МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ

ХАРЬКОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИСТЕТ

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии им.проф.Д.П. Гринева

ПРОТОКОЛЫ ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЙ

СПЕЦИАЛЬНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

СТУДЕНТА (КИ) II - ІІІ КУРСА

_____ГРУППЫ____________________________Ф-ТА

Ф.И.О._________________________________________

_______________________________________________

ПРЕПОДАВАТЕЛЬ_____________________________

_______________________________________________

2

Протоколы практических занятий по специальной (частной) микробиологии,

для студентов 2 и 3 курса V факультета (медицинский и стоматологический)

3

Протокол № 1

Тема: Микробиолическая диагностика заболеваний, вызванных

грамположительными кокками.

Цель: Изучение основных элементов микробиологических исследований при

диагностике заболеваний, вызванных стафилококками и стрептококками.

1. Изучение морфологии стафилококка, стрептококка и пневмококка в мазках из

чистых культур, окрашенных по Граму. Зарисовка препаратов.

Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae

(окраска по Граму) (окраска по Граму) (окраска метиленовым синим)

2. Изучение коллекции питательных сред без посева:

а) МПБ для стафилококка;

б) сывороточный и глюкозный бульон для стрептококка;

в) асцитный бульон для пневмококка;

г) среды с углеводами (среды Гисса).

3. Изучение культурально-биохимических свойств:

а) рост стафилококка на МПА ___________________________________________________

_____________________________________________________________________________

б) рост стафилококка на МПБ____________________________________________________

в) рост стафилококка и стрептококка на кровяном агаре______________________________

_____________________________________________________________________________

г) рост стафилококка на желточно-солевом агаре Чистовича__________________________

_____________________________________________________________________________

д) среды с маннитом (разлагает патогенный стафилококк) и инулином (разлагает

пневмококк и не разлагает стрептококк).

е) сахаролитические и протеолитические свойства стафилококков на средах Гисса и МПБ:

Вид Лактоза Глюкоза Маннит Мальтоза Сахароза МПБ

H2S Индол

S.aureus к к К к к + -

S.epidermidis к к - к к + -

S.saprophyticus к к К к К + -

4. Ознакомление со средствами специфической терапии и профилактики -

антистафилококковый иммуноглобулин и стафилококковая аутовакцина.

5. Демонстрация антибиотиков, эффективных в отношении стафилококка и других

грамположительных кокков (цефалоспорины I и II поколений: цефазолин, цефуроксим,

цефаклор, цефокситин; пенициллины: оксациллин, ампициллин, амоксициллин+

клавулановая кислота (амоксиклав), ампициллин+оксациллин (ампиокс); фторхинолоны:

ломефлоксацин, моксифлоксацин, левофлоксацин; ванкомицин, клиндамицин и др.).

6. Демонстрация чашки Петри с определением чувствительности стафилококка к

антибиотикам дисковым методом.

7. Изучение схем лабораторной диагностики стафило- и стрептококковых

инфекций.

4

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Патогенные кокки Кокки - это обширная группа микроорганизмов, включающая патогенных, условно-

патогенных и непатогенных представителей.

По классификации Берги патогенные кокки относятся к трем семействам:

1. Micrococcaceae - род Staphylococcus (стафилококки).

2. Streptococcaceae - род Streptococcus (стрептококки и пневмококки).

3. Neisseriaceae - род Neisseria (менингококки и гонококки).

Общим признаком для всех патогенных кокков является их способность вызывать

гнойные процессы, поэтому они называются гноеродными (пиогенными).

Степень органотропности у кокков неодинакова, она наиболее выражена у

пневмококков, менингококков и гонококков.

Все патогенные кокки неподвижны, не образуют спор, пневмококки образуют

капсулу.

По тинкториальным свойствам они делятся на грамположительные (стафилококки,

стрептококки) и грамотрицательные (менингококки, гонококки).

Патогенные представители гноеродной группы отличаются друг от друга по

потребности в питательных веществах и биохимической активности. Наименее

требовательны к средам, а биохимически более активны стафилококки, наиболее

требовательны к средам и наименее биохимически активны - гонококки.

Стафилококки. Семейство Micrococcaceae, род Staphylococcus.

Морфология. Стафилококки (от греч. staphyle - виноградная гроздь) имеют вид

круглых шаров диаметром 0,5-1,5 мкм. Размножаясь, образуют скопления в виде грозди

винограда. Такая форма является результатом деления микробов в различных плоскостях.

Однако в гное встречаются единичные и парные кокки. Стафилококки неподвижны, не

имеют спор, при специальных условиях культивирования образуют микрокапсулу,

грамположительны.

Культивирование. Стафилококки - факультативные анаэробы, однако лучше

растут в присутствии кислорода. Растут и размножаются на обычных питательных средах,

хорошо растут на средах с кровью, оптимальные условия - температура 37°С, рН 7,2-7,4.

Элективными средами являются желточно-солевой агар и солевой агар. На МПА

колонии стафилококка выпуклые, круглые, непрозрачные, блестящие, размером 2-4 мм с

ровными краями. При росте стафилококки образуют пигмент: золотистый, лимонно-

желтый или белый. Лучше всего пигмент образуется на молочной среде при комнатной

температуре и рассеянном свете. Стафилококковый пигмент не растворяется в воде,

растворяется в ацетоне, эфире, спирте и т.д. При росте некоторых штаммов стафилококка

на агаре с кровью вокруг колонии образуется зона гемолиза. Рост на бульоне

характеризуется равномерным помутнением и осадком на дне.

Ферментативные свойства. Стафилококки вырабатывают сахаролитические и

протеолитические ферменты. Сахаролитические ферменты расщепляют ряд сахаров:

лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, глицерин и другие с образованием кислоты.

Протеолитические свойства стафилококка выражаются в способности растворять казеин,

разжижать желатин (медленно), расщеплять другие белковые субстраты.

