0 1 Tabella 19.1 Esempi di enzimi di restrizione con indicazioni relative allorganismo di origine e alla sequenza di riconoscimento (la linea nera indica

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Tabella 19.1Esempi di enzimi di restrizione con indicazioni relative all’organismo di originee alla sequenza di riconoscimento (la linea nera indica l’assedi simmetria binaria mentre le frecce contraddistinguono i siti di taglio).

19.1 TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

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Figura 19.1Meccanismo di azione di EcoRI (endonucleasi sticky end) (A)e Smal (enzima blunt end) (B).

A

B


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Figura 19.2Produzione di molecole di DNA ricombinante.


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Figura 19.3Mappa di un plasmide modello usato come vettore di clonaggio composto di:sequenza di origine della replicazione (ori), gene per la resistenzaall’ampicillina (ampR), gene per la β-galattosidasi (lacZ+) e regionecon siti unici di restrizione (polylinker).

19.2 VETTORI DI CLONAGGIO

PLASMIDI

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Figura 19.4Saggio colorimetrico per il riconoscimento delle colonie battericheottenute da cellule contenenti il plasmide con l’inserto di DNA esogeno.

PLASMIDI


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Figura 19.5Mappa di un plasmide usato per trascrivere RNAe per clonare DNA dei prodotti di PCR.

PLASMIDI


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Figura 19.6Vettore di clonaggio derivatodal batteriofago λ.

VETTORI DERIVATI DAI BATTERIOFAGI E COSMIDI


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Figura 19.7Clonaggio di DNA esogenoin vettori di inserzionee di sostituzione.



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Figura 19.8Vettore di clonaggio cosmidico.



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Figura 19.9Vettore di clonaggio YAC circolarizzato unendo i telomeri con una regionedi riempimento e linearizzato dopo restrizione con BamHIal fine di rimuovere la regione di riempimento: i siti unici di restrizionedel polylinker possono essere impiegati per inserire frammenti di DNA esogeno.

CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO (YAC) E DI BATTERI (BAC)


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Figura 19.10Colonie di lievito contenenti vettori di clonaggio ricombinanti(bianche) e senza inserto di DNA esogeno (rosse).



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Figura 19.11Organizzazionedi un vettore BAC.



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Figura 19.12Costruzionedi una libreria genomica.

19.3 GENOTECHE: LIBRERIE DI DNA GENOMICO (gDNA)

E DI DNA COMPLEMENTARE (cDNA)

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Figura 19.13Digestione totale e parzialedi DNA genomico.



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Figura 19.14Sintesi di DNA complementare(cDNA) a doppia elica.



17Figura 19.15Clonaggio di cDNA in vettori plasmidici (A) e vettori derivati dal batteriofago λ (B).



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Figura 19.16Screeningdi una libreria plasmidica.

19.4 IDENTIFICAZIONE DI GENI NELLE LIBRERIE GENETICHE

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Figura 19.17(A) Rappresentazioneschematica di una membrana BAC.(B) Elenco ordinato delle piastre contenute in ogni campo.


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Figura 19.18Film autoradiografico ottenutoibridando una membrana diuna libreria BAC con una sonda RFLP (le frecce indicano i possibili cloni BAC contenenti l’allele marcatore).


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Tabella 19.2Copertura genomica di librerie BAC di A. thalianae di alcune delle principali specie di interesse agrario.

GENOME COVERAGE DI UNA LIBRERIA


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Tabella 19.3Numero (N) teorico di cloni richiesti per avere una probabilità pari al 99%che un determinato clone sia rappresentato nella libreri considerando insertidi 40 kb (cosmidi), 150 kb (BAC) e 500 kb (YAC) di lunghezzae con riferimento a diverse specie di interesse agrario.

GENOME COVERAGE DI UNA LIBRERIA


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Figura 19.19Screening di una libreriafagica per la ricercadi uno specifico clone.


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Figura 19.20Risultato di una analisiautoradiografica di un filtro ibridato con uno specifico anticorpo marcato per l’identificazione di colonie di una libreria esprimenti una determinata proteina.


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Figura 19.21Metodo di sequenziamentoa terminazione di catena ideato da Sanger, chiamato anche metodo dideossi.

19.5 SEQUENZIAMENTO DEI GENI

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Figura 19.22Diversi tipi approccio per il sequenziamento con primer universali(disegnati sulle braccia del vettore) e primer interni (disegnati sull’inserto clonato nel vettore).


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Figura 19.23Lastra autoradiografica di una sequenza nucleotidica ottenuta con sistema manuale seguendo il metodo dideossi.


