· Web viewKlebsiella culture Methyl-Red Indicator يضاف 3-4 قطرات من Methyl-Red Indicator الى الانابيب الحاويه على وسط MR-VP broth والملقحه

كلية العلوم للبنات – المرحله الرابعه2008/2009

Enterobacteraiceae

البكترياالمرضيه

المختبر الرابع البكتريا المعويه

Enterobacteraiceaeالمقدمة

تضم عائلة المعويات اجناس متعددة يصعب التمييز بينها تحت المجهر .عصيات سالبة بصبغة غرام ،

متحركة او غير متحركة ، التكون سبورات تبلغ 0.7 – 0.5 مايكرون طوال 5-3حجومها من

مايكرون عرضها ، جميعها مخمرة لسكر الكلوكوز ، سالبة الختبار االوكسيديز مع بعض الشواذ موجبة

الى نتريت NO3الختبار الكاتاليز ، وتختزل النترات NO2 .الموطن الطبيعي لها االمعاء الدقيقة لالنسان

تشكل E. coliوالحيوان حتى ان قسما منها مثل البكتريا الطبيعية لالمعاء في حين ان انواعاً اخرى

تعتبر مرضية خطرة Shigella وال Salmonella مثل اللالنسان .

اهم االجناس التي تضمها Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter,

Serratia, Salmonella, Proteus, Shigella, Yersinia, Providencia, Hafnia, Morganella, Pseudomonas,

Acinetobacter, Alcaligenesالعينات

تؤخذ العينات في الحاالت المرضية من االدرار ، الخروج ، او في المياهفي حاالت االنواع الحرة المعيشة .

اهم الفحوصات التفريقيه

فحص تحلل التربتوفانTryptophan Hydrolysis ( Indole )

.Eبعض االنiiواع البكتيريiiه مثiiل coli

تملك القابليiiه على شiiطر الحiiامض1


Enterobacteraiceae


وIndoleاالميني التربتوفان الى مكونين همiiا االنiiدول واالنزيم المسؤول عنPyruvic acidالحامض البايروفي

.Tryptophanaseعمليiiه التحلiiل هiiذه هiiو التربتوفiiاينيز يمكن تشiiخيص االنiiدول بسiiهوله بواسiiطة كاشiiف

. هذا الفحص مفيiiد جiiدا فيKovacs’ reagentكوفاكس .Eتشخيص بكتريا coliهiiه المعويiiواع البكتيريiiعن االن

Peptoneالقريبه منهiiا. يسiiتخدم مiiاء الببتiiون Waterاو Tryptone broth (1%)ذا الفحصiiفي ه

الحتوائهمiiiا على كميiiiه كبiiiيره منTryptophanالببتون يشتق من كازائين .

مهضوم بواسطة عصارة البنكرياس.المواد

Kovacs’ reagentTryptone broth or Peptone water E. coli culture

بعiiد تلقيح الوسiiط بالبكتريiiا يحضiiن م ،37 سiiiiاعه بدرجiiiiة 24لمiiiiدة

لغرض فحص االندول يضاف للبروث ’Kovacs قطiiره من كاشiiف كوفiiاكس 12-10الملقح

reagentا منiiه العليiiراء على الطبقiiه حمiiتكوين حلق . االنبوبه دليل على الفحص االيجابي لالندول.

-Mixed Acid ( Methyl تخمر السكريات المختلطه Red ) Fermentation

العديد من البكتريا المعويه )سالبة الكرام خصوصا(، يمكن تفريقهiiا عن بعضiiها بواسiiطة النiiاتج النهiiائي لعملية االيض الخاصه بهiiا عنiiدما تسiiتهلك الكلوكiiوز

-Methyl Red and Voges-Proskauer (MR)تخمره( على وسط VP) لiiبعض االنواع البكتيريه مث .Escherichia, Salmonella,

2


Enterobacteraiceae


Proteus و Aeromonas تخمر الكلوكوز لتنتج كميات كبيره Lacticمن حامض الالكتiiك Acidنيتiiامض السكسiiح ،

Succinic Acid كiامض الفورميiو ح Formic Acidافهiباالض ، CO2الى H2 انولiiو االيث Ethanolواتجiiذه النiiع هiiتجم .

iؤدي الى خفض الiiتpH(iادون الiiط الى مii5 للوس). اذا مiiا اضiiيف المثيiiل االحمiiر الى هكiiذا وسiiط )ذو حامضيه مرتفعه( سيتكون لiiون احمiر )لiون الiدليل المثيلي(، فنستنتج بان الكائن المجهiiري النiiامي في

Mixedالوسiiط هiiو مخمiiر لحiiوامض مختلطiiه ) Acid Fermenterواضiiتعتبر االحياء المجهريه المخمره للح .)