Стафилококки продуцируют ферменты патогенности: 1) коагулазу (сворачивает

плазму крови); 2) гиалуронидазу (фактор распространения); 3) лецитиназу (растворяет

лецитин оболочки клеток); 4) фибринолизин (лизирует фибрин); 5) ДНКазу

(деполимеризует ДНК); 6) фосфатазу и др.

Наличие плазмокоагулазы позволяет дифференцировать золотистый стафилококк

от стафилококков других видов. Многие стафилококки вырабатывают пенициллиназу,

разрушающую пенициллин.

Токсинообразование. Стафилококки вырабатывают экзотоксины. К их числу

относятся гемолизины четырех типов, из которых наибольшее значение имеет α-токсин.

5

Он обладает следующими свойствами: гемолитическим - вызывает гемолиз эритроцитов,

дермонекротическим - при внутрикожном введении вызывает некроз, летальным - при

внутривенном введении приводит к гибели чувствительных к нему животных.

Кроме гемолизинов стафилококки образуют лейкоцидин, убивающий лейкоциты,

энтеротоксины шести типов, вызывающие пищевые отравления, эксфолиатины двух

типов, приводящие к отслаиванию эпидермиса у новорожденных детей.

Антигенная структура. Стафилококки имеют протеиновый антиген А, общий для

всех золотистых стафилококков, и полисахаридные антигены: А, Б, С.

Стафилококки выделяют бактериоцины (стафилоцины), которые обладают

антагонистическим действием по отношению к микроорганизмам данного рода.

Среди золотистых (реже эпидермальных) стафилокков различают около 40

фаговаров. Определение чувствительности выделенных из различных объектов

стафилококковых культур к типовым фагам имеет важное эпидемиологическое значение

(при установлении источника и путей передачи возбудителя).

Классификация. В настоящее время стафилококки, выделенные от человека, делят

на 3 вида: S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Стафилококки довольно

устойчивы, поэтому они обнаруживаются в воздухе, почве, воде, на предметах обихода.

При температуре 100°С они погибают моментально, при температуре 70°С - через 10-15

мин. Они хорошо переносят низкие температуры. При замораживании сохраняют

жизнеспособность в течение нескольких лет. Хорошо переносят высушивание. Прямой

солнечный свет убивает их только через несколько часов. Обычные растворы

дезинфицирующих веществ (например, сулема в разведении 1:1000) убивают их через 15-

20 мин. При обезвреживании выделений, содержащих гной, белок, мокроту, не следует

применять фенол. Это дезинфицирующее вещество вызывает коагуляцию белков, что

предохраняет микроорганизмы от гибели. Стафилококки чувствительны к

бриллиантовому зеленому.

Восприимчивость животных. К стафилококку чувствительны крупный и мелкий

рогатый скот, лошади, свиньи, куры. Из экспериментальных животных - кролики, белые

мыши и котята.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-капельный, воздушно-пылевой,

пищевой.

Заболевания у человека. Пиодермия, фурункулы, карбункулы, панариции,

абсцессы; воспалительные процессы различных органов и тканей; ангины, циститы,

остеомиелиты, холециститы, маститы; сепсис и септикопиемия; пищевые

токсикоинфекции и многие другие. Описано около 120 нозологических форм

стафилококковой этиологии.

Патогенез. Стафилококки проникают через кожу и слизистые оболочки.

Преимущественное значение при стафилококковых заболеваниях имеет золотистый

стафилококк (S. aureus). Менее выражена роль в патологии человека S. epidermidis и S.

saprophyticus. Патогенез обусловливается свойствами возбудителя - ферментами,

экзотоксинами, веществами бактериальной клетки и состоянием иммунной системы

макроорганизма.

Чаще поражается кожа и подкожная клетчатка - возникают пиодермиты,

фурункулы, панариции. Нередко стафилококки обусловливают вторичные заболевания,

например пневмонию при гриппе. Они также вызывают раневые инфекции. Особенно

велика роль стафилококков в акушерской практике, так как новорожденные очень

чувствительны к ним. В течении стафилококковых заболеваний имеет значение развитие

аллергии, поэтому заболевание характеризуется рецидивами.

6

Особое место среди стафилококковых заболеваний занимают пищевые

интоксикации. Клинически они протекают как токсикозы, сопровождаются рвотой,

поносом, головной болью и другими явлениями.

Иммунитет. У человека имеется естественная резистентность, связанная с

механическими факторами, фагоцитозом и наличием антител. Воспалительный процесс,

возникающий в месте внедрения возбудителя, обусловливает задержку стафилококков и

затрудняет их распространение по организму. В образовавшемся очаге стафилококки

подвергаются фагоцитозу.

Образующийся в процессе заболевания антитоксин является важным фактором в

общем комплексе иммунитета. Однако приобретенный иммунитет нестойкий, поэтому

наблюдаются рецидивы.

Профилактика. Сводится к улучшению санитарно-гигиенических условий,

активному выявлению больных и бактерионосителей, правильному режиму работы

больничных учреждений.

Специфическая профилактика. Стафилококковый анатоксин и

антистафилококковый иммуноглобулин.

Лечение. Антибактериальные препараты, поливалентный стафилококковый

бактериофаг, антистафилококковая плазма и иммуноглобулин. В некоторых случаях при

хроническом течении стафилококковых инфекций применяют аутовакцину.

Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций.

Материалом для исследований является гной, кровь, отделяемое слизистой

оболочки, спинномозговая жидкость, мокрота, моча, а при пищевых отравлениях -

рвотные массы, промывные воды желудка.

Отбор патологического материала обычно выполняют стерильными пятнашки,

которые вносят в пробирку с транспортным питательной средой для контроля

стерильности (СКС). С закрытых гнойных очагов материал берут с помощью шприца.

Мокроту, мочу, рвотные массы и промывные воды желудка помещают в стерильные

пробирки, банки. Кровь высевают у постели больного в питательную среду на основе СКС

в соотношении 1:10.

Используют микроскопический и бактериологический методы.