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Figura 19.24Sequenziamento automatico.


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Figura 19.25Sequenziamento dei cromosomiin ordine gerarchico (A)e col metodo shotgun (B).

19.5 SEQUENZIAMENTO DEI GENOMI

A

B

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Figura 19.26Confronto tra vettori virali e plasmidici riguardo alle loro modalità di espressione.

19.6 PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM):

METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICAMETODI DI TRASFERIMENTO GENICOMEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERI

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Figura 19.27Elementi costitutivi essenzialidi un genoma virale e vettore modelloper l’espressione transientedi un gene esogeno in pianta.

METODI DI TRASFERIMENTO GENICOMEDIATO DA VIRUS E AGROBATTERI


METODI DI TRASFORMAZIONE GENETICA

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Figura 19.28Dischi fogliari con accentuata emissionedi radici avventizie (hairy roots)in seguito ad infezione con A. rhizogenes.




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Figura 19.29Rappresentazione schematicadi un plasmide Ticon i principali elementi costitutivi.




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Tabella 19.4Elenco di sistemi di geni marcatori selezionabilie di geni reporterusati per la trasformazione geneticadelle piante.




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Figura 19.30Vettore di clonaggio derivantedalla ricombinazione omologadi un vettore cointegratocon uno intermedio.




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Figura 19.31Rappresentazione schematicadi un vettore binarioe di un plasmide helper in agrobatterio.




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Figura 19.32Metodo di trasformazione geneticamediato dal plasmide Ti di Agrobacterium tumefaciens; metodo biolisticodi trasformazione genetica basatasull’impiego del particle gun(Adattato da: C.S. Gasser e R.T. Fraley (1992) Transgenic Crops, Scientific American Inc.).

METODI CHIMICO-FISICI DI TRASFERIMENTO GENICO



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Figura 19.33Vettori plasmidici impiegati per la trasformazionedel genoma di cloroplasto: vettore contenente siail gene esogeno che il gene marcatore selezionabile (A); vettori distinti contenenti il gene esogenooppure il gene marcatore selezionabile (B).In entrambi i casi le sequenze geniche sono fiancheggiate da una regione di DNA del cloroplasto.

INTEGRAZIONE ED ESPRESSIONE DEI TRANSGENI



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Figura 19.34Proteina fluorescente verdeo GFP (green fluorescent protein):modello tridimensionale della proteina (A) e localizzazione subcellulare della proteina (B).


A

B



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Figura 19.35Sezione di tessuto fogliarecon cellule competenti,non competentie potenzialmente competenti alla rigenerazione e/oalla trasformazione.




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Figura 19.36Segregazione 3:1 di un ipotetico marcatore PCR-derivato osservatanella discendenza T1 ottenuta autofecondando una pianta T0 aventeuna singola copia del transgene.




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Figura 19.37Biosintesi delle antocianine(Fonte: B.R. Glick e J.J.Pasternak (1988) Molecular biotechnology.Principles and applicationsof recombinant DNA.American Society for Microbiology).




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Figura 19.38Schema semplificato del processo di infezioneda parte di Agrobacterium tumefaciens e di integrazione del T-DNA nel cromosoma della pianta ospite.Immagine al microscopio elettronico di agrobatterie particolare di tumore del colletto (crown gall) nella vite.




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Figura 19.39Statistiche relativealle piante geneticamente modificate.

DIFFUSIONE E CLASSIFICAZIONE DELLE PIANTE TRANSGENICHE



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Tabella 19.5Lista delle principaliPGM di I generazione autorizzateall’immissionesul mercato neiPaesi extra UE.




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Tabella 19.6Lista delle principali PGM di II generazioneoggetto di sperimentazione in pieno campo.




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Figura 19.40(A) Percorso biosintetico semplificato degli amminoacidi derivanti dall’acido aspartico(la retroinibizione o inibizione a feedback è evidenziata in rosso); (B) vettore plasmidico usato per la trasformazione di soia e colza allo scopo di modificare il tenore di lisina nei semi (Pv5’ e Pv3’: promotore e terminatore del gene della β-faseolina di fagiolo; cts:regione codificante il peptide di transito del cloroplasto; dapA: gene di Corynebacterium codificante una acidodiidropicolinico-sintasi (DHDPS) insensibile alla lisina; lysCM4: membro mutante di un gene di E. coli codificante una aspartato-chinasi (AK) insensibile alla lisina.

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEMiglioramento delle caratteristiche nutrizionali



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Figura 19.41Produzione di β-carotenenel riso transgenico.




