysculas ouna combinacin de letras maysculas y nmeros (comenzando con letra). Por ejemplo, la l-nea de ratn DBA o la lnea de rata SHR, aunque existen algunas excepciones en lneas muyconocidas como la lnea 129. Los smbolos de las lneas nuevas deben ser preferentementecortos y previamente confrontados con la lista existente, para evitar duplicaciones. Las lneascon un origen comn, separadas antes de la generacin 20 de endocra (F20), deben ser to-madas como lneas relacionadas y por lo tanto sugerirlo en el nombre, por ejemplo las lneasde ratn NZB, NZC, NZO.

Los smbolos abreviados. En algunos casos se permite utilizar abreviaturas para las lneas msconocidas. Por ejemplo, las lneas de ratn AKR (AK); BALB/c (C); C3H (C3); C57BL/6 (B6);C57BL/10 (B10); DBA/1 (D1); DBA/2 (D2).

Los smbolos de sublnea. Se debe utilizar el nombre de la lnea de origen, seguido de unabarra y un smbolo apropiado de sublnea. Smbolos de sublnea: (i) nmeros (DBA/1,DBA/2), (ii) cdigo de laboratorio, con la primera letra en mayscula (BALB/cJ, la J es el c-digo del Jackson Laboratory, USA), (iii) iniciales de un apellido, con primera letra mayscula(C3H/He, por Heston) y (iv) la combinacin de cdigo y nmeros. Algunas excepciones sonpermitidas en el caso de lneas muy conocidas como BALB/c, donde la c indica albinismo yno una sublnea.

Los cdigos de registro para laboratorios. Los cdigos nicos de registro para cada labora-torio y los smbolos de sublnea son asignados por el ILAR (Institute for Laboratory Animal Re-sources). Pare ver los cdigos existentes o para solicitar un cdigo visitar la pgina de Internet


de ILAR (http://dels.nas.edu/ilar/codes.asp?id=codes). El uso de estos cdigos es apropiadopara designar colonias de la misma lnea (sin diferencias genticas) mantenidas por diferenteslaboratorios. Debe colocarse al final del nombre completo de la lnea el signo @ seguidodel cdigo del laboratorio, por ejemplo C57BL/6J@Pas (la lnea C57BL/6 importada del Jack-son Laboratory y mantenida por el Institut Pasteur).

4.1.2.5 Mantenimiento de las lneas consanguneas

Como hemos visto en el Captulo II, para el mantenimiento de las lneas consanguneas se re-comienda un sistema basado en un ncleo reproductor (foundation stock colony) y una o mscolonias de multiplicacin o expansin (multiplication colony). El ncleo de reproduccin es loms valioso debido a que es la fuente de animales puros, genticamente controlados. Este n-cleo de reproduccin est formado normalmente por 10 a 20 parejas monogmicas. Las prin-cipales medidas de manejo para prevenir la contaminacin gentica por cruzas no deseadasson las siguientes: (i) Separacin fsica de las colonias reproductoras, en particular los ncleosde fundacin, en aisladores o en cuartos separados. (ii) Si la separacin fsica no es posible,distribuir las lneas de acuerdo a su color de pelaje. (iii) Se debe elegir un sistema de cra queminimice el movimiento de animales entre cajas y cuartos. En este aspecto, las parejas mono-gmicas o los tros estables son la mejor opcin. Es importante tener presente que, dentrodel ncleo reproductor, debe haber una lnea de ancestro principal, pero con la menor canti-dad posible de ramificaciones. Para lograr este objetivo se recomiendan dos sistemas de pro-duccin: (i) de lnea nica y (ii) de lneas paralelas.

En el sistema de lnea nica, las nuevas parejas reproductoras se seleccionan de un nmero li-mitado de jaulas (no ms de 30) e, idealmente, se las somete a un control de la pureza gen-tica. Lo ms importante es que todos los animales de la generacin presente desciendan deuna nica pareja ancestral, no ms de cinco generaciones atrs. En el sistema de lneas parale-las (modificado), la exigencia de perpetuar una lnea nica es menos estricta, lo que facilita unpoco el manejo. Normalmente, se mantienen tres lneas en paralelo, usando entre 5 y 10 pa-rejas por lnea. Luego de cuatro generaciones, se seleccionan un macho y una hembra (her-manos), los cuales sern la pareja ancestral de las prximas cuatro generaciones. A partir deesta nueva pareja se vuelven a abrir tres lneas (tres hembras y tres machos de la misma ca-mada) y se las mantiene por cuatro generaciones, y as sucesivamente (Figura 4.3). Este siste-ma est basado en el supuesto de que es casi imposible que se produzca una contaminacingentica simultneamente en las tres lneas. Para evitar accidentes, la pareja seleccionada de-bera pasar por un estricto control de calidad gentica. Muchos encargados de animalarios se-leccionan estos animales teniendo en cuenta el comportamiento reproductivo (por ejemploel nmero de cras por hembra por semana), aunque es una medida discutible. Los libros deFesting (1979) y Hedrich (1990) contienen informacin detallada de estos esquemas de re-produccin.


4.1.3 Hbridos F1 (hybrid F1 mice)

Son la primera generacin obtenida de la cruza de dos lneas consanguneas, no obstante sergenticamente uniformes (isognicas), sern heterocigotas para todos los loci en los que difie-ran las lneas parentales (Figura 4.4). Como consecuencia, los hbridos F1 no pueden ser aco-plados entre s (como veremos en el Captulo VI, esta cruza generar animales F2) sino quedeben ser producidos, cada vez que se requiera, por la cruza de las lneas parentales. La uni-formidad gentica a travs del tiempo es una de las ventajas ms claras de estos animales. Elvigor hbrido es otro de sus rasgos sobresalientes, expresado en un estado fsico superior alde las lneas parentales y una mejor adaptacin al medio. Una de las aplicaciones clsicas delos hbridos F1 en la investigacin del cncer es el anlisis de prdida de la heterocigosis(del ingls, loss of heterozygosity-LOH). Este mtodo saca provecho de la presencia de marca-dores polimrficos entre las lneas parentales (por ejemplo, un microsatlite dar dos bandasde electroforesis en el ADN normal) evaluando la prdida de algn alelo en el ADN tumoral.Por ejemplo, los hbridos B6C3F1 son el estndar para el estudio de cncer de hgado induci-do por carcingenos qumicos.


Figura 4.3. Sistemas de cra. Sistema de lneas paralelas usado para el mantenimiento de un ncleo reproductor de una lneaconsangunea. Cada crculo representa una pareja reproductiva y todos los animales pueden ser referidos a una pareja ancestral (cr-culo gris de la generacin F90). En este ejemplo se mantienen tres lneas en paralelo con cinco parejas por lnea. Luego de cuatro ge-neraciones se vuelve a elegir una pareja que ser el futuro ancestro comn (crculo gris de la generacin F94); en este caso, seleccio-nada por tener el mejor comportamiento reproductivo. Los valores dados en la ltima generacin son nmero de cras por hembra ypor semana. Adaptado de Hedrich H. Genetic monitoring of inbred strains of rats. Stuttgart, New York. Gustav Fischer Verlag, 1990.

Nomenclatura de los hbridos F1

Los hbridos F1 son designados anotando primero el progenitor hembra, una x que simboli-za el cruzamiento y en segundo lugar el macho, ms el smbolo F1. Puede utilizarse la formacompleta del nombre, (C57BL/6 x DBA/2)F1, si es la primera vez que se lo menciona en untexto, o su forma abreviada (B6D2F1).

4.1.4 Lneas congnicas y coisognicas (congenic strains)

Dos lnea que son genticamente idnticas pero que difieren slo en un locus, por ejemplo acausa de una mutacin, se denominan coisognicas. Esto puede suceder slo cuando la mu-tacin ha ocurrido en una lnea consangunea. Por lo tanto, podemos especular que estos ani-males son idnticos, a excepcin del locus mutado.