Микроскопический метод. Из материала, который исследуется (исключая крови)

готовят мазки, окрашивают по Граму. Грамположительные стафилококки, диаметром 0,5-

1,5 мкм, располагаются в мазках чаще всего в виде скоплений, напоминающих гроздья

винограда. Также они могут проявляться в одиночку, парами, короткими цепочками.

Микроскопическое исследование не позволяет идентифицировать стафилококки,

но дает возможность сориентироваться в выборе питательных сред для выделения чистой

культуры бактерий.

Бактериологический метод. Включает выделение чистой культуры микробов из

исследуемого материала и их идентификацию.

Патологический материал высевают на кровяной агар, желточно-солевой агар и

инкубируют в термостате 18-24 часов при температуре 370С.

Через сутки изучают колонии, выросшие на питательной среде. Стафилококки

образуют выпуклые непрозрачные колонии средней величины (1-3 мм), гомогенной

структуры, гладкие с ровными краями.

Колонии S. aureus на кровяном агаре окружены зоной гемолиза и часто имеют

золотистый пигмент. На желтково-солевом агаре (ЖСА) колонии этого вида

стафилококков окружены радужным венцом помутнение среды, мутнеет, поскольку эти

микроорганизмы способны продуцировать лецитиназу.

С изолированных колоний, выросших на плотной питательной среде готовят мазок,

окрашивают по Граму, микроскопируют. Часть колонии, которая осталась, пересевают на

скошенный мясопептонного агар и ставят его в термостат для увеличения количества

выделенных микробов. Через 18-24 часов с микробного налета, образовавшегося на

7

скошенном агаре, готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют.

Удостоверившись, что культура выделенных микробов чистая, приступают к изучению

комплекса их биологических свойств с целью видовой идентификации стафилококков к

виду.

Для дифференциации S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus ставят реакцию

плазмокоагуляции, определяют ДНК-азную активность, фосфатазу, способность

расщеплять маннит в анаэробных условиях, вызвать некроз кожи кролик.

Реакция плазмокоагуляции. В пробирку наливают 0,5 мл разведенной 1:5

кроличьей плазмы и петлей вносят в нее суточную агаровой культуры стафилококка.

Пробирку помещают в термостат. Появление желеобразного сгустка свидетельствует о

наличии у штамма, который изучается, фермента плазмокоагулазы. Это характерно для S.

aureus.

Определение ДНК-азы. На поверхность мясопептонного агара, содержащий ДНК,

засевают штрихом суточную агаровой культуры стафилококка и помещают в термостат на

24 часа. После инкубации поверхность агара заливают 1 N раствором соляной кислоты.

Если стафилококки продуцируют ДНК-азу, то вокруг колоний остается зона

просветления.

Определение фосфатазы. На чашку с фенолфталеиновой агаром высевают

выделенную культуру стафилококка. Колонии, выросшие через 18-24 часа, обрабатывают

парами аммиака. Появление розовой окраски колоний свидетельствует о положительной

реакции.

Токсигенность выделенных культур стафилококков определяют в опыте in vitro с

помощью реакции диффузной преципитации в геле.

Для установления источника инфекции определяют фаговар патогенных

стафилококков.

Схема выделения и идентификации стафилококка

8

Принципиальная схема выделения стафилококков

Стрептококки. Семейство Streptococcaceae, род Streptococcus.

К роду Streptococcus относятся: Streptococcus pyogenes (гноеродный) и

Streptococcus pneumoniae (пневмококк).

Streptococcus pyogenes (гноеродный)

Морфология. Стрептококки - это кокки, имеющие шаровидную форму. Диаметр

каждого кокка в среднем 0,6-1 мкм, однако для них характерен полиморфизм:

встречаются мелкие и крупные кокки, строго шаровидные и овальные. Стрептококки

располагаются цепочкой, что является результатом деления их в одной плоскости. Длина

цепочек разная. На плотной питательной среде цепочки обычно короткие, на жидких -

длинные. Стрептококки неподвижны, не имеют спор. Свежевыделенные культуры иногда

образуют капсулу. На ультратонких срезах видна микрокапсула, под ней расположена

трехслойная клеточная стенка и трехслойная цитоплазматическая мембрана.

Грамположительны.

Культивирование. Стрептококки - факультативные анаэробы. Растут при

температуре 37°С и рН среды 7,6-7,8. Оптимальными средами для их выращивания

являются среды, содержащие кровь или сыворотку крови. На плотных питательных

9

средах колонии стрептококков мелкие, плоские, мутные, сероватого цвета. На агаре с

кровью некоторые разновидности стрептококков образуют гемолиз. β-гемолитические

стрептококки образуют четкую зону гемолиза, α-гемолитические стрептококки образуют

небольшую зеленоватую зону (результат перехода гемоглобина в метгемоглобин).

Встречаются стрептококки, не дающие гемолиза.

На сахарном бульоне стрептококки растут с образованием пристеночного и

придонного мелкозернистого осадка, бульон при этом остается прозрачным.

Ферментативные свойства. Стрептококки обладают сахаролитическими

свойствами. Они расщепляют глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит (не всегда) и мальтозу с

образованием кислоты. Протеолитические свойства у них слабо выражены. Они

свертывают молоко, желатин не разжижают.

Токсинообразование. Стрептококки образуют ряд экзотоксинов: 1) стрептолизины

- разрушают эритроциты (О-стрептолизин обладает кардиотоксическим действием); 2)

лейкоцидин - разрушает лейкоциты (образуется высоковирулентными штаммами); 3)

эритрогенный (скарлатинозный) токсин - обусловливает клиническую картину

скарлатины - интоксикацию, сосудистые реакции, сыпь и пр. Синтез эритрогенного

токсина детерминирован профагом; 4) цитотоксины - обладают способностью вызывать

гломерулонефрит.

Антигенная структура и классификация. У стрептококков обнаружены

различные антигены. В цитоплазме клетки содержится видовой нуклеопротеидной

природы антиген - единый для всех стрептококков. На поверхности клеточной стенки

расположены протеиновые типовые антигены. В клеточной стенке стрептококков

обнаружен полисахаридный групповой антиген.