المختلطه عموما منتجه للغiiاز وذلiiك بسiiبب انتاجهiiاformicالنزيم Hydrogenylase امض والذيiiيقوم بشطر ح

.CO2 ، H2 الفورميك الى جزئين متساويين منالمواد

MR-VP brothE. coli and Klebsiella culture

Methyl-Red IndicatorMethyl-Red قطiiiiرات من 4-3يضiiiiاف Indicatorالى

MR-VPاالنiiابيب الحاويiiه على وسiiط broth هiiوالملقح ، ظهور اللون االحمر التوتيKlebsiella و E. coliببكتريا

Cherry Red ه علىiiف داللiiافة الكاشiiد اضiiمباشرة بع الفحص الموجب الحمر المثيل.

Butanediol Fermentation فحص تخمر البيوتانيدويل( Voges-Proskauer )

الفحص السiiلبي الحمiر المثيiiل يمكن ان يعiiد داللiiه MR-VPعلى ان الكiiائن المجهiiري المنمى في وسiiط

broth يره منiiدويل )2,3 منتج لكميات كبii2,3, بيوتاني, Butanediolعiiاض. جميiiاج االحمiiوااليثانول بدال عن انت ) باالضiiافه الى اجنiiاس منSerratia و Enterobacterانiiواع

3


Enterobacteraiceae


Erwinia و Bacillus و Aeromonasومiiiiتق بذلك.

انتاج هذه المنتجات النهائيه الغiiير حامضiiiيه تiiiؤدي الى تقليiiiل في

MR-VPحموضiiية وسiiط brothهiiقل( iاض الiiiفي انخفpHه الىiiiمؤدي )

النتيجiiه السiiلبيه بلنسiiبه لفحص (. لسiiء الحiiظMRاحمiiر المثيiiل )

ليس هنiiاك اختبiiار للكشiiف عن )2,3 i,Butanediolمع ذلك فان ،) (Acetoin

)acetylmethylcarbinolاتiiد المركبiiاح ( iiiه للii2,3االولي iii,Butanediolدهiiاطه تحديiiيمكن ببس )

Barritt’sوالكشف عنه بواسطة كاشف بiiارييت reagent -MR(، عند تلقيح وسط KOH و alpha Naphthol)مكون من

VP brothافةiiوم باضiiام نقiiة ايiiدة ثالثiiا ولمiiبالبكتري الكاشف ، سيتحول لون الوسط الى اللiiون الiiوردي

دالله على الفحص الموجب(Pink-Burgundy)البيرغندي iللVP.

الموادMR-VP broth

E. coli and Enterobacter aerogenes or Klebsiella cultureBarritt’s reagent )Voges-Proskauer( Indicator قطiiره من محلiiول الكشiiف18 مiiل( 0.5يضاف )

الى الوسط الملقح الحاوي على(alpha naphthol)االول مل من الزرع ، ثم يضاف كميه مساويه للكاشiiف1

الى نفس االنبوبiiه،(KOH)االول من الكاشiiف الثiiاني يعتبر مهم جدا وذلك لغرضترج االنبوبه بقوه ))

ثانيه حتى تحول لون الوسط الى20(( كل التهويهاالحمر الغامق او الوردي

4


Enterobacteraiceae


فحص استهالك الستراتCitrate Utilization

Enterobacterقابليiiiة بعض االحيiiiاء المجهريiiiه مثiiiل

aerogenes و Salmonella typhimuriumعلى اسiiتهالك السiiترات كمصiiدر وحيiiد ورئيسي للكiiاربون يمكن ان يعتiiبر مفيد جiiدا في عمليiiة التفريiiق بين البكتريiiiiا المتواجiiiiده في امعiiiiاء

االنسان.

