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CICY
( POSGRADO EN
) CIENCIAS ( BIOLÓGICAS
Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
Comportamiento de dos variedades de chile
habanero (Capsicum chinense Jacq.) durante un
período de déficit de nitrógeno
Tesis que presenta
GLADYS SANTIAGO ANTONIO
En opción al título de
DOCTOR EN CIENCIAS
(Ciencias Biológicas: Opción Bioquímica y Biología Molecular)
Mérida, Yucatán, México
2013
CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTfFICA DE YUCA TAN, A. C.
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
CICY
RECONOCIMIENTO
CIENCIAS BIOLÓGICAS
Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado
COMPORTAMIENTO DE DOS VARIEDADES DE CHILE HABANERO (Capsicum
chinense Jacq.) DURANTE UN PERIODO DE DÉFICIT DE NITRÓGENO fue realizado
en los laboratorios de la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas del Centro
de Investigación Científica de Yucatán, A.C. bajo la dirección de la Dra. lleana Echevarría
Machado, dentro de la opción de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas,
perteneciente al Programa de Posgrado en Ciencias Biológicas de este Centro.
Dr. Felipe Augusto Vázquez Flota
Coordinador de Docencia
Mérida, Yucatán , México, 2 de diciembre de 2013.
AGRADECIMIENTOS
Se necesita tener la misma capacidad analítica para escribir una tesis que para escoger
las palabras adecuadas y agradecerles a aquellos que me han brindado su apoyo
necesario para completar este ciclo de vida.
Quiero agradecer al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por darme la
oportunidad única de superarme con el apoyo económico que me otorgó durante mis
estudios de Doctorado a través de la Beca otorgada No. 163963.
Quiero agradecer al Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY) . Por ser un
excelente espacio de formación y estudio. Por darnos el privi legio de tener clases con
grandes profesores, por sus instalaciones y sobre todo al personal de Postgrado que
siempre me recibió con una sonrisa para los trámites de documentos en toda mi
permanencia en esta institución, gracias.
Quiero agradecer a la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas (UBBMP) al
personal que hizo posible más placentera mi estancia, así como sus instalaciones.
Quiero expresar mi gratitud a todos quienes, de una u otra manera, me han acompañado
en esta larga jornada de trabajo para la elaboración de mi tesis.
En primer lugar, quiero expresar mi agradecimiento a mi hija Alexia García Santiago,
porque ella tuvo que soportar largas horas sin la compañía de su mama, sin poder
entender, a su corta edad , el porqué prefería estar frente a la pantalla de una
computadora y no a su costado y/o jugando con ella. A pesar de ello, cada vez que
podíamos, al reunirnos, aprovechamos hermosos momentos, en los que su sola sonrisa
me llenaba de ánimo y fuerzas.
Quiero agradecer a mi amado compañero de vida, mi esposo y amigo, Martin Andrés
García Gómez, mil gracias por acompañarme en este proceso, por sobre todo, tu amor, tu
comprensión, paciencia y fortaleza que permitieron que pudiese lograr terminar mi
Doctorado y sobre todo tu apoyo incondicional. Amo vivir y estar contigo. Amo saber que
tu compañía se extenderá mucho más allá de este período. Te amo porque eres mi amor,
mi cómplice y todo. Gracias.
Quiero agradecer a mi mamá, Beatriz Santiago, que con sus consejos y sabidurías, me
enseño a soñar despierta y cada día brincar nuevos obstáculos, a mis hermanos y
hermanas, Laura, Ociel , Eber y Maritza , mi familia consanguínea, quienes me apoyaron
en este proceso de mi formación . Sin ustedes esto tampoco habría sido posible. En
especial a mi hermana Laura por su apoyo incondicional, por ser la primera en apoyar mis
proyectos y ser un ejemplo a seguir, gracias PIBE. No puedo dejar pasar esta oportunidad
sin decirles que los amo y que gracias a ustedes estoy donde estoy.