По составу полисахаридной группоспецифической фракции антигена все

стрептококки делятся на группы, обозначаемые большими латинскими буквами А, В, С, D

и т.д. до S. Кроме групп, стрептококки разделены на серологические типы, которые

обозначаются арабскими цифрами.

Группа А включает 70 типов. В эту группу входит большинство стрептококков,

вызывающих различные заболевания у человека. Группа В включает в основном условно-

патогенные для человека стрептококки. Группа С включает патогенные для человека и

животных стрептококки. Группа D состоит из непатогенных для человека стрептококков,

однако в эту группу входят энтерококки, которые являются обитателями кишечного

тракта человека и животных. Попадая в другие органы, они обусловливают

воспалительные процессы: холециститы, пиелиты и др. Таким образом, их можно отнести

к условно-патогенным микробам.

Принадлежность выделенных культур к одной из серологических групп

определяют с помощью реакции преципитации с групповыми сыворотками. Для

определения серологических типов используют реакцию агглютинации с

типоспецифическими сыворотками.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Стрептококки довольно

устойчивы в окружающей среде. При температуре 60° С погибают через 30 мин.

В высушенном гное и мокроте они сохраняются месяцами. Обычные концентрации

дезинфицирующих веществ губят их через 15-20 мин. Энтерококки значительно

устойчивее, дезинфицирующие растворы убивают их только через 50-60 мин.

Восприимчивость животных. К патогенным стрептококкам чувствителен рогатый

скот, лошади, собаки, птицы. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые

мыши. Однако стрептококки, патогенные для человека, не всегда патогенны для

экспериментальных животных.

Источники инфекции. Люди (больные и носители), реже животные или

инфицированные продукты.

Пути передачи. Воздушно-капельный и воздушно-пылевой, иногда пищевой,

возможен контактно-бытовой.

10

Заболевания могут возникать в результате экзогенного заражения, а также

эндогенно - при активации условно-патогенных стрептококков, обитающих на слизистых

оболочках зева, носоглотки, влагалища. Снижение сопротивляемости организма

(охлаждение, голодание, переутомление и пр.) может привести к возникновению

аутоинфекций.

Большое значение в патогенезе стрептококковых инфекций имеет предварительная

сенсибилизация - как следствие ранее перенесенного заболевания стрептококковой

этиологии.

При проникновении в кровяное русло стрептококки обусловливают тяжело

протекающий септический процесс.

Заболевания у человека чаще вызывают β-гемолитические стрептококки

серологической группы А. Они продуцируют ферменты патогенности: гиалуронидазу,

фибринолизин (стрептокиназу), дезоксирибонуклеазу и др. Кроме того, у стрептококков

обнаруживают капсулу, М-протеин, обладающие антифагоцитарными свойствами.

Стрептококки вызывают у человека различные острые и хронически протекающие

инфекции, как с образованием гноя, так и не нагноительные, различающиеся по

клинической картине и патогенезу. Нагноительные - флегмоны, абсцессы, раневые

инфекции, ненагноительные - острые инфекции верхних дыхательных путей, рожистое

воспаление, скарлатина, ревматизм и др.

Стрептококки часто вызывают вторичные инфекции при гриппе, кори, коклюше и

других заболеваниях и нередко осложняют раневые инфекции.

Иммунитет. По характеру иммунитет - антитоксический и антибактериальный.

Постинфекционный антимикробный иммунитет малонапряженный. Это объясняется

слабой иммуногенностью стрептококков и большим количеством сероваров, не дающих

перекрестного иммунитета. Кроме этого, при стрептококковых заболеваниях наблюдается

аллергизация организма, чем объясняют склонность к рецидивам.

Профилактика. Сводится к санитарно-гигиеническим мероприятиям, укреплению

общей резистентности организма. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Применяют антибиотики. Чаще используют пенициллин, к которому

стрептококки не приобрели устойчивости, а также эритромицин и тетрациклин.

Значение стрептококка в этиологии ревмокардита. Патогенез ревмокардитов

изучен недостаточно. Но в пользу роли стрептококка в развитии этого заболевания

говорит ряд фактов:

1. У больных ревмокардитом из зева высевают β-гемолитический стрептококк.

2. Ревматизм часто возникает после перенесенной ангины, тонзиллитов, фарингитов,

сенсибилизирующих организм.

3. В сыворотке крови больных обнаруживают антистрептолизин,

антистрептогиалуронидазу - антитела к стрептококковым ферментам, токсинам.

4. Косвенным подтверждением роли стрептококка является успешное лечение

пенициллином.

В последнее время в возникновении хронических форм ревмокардита придают

значение L-формам стрептококка.

Профилактика обострений ревмокардита сводится к предупреждению

стрептококковых заболеваний (например, весной и осенью проводят профилактический

курс введения пенициллина). Лечение сводится к применению антибактериальных

препаратов - пенициллина.

Значение стрептококка в этиологии скарлатины. Г.Н. Габричевский (1902)

впервые высказал предположение о том, что гемолитический стрептококк является

возбудителем скарлатины. Но так как стрептококки, выделяемые при других

заболеваниях, не отличались от возбудителей скарлатины, то это мнение не всеми

разделялось. В настоящее время установлено, что скарлатину вызывают стрептококки

группы А, вырабатывающие эритрогенный токсин.

11

У переболевших возникает иммунитет - стойкий, антитоксический. Его

напряженность определяют постановкой реакции Дика - внутрикожным введением

эритрогенного токсина. У не болевших вокруг места введения возникают гиперемия и

отек, что характеризуется как положительная реакция (отсутствие антитоксина в

сыворотке крови). У переболевших такая реакция отсутствует, так как образовавшийся у

них антитоксин нейтрализует эритрогенный токсин.

Профилактика. Изоляция, госпитализация. Контактным, ослабленным детям

вводят гамма-глобулин. Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Используют пенициллин, тетрациклин. В тяжелых случаях вводят

антитоксическую сыворотку.