De todas formas, existe la posibilidad de generar un anlogo de las lneas coisognicas transfi-riendo, por medio de la reproduccin sexual, la mutacin de inters a un fondo gentico (del


Figura 4.4. Animales hbridos F1. El dibujo representa lo que sucede cuando cruzamos ratones de dos lneas consanguneas paragenerar animales hbridos F1. El ratn F1 hereda un juego de cromosomas completo de cada progenitor por lo tanto ser heterocigo-ta para todos aquellos loci en los cuales difieran las lneas parentales. Ms all de este rasgo, los ratones F1 generados a partir de lasmismas lneas sern genticamente idnticos (isognicos).

ingls, genetic background) determinado, normalmente una lnea consangunea estndar. Las l-neas creadas por la introduccin de una regin cromosmica que contiene un locus diferen-cial se denominan lneas congnicas. Estas lnea se obtienen por retrocruzas repetidas de la l-nea donante (la cual porta la mutacin) con una lnea consangunea receptora, a travs depor lo menos 10 generaciones, llamadas sucesivamente N2, N3, N4 etc. (Figura 4.5). De estaforma, el gen transferido se encuentra sumergido en un segmento cromosmico cuyo ta-mao se reduce, generacin tras generacin, a causa de las recombinaciones cromosmicas.


Figura 4.5. Lneas congnicas. El grfico muestra la construccin de una lnea congnica. Las retrocruzas sucesivas con la lnea re-ceptora (cuadrados negros) aumenta el porcentaje de ese genoma en cada generacin (en promedio 50%), mientras que el porcenta-je del genoma de la lnea donante (cuadrados blancos) va disminuyendo en la misma proporcin. La heterocigosis residual va desapa-reciendo y slo queda el segmento del cromosoma que acompaa al locus diferencial, seleccionado en cada generacin. En la genera-cin N10, ya se puede considerar a la lnea como congnica completa (del ingls, full congenic). Adaptado de Silver L. M. (ed) MouseGenetics. Concepts and applications. Oxford University Press, Oxford, 1995

Es importante aclarar que en cada generacin de retrocruza se seleccionan (como futurosprogenitores) slo aquellas cras que han recibido el alelo mutado, de lo contrario corremosel riesgo de perderlo. En cada generacin de retrocruza el nivel de heterocigosis se reduce un50% y aumenta en la misma proporcin el fondo gentico de la lnea receptora (esto se apli-ca slo a los cromosomas que no portan la mutacin). Se puede calcular el porcentaje del ge-noma de la lnea donante que an persiste en el genoma receptor por la siguiente frmula:1/2N (donde N es el nmero de generaciones de retrocruza). Para ocho generaciones (N8),1/2N = 1/28 = 1/256, o sea que queda slo un 0,4% del genoma de la lnea donante (Figura4.6). Con respecto al segmento cromosmico que porta el locus diferencial, existe una apro-ximacin estadstica que indica que el mismo tendra, en promedio, un tamao de 20 cM (10cM a cada lado del locus diferencial) en la generacin N10 y alrededor de 5 cM si llegamoshasta N20 (Figura 4.7). Normalmente, estas lneas se desarrollan por medio del esquema de-nominado cruza-intercruza, donde (durante el proceso de retrocruzas) un animal homocigo-ta para la mutacin es siempre cruzado con un ejemplar puro de la lnea de fondo. En el casode querer desarrollar lneas congnicas segregando para mutaciones letales o estriles al esta-do homocigota se puede usar el mtodo de cruza-intercruza con transplante de ovarios (verCaptulo II). Por ejemplo, las mutaciones microphtalmia (Mitfmi) y obese (Lepob) fueron histri-camente mantenidas con este esquema.


Figura 4.6. Retrocruzas contra una lnea consangunea. El grfico muestra el aumento del porcentaje correspondiente al ge-noma de la lnea de fondo (lnea receptora) durante la construccin de una lnea congnica. Como puede observarse, el porcentajeaumenta 50% en cada generacin de retrocruza, llegando casi a 100% en la generacin N12, momento en el cual se considera a la l-nea como congnica completa (del ingls, full congenic).

En trminos prcticos, se puede estimar que el desarrollo de una lnea congnica llevar apro-ximadamente la mitad del tiempo que para desarrollar una consangunea: alrededor de 5 aos.Actualmente, desde la gran profusin de los marcadores moleculares (como los microsatli-tes), es posible acortar mucho estos tiempos, por un sistema de reproduccin asistida pormarcadores conocido en ingls como speed congenic. Esta metodologa se basa en elegir, encada generacin de retrocruza, a aquellos progenitores que tengan la mayor proporcin delgenoma de la lnea receptora (fondo gentico), por medio del uso de marcadores polimrficosque cubran todos los cromosomas. Esto se realiza en base a que la proporcin del genoma dela lnea de fondo sigue un distribucin normal; por ejemplo, el promedio de esa proporcin esdel 50% en la N2. Pero, en realidad, en un grupo de 100 ratones N2 existirn individuos convalores de 20% y otros de 80% del mismo fondo gentico. La reproduccin asistida con mar-cadores intenta rescatar estos animales con mayores proporciones para ser usados como pro-genitores. Por ejemplo, realizando un genotipado de alta densidad (con marcadores espaciadoscada 10 cM) a 40 ratones machos en cada generacin, Wakeland y colaboradores obtuvieronun promedio de 0,1% de genoma dador contaminante en la generacin N5 (este porcentajesubi a 0,4% cuando usaron los marcadores espaciados cada 25 cM).


Figura 4.7. Desarrollo de una lnea congnica. El dibujo muestra la disminucin del tamao del segmento diferencial (el cualporta el locus introducido por seleccin) durante la creacin de una lnea congnica. A medida que realizamos las retrocruzas con lalnea receptora, el tamao del fragmento cromosmico introducido (rectngulo gris) es menor, siendo de (aproximadamente) 20 cM(10 cM a cada lado) en la generacin N10 y de 5 cM (2,5 cM a cada lado) en la N20.

Las lneas congnicas (existen cientos de ellas en el ratn y la rata) son esenciales para estu-diar el efecto de las mutaciones (sean espontneas, inducidas o por manipulacin gentica),ya que permiten comparar animales en los cuales se han eliminado las diferencias en el fondogentico. Un ejemplo de sto es el panel de lneas congnicas de rata establecido por B.Voigt y colaboradores utilizando la lnea normotensa BB/Ok (aunque proclive a desarrollardiabetes) y la lnea hipertensa SHR/Mol (resistente a la diabetes). El panel BB.SHR se desarro-ll de manera que cada lnea lleve un segmento nico de la lnea SHR (conocido por estar in-volucrado en el desarrollo de la hipertensin) sobre fondo BB. En el ratn, las lneas congni-cas creadas con los diferentes genes de histocompatibilidad, han jugado un papel muy impor-tante en el estudio de la biologa de los transplantes. Los trabajos de George D. Snell con laslneas congnicas resistentes permitieron el descubrimiento de las leyes que gobiernan el re-chazo de los injertos, trabajos por los que recibi el nico premio Nobel relacionado directa-mente a la gentica de ratones (ver Captulo V).

Recientemente, se dio a conocer la creacin de los ratones GTM (del ingls genome taggedmice). Olga Iakoubova y colaboradores generaron, por medio de cruzas asistidas por marca-dores moleculares, 60 lneas congnicas, cada una portando un segmento (entre 8 y 58 cMde tamao) proveniente de DBA/2 o CAST/Ei sobre fondo C57BL/6J. Estas lneas sern degran utilidad en el anlisis de enfermedades genticas complejas.

Nomenclatura de las lneas coisognicas y congnicas

Las lneas coisognicas deben designarse por el smbolo de la lnea ms, seguido de un guin,el smbolo del gen o alelo diferencial, por ejemplo C3H/N-lpr. Las lneas congnicas se desig-nan con un nombre compuesto por dos partes (separadas por un punto). La primera es elnombre completo, o abreviado, de la lnea de fondo (la que recibe el locus diferencial) y, lue-go del punto, se coloca la abreviatura de la lnea donante, un guin y, seguido, el smbolo dellocus o alelo diferencial. Por ejemplo, B10.129-H12b es una lnea con fondo C57BL/10Sn (=B10) pero que difiere de esa lnea original en el alelo H12b, derivado de la lnea 129. Si el ori-gen de la lnea donante de la mutacin es desconocido puede indicarse como B6.Cg-nkt, endonde Cg indica lnea congnica.