Quiero expresar mi agradecimiento a mis Abuelos Lucas (t) y Blandina (t), a quien
siempre preferí llamar papas, porque fueron personas excepcionales, que ayudaron en mi
crianza y formación , Por ser las personas que me enseñaron a sonreír a carcajadas. Por
escuchar mis opiniones en temas de adultos. Por enseñarme el compromiso absoluto con
lo que uno hace. Se que ya no están físicamente con nosotros, pero la presencia de sus
ausencias, cada día me vuelve más capaz.
Quiero agradecer a mis suegros, Andrés y Gloria, gracias por su cariño, comprensión,
apoyo y paciencia infinita e incondicional. Por quererme y cuidarme como su hija. Por sus
consejos y compartir sus experiencias para ser mejor cada día.
Quiero agradecer a mis cuñados, Pablo, Hermilo, Maria, Guadalupe y María Cristina, por
su cariño y aprecio, por valorarme, por sus conversaciones y compañía, por cada día
preguntar cómo iba mi tesis y en especial a María Y. María Cristina, por sacrificar su
valioso tiempo para acompañarme y cuidar a mi hija. Gracias.
Quiero agradecer a mis tíos (Rosa , Antonia , Primitivo, Tereso, Armando, Marcos, Elena),
por sus consejos, por enseñarme que el aprendizaje no necesariamente debe darse bajo
estructuras de dominación, por su apoyo incondicional en muchos momentos y
permitirme crecer con ustedes. A mis primos (Osear, Ornar, Hugo, Miriam, Xochilt , Gema,
Teresa, etc.). A mis sobrinos (Damaris, Anniel , Jaslha, Marlon, Brandon, Gowie, Jesús,
Juliana, Britani , Naomi), por todo su cariño y preocupación constante. Gracias a todos
quienes componen a mi hermosa familia , por su apoyo y siempre estar pendientes en mi
proceso de formación.
Fundamentalmente quiero agradecer a la Dra. lleana Echevaria, mi profesora guía de
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación
Científica de Yucatán, A.C. , y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los
servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos
de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece
patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya
manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le
pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C., y en
el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o
desarrollos tecnológicos, en lo especial , estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por
la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo
expuesto en la presente Declaración.
Finna ¿¿t:J?d · Nombre: M.C. GLADYS SANTIAGO ANTONIO
Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas
del Centro de Investigación Científica de Yucatán, y forma parte del proyecto CONACYT
titulado, "Estudios de los mecanismos bioquímicos y fisiológicos que contribuyen a la
variabilidad en la respuesta del sistema radical a distintas fuentes de nitrógeno en
Capsicum chinense" con número de referencia 169041 , bajo la dirección de la Dra. lleana
Echevarría Machado y el proyecto FOMIX-YUCATÁN titulado "Obtención de variedades
más productivas y más tolerantes de chile habanero a partir de biodiversidad genética de
la especie en Yucatán" con número de referencia 10569, bajo la dirección de la Dra.
Nancy Santana Buzzy.
tesis. Sus comentarios, apreciaciones y críticas hicieron que esta tesis resultara ser mil
veces mejor que lo que se proyectaba orig inalmente. Gracias por darme un amplio
margen de libertad en el proceso investigativo y en la escritura. Pero no solamente quiero
agradecer por este período de tesis, sino por lo que antecede y trasciende a este período.
Con respeto y admiración profunda a su labor como asesora, a su rigor académico,
investigación y la docencia. Pero mucho más aún , muchas gracias, porque ya no siendo
mi profesora me recibió en su oficina en IDEA para conversar. Conversaciones que, ayer
como hoy, van de lo académico, a comentarios amigables y personales. Gracias, porque
teniendo todo el mérito académico nunca he sentido que se comporte como "diva del
saber". Virtud que va acompañada de una honestidad tremenda. Para usted, sólo
palabras de admiración , de quien más allá de este proceso la seguirá viendo como su
alumna.
Quiero Agradecer en mención especial al Dr. Manuel Martínez y a la Dra. lleana
Echevarría, por dejarme participar en su grupo de trabajo y su apoyo para mi formación .
Por las múltiples conversaciones, por la confianza, así como su paciencia, comprensión.