Микробиологическая диагностика стрептококковой инфекции.

Материалом для исследования навоз, отделяемое из зева и носа, ликвор, мокрота,

кровь, моча, содержимое везикул, пустул.

Материал отбирают одноразовым шприцем или стерильным ватным тампоном,

который помещают в пробирку с транспортным питательной средой (СКС-среду для

контроля стерильности).

Кровь для бактериологического исследования в объеме 5-10 мл засевают в

сахарный бульон непосредственно у постели больного таким образом, чтобы соотношение

крови и питательной среды было бы не менее 1:10 - 1:20. Срок передачи патологического

материала в бактериологическую лабораторию не должен превышать двух часов.

Микробиологическую диагностику стрептококковых заболеваний проводят

микроскопическим, бактериологическим и серологическим методами.

Микроскопический метод. Из материала, который исследуется готовят мазок и

красят его по Граму. При микроскопии в мазке обнаруживаются грамположительные

кокки, которые располагаются короткими цепочками, иногда попарно или в виде

единичных кокков. На основе изучения морфологических и тинкториальных свойств

невозможно определить род выявленных в препарате микробов.

Для выявления патогенного стрептококка, в полученном от больного клиническом

материале, используют реакцию имунофлюоресценциии (РИФ). В этом случае

используют специфические сыворотки, в которых антитела против стрептококков

замечены флюорохромом.

Бактериологический метод является основным в диагностике стрептококковых

заболеваний. Взят для исследования материал высевают в среду обогащения, в качестве

которого используют среду для контроля стерильности (СКС). После инкубации в

термостате материал, исследуется пересевают сахарным бульон и на 5% кровяной агар с

целью выделения чистой культуры микробов, изучение культуральных свойств и

характера его гемолиза. Посевы помещают в эксикатор с плотно притертой крышкой и

зажженной внутри свечой, или в анаэростатах, где создают повышенную концентрацию

двуокиси углерода. Инкубируют в термостате при температуре 37 ° С в течение 18-24

часов. На сахарном бульоне S. pyogenes дает придонно- пристеночный рост с

образованием мелкозернистого осадка и сохранением полной прозрачности среды. S.

bovis вызывает интенсивное помутнение бульона с образованием небольшого

гомогенного осадка. В изготовленных из бульонной культуры мазках стрептококки

располагаются обычно в виде типичных для них длинных цепочек.

На кровяном агаре стрептококки образуют мелкие (1-2 мм в диаметре) прозрачные

или полупрозрачные колонии серовато-белого цвета. По типу гемолиза на кровяном агаре

стрептококки разделяют на три группы.

Первая группа представлена β-гемолитическими стрептококками, способными

вызвать полный лизис эритроцитов (полное просветление среды) вокруг колоний.

Колонии прозрачные, слизистые, круглой формы, напоминающие капли росы. Это

характерно для свижовидилених штаммов S. pyogenes. Блестящие колонии характерны

для многих штаммов S.agalactiae.

12

Вторая группа представлена α-гемолитическими стрептококками, которые

вызывают на кровяном агаре неполный гемолиз в виде полупрозрачной зоны зеленоватого

оттенка. Зеленящий стрептококки растут в виде мелких колоний серого цвета с гладкой

или шероховатой поверхностью. Такой рост характерен для многих видов стрептококков,

вегетирующих на слизистой оболочке полости рта (S.salivarius, S. mutans, S.oralis и др.)

Третья группа представлена негемолитическая γ-стрептококками. Они не вызывают

изменений кровяного агара в процессе своего роста, имеют слабо выраженную

вирулентность.

С подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микро- копают.

Колонии, выросшие на кровяном агаре, пересевают на скошенный кровяной агар. Посевы

инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 часов. С целью проверки

чистоты выделенной культуры, с микробного налета, вырос на скошенном агаре готовят

мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. В случае, когда культура микробов

чистая, продолжают изучать их биохимические и антигенные свойства. Для установления

видовой принадлежности стрептококков наибольшее значение имеют следующие тесты:

тип гемолиза на кровяном агаре, проба на каталазу, чувствительность к бацитрацину и

сульфаниламидов (сульфаметоксазола и триметоприма), желчно-ескулиновий тест, рост в

бульоне с 6,5% NaCl, наличие пиролидонилариламидазы (PYR), гидролиз гипурату

натрия.

Проба на каталазу. Тест основан на способности микроорганизмов, которые

имеют этот фермент, расщеплять перекись водорода с образованием кислорода и воды.

Для постановки этого теста чистую культуру помещают в каплю 3-10% раствора перекиси

водорода на предметном стекле и растирают круговыми движениями. В положительном

случае наблюдают выделение пузырьков газа. В отличие от стафилококков, стрептококки

не имеют этого фермента.

Проба с бацитрацином и сульфаниламидами. Для предварительной

идентификации S.pyogenes и β-гемолитических стрептококков групп C и G используют

два бумажных диска, один из которых пропитан раствором антибиотика бацитрацином, а

второй - смесью сульфаметоксазола и триметоприма. Диски помещают на чашку с

кровяным агаром, усеянным культурой, которую испытывают и инкубируют 18-24 часов в

аэробных условиях. Любая видимая зона задержки роста вокруг дисков интерпретируется

как чувствительна к этим антимикробных препаратов. Абсолютное большинство штаммов

S. pyogenes чувствительна к бацитрацину, а стрептококки групп С и G - до

сульфаниламидов.

Желчно-ескулиновий тест. Используется для предварительной идентификации

стрептококков S.bovis, которые растут на желчно-ескулиновому агаре с образованием

колоний темно-коричневого или черного цвета.

Рост в бульоне с 6,5% раствором NaCl. S. agalactiae в отличие от других

стрептококков устойчив к высокой концентрации хлористого натрия и дает рост в бульоне

через 24-48 часа инкубации в термостате при температуре 370С.