4.1.5 Lneas consanguneas recombinantes (recombinant inbred strains-RIS)

Debido a su importancia en el desarrollo de los mapas genticos, las lneas consanguneas recombinantes sern vistas en detalle en el Captulo VI. Bsicamente, se trata de grupos o pa-neles (del ingls, set) de lneas que se producen por 20 ms generaciones de endocra siste-mtica de las cras sucesivas de una cruza entre dos animales F1, tomadas al azar desde la F2(ver Figura 6.13 en el Captulo VI). Tratndose de lneas consanguneas, cada lnea de un pa-nel de ratones RIS representa una coleccin de individuos con genomas idnticos, homocigo-tas para todos sus loci, y que pueden ser criados en nmero ilimitado, lo que significa unagran ventaja. Estas lneas tambin permanecen estables a lo largo de las generaciones, con la


sola excepcin de la posibilidad de mutaciones. En trminos genticos, los cromosomas deestas lneas son un tapiz hecho de trozos (de tamao variable) de cromosomas derivados,al azar, de las dos lneas parentales (50% y 50% en promedio). La gran ventaja que presentanestas lneas para el anlisis de ligamiento es la posibilidad de acumular informacin en formaaditiva a lo largo de los aos sobre el mismo panel de ratones RIS. Las lneas consanguneasrecombinantes estn volviendo a tener protagonismo ya que permiten estudiar la herencia decaracteres complejos y cuantitativos. De hecho, en la actualidad se encuentran en desarrollonuevos paneles RIS.

Nomenclatura de las lneas consanguneas recombinantes

Las lneas consanguneas recombinantes deben designarse con los smbolos abreviados de laslneas parentales separados por la letra X (en mayscula y sin dejar espacios). Por ejemplo,CXB ser un grupo de RIS derivado de una cruza entre una madre BALB/c (C) y un padreC57BL/6 (B). Las lneas individuales dentro de la serie se designan con nmeros (CXB1,CXB2, CXB3 etc.).

4.1.6 Lneas congnicas recombinantes (recombinant congenic strains-RCS)

Estas lneas son una variacin de la filosofa de las RIS y por lo tanto se empiezan cruzandodos lneas consanguneas. Una vez obtenidos los animales F1, se realizan algunas generacionesde retrocruza contra una de las lneas parentales (la que ser la lnea de fondo) para finalmen-te proseguir con la endocra (sin seleccin) de estos animales. De esta manera, la proporcinde la lnea de fondo y la donante no ser, como en el caso de las RIS, 50% y 50%. Por ejem-plo, para el caso de dos generaciones de retrocruza, ser 87,5% de la lnea de fondo y 12,5%de la lnea donante. Como veremos en el Captulo VI, las RCS son especialmente tiles parala localizacin de genes asociados a caracteres hereditarios complejos, como son los genes desusceptibilidad al cncer.

Una variante de las lneas congnicas recombinantes surgi de la cruza de lneas de ratonesMus spretus y Mus musculus. Xavier Montagutelli y colaboradores (Institut Pasteur, Pars) handesarrollado 50 lneas conocidas como lneas congnicas recombinantes inter-especficas(inter-specific recombinant congenic strains, IRCS), donde C57BL/6 es la lnea de fondo ySEG/Pas la lnea donante. Segn el esquema de cruzas utilizado, se esperaba (en teora) unacontribucin de alrededor del 9% del genoma de origen Mus spretus. En realidad (aunque nose realiz seleccin durante la endocra) se encontr que ese porcentaje era slo del 1,6%,debido a la contra-seleccin de los alelos Mus spretus. De esta forma, cada lnea IRCS lleva unbajo nmero de segmentos cromosmicos pequeos de origen Mus spretus, representandouna lnea multi-congnica. Estas lneas han sido muy tiles a la hora de localizar loci de resis-tencia a la formacin de linfomas por radiacin en el ratn.


Nomenclatura de las lneas congnicas recombinantes

Las lneas congnicas recombinantes deben designarse con los smbolos abreviados de las l-neas parentales (primero la receptora y luego la donante) separados por la letra c minscu-la. Por ejemplo, CcS ser un panel de RCS derivado de una cruza entre BALB/c (C) y STS (S),donde BALB/c es la lnea receptora (fondo gentico). Las lneas individuales dentro de la seriese designan con nmeros (CcS1, CcS2 etc.).

4.1.7 Lneas consmicas (consomic strains)

Las lneas consmicas son lneas en las cuales se introduce un cromosoma entero (en vez deun segmento) en una lnea receptora, tambin por medio de retrocruzas. Son conocidas tam-bin como lneas con sustitucin de cromosoma (del ingls, chromosome substitution strains).Igual que para las lneas congnicas, se necesitan por lo menos diez generaciones de retrocru-zas para lograrlas. Una de sus formas ms simples es utilizar el cromosoma Y como donante,por ejemplo para obtener animales con fondo C57BL6 pero que porten un cromosoma Y ensu totalidad Mus musculus castaneus (la nomenclatura sera B6-YCAS). Tambin pueden intro-ducirse cromosomas autosmicos pero, en este caso, las cruzas deben ser asistidas por mar-cadores moleculares (normalmente microsatlites). Gunet y colaboradores (Institut Pasteur)han desarrollado un grupo de lneas consmicas inter-especficas entre C57BL6 y STF/Pas(Mus spretus) para algunos cromosomas de origen Mus spretus. Debido a problemas de re-produccin no se pudieron lograr lneas para todos los cromosomas y slo los cromosomas14, 16 y 19 han quedado en estado de homocigosis. De todas formas, estas lneas han sidousadas para localizar loci de resistencia a la formacin de linfomas por radiacin . Otro ejem-plo del valor de estos modelos son las cinco lneas de ratas consmicas desarrolladas en elMedical College of Wisconsin, Estados Unidos. En este caso, los fondos genticos involucradosfueron las lneas Brown Norway (BN), Fawn-Hooded Hypertensive (FHH) y Dahl Salt-Sensiti-ve (SS). Se espera que estas lneas consmicas sean tiles en la diseccin gentica de la hiper-tensin.

4.1.8 Lneas conplsticas (conplastic strains)

Las lneas conplsticas tienen el genoma mitocondrial (completo) perteneciente a otra lneaconsangunea. Teniendo en cuenta que el ADNmt (de un tamao aproximado de 16,3 kb enel ratn) es indistinguible entre las lneas clsicas de laboratorio, este tipo de acercamientoslo tiene sentido para cruzas inter-especficas o inter-subespecficas. Se pueden obtener, porejemplo, ratones con fondo C57BL6 pero que porten el genoma mitocondrial de origen Musmusculus castaneus. En este caso, la nomenclatura sera B6-mtCAS.


4.1.9 Los roedores no consanguneos (outbred stocks)

Una gran mayora de las ratas y ratones vendidos en todo el mundo para ser usados en inves-tigacin pertenece a grupos (del ingls, stocks) de animales no consanguneos, exocriados oexogmicos (en ingls random bred o outbred). Para ser ms exactos, datos recientes mues-tran que alrededor del 75% de las ratas y ratones producidos comercialmente (por lo menosen Estados Unidos) son animales no consanguneos. Su gran popularidad se debe especial-mente a que son mucho ms baratos que las lneas consanguneas, son muy buenos repro-ductores y mansos para el manejo de laboratorio, pero es importante destacar que se tratade animales no definidos genticamente. Para mantener correctamente estos grupos de roe-dores no debe sobrepasarse del 1% de endocra por generacin, tratando de cruzar siempreanimales no emparentados. En una colonia cerrada, esto es muy difcil de lograr, por lo tantodepender del tamao inicial de la colonia. Lo ideal es contar con alrededor de 80 parejas re-productoras como fundadores del ncleo; de esta manera el coeficiente de endocra F no lle-ga a superar el 10% dentro de las 20 generaciones. Existen varios sistemas de cra para man-tener animales exocriados, dependiendo del nmero de animales que se tenga en la colonia.El sistema Poiley, del tipo rotativo, se ajusta mejor para grandes colonias, otros sistemas,como el Han, donde se intercalan una o dos veces las generaciones de apareamientos, sonms aptos para colonias pequeas. Para ms informacin sobre la gentica de las poblacionesexocriadas consultar el artculo de Daniel L. Hartl (2001) Genetic Management of Outbred La-boratory Rodent Populations (http://www.criver.com/techdocs/index.html) y el libro MicrobialStatus and Genetic Evaluation of Mice and Rats (2000).