Koser’s)وسiiiط السiiiترات بنوعيiiiه citrate medium and Simmons citrate agar) يمكن ان يسiiiiiتخدم في عمليiiiiiة الكشiiiف عن قابليiiiة البكتريiiiا في اسiiiiiiتهالك السiiiiiiترات. في كال

iادة الiiطين ، مiiالوسSodium Citrate درiiبر المصiiتعت الرئيسي للكاربون والنيتروجين يجهز بواسطة امالح

Ammoniumاالمونيوم salts. هiiبدال من االحماض االميني والذي له دور مهمBromthymol blueيحوي الوسط على

في تحويل لون الوسط الى االزرق عند iة الiاع قيمiiارتفpHطiiد تلقيح الوسiiعن .

ساعه بدرجة24بالبكتريا وحضنها لمدة Enterobacterم، في النتيجiiة االيجابيiiه )37

aerogenesيiiiون ازرق بروسiiiظ لiiiنالح ) .Prussian blue color)ازرق داكن(

فحص تحلل اليورياUrea Hydrolysis

منUreaseيعتiiبر انتiiاج انiiزيم اليiiوريز الخصiiائص المهمiiه في تفريiiق البكتريiiا

5

Citrate -

Urea -

Urea +

Urea ++


Enterobacteraiceae


المعويiiه. يقiiوم االنiiزيم بشiiطر جزيئiiة اليوريiiا الىتعتبر Proteusاالمونيا، vulgaris, Providencia, and Morganella

من االجناس المنتجه النiiزيم اليiiوريز. وسiiط اليوريiiا المنتجه منBuffered solutionيعتبر من الوساط البفريه

خالصات الخمiiائر باالضiiافه الى اليوريiiا. كمiiا يحiiوي iعلى الPhenol red iكمحدد لل pHيرiiا غiiا ان اليوريiiبم .

مسiiتقره وتتحطم في االوتوكليiiف عنiiد التعقيم لiiذا تعقم بواسiiiطة الترشiiiيح ثم تضiiiاف الى الوسiiiط المعقم. عند افiiراز اليiiوريز في الوسiiط الملقح من قبiiل البكتريiiا فiiان المونيiiا المنشiiطره من اليوريiiا

iة الiiع قيمiiوف ترفiiزيم سiiبواسطة االنpHببiiوبس . iالقيمه العاليه للpH فان Phenol redفرiiيتغير من االص

.Cerise Red colorالى االحمر الكرزي Triple السكر الثالثي الحديدي فحص

Sugar Iron (TSI)او

Kligler's كلكلر الحديدي فحص Iron agar (KIA)

( من الفحوصiiiiات المسiiiiتخدمهKIA( و )TSIيعتiiiiبر ) iاج الiiدراتي وانتiiر الكاربوهيiiف عن التخمiiللكشH2S

في البكتريا المعويه. هذه االوساط تمتلك العديد من المiiiواد االوليiiiه الiiiتي تسiiiتطيع البكتريiiiا المعويiiiه اسiiتهالكها متضiiمنة عiiدة انiiواع من الكاربوهيiiدرات والبروتينات اضiiافة الى الثايوسiiلفات. اعتمiiادا على نiiوع المiiواد المسiiتخدمه في عمليiiة التخمiiر يمكن تفريق البكتريا المعويه. كال الوسiiطين يحويiiان على

Beefخالصة لحم البقر والخمiiائر Extract و Yeast Extract والببتون.

6


Enterobacteraiceae


هيTSIالسiiiiكريات القابلiiiiه للتخمiiiiر في وسiiiiط و السiiiكروزLactose ، الالكتiiiوز Glucose))الكلوكiiiوز

Sucrose طiiر في وسiiه للتخمiiكريات القابلiiالس .))KIA ((. يعتiiiبرLactose و الالكتiiiوز Glucoseهي ))الكلوكiiiوز

Sodium Thiosulfateرضiiلفات لغiiد للسiiدر الوحيiiالمص Ferrous. كال الوسiiطين يحيiiان على H2Sانتiiاج Sulfate

لتكiiون الترسiiب االسiiود فيH2Sوالتي تتفاعiiل مiiع قعر االنبوبه . الكاشف الموجiiدود في كال الوسiiطين

iللpH هو Phenol Red يعطي .Phenol Redدiiلون احمر عن pH 7.4ونiiي ولiiط الحامضiiفر في الوسiiون اصiiو ل

احمiiر قiiاتم في الوسiiط القاعiiدي. تلقح االوسiiاط بواسiiطة الطعن الى اسiiفل االنبوبiiه ثم التخطيiiط

على السطح.Interpretation of Enterobacteraiceae reactions on Kligler’s

iron agar (KIA)InterpretationReaction

Only glucose fermentedAcid butt )yellow( and alkaline slant )red(Glucose and lactose fermentedAcid throughout medium )butt and slant

yellow(Neither glucose nor lactose fermentedAlkaline throughout medium )butt and

slant red(Gas-producing bacteriaGas bubbles in butt or cracks in the

mediumHydrogen sulfide )H2S( producedBlackening in the butt

Typical reaction patterns of Enterobacteraiceaeon Kligler’s iron agar (KIA)

Bacteria speciesSugar)s( fermentedReactionEscherichia coli - Klebsiella

Enterobacter - Citrobacter diversusSerratia liquefaciens

Glucose: acid and gasLactose: acid and gas

Gas Forming

Butt acidSlant acidGas in butt

No H2S

7


Enterobacteraiceae


Salmonella - ProteusCitrobacter freundii

Glucose: acid and gasLactose: No fermented

Gas Forming

Butt acidSlant alkalineGas in butt

H2S productionShigella - Yersinia

Serratia marcescensProvidencia stuartii - Providencia

rettgeri

Glucose: acid onlyLactose: No fermented

No Gas Forming

Butt acidSlant alkaline

No GasNo H2S

Salmonella paratyphi AHafnia alvei

Serratia marcescensMorganella morgani

Glucose: acid and gasLactose: not fermented

Gas Forming

Butt acidSlant alkalineGas in butt

No H2SAlcaligenes

PseudomonasAcinetobacter

No sugars fermentedButt neutral/alkaline

Slant alkalineNo GasNo H2S

Tube e

Tube d

Tube c

Tube b

Tube a

AAAK-SlantAAAK-Butt-+---Gas--+--H2S

Litmus حليب اللتموس فحص Milk ReactionsSkim% من 10يحiiiiوي حليب اللتمiiiiوس على Milk

وكميات قليله من اللتموس )تعتبر كiiدليل على تغiiير iالpH iون الiiط يكiiير الوسiiعند تحض )pH . تعتiiبر6.8

هذه الدرجه من الحموضه ممتازه ومالئمه جدا لنمiiو العديiiiد من االحيiiiاء المجهريiiiه ويمكن ان يعتiiiبر مسiiاعدا جiiدا في عمليiiة التشiiخيص. باالضiiافه الى الى ذلك : لمعرفiiة وجiiود او عiiدم وجiiود تخمiiر في الوسiiiط يمكن من خاللiiiه معرفiiiة نشiiiاط بعض الخصائص االنزيميiiه البروتينيiiه للبكتريiiا. العديiiد من

8


Enterobacteraiceae


البكتريا االختياريه التي تملك خاصيه االختزال القوي(Strong Reducing Powersاللتموس استهالك تتمكن من )

كبiiديل السiiتقبال االلكترونiiات مؤديiiه لتغiiير لiiون م37 ايiiام وبدرجiiه 5-4الوسط. يحتاج التفاعل الى ساعه.24لكي يكتمل مع مراقبته كل

التفاعالت : يصبح اللتموسAcid Reactionالتفاعل الحامضي .1

وردي اللون وهو مثالي للتخمر البكتيري.Alkalineالتفاعiiiل القاعiiiدي .2 Reactionولiiiيتح :

اللتمiiiiiiiiiiوس الى االزرق او البنفسiiiiiiiiiiجي الفاتح.العديد من البكتريا ذات النشiiاط المحلiiل

iاهره خالل الiiذه الظiiبب هiiات تسii24للبروتين ساعه االولى.

Litmusتفاعiiiل اللتمiiiوس .3 Reductionطiiiالوس : الiiiزرعي يتحiiiول الى اللiiiون االبيض بسiiiبب

استهالك االوكسجين اثناء تكاثر البكتريا.Coagulationتكوين الخثiiاره .4 Curd formationلبiiتص :

الوسiiط نتيجiiة تخiiثر الiiبروتين ، امiiل انبوبiiة لتشاهد فيمiiا اذا كiiان هنiiاك°45االختبار بزاويه

تخثر او ال.: Peptonizationالببتنه .5 يصبح الوسط نصف شiiفاف

وغالبا ما يعطي لون رمادي على السطح بسببالبكتريا ذات النشاط المحلل للبروتينات.

: تكوين نمو كثيف لزج في قعرRopiness اللزوجه.6االنبوبه.

9


Enterobacteraiceae


Growth النمو على االوساط الزرعيه on Cultural Media

اوال/ وسط الماكونكيMacConkey agar

10

فحص حليب اللتموس Litmus milk reactions

)A( Alkaline. )B( Acid. )C( Upper transparent portion is Peptonization solid white portion in bottom is coagulation and litmus reduction; overall redness is

interpreted as acid. )D( Coagulation and litmus reduction in lower half; some Peptonization )transparency( and acid in top portion. )E( Litmus indicator is

masked by production of soluble pigment )Pseudomonas(; some Peptonization

A B C D E


Enterobacteraiceae


يعتiiiiiiبر من االوسiiiiiiاط على شكلEscherichia coliالتفريقيه حيث تظهر بكتريا

Klebsiellaمسiiiتعمرات صiiiغيرة ورديiiiة امiiiا بكتريiiiا

مسiiتعمرات بيضiiوية ورديiiة ذات مركiiز غiiامق بعiiد م ويحiiوي هiiذا37 سiiاعة بدرجiiة 24فiiترة حضiiانة

الوسط امالح الصفراء كمانع لنمو البكتريiiا الموجبiiةSerratiaلصبغة غiiرام. امiiا بكتريiiا marcescens ونiiفتك

فتكiiون ذات Pseudomonasباهتة اللون رماديه ، اما ال نمو غير منتظم وشفافه.

Eosin Methylin ثانيا/ وسط االيوسين مثيلين االزرق Blue media )EMB(

يعتiiبر من االوسiiاط التفريقيiiه حيث تظهiiر بكتريiiاEscherichia coliغيرة ذاتiiتعمرات صiiكل مسiiعلى ش

Greenلون ازرق مخضر لماع معiiني Metallic Shineفي . تكiiون مسiiتعمرات ورديiiةKlebsiella aeruginosaحين ان

مخاطية ونادرا ما تمتلك بريق معدني.

11


Enterobacteraiceae


– Salmonella ثالثا/ وسط السالمونيال - الشيكيال Shigella agar )S-S agar(

يعتبر هذا الوسط من االوساط المهمه لعiiزل بكتريiiاSalmonella و Shigellaتعمراتiiiiiiiiر مسiiiiiiiiحيث تظه

السالمونيال بلون رمiiادي وتكiiون نهايiiات النمiiو ذات.H2Sلون داكن اسود بسبب ترسب الثايوسلفات

Nutrient agar رابعا/ وسط االكار المغذي يعتبر من االوسiiاط العامiiه الiiتي تنمiiو عليهiiا تقريبiiا جميع انواه البكتريا )الموجبه والسالبه لصبغة كرام ، الهوائيه والالهوائيه حسب ظiiروف الحضiiن(. تظهiiر االنواع البكتيريه على وسط االكار المغذي باشiiطال

Serratiaوالiiiوان مختلفiiiه، حيث تظهiiiر مسiiiتعمرات

marcescens اiiو بكتريiiون نمiiا يكiiبلون احمر مميز بينم Pseudomonas بغاتiiمميزا بسبب تكوينها للص Pyocyanin

)والiiتي تكiiون خضiiراء مصiiفره(. امiiا نمiiو بكتريiiاKlebsiellaونiiiiه حيث تكiiiiيزا بلزوجتiiiiون ممiiiiفيك

المستعمرات الناميه مخاطية التكوين. Chromedia agar رابعا/ وسط االكار الملون

يعتبر من االوسiiاط العامiiه الiiتي تنمiiو عليهiiا تقريبiiا جميع انواه البكتريا )الموجبه والسالبه لصبغة كرام ، الهوائيه والالهوائيه حسب ظiiروف الحضiiن(. تظهiiر االنواع البكتيريه على وسط االكار المغذي باشiiطال

والوان مختلفه،.

12

Documents

· Web viewKlebsiella culture Methyl-Red Indicator يضاف 3-4 قطرات من Methyl-Red Indicator الى الانابيب الحاويه على وسط MR-VP broth والملقحه