PYR-тест. В основе теста лежит выявление фермента пиролидониламидазы,

которая у большинства штаммов S. pyogenes и не встречается в других стрептококков.

Культуру, которую исследуют, петлей вносят в питательную бульон, содержащий 0,01%

L-пиролидонил-β-нафтиламиду и инкубируют при температуре 370С в течение 4 часов.

После добавления одной капли диметиламиноациннамальдегида в положительном случае

появляется ярко-красную окраску.

Гидролиз гипурату натрия. В основе данного теста лежит способность S.

agalactiae вызвать гидролиз гипурату натрия. Выделенную чистую культуру с помощью

петли диспергируют в 1% водном растворе гипурату натрия. Через 2:00 инкубации при

температуре 37°С добавляют 3,5% раствор нингидрина в смеси бутанола и ацетона (1: 1).

При положительном результате после инкубации в течение 10 мин. появляется пурпурное

окрашивание.

13

Дифференциация стрептококков по антигенной структуре. Основывается на

выявлении полисахаридного антигена клеточной стенки стрептококка. Например

применяют реакцию преципитации с группоспецифические сыворотками групп А, В, С, G.

Эти сыворотки наливают в 4 узкие преципитацийни пробирки. Экстракт, полученный

после обработки центрифугата чистой культуры стрептококка раствором хлористо-

водородной кислоты, осторожно, не смещая жидкости, наслаивают на

группоспецифические сыворотки. При положительной реакции на границе двух

жидкостей появляется белое кольцо. Конечно реакция преципитации возникает через 5-30

мин.

Серологический метод диагностики стрептококковых заболеваний нашел

применение в случае установления диагноза ревматизма. Для этого в сыворотке крови

больного определяют титр антител к экстрацеллюлярного продуктов стрептококка -

стрептолизина-О. Исследуют парные сыворотки больного с интервалом 7-10 дней.

Препарат стрептолизина-О, который выпускают в сухом виде, растворяют и вносят в

каждую пробирку с разбавленной сывороткой. В день постановки опыта готовят 5%

взвесь эритроцитов дефибринированной крови кролика и также вносят в каждую

пробирку.

Реакция базируется на нейтрализации способности стрептолизина-О растворять

эритроциты in vitro в случае присутствия в сыворотке больного антител против

стрептококка (Антистрептолизин-О). Максимально разведенная сыворотка в пробирке

обеспечивает задержку гемолиза эритроцитов и указывает на соответствующее

количество антистрептолизина-О.

Титр антистрептолизина-О у практически здоровых лиц не превышает 250

международных единиц. При острых и хронических стрептококковых инфекциях он

нарастает, причем при наличии ревматизма или нефрита с первых дней заболевания

отмечается очень высокий титр антител (500 ед. и выше).

Схема выделения и идентификации стрептококка

14

Принципиальная схема бактериологического выделения стрептококков группы А

Streptococcus pneumoniae (пневмококк)

Морфология. Пневмококки - это диплококки, у которых стороны клеток,

обращенные друг к другу, уплощены, а противоположные стороны вытянуты, поэтому

они имеют ланцетовидную форму, напоминающую пламя свечи. Размер пневмококков

0,75-0,5 × 0,5-1 мкм, располагаются они парами. В жидких питательных средах часто

образуют короткие цепочки, приобретая сходство со стрептококками. Превмококки

неподвижны, не имеют спор, в организме образуют капсулу, окружающую оба кокка. В

капсуле содержится термоустойчивое вещество антифагин (защищающий пневмококк от

фагоцитоза и действия антител). При росте на искусственных питательных средах

15

пневмококки утрачивают капсулу. Пневмококки грамположительны. В старых культурах

встречаются грамотрицательные бактерии.

Культивирование. Пневмококки - факультативные анаэробы. Растут при

температуре 36-37° С и рН среды 7,2-7,4. Они требовательны к средам, так как не могут

синтезировать многие аминокислоты, поэтому растут только на средах с добавлением

нативного белка (крови или сыворотки). На агаре с сывороткой образуют мелкие, нежные,

довольно прозрачные колонии. На агаре с кровью вырастают влажные колонии

зеленовато-серого цвета, окруженные зеленой зоной, что является результатом перехода

гемоглобина в метгемоглобин. Пневмококки хорошо растут в бульоне с добавлением 0,2%

глюкозы и в бульоне с сывороткой. Рост в жидких средах характеризуется диффузным

помутнением и пылевидным осадком на дне.

Ферментативные свойства. Пневмококки обладают довольно выраженной

сахаролитической активностью. Они расщепляют: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу,

инулин с образованием кислоты. Не ферментируют маннит. Протеолитические свойства у

них выражены слабо: молоко они свертывают, желатин не разжижают, индол не образуют.

Пневмококки растворяются в желчи. Расщепление инулина и растворение в желчи

является важным диагностическим признаком, отличающим Streptococcus pneumoniae от

Streptococcus pyogenes.

Факторы патогенности. Пневмококки продуцируют гиалуронидазу,

фибринолизин и др.

Токсинообразование. Пневмококки образуют эндотоксин, гемолизин, лейкоцидин.

Вирулентность пневмококков связана также с наличием в капсуле антифагина.

Антигенная структура и классификация. В цитоплазме пневмококков имеется

общий для всей группы протеиновый антиген, а в капсуле - полисахаридный антиген. По

полисахаридному антигену все пневмококки разделяют на 84 серовара. Среди патогенных

для человека наиболее часто встречаются I, II, III серовары.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Пневмококки относятся к группе

нестойких микроорганизмов. Температура 60° С губит их через 3-5 мин. К низким

температурам и высушиванию они довольно устойчивы. В высушенной мокроте

сохраняют жизнеспособность до 2 мес. На питательной среде они сохраняются не более 5-

6 дней. Поэтому при культивировании необходимо делать пересевы через каждые 2-3 дня.

Обычные растворы дезинфицирующих веществ: 3% фенол, сулема в разведении 1:1000

губят их через несколько минут.