Entre los ratones no consanguneos ms populares podemos citar los Swiss-Webster, CD-1,ICR, y CF-1, todos de uso general. Los ratones llamados Swiss o Swiss-Webster derivan to-dos de un grupo de 9 ratones llevados desde Suiza hacia Estados Unidos por Clara Lynch en1926. All fueron criados en el Rockefeller Institute, Nueva York, desde donde fueron distribui-dos a distintos institutos, siempre como ratones exocriados. En la dcada de 1930, LeslieWebster los pas a manos de vendedores comerciales, de all el origen del nombre Swiss-Webster. Los ratones ICR (Institute of Cancer Research), originalmente HA(ICR), derivan total-mente de ratones Swiss-Webster, aunque existen dudas sobre la contribucin de ratones al-bino de origen desconocido (vendedores comerciales). Este grupo lo comenz John Haus-chka en el ao 1947 en el Institute of Cancer Research, Philadelphia, Estados Unidos. Esimportante tener en cuenta que tambin existen muchas lneas consanguneas que han sidodesarrolladas a partir de ratones Swiss, como SJL/J, SWR, HSFS, ICR/Ha y NIH/Ola, entreotras (Figura 4.8).

Las ratas Wistar Hannover, Wistar Kyoto (WKY), Sprague-Dawley (SD), Long Evans (LE) yZucker (ZUC) son los grupos de ratas no consanguneas ms populares. Las primeras colo-nias de ratas albinas fueron comenzadas en 1906 en el Wistar Institute, donde se originaron lamayora de estos grupos exocriados. Por ejemplo, las ratas Long Evans provienen de cruzasde ratas Wistar con ratas salvajes. Existen tambin grupos no consanguneos de cobayos(Hartley e IAF), hmsters (LVG) y jerbos (MON) empleados en distintas reas de la investiga-cin biomdica (ver Captulo III).



Figura 4.8. Ratones de la familia Swiss. El diagrama muestra la historia genealgica de los ratones de la familia Swiss. Se mues-tran los orgenes de los distintos grupos de ratones exocriados y tambin algunas de las lneas consanguneas que se derivaron a partirde esos grupos. Adaptado de Rice MC, OBrien SJ. Genetic variance of laboratory outbred Swiss mice. Nature 283: 157, 1980.

Estos grupos de roedores son los que mejor representan la variabilidad gentica de una po-blacin humana tpica; rasgo que puede ser confirmado al estudiar la frecuencia gnica de ungrupo de genes (isoenzimas) o el porcentaje de heterocigosis de marcadores moleculares(microsatlites). Por esta caracterstica, los grupos de ratas y ratones exocriados son muy usa-dos en toxicologa y farmacologa, aunque actualmente su uso est cada vez ms cuestionado,ya que se puede obtener mayor variabilidad utilizando un conjunto de lneas consanguneas.Otra forma de generar variabilidad es produciendo hbridos F1 de lneas bien distantes (porejemplo, unos entre ratones AKR y BALB/c y otros entre las lneas C3H y DBA) y cruzandoluego estos hbridos entre s. A este grupo de animales se los conocen como hbridos multi-cruza (en ingls, multicross hybrids); en el ejemplo dado sera un cruce de cuatro vas (four-waycross). El polimorfismo generado con estas cruzas es muy alto y se acerca al de las poblacio-

nes humanas. An as, existen algunas circunstancias donde el uso de grupos no consangune-os podra estar indicado, como sucedera en experimentos de seleccin (por ejemplo tamaocorporal), donde una lnea consangunea ser completamente inadecuada debido a la falta devariacin gentica. Adems, algunos roedores no consanguneos pueden ser valiosos modelosde enfermedades humanas, como lo son las ratas Zucker para la obesidad y las ratas BB parala diabetes mellitus.

Nomenclatura de los roedores no consanguneos

Debido a la falta de homogeneidad gentica, estos grupos de animales deben ser nombradoscomo grupos (stocks) o colonias y no como lneas (o cepas). Por la misma razn, no exis-te una nomenclatura oficial sobre estos animales; los ltimos reglamentos son de 1972 y noson aplicados con uniformidad. Actualmente existen dos tendencias: (i) utilizar nombres con2 a 6 letras en mayscula y aclarar en el texto que se trata de animales exocriados (ratonesSENCAR, NMRI o ratas WISTAR, LONG EVANS) y (ii), usar un nombre compuesto, colo-cando en primer lugar el cdigo del laboratorio y, luego de dos puntos, el nombre del grupo(puede agregarse entre parntesis el origen). Por ejemplo, Crl:CD-1(ICR)BR es el stock CD-1(de origen ICR) criado en el Charles River Laboratories, N:NIH (S) es un stock denominadoNIH de origen Swiss (S) criado en el NIH (N), Crl:(LE)BR y Crl:(WI)BR son las ratas LongEvans y Wistar, respectivamente, criadas en el Charles River Laboratories.

La Tabla 4.2 resume las caractersticas comunes a las lneas consanguneas, los hbridos F1 ylos grupos de roedores no consanguneos.


Tabla 4.2. Caractersticas de las lneas genticamente definidas. Resumen de las caractersticas comunes a las lneas con-sanguneas, los hbridos F1 y los grupos no consanguneos de roedores. Adaptado de Festing MF. Inbred strains in biomedical research,Macmillan Press, London: Oxford University Press, New York, 1979.

4.2 La contaminacin gentica y los controles de calidad

4.2.1 Generalidades

A lo largo de los ltimos 30 aos, se han publicado varios casos de lneas de ratas y ratonesgenticamente contaminadas (no autnticas), con el correspondiente detrimento de los resul-tados obtenidos y las prdidas de tiempo y dinero que acarrea. De aqu la necesidad de esta-blecer controles genticos (en ingls, genetic monitoring) en las colonias de animales utilizadosen investigacin, para que los resultados sean reproducibles y tengan validez cientfica. Fre-cuentemente, la obtencin de resultados errneos en la investigacin es atribuida a distintosfactores experimentales, pero muy pocas veces se repara en verificar la pureza gentica delos animales utilizados.

El control gentico es un conjunto de tcnicas que nos permite verificar si los animales queestamos utilizando an conservan las caractersticas genticas originales de la lnea a la cualpertenecen, o han sufrido algn cambio debido a una contaminacin gentica (por cruzasaccidentales). Lamentablemente, estos controles no estn diseados para detectar la pre-sencia de mutaciones espontneas, ya que al producirse al azar sera necesario evaluar latotalidad del genoma. El fundamento de los controles de pureza gentica consiste en anali-zar caracteres cualitativos o cuantitativos (enzimas, marcadores inmunolgicos, marcadoresde ADN) y compararlos con valores de referencia establecidos internacionalmente para lalnea consangunea. En todos los casos se trata de utilizar marcadores lo suficientementepolimrficos entre lneas como para detectar cruzas accidentales. Segn Michael F. Festing,podemos dividir a estos controles en tres categoras: (i) Caracterizacin: es para describirel genotipo de una lnea nueva, analizando el mayor nmero de loci posible. (ii) Controltipo I: se emplea slo para confirmar el perfil gentico de una lnea. (iii) Control tipo II: seanaliza un grupo mnimo de loci seleccionados especialmente para discriminar entre variaslneas.