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Figura 19.42Chicchi di “riso dorato”,Golden rice.




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Tabella 19.7Alcuni esempi di erbicidi con diversa modalità di azionee di enzimi codificati da geni clonati per lo più nei procariotied impiegati per produrre piante transgeniche resistenti agli erbicidi.

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEResistenze agli erbicidi



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Figura 19.43Mappa del T-DNAdi un costrutto chimerico.

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHE



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Figura 19.44Batteri di Bacillusthuringiensis (A)ed esempi di piantetransgeniche resistenti agli insetti: danni da piralide in spighe e culmi di mais (B, C): varietà di mais Bt (D); foglie di una varietà di soia Bt e di una normale (E,F); capsule di una varietà di cotone Bt e di una normale (G,H).

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEResistenze a stress biotici (patogeni)



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Figura 19.45Mortalità delle larvedel coleottero Callosobruchus maculatussulle piante di pisello transgenico inrelazione alla quantitàdi inibitoredell’α-amilasi.




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Figura 19.46(A) Strategia antisenso: la trasformazione di piante con geni aventi un orientamento inverso rispetto alle regioni di regolazione determina il blocco della espressione del corrispondente gene endogeno.(B) Pomodori transgenici e prodotto commerciale americano a base di pomodori transgenici.


B

A



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Figura 19.47Ruolo degli essudati radicali (ER)nei suoli acidi e in quelli alcalini.

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHETolleranza a stress abiotici (ambientali)



56Figura 19.48Melanzana partenocarpica (foto: A. Spena).

APPLICAZIONI DELLE VARIETÀ TRANSGENICHEControllo dello sviluppo e del sistema riproduttivo



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Figura 19.49Tecnologia gene terminator.




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Figura 19.50Fiore wild-type (A) e del mutante partenocarpico di pomodoropat-2 (B, notare l’accrescimento precoce dell’ovario),Bacche wild-type (C)e del mutante pat-2 (D, notare l’assenza di seme)(foto: P. Mosconi).




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Tabella 19.8Esempi di partenocarpia naturale, artificiale e biotecnologia scopertao ottenuta in diverse specie di interesse agrario.




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Figura 19.51RNA interference:meccanismo di azione.

19.7 TRASFORMAZIONE GENETICA COME STRUMENTO

PER LO STUDIO DELLA FUNZIONE GENICA:RNA INTERFERENCE (RNAi) E

SILENZIAMENTO GENICO POST-TRASCRIZIONALE

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Figura 19.52Struttura della molecoladi un anticorpo.

19.8 PRODUZIONE DI BIOFARMACI, ANTICORPI E VACCINI

MEDIANTE PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE

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Tabella 19.9Espressione di anticorpi in piante transgeniche.

PRODUZIONE DI ANTICORPI (IMMUNOGLOBULINE) NELLE PIANTE



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Figura 19.53Costi per grammodi immunoglobulina Aprodotta con diversisistemi di espressione.

PRODUZIONE DI ANTICORPI (IMMUNOGLOBULINE) NELLE PIANTE



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Tabella 19.10Piante transgeniche che producono proteinepotenzialmente utilizzabili come vaccini.

PRODUZIONE DI VACCINI (PROTEINE IMMUNOGENE)EDULI NELLE PIANTE



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Tabella 19.11Produzionedi compostibiofarmaceuticicon piantetransgenicheper la terapiamedica nell’uomo.

PRODUZIONE DI PRODOTTI BIOFARMACEUTICIE DI PROTEINE UMANE NELLE PIANTE



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Figura 19.54Rappresentazione schematica della GAD65 umana:sono evidenziati il segnale di ancoraggio alle membrane,il sito cataliticoe gli epitopi immunoreattivi della proteina.




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Figura 19.55Immagine al microscopio elettronico del tessuto fogliaredi piante transgeniche di tabacco che evidenzia la localizzazione subcellulare della hGAD65 a livello di cloroplasti e mitocondri.La immuno-marcatura in situ è stata condottautilizzando anticorpi specifici per la hGAD65.




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Figura 19.56Localizzazione sub-cellulare della GAD67/65: la fotografia,ottenuta tramite microscopia elettronica del tessuto fogliaredi piante transgeniche di tabacco dopo immuno-marcatura conanticorpi specifici per la GAD67/65, mostra segnali a livello citosolico.




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0 1 Tabella 19.1 Esempi di enzimi di restrizione con indicazioni relative allorganismo di origine e alla sequenza di riconoscimento (la linea nera indica