Особенно чувствительны пневмококки к оптохину, который убивает их в

разведении 1:100000.

Восприимчивость животных. Естественным хозяином пневмококков является

человек. Однако пневмококки могут вызвать заболевания у телят, ягнят, поросят, собак и

обезьян. Из экспериментальных животных к пневмококку высокочувствительны белые

мыши.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Воздушно-капельный путь, может быть воздушно-пылевой.

Входные ворота. Слизистая оболочка верхних дыхательных путей, глаз и уха.

Заболевания у человека. Пневмококки могут вызвать гнойно-воспалительные

заболевания разной локализации. Специфическими для пневмококков являются:

1) крупозная пневмония;

2) ползучая язва роговицы;

3) отит.

Наиболее частым заболеванием является крупозная пневмония, захватывающая

одну, реже две или три доли легкого. Заболевание протекает остро, сопровождается

высокой температурой, кашлем. Заканчивается обычно критически.

Иммунитет. После перенесенного заболевания остается нестойкий иммунитет, так

как пневмония характеризуется рецидивами.

16

Профилактика. Сводится к санитарно-профилактическим мероприятиям.

Специфическая профилактика не разработана.

Лечение. Используют антибиотики - пенициллин, тетрациклин и др.

Микробиологическое исследование.

Материал для исследования: харкотиня (пневмония), слизь из зева (ангина),

выделения из язвы (ползучая язва роговицы), выделения из уха (отит), навоз (абсцесс),

плевральный пунктат (плеврит), кровь (подозрение на сепсис).

Основные методы исследования:

1. Микроскопический.

2. Микробиологический.

3. Биологический.

Биологическая проба. Немного (3-5 мл мокроты) эмульгируют в стерильном

бульоне, 0,5 мл этой смеси вводят внутрибрюшинно белой мыши. Через 6-8 ч у мыши

отмечаются признаки заболевания. В это время пневмококк уже можно обнаружить в

экссудате брюшной полости. Экссудат берут стерильным шприцем. Из него делают мазки,

окрашивают по Граму и проводят микроскопию. Для выделения чистой культуры

экссудат засевают на агар с сывороткой. Если мышь погибает или заболевает, делают

посев крови из сердца на агар с сывороткой крови для выделения чистой культуры.

Посевы ставят в термостат.

Ускоренный метод определения типа пневмококка (реакция

микроагглютинации). 4 капли экссудата из брюшной полости зараженной мыши наносят

на предметное стекло. К первой капли добавляют агглютинируют сыворотку I типа, ко

второй - сыворотку II типа, к третьей - III типа, к четвертой - изотонический раствор

натрия хлорида (контроль).

Сыворотки I и II типа предварительно разводят в соотношении 1:10, а сыворотку III

типа - 1: 5. Все капли размешивают, высушивают, фиксируют и окрашивают разведенным

фуксином. При положительном результате в одной из капель отмечается скучивание

микробов (агглютинация).

Посевы вынимают из термостата, просматривают и с подозрительных колоний

делают мазки. При наличии в мазках грамположительных ланцетовидных диплококки 2-3

колонии выделяют на скошенный агар с сывороткой для получения чистой культуры.

Посевы помещают в термостат. Из бульона делают мазки, окрашивают по Граму и

проводят микроскопию.

Посевы вынимают из термостата. Проверяют чистоту культуры - делают мазки,

окрашивают по Граму и проводят микроскопию. При наличии в выделенной культуры

грамположительных ланцетовидных диплококки проводят идентификацию выделенной

культуры путем посева:

1) на среды Гисса (лактоза, глюкоза, сахароза, мальтоза) проводят посев обычным

способом - уколом в среду;

2) на среду с инулин;

3) на среду с оптохином;

4) ставят пробу с желчью.

Проба на инулин. Исследуемую культуру засевают на питательную среду,

содержащую инулин и лакмусовая настойку, и ставят в термостат. Через 18-24 ч посевы

вынимают из термостата. При наличии пневмококков среда окрашивается в красный цвет

(стрептококки консистенцию и цвет среды не меняют).

Определение чувствительности к оптохину. Выделенную культуру засевают на

10% агар с кровью, содержащей оптохин 1: 50000 Пневмококки, в отличие от

стрептококков, не растут на средах, содержащих оптохин.

В агглютинационные пробирки наливают по 1 мл исследуемой бульонной

культуры. В одну из них добавляют каплю кроличьей желчи, вторая пробирка служит

контролем. Обе пробирки помещают в термостат. Через 18-24 ч наступает лизис

17

пневмококков, который выражается в просветления мутного бульона. В контроле

суспензия остается мутной.

Пробу с желчью можно поставить на плотной питательной среде. Для этого в

колонию пневмококков, которые выросли в чашках с агаром и сывороткой, наносят

крупинку сухой желчи - колония растворяется - исчезает.

В настоящее время широко используются серологические методы исследования

(РСК и РИГА) для определения стрептококковых антител. Определение группы и серовар

выделенной культуры проводят с помощью флуоресцентных антител.

Определение вирулентности пневмококка. Суточную бульонную культуру

пневмококка разводят 1% пептонной водой от 10-2

до 10-8

, 0,5 мл каждого разведения

вводят двум белым мышам. Культуру, вызвала гибель мышей в разведении 10-7

,

оценивают как вирулентную, в разведении 10-4

-10-6

считают средневирулентной.

Культура, не вызвала гибель мышей, авирулентные.

Принципиальная схема бактериологического выделения пневмококков

Теоретические вопросы:

1. Морфологические, культуральные, биохимические свойства стафилококков и стрептококков.

2. Принципы классификации стафилококков (эпидермальные, золотистые) и стрептококков.

3. Заболевания, вызванные этими микроорганизмами. 4. Распространение грамположительных кокков в природе. Потенциально-патогенные. 5. Носительство стафилококков. 6. Пути заражения, патогенез. 7. Схема микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, вызванных

грамположительными кокками.

18

Протокол № 2

Тема: Микробиологическая диагностика заболеваний, вызванных

грамотрицательными кокками.

Цель: Изучение методов микробиологической диагностики заболеваний,

вызванных менингококками и гонококками.

1. Микроскопия и зарисовка демонстрационных препаратов: мазков из чистой

культуры менингококка и гонококка (окраска по Граму) и из гноя больного гонореей –

незавершенный фагоцитоз (окраска метиленовой синькой).

Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria gonorrhoeae

(окраска по Граму) (окраска по Граму) (окраска метиленовым синим)

2. Изучение питательных сред:

а) сывороточный агар;

б) асцитический агар;

в) шоколадный агар.

Культуры инкубируют при 370С и повышенным содержанием СО2 (8-10%).

Носоглоточные смывы сеют на агар с антибиотиками (ванкомицином, колистином,

нистатином), которые задерживают рост других микроорганизмов.

3. Изучение оксидазной активности нейссерий проводится на шоколадном агаре

при добавлении оксидазного реагента (1 % раствора тетраметил-пара-фенилдиамино-

гидрохлорида) на поверхность колонии. Тест позволяет определить наличие у бактерий

фермента цитохромоксидазы. Поскольку нейссерии синтезируют фермент, края колоний

(но не окружающая их среда) окрашиваются в сине-черный цвет в течение нескольких

секунд.

4. Изучение ферментативной активности гонококка и менингококка:

Вид бактерий Глюкоза Мальтоза

Neisseria gonorrhoeae К -

Neisseria meningitidis К К

5. Дифференциация менингококка (Neisseria meningitidis) и катарального

диплококка (Neisseria catarrhalis) на сывороточном и мясо-пептонном агарах при

различных температурах:

19

Neisseria meningitidis Neisseria catarrhalis

370 С 22

0 С 37

0 С 37

0 С 22

0 С 37

0 С

МПА сывороточ- сывороточ- МПА сывороточ- сывороточ-

ный агар ный агар ный агар ный агар

Заключение: Заключение:

________________________________ ___________________________________

________________________________ ___________________________________

________________________________ ___________________________________

6. Изучение схем лабораторной диагностики гонореи и менингита.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Род Neisseria включает два вида микробов, патогенных для человека: N.

meningitidis и N. gonorrhoeae.

Менингококки Возбудитель - Neisseria meningitidis относится к семейству Neisseriaсеае, роду

Neisseria.

Морфология. Менингококки - это парные кокки, состоящие из двух бобовидных

кокков, лежащих вогнутыми сторонами друг к другу, наружные стенки у них выпуклые

(см. рис.4). Размер каждого кокка 0,6-0,8 × 1,2-1,5 мкм. Они полиморфны. Менингококки

неподвижны, не имеют спор, образуют капсулу. Грамотрицательны. В чистых культурах

располагаются тетрадами и в виде отдельных кокков без определенного порядка, а в

мазках, приготовленных из спинномозговой жидкости, чаще располагаются попарно. В

гнойном материале находятся внутри лейкоцита.

Культивирование. Менингококки - аэробы. Они требовательны к питательным

средам, размножаются только на средах, содержащих нативный белок (сыворотку, кровь).

Растут при температуре 36-37° С (при 25° С рост прекращается), рН среды 7,4-7,6. Для их

размножения необходима влажная среда и повышенное количество углекислоты (фактор,

стимулирующий их рост). Посев следует производить на свежеприготовленную среду.

На плотных питательных средах менингококки образуют небольшие 2-3 мм в

диаметре, нежные, полупрозрачные, голубоватые, вязкие колонии. В бульоне с

сывороткой менингококки дают легкую муть и небольшой осадок. Свежевыделенные

штаммы в S-форме. Старые культуры могут диссоциировать, образовывать шероховатые

R-формы колоний.

Ферментативные свойства. Биохимически менингококки мало активны. Они

расщепляют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические свойства у

них не выражены (не створаживают молоко, желатин не разжижают).

Патогенность менингококков обусловливается наличием капсулы, которая

препятствует фагоцитозу, пи лей, способствующих прикреплению микроба к поверхности

эпителиальных клеток, и образованием ферментов: гиалуронидазы и нейраминидазы.

Токсинообразование. При разрушении бактериальных клеток высвобождается

сильный термоустойчивый эндотоксин, который является липополисахаридом клеточной

стенки. При заболевании он обнаруживается в крови и в спинномозговой жидкости

больных. Тяжесть заболевания часто зависит от количества накопившегося токсина.

20

Антигенная структура. По полисахаридному (капсульному) антигену

менингококки разделяют на серогруппы: А, В, С, D, X, Y U-135 29E (всего девять

серогрупп).

Согласно международной классификации основными группами являются А, В и С.

Менингококки группы А часто вызывают генерализованные процессы и имеют

наибольшее эпидемиологическое значение. Менингококки групп В и С вызывают

спорадические заболевания. Остальные серогруппы мало изучены.

Устойчивость к факторам окружающей среды. Менингококки малоустойчивы.

Температура 70° С губит их через 2-3 мин, 55° С - через 5 мин. В отличие от других

кокков этой группы они плохо переносят низкую температуру, особенно чувствительны к

температурным колебаниям.

Обычные концентрации дезинфицирующих растворов губят их быстро.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные не

чувствительны к менингококкам. Но при субдуральном введении менингококков

обезьянам можно вызвать у них заболевание.

Внутрибрюшинное заражение морских свинок и белых мышей вызывает их гибель

за счет действия эндотоксина.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Основной путь воздушно-капельный.

Заболевания у человека:

1) назофарингит;

2) менингококкцемия;

3) цереброспинальный эпидемический менингит.

Патогенез. Попав на слизистую оболочку носоглотки, менингококки могут там

локализоваться, обусловив носительство или вызвать острый назофарингит. Если они

проникают в лимфатические сосуды, кровь и генерализуются, то вызывают глубокие

изменения в паренхиматозных органах за счет действия эндот