El ltimo tipo de control es el que debera aplicarse peridicamente en los animalarios de ro-edores consanguneos. Ante la inquietud de saber cundo se debe realizar un control de pu-reza gentica, podemos decir que una colonia debe ser controlada genticamente fundamen-talmente en dos casos: (i) al establecer una colonia nueva y (ii) cuando se sospecha de conta-minacin gentica. Mas all de estos casos, un control de rutina debera estar presente enaquellas colonias con alto riesgo de contaminacin, como ser aquellas que mantienen ms deuna lnea albina simultneamente. Con motivos didcticos, podemos agrupar las tcnicas decontrol gentico en aquellas que controlan loci individuales y las que lo hacen sobre variosloci simultneamente. Dentro del primer grupo encontramos los marcadores bioqumicos, losmarcadores inmunolgicos, el anlisis del color del pelaje y la tipificacin de microsatlites deADN. Dentro de las tcnicas que controlan varios loci simultneamente encontramos los in-jertos de piel, los estudios morfolgicos, el comportamiento reproductivo y el fingerprinting deADN.


4.2.2 Marcadores bioqumicos

Excepto algunas protenas especficas como la hemoglobina con sus cadenas alfa y beta (Hbay Hbb), las transferrinas (Trf) y la protena mayor urinaria (Mup), la mayora de los marcado-res bioqumicos son enzimas. Se denominan isoenzimas a las diferentes formas molecularesque adopta una determinada enzima y que poseen similares pero no necesariamente idnti-cas propiedades catalticas, por ejemplo esterasa 1 (Es1), esterasa 2 (Es2), esterasa 3 (Es3),etc. Existen por lo menos 20 loci de isoenzimas utilizados en los controles genticos, algunosde los cuales se analizan en la Tabla 4.3. Por otro lado, las diferencias moleculares en los dis-tintos alelos de un mismo locus de isoenzima se denominan aloenzimas y se designan con lasletras a, b, c, etc. segn su comportamiento electrofortico (Es1a, Es1b, Es1c).

En nuestro caso, y asumiendo el estado isognico de las lneas consanguneas, cabe esperarun patrn nico de aloenzimas para cada lnea en particular, lo que constituye el arma funda-mental de nuestro control. La electroforesis es el mtodo de eleccin para determinar losproductos de estos loci polimrficos y caracterizar as una lnea de ratones determinada. Por


Tabla 4.3. Control gentico por marcadores bioqumicos. Alelos de aloenzimas y protenas usados como marcadores bio-qumicos en los controles de la pureza gentica para las lneas consanguneas de ratn y rata. Se muestran slo algunas de las lneasms comunes. Los alelos se designan segn el patrn en el gel de electroforesis como a, b, c, o d. Es1, esterasa 1; Es3, esterasa 3;G6pd1, glucosa 6 fosfato deshidrogenasa 1; Gpi1, glucosa fosfato isomerasa 1; Idh1, isocitrato deshidrogenasa 1; Mod1, malato deshi-drogenasa 1; Pgm1, fosfoglucomutasa 1; Ahd2, aldehido deshidrogenasa 2; Fh1, fumarato hidratasa 1; Gst1, glutation S transferasa 1;Lap1, leucil aril aminopeptidasa 1; Pep 3, peptidasa 3; Svp1, protena de la vescula seminal 1.

medio de esta tcnica obtenemos informacin indirecta, pero precisa, sobre la constitucingentica de los animales, pudiendo detectarse contaminacin con la sola presencia de patro-nes anormales para la lnea. Los principales inconvenientes de estos marcadores son que de-ben llevarse a cabo protocolos especficos para cada isoenzima y que requieren de grandescantidades de tejido (con el consecuente sacrificio de los animales) y de una estricta cadenade fro. A pesar de que esto complica la aplicacin rutinaria de estos marcadores, algunoscriadores comerciales todava los utilizan. Los protocolos precisos para estos controles en elratn se encuentran en el libro de Tatsuji Nomura y colaboradores ICLAS manual for geneticmonitoring of inbred mice (1984) y para la rata en el libro de Hans Hedrich Genetic monitoringof inbred strains of rats (1990).

4.2.3 Marcadores Inmunolgicos

A pesar de contar con un gran nmero de marcadores inmunolgicos (Tabla 4.4), los ant-genos de histocompatibilidad son los ms usados en controles genticos. Estos antgenos, queintervienen en los mecanismos ntimos de la respuesta inmune y estn involucrados en losprocesos de rechazo de injertos, se encuentran distribuidos en cientos de loci independientesen el genoma, abarcando virtualmente todos los cromosomas. Dentro de ellos, los ms des-criptos han sido los pertenecientes al complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), deno-minado complejo H2 en el ratn y complejo RT1 en la rata. Sus productos, los antgenos dehistocompatibilidad de clase I (loci H2-K, H2-D, H2-L) y clase II (loci H2-A, H2-E), son las mo-lculas ms polimrficas que se conocen y sern descriptas en detalle en el Captulo V. Loshaplotipos estndar para cada lnea consangunea de ratn han sido definidos por serologa,conocindose ms de 50 haplotipos diferentes, sin contar mutantes ni ratones salvajes (verTablas 5.1 y 5.2 en el Captulo V). En trminos prcticos, los diferentes haplotipos se analizanpor mtodos serolgicos (test de citotoxicidad o citometra de flujo), para lo cual es indispen-sable contar con los antisueros o los anticuerpos monoclonales adecuados.


Tabla 4.4. Control gentico por marcadores inmunolgicos. Alelos de molculas de superficie de linfocitos usadas comomarcadores inmunolgicos en los controles de la pureza gentica de lneas consanguneas de ratn. Se muestran slo algunas de lascepas ms comunes. Para ms detalle sobre los haplotipos H2 referirse al Captulo V.

El fundamento del test de citotoxicidad es la presencia de toxicidad celular mediada por losanticuerpos especficos en presencia de complemento, medida con la utilizacin de colo-rantes vitales o por la liberacin de cromo radioactivo. Histricamente, el mtodo reco-mendado fue el que utilizaba las placas de microcitotoxicidad de Terasaki con clulas pro-venientes del ganglio linftico. En la actualidad, el citmetro de flujo est reemplazando alas tcnicas de citotoxicidad en el anlisis de antgenos de los complejos H2 y RT1. Trabajacuantificando fluorescencia de los antisueros conjugados con isotiocianato de fluorescena(FITC) u otras sustancias fluorescentes. Su precisin y velocidad de trabajo son ptimos,pero el costo de estos equipos es muy elevado. Tambin se podran realizar trabajos de ti-pificacin de estos genes por medio de la utilizacin de sondas moleculares (RFLPs) o conel uso de un termociclador de PCR e iniciadores especficos (ver Captulo I). Algunos labo-ratorios agregan a la lista de marcadores inmunogenticos a los antgenos de glbulos rojosdel ratn (la serie Ea1 a Ea10) (erythrocyte antigen) y los grupos sanguneos Rt2, Rt3 y Rt8de la rata.

4.2.4 Anlisis del color del pelaje

La herencia del color del pelaje en roedores es sumamente compleja: en los ratones se des-cribieron ms de 60 genes que afectan la pigmentacin del pelo y muchos de ellos interactaentre s dando un vasto nmero de combinaciones. No obstante, para este anlisis se contro-lan solamente cuatro loci:

El locus C (cromosoma 7), denominado histricamente locus albino, es el gen de la tirosinasa(Tyr), enzima que realiza la oxidacin de la tirosina hacia melanina, lo que determina la pre-sencia de pigmentos. El alelo c es una mutacin en el gen de la tirosinasa (Tyrc). El alelo salvajeC (dominante) produce un fenotipo con color, pues permite la expresin de los loci A y B(determinantes del tipo de color). El alelo c (recesivo) reprime la expresin de los loci A y Bdando por resultado un fenotipo albino en los animales homocigotas (Tyrc/Tyrc), debido a laausencia de pigmentos.

El locus D (cromosoma 9), cuyo nombre actual es Myo5a (myosin Va), regula la distribucinde los grnulos de melanina dentro de los melanocitos. El alelo salvaje D (dominante) produ-ce una distribucin regular de pigmentos, no afectando el fenotipo final. Se sabe que el alelo d(recesivo) es una mutacin de este gen (Myo5ad) y que produce una distribucin irregular delos pigmentos dando como resultado un fenotipo con una notable dilucin del color.

El locus A (cromosoma 2) controla la cantidad relativa y la distribucin de los pigmentos ama-rillo (feomelanina) y negro/marrn (eumelanina). Este locus presenta dos alelos que nos inte-resan para los controles genticos (aunque existen alrededor de 25 alelos diferentes reporta-dos en la literatura): A (agouti, alelo salvaje) y a (non agouti, alelo mutado). El locus B (cromo-soma 4), ahora llamado Tyrp1 (tyrosinase related protein), presenta los alelos B (black) y b(brown). Ambos loci (A y B) se ven afectados por la regulacin del locus C, que activa o repri-


me su expresin, y por el locus D que determina la dilucin del color. Estos loci son los res-ponsables de la determinacin del tipo de color (ver Lmina Color) que resulta de las inter-acciones detalladas en la Tabla 4.5.

El anlisis del color consiste en la cruza de prueba de un ratn albino (de la lnea que estamoscontrolando) con otro de color marrn diluido (lnea DBA/2), para desenmascarar el genoti-po oculto por el albinismo (genes hipostticos). La lnea DBA/2 es triple homocigota para losgenes recesivos (a/a; b/b; d/d), lo cual nos permite analizar todas las combinaciones de alelosque se expresen en la F1 y as confrontarlo con el estndar para la lnea (Figura 4.9). Es im-portante tener en cuenta que el fenotipo puede presentar variaciones con la edad, por lo quese aconseja trabajar con animales de entre dos y ocho meses. Este es un mtodo muy econ-mico, fcil de realizar y muy eficiente para detectar cruzas accidentales recientes en una colo-nia de lneas albinas. Un esquema similar podra ser aplicado en ratas albinas usando la lneaconsangunea ABH (a/a; b/b; h/h).

4.2.5 Injertos de piel

Por medio de esta tcnica se pueden evaluar cientos de loci de histocompatibilidad simult-neamente en forma accesible a cualquier laboratorio, pues no requiere ni reactivos ni instru-mental especfico. El protocolo ms recomendable consiste en transplantar recprocamenteun pequeo fragmento de piel de la cola entre dos (o ms) animales y observar, durante nomenos de 60 das, la evolucin del injerto. Tambin puede usarse piel proveniente de las ore-jas o del dorso del animal como fuente del injerto. Por el estado de isogenicidad de las lneas


Tabla 4.5. Control gentico por genes del color. El color del pelaje de las lneas consanguneas de ratn resulta de la combi-nacin de los alelos presentes en los cuatro loci descriptos en el texto. En el caso del albinismo (ratones homocigotas Tyrc/Tyrc), noimportando cuales sean los alelos presentes en los otros tres loci, la ausencia de pigmentos har que los ratones sean blancos y con

consanguneas, es lgico esperar la aceptacin de los injertos entre individuos de una mismalnea, caso contrario, la presencia de un rechazo puede atribuirse a una contaminacin genti-ca, o bien a fallas en la tcnica quirrgica (5-10% de los casos). Si existen dudas acerca del re-chazo o aceptacin de un injerto, es necesario repetir la prueba sobre el mismo animal: si eraun caso real de incompatibilidad, el segundo injerto ser rechazado ms rpidamente y deuna forma ms evidente. Esta tcnica se encuentra actualmente en desuso por ser poco con-fiable y por el largo tiempo que lleva su lectura. Los libros de Festing (1979) y Hedrich (1990)contienen protocolos detallados de esta tcnica.

4.2.6 Caracteres morfolgicos (Osteometra)

Muchas caractersticas seas cumplen los requisitos para ser utilizadas en un control genti-co. Uno de los controles utilizados en el ratn fue el test de mandbula, ya que permite de-tectar desviaciones en muchos loci simultneamente. Podemos dividir al test en tres pasosprincipales. El primero consiste en la extraccin de la hemi-mandbula derecha a una mues-tra de animales del mismo sexo y aproximadamente del mismo peso. Luego se toman 11 (aveces 13) medidas pertenecientes a puntos anatmicos de referencia en dichas mandbulas,utilizando para ello un pequeo tablero cuadriculado y una lupa. El ltimo paso es el proce-samiento estadstico de los datos para poder compararlos con valores de referencia y deter-minar si existen o no diferencias significativas que denoten desviaciones genticas en lamuestra. Esta tcnica se encuentra tambin en desuso por ser poco precisa y por lo subjeti-vo de su lectura.


Figura 4.9. Anlisis del color del pelaje. Cruzando ratones DBA/2 (color marrn diludo) con ratones albinos podemos desen-mascarar los genes ocultos en estos ltimos simplemente observando el color de las cras F1. En el caso de la cepa AKR, el color delhbrido F1 ser negro y en el caso de BALB/c, el hbrido F1 tendr un color canela. Este simple estudio nos permite descubrir cruzasaccidentales (particularmente las ms recientes) en cepas albinas sin utilizar protocolos de biologa molecular y con un costo mnimo.

4.2.7 Caracteres reproductivos

Como hemos visto en el Captulo II, el nmero de cras por camada es una caracterstica pro-pia de cada lnea (ver Tabla 2.1). Su promedio es utilizado frecuentemente como un primerindicador de la pureza gentica de la lnea. Un importante factor de alerta de contaminacingentica en la colonia ser la deteccin de camadas que difieran ampliamente del promediocalculado para la lnea. En este caso es aconsejable realizar otros controles ms precisos paraconfirmar dicha sospecha.

4.2.8 Marcadores de ADN

Todos los marcadores que hemos descripto, para ser utilizados en controles genticos, sonrasgos fenotpicos que nos dan informacin indirecta del genoma de los animales. Por el con-trario, los mtodos de tipificacin de ADN analizan directamente rasgos genotpicos. Los msutilizados en los controles de calidad gentica de lneas consanguneas son el fingerprinting deADN y el anlisis de microsatlites por PCR.

4.2.8.1 Fingerprinting de ADN

El fingerprinting de ADN (o huella digital del ADN) es el patrn nico e individual debandas obtenido de la hibridacin, por la tcnica de Southern blot, con sondas para regionesextremadamente polimrficas del ADN (secuencias minisatlites). Estas regiones hipervaria-bles del ADN contienen secuencias cortas (entre 4 y 40 pb), repetidas en tandem, con un ta-mao final para la secuencia de 5 a 10 kb. Estos minisatlites se encuentran esparcidos a lolargo del genoma de los vertebrados y muchos comparten entre s una secuencia corta llama-da core, formando as grupos de minisatlites con un core comn. Cuando el ADN es digeri-do por enzimas de restriccin y sus fragmentos posteriormente separados en un gel de aga-rosa e hibridados con sondas especficas para la secuencia core, se obtiene un patrn de ban-das extremadamente variable entre individuos (excepto para los gemelos monocigticos). Lalongitud de cada banda est dada por el nmero de repeticiones en tandem que posea el in-dividuo en ese fragmento. Como este nmero es muy variable, el patrn de bandas es alta-mente especfico para cada individuo, siendo adems estable en todas las clulas, somticas ygerminales, y heredado en forma mendeliana. Por lo tanto, el patrn de bandas obtenido deanimales consanguneos ser nico e individual para la lnea, dado su estado de isogenicidad(ver Figura 6.8 en el Captulo VI). Es por ello que el fingerprinting de ADN ha sido utilizadoen los controles de la calidad gentica en la rata y el ratn, aunque su aplicacin nunca fuemuy extendida. Las grandes desventajas de esta tcnica son que deben usarse protocolos deSouthern blot y que requiere (relativamente) grandes cantidades de ADN (5 a 10 microgra-mos). A pesar de esto, algunos criadores comerciales utilizan el fingerprinting de ADN comoun control complementario de la pureza gentica.


4.2.8.2 Anlisis de microsatlites por PCR

Se conoce como microsatlites o SSLP (simple sequence length polymorphisms) a las secuenciasde ADN repetitivo conteniendo un motivo de repeticin de 1 a 6 nucletidos. El nmero derepeticiones comprende un rango de entre 15 y 40, lo que facilita la posibilidad de amplifica-cin de estos pequeos segmentos por medio de la tcnica de PCR (ver Captulo I). Su pre-sencia es ms frecuente que la de los de minisatlites calculndose que su nmero podra su-perar los 200.000 por genoma, dando un promedio de un locus cada 30 kb. Aproximadamen-te el 50 % de los microsatlites descriptos hasta el momento en el ratn muestra polimorfismoentre las distintas lneas consanguneas clsicas, aunque ese porcentaje se eleva al 77% entre lalnea C57BL/6 y M. m. castaneus, y al 90% si se trata de M. spretus. Muchas de estas variacio-nes, en el rango de 2 a 40 bp, son detectables por la observacin de los productos de PCR engeles de agarosa o poliacrilamida. En un estudio que abarc 61 lneas consanguneas de rata yla utilizacin de 37 microsatlites, se pudo obtener un perfil nico para cada lnea, incluyendolneas muy relacionadas como BN/M y BN/Cub-1x, o SHR/OlaHsd y SHRSP/Riv. Algunos de


Tabla 4.6. Control gentico por marcadores microsatlites. Seleccin de 15 marcadores microsatlites (SSLPs) abarcando13 cromosomas del genoma del ratn. Esta lista es slo un ejemplo de un grupo de microsatlites polimrficos entre las lneas AKR,BALB/c, C57BL/6, C3H y DBA/2. Como se puede ver, se trata de elegir aquellos loci que tengan productos de PCR cuyos tamaos sepuedan diferenciar en geles de agarosa. Los valores representan los alelos de microsatlite en pares de base. La nomenclatura de losmicrosatlites es: D [nmero del cromosoma] [cdigo del laboratorio] [nmero del marcador]. Por ejemplo, D18Mit202 es el micro-satlite asignado con el nmero 202 en el cromosoma 18, identificado en el Massachusetts Institute of Technology (MIT).

estos marcadores microsatlite mostraron hasta 14 alelos diferentes en el mencionado estudio.Comparaciones entre lneas de rata de laboratorio (consanguneas) y ratas capturadas en la na-turaleza (todas pertenecientes a la especie Rattus norvegicus) mostraron que alrededor de 80%de los microsatlites estudiados (de 58 analizados) fueron polimrficos.

En particular, el uso de los microsatlites en controles de calidad gentica presenta varias ven-tajas sobre las dems tcnicas: (i) por ser tan polimrficos resulta ms fcil la seleccin de unjuego de microsatlites para controlar un grupo de lneas (Tabla 4.6), (ii) su gran abundancia(hay ms de 8.000 disponibles para el ratn y la rata) y (iii) todos los microsatlites puedenser analizados con el mismo protocolo y a partir de cantidades nfimas de ADN (50 nanogra-mos) provenientes, por ejemplo, de unos pocos microlitros de sangre o de una punta decola. Normalmente, se debe identificar previamente un grupo de loci (entre 8 y 10 SSLP) quenos permita diferenciar un grupo de lneas consanguneas de inters y cuyos alelos puedan serresueltos en geles de agarosa al 4%. En los ltimos aos esta tcnica ha sido adoptada por lamayora de los animalarios (bioterios) y grandes criadores comerciales de ratas y ratonescomo un control gentico rpido, eficaz y econmico (Figura 4.10). Para ms detalles sobrelos marcadores microsatlites ver el Captulo VI.


Figura 4.10. Control gentico por PCR-microsatlites. Las fotografas muestran un caso de contaminacin gentica detecta-do en una colonia de ratones SJL. El control de la pureza gentica se realiz por medio de 6 microsatlites (amplificados por PCR)elegidos por ser polimrficos entre SJL y BALB/c, la otra lnea albina mantenida en las instalaciones. Se observan varios loci heteroci-gotas y otros homocigotas de origen BALB/c (alelo fijado), lo que evidencia una cruza accidental entre estas dos lneas consanguneas.1 y 2, muestras de ADN analizadas, S, control SJL; C, control BALB/c. A la derecha de las fotografas se indican los tamaos estndarde los alelos para SJL y BALB/c (en pares de bases). Tomado de Benavides F. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science 38: 54-55, 1999.

4.2.8.3 Otras tcnicas moleculares

En esencia, cualquier metodologa que nos permita discriminar entre lneas consanguneaspuede ser empleada para un control gentico. Aquellos laboratorios que realizan tcnicas dePCR en forma rutinaria podrn incorporar otras variantes del control gentico, ms all delanlisis de marcadores microsatlites. Entre esas posibilidades se encuentran las tcnicasRAPDs (random amplified polymorfic DNA), LINE repeat sequence-PCR, Inter-SSR PCR, anlisisde SNPs, entre otras (ver Captulo VI).

Bibliografa General


BAILEY DW AND USAMA. A rapid method of grafting skin ontails of mice. Plast. Reconstr. Transplantation Bulletin25: 424-425, 1960.

BAILEY DW. Recombinant inbred strains, an aid to findingidentity, linkage, and function of histocompatibility andother genes. Transplantation 11: 325-327, 1971.

BECK JA, LLOYD S, HAFEZPARAST M, LENNON-PIERCE M, EPPIGJT, FESTING MF, FISHER EM. Genealogies of mouse inbredstrains. Nature Genetics 24: 23-25, 2000.

BENAVIDES F, PEREIRA C. Evaluacin de la calidad gentica enratones utilizados en investigaciones biomdicas. RevistaArgentina de Microbiologa 25: 100-109, 1993.

BENAVIDES F, CAZALLA D, PEREIRA C. Evidence of genetic het-erogeneity in a BALB/c mouse colony as determined byDNA fingerprinting. Laboratory Animals 32: 80-85,1998.

BENAVIDES F. Genetic Contamination in a SJL mouse colony:fast diagnostic by PCR-microsatellites markers. Contem-porary Topics in Laboratory Animal Science 38: 54-55,1999.

BENAVIDES F, GLASSCOCK E, COGHLAN LG, STERN MC, WEISSDA, CONTI CJ. PCR-based microsatellite analysis for dif-ferentiation and genetic monitoring of nine inbred SEN-CAR mouse strains. Laboratory Animals 35: 157-162,2001.

BENAVIDES F, ZAMISCH M, FLORES M, CAMPBELL MR, ANDREWSE, ANGEL JM, LICCHESI J, STERNIK G, RICHIE ER, CONTI CJ.Application of inter-simple sequence repeat PCR tomouse models: assessment of genetic alterations in car-cinogenesis. Genes Chromosomes and Cancer 35:299-310, 2002.

COMMITTEE ON RAT NOMENCLATURE, INSTITUTE OF LABORATO-RY ANIMAL RESOURCES COMMISSION ON LIFE SCIENCES, NA-TIONAL RESEARCH COUNCIL. Definition, Nomenclature, andConservation of Rat Strains. ILAR News 34 (4): S3-S26,1992

DAVISSON MT. Rules and guidelines for genetic nomencla-ture in mice. Mouse Genome 92 vii-xxxii, 1994.

DAVISSON MT. Rules for nomenclature of inbred strains, pp.1532-1536. In: Genetic Variants and Strains of theLaboratory Mouse, Lyon, M.F., Rastan, S., and Brown,S.D.M. (Eds.), Third Edition, Volume 2, Oxford Univer-sity Press, Oxford, 1996.

DEMANT P, HART AAM. Recombinant congenic strains anew tool for analyzing genetic traits determined by morethan one gene. Immunogenetics 24: 416-422, 1986.

DIETRICH WF, MILLER J, STEEN R, MERCHANT MA, DAMRON-BOLES D, HUSAIN Z, DREDGE R, DALY MJ, INGALLS KA,OCONNOR TJ, et al. A comprehensive genetic map ofthe mouse genome. Nature 380: 149-152, 1996.

FESTING MF. Inbred strains in biomedical research. MacmillanPress, London: Oxford University Press, New York,1979.

FESTING MF. Genetic contamination of laboratory animalcolonies: An increasingly serious problem. ILAR News 25:6-10, 1982.

FESTING MF. Introduction to genetic monitoring. ScandinavianJournal of Laboratory Animals Science 17: 119-125,1990.

FESTING MF. International Index of Laboratory Animals, 6thedition, 1993.

FESTING MF. Origins and characteristics of inbred strains ofmice, 11th listing. Mouse Genome 91: 393-550, 1993.

FESTING MF. Experimental approaches to the determination ofgenetic variability. Toxicology Letters 120: 293-300, 2001.

FOSTER HL, SMALL JD AND FOX JG (Eds). The Mouse in Bio-medical Research, Vol. I. Academic Press, New York,1981.

FOX RR, WITHAM BA (Eds.). Handbook on Genetically Stan-dardized Jax Mice. 5th ed. Bar Harbor: The JacksonLaboratory, 1997.

GROEN A. Identification and genetic monitoring of mouse in-bred strains using biochemical polymorphisms. Laborato-ry Animals 11: 209-214, 1977.

GUNET J-L, MONTAGUTELLI X. Genetic monitoring of inbredstrains: principles and practice. Fifth Symposium of theFederation of European Laboratory Animal Science Asso-ciations. Royal Society of Medicine Press, London,1994.

GUNET JL, BONHOMME F. Wild mice: an ever-increasing con-tribution to a popular mammalian model. Trends in Ge-netics 19: 24-31, 2003.

HEDRICH H. Genetic monitoring of inbred strains of rats.Stuttgart, New York. Gustav Fischer Verlag, 1990.

IAKOUBOVA OA, OLSSON CL, DAINS KM, ROSS DA, ANDALI-BI A, LAU K, CHOI J, KALCHEVA I, CUNANAN M, LOUIE J, NI-MON V, MACHRUS M, BENTLEY LG, BEAUHEIM C, SILVEY S,CAVALCOLI J, LUSIS AJ, WEST DB. Genome-tagged mice(GTM): two sets of genome-wide congenic strains. Ge-nomics 74: 89-104, 2001.

INTERNATIONAL COMMITTEE OF THE INSTITUTE FOR LABORATORYANIMAL RESEARCH, NATIONAL RESEARCH COUNCIL. Micro-bial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Pro-ceedings of the 1999 US/Japan Conference. NationalAcademy Press, Washington, D.C., 2000.

JACKSON I AND ABBOTT C (Eds.). Mouse Genetics and Trans-genics. A Practical Approach. Oxford University Press,New York, 2000.

JEFFREYS A, WILSON V, KELLY R, TAYLOR B, GRAHAME B.Mouse DNA fingerprints: analysis of chromosome local-ization and germ-line stability of hypervariable loci in re-combinant inbred strains. Nucleic Acids Research 15:2823-2837, 1987.

JULIER C, GOUYON B DE, GEORGES M, GUNET J, NAKAMURAY, AVNER P, LATHROP M. Minisatellite linkage maps in themouse by cross-hybridization with human probes contain-ing tandem repeats. Proceedings of the National Acad-emy of Science of USA 87: 4585-4589, 1990.

KAHAN B, AUERBACH R, ALTER B, BACH FH. Histocompatibili-ty and isoenzyme differences in commercially suppliedBALB/c mice. Science 217: 379-381, 1982.

KLTING I, VOIGT B, KOVACS P. Comparison of genetic vari-ability at microsatellite loci in wild rats and inbred ratstrains (Rattus norvegicus). Mammalian Genome 8: 589-591, 1997.

KURTZ T, MONTANO M, CHAN L, KABRA P. Molecular evi-dence of genetic heterogeneity in Wistar-Kyoto rats: Impli-cations for research with Spontaneously Hypertensive Rat.Hypertension 13: 188-192, 1989.

LOVE J, KNIGHT A, MC ALEER M, TODD J. Towards construc-tion of a high resolution map of the mouse genome usingPCR-analyzed microsatellites. Nucleic Acids Research18: 4123-4130, 1990.

LYON M, RASTAN S AND BROWN S (Eds.). Genetic Variantsand Strains of the Laboratory Mouse. Oxford UniversityPress, New York, 1996.

MARKEL P, SHU P, EBELING C, CARLSON GA, NAGLE DL,SMUTKO JS, MOORE KJ. Theoretical and empirical issues formarker-assisted breeding of congenic mouse strains. Na-ture Genetics 17: 280-284, 1997.

MONTAGUTELLI X., GUNET J-L. Genetic monitoring of inbredstrains by analysis of microsatellite polymorphisms. FifthSymposium of the Federation of European LaboratoryAnimal Science Associations. Royal Society of Medi-cine Press, London, 1994.

MORSE III, H. Origins of Inbred Mice. Academic Press, NewYork, 1978.

NOMURA T, ESAKI K AND TOMITA T (Eds.). ICLAS manual forgenetic monitoring of inbred mice. University of TokyoPress, Tokyo, 1984.

OTSEN M, DEN BIEMAN M, WINER ES, JACOB HJ, SZPIRER J,SZPIRER C, BENDER K, VAN ZUTPHJEN LF. Use of simple se-quence length polymorphisms for genetic characterizationof rat inbred strains. Mammalian Genome 6: 595-601,1995.

PAIGEN K, EPPIG JT. A mouse phenome project. MammalianGenome 11: 715-717, 2000.

PENNLINE KJ, SMITH JP, BITTER-SUERMANN H. My kingdom foran inbred rat. Transplantation 34: 70, 1982.

POILEY SM. A systematic method of breeder rotation for non-inbred laboratory animals colonies. Proceedings of theAnimal Care Panel 10: 159-166, 1960.

POTTER M. History of the BALB/c family. Current Topics inMicrobiology and Immunology 122: 1-5, 1985.


REINHARD C, EDER G, FUCHS H, ZIESENIS A, HEYDER J, SCHULZH. Inbred strain variation in lung function. MammalianGenome 13: 429-437, 2002.

RICE MC, OBRIEN SJ. Genetic variance of laboratory outbredSwiss mice. Nature 283: 157-161, 1980.

SANTOS J, MONTAGUTELLI X, ACEVEDO A, LOPEZ P, VAQUEROC, FERNANDEZ M, ARNAU MR, SZATANIK M, SALIDO E,GUNET JL, FERNANDEZ-PIQUERAS J. A new locus for resist-ance to gamma-radiation-induced thymic lymphomaidentified using inter-specific consomic and inter-specificrecombinant congenic strains of mice. Oncogene 21:6680-6683, 2002.

SILVER L. M. (ed.) Mouse Genetics. Concepts and applica-tions. Oxford University Press, Oxford, 1995. (Versinonline disponible en http://www.informatics.jax.org/sil-ver/)

SILVERS W. The Coat Colors of Mouse. Springer-Verlag,New York, 1979.

SIMPSON EM, LINDER CC, SARGENT EE, DAVISSON MT, MO-BRAATEN LE, SHARP JJ. Genetic variation among 129 sub-strains and its importance for targeted mutagenesis inmice. Nature Genetics 16: 19-27, 1997.

VOIGT B, BERG S, KOVACS P, VOGT L, KLOTING I. Congenicspontaneously diabetic hypertensive BB.SHR rats. Trans-plant Proceedings 29: 1677-1678, 1997.

WELSH J, PETERSEN C, MCCLELLAND M. Polymorphisms gen-erated by arbitrary primed PCR in the mouse: applicationto strain identification and genetic mapping. NucleicAcids Research 19: 303-306, 1991.

WOOD PA, HAMM DA, CARTNER SC, LINDSEY JR. Simplesequence length polymorphism analysis of mice forgenetic monitoring. Contemporary Topics in Labora-tory Animal Science 35: 60-62, 1996.


Documents

04 Genetica Pba 2