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新的里程碑: TALEN 靶向基因敲除. 北京康为世纪生物技术有限公司. 北京康为世纪生物科技有限公司. 王春香 博士 执行董事兼总经理 北京大学生物系学士和硕士学位 美国加州大学洛杉矶分校( UCLA )病理系博士学位。 1999 年回国 2002 年创办北京天为时代科技有限公司 2005 年被 QIAGEN 收购 - 天根 2007 年底创建康为世纪 目标:成为中国的 Invitrogen. 北京康为世纪生物科技有限公司. 完善的产品线. 一站式服务平台. 实验设计平台 分子生物学平台 蛋白表达与纯化 平台 抗体制备纯化平台 - PowerPoint PPT Presentation
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新的里程碑:TALEN靶向基因敲除
北京康为世纪生物技术有限公司
王春香 博士 执行董事兼总经理
• 北京大学生物系学士和硕士学位• 美国加州大学洛杉矶分校( UCLA )病理系博士学位。
• 1999年回国 • 2002年创办北京天为时代科技有限公司
• 2005年被 QIAGEN收购 - 天根• 2007年底创建康为世纪• 目标:成为中国的 Invitrogen
北京康为世纪生物科技有限公司
康为世纪生物科技有限公司
完善的产品线
分子生物学 全系列产品
蛋白生物学产品
免疫学相关产品
一站式服务平台
实验设计平台
分子生物学平台
蛋白表达与纯化 平台
抗体制备纯化平台
免疫学检测平台
北京康为世纪生物科技有限公司
我们的客户我们的合作伙伴
北京大学、清华大学、 复旦大学中国科学院、军事医学 科学院301 医院、协和医院、 上海瑞金医院华大基因、诺华制药
• 江苏泰州中国医药城• 临床诊断试剂研发及
中试平台• 3000 平米实验室及
GMP 厂房
崭新的技术 - TALEN
经典的挑战 - 基因敲除( Knockout )
什么是基因敲除 - 通过某种方法将一个特定的目标基因破坏,使其失去原有的功能。
为什么要做基因敲除 - 基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一。
寻找、证明一个基因的功能都需要哪些步骤?
崭新的技术解决经典的挑战
科研论证基本法则
科霍法则 ( Koch‘s postulates )
如何证明某种微生物导致了某种疾病?
• 该种微生物存在与患病个体而不存在于健康个体。
• 该种微生物可从患病个体上分离出来并体外培养。
• 当把该种微生物接种入健康个体体内时可使健康个体患病。
• 从人为接种的患病个体中又可分离得到该种微生物。
Robert Koch
1843 – 1910
科研论证基本法则
Falkow的分子科霍法则( Falkow’s molecular Koch‘s postulates)
如何证明一个基因编码一种毒力因子?
• 该基因存在于毒力菌株,而不存在于无毒菌株。• 当该基因被敲除时菌株毒力消失或下降。• 当该基因被补回(敲除)突变菌株时毒力得到恢复。
Reverse genetics
• 基因敲除是证明基因功能不可缺少的逻辑环节
• 基因敲除是基因工程和基因治疗的重要手段
为什么要做基因敲除?
怎样做基因敲除?
• 经典方法 :自杀质粒,同源重组 – 几率低 (~1 HR event per 106 cells),难!
• 革命性的进步: RNAi – 临时性,不完全敲除 – Knockdown
• 饱含希望与失望的技术: ZFN
• 新的里程碑: TALEN
TALEN技术原理
基于 TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具,其本质是一个转录调控因子,主要有两个重要的结构域:特异性识别靶核酸序列的靶点识别域,切断 DNA序列的核酸酶功能结构域。
靶点识别结构域的组成•17 -18 个 34aa重复序列•34aa中的第 12 和 13个氨基酸( Repeat Variant Di-residue, RVD)
对应识别一个目标碱基
靶向敲除靶向敲除
TALEN发展过程
• 1989年,植物病原体黄单胞菌属 ( Xanthomonas spp. ) avrBs3 基 因被克隆。
• 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性, avrBs3 - TA
• 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译
2011 年 8月, Nature Biotechnology 上同时发表了用 TALEN 技术进行基因敲除的 4篇研究文章,另加一篇综述。• 一篇人类干细胞
《 Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases 》
• 一篇大鼠
《 Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 》
• 两篇斑马鱼
《 Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs 》
《 Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs 》
• 一篇综述《 Move over ZFN 》
TALEN的最前沿
TALEN基因敲除基本流程
1. 确定靶点:选择目标基因外显子中相隔 17-18bp的两段 14-18bp序列作为靶点
2. TAL靶点识别域的克隆构建
3. 将 TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体以表达重组核酸酶
4. 将重组真核表达质粒转入(卵)细胞
5. 筛选突变体
• TAL的核酸识别单元为 34aa模块中的双连氨基酸( RVD)
• RVD 与A 、 G 、 C 、 T有恒定的对应关系,即 NI识别 A , NG识别 T,HD识别 C , NN识别 G ,非常简单明确
• 欲使 TALEN特异识别某一核酸序列(靶点),只须按照靶点序列将相应 TAL单元( 14 -18个)串联克隆即可。
构建 TAL靶点识别域
具专利保护的克隆构建系统
具专利保护的克隆构建系统
步骤一:靶点识别单元串联
步骤二: TALEN表达质粒构建
具专利保护的克隆构建系统
FokITAL 靶点识别模块 FokIFokITAL 靶点识别模块
将靶点识别模块克隆入真核表达载体,得到 Talen 质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有 TAL的其它必需结构域并在 C端融合有 FokI序列。
目前, TALEN系统利用 FokI的内切酶活性打断目标基因。因 FokI需形成 2聚体方能发挥活性,在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻(间隔 17碱基)的靶序列( 14 - 18个碱基)分别进行 TAL识别模块构建。
X 2
真核表达 TALEN质粒对
步骤三 . 将 TALEN 质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除
TALEN质粒对共转入细胞后,其表达的融合蛋白即可分别找到其 DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时,两个 TALEN融合蛋白中的 FokI功能域形成二聚体,发挥非特异性内切酶活性,于两个靶位点之间打断目标基因。
FOKI 内切酶打断靶点区
内切酶的切割诱发 DNA损伤修复机制( nonhomologous end-joining , NHEJ)。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。
突变体形成
突变体筛选
MutMut
利用实验设计时挑选的,位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点,可进行 PCR产物酶切鉴定以筛选发生目标基因敲除的突变个体。当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用 CEL-I核酸酶检测
TALEN介导的同源重组
同源重组发生率升高几个数量级 Donor plasmid
HR
锌指蛋白核酸酶( ZFN) 基因敲除
• 约 30aa模块,在锌离子帮助下形成“ ββα”结构。其中构成 alpha螺旋的 6aa可特异识别 3连碱基
• 不是任意三连碱基组合都有对应模块 – 靶点选择受限
• ‘上下文效应’( context effect ) - 模块单元对 3连碱基的识别特异性受相邻模块影响 - 模块串联构建方法基本不实用
• 通常用 3 – 4个模块构成靶点识别域
• Off-targeting现象严重
ZFN
off-targeting
原因
基本工具质粒
14 – 18bp靶点序列
怎样做 TALEN
• 1单元模块质粒: A , G , C, T 共 4种• 2单元模块质粒: 4X4=16种• TALEN表达载体: 2种
怎样做 TALEN
TALEN定制质粒产品
1单元模块质粒 A, G, C, T 4种选择2单元模块质粒 共 16种选择pCS2 TALEN真核表达载体
TALEN空载体 2 种 /套
1+2单元模块质粒套装
4+16+2 共 22种质粒 /套
多单元模块质粒 20以下任意单元数目pCS2 TALEN真核表达质粒
将指定 TALEN模块插入 pCS2 TALEN真核表达载体
怎样做 TALEN
TALEN技术服务
TALEN质粒构建
提供两个测序证明的 14碱基 TALEN识别域真核表达克隆 (pCS2)。且以 293T细胞系转染, PCR酶切鉴定,灰度扫描定量证实突变效率高于 10%
TALEN靶向敲除细胞系构建
提供经克隆测序证明的(至少单等位基因)移码突变细胞系
TALEN靶向敲除斑马鱼构建
提供(至少)单等位基因移码突变 F1斑马鱼
TALE技术应用展望• 靶向基因表达调控
• 靶向基因敲除 - NHEJ
• 靶向基因敲入 -HR– 基因治疗
例如: chemokine receptor 5 ( CCR5 )基因
谢谢!北京康为世纪生物技术有限公司
总机 010-58851919 4006-222-360
• 订购 010-58851919-618
• 技术支持 010-58851919-615/616
• 市场部 010-58851919628 [email protected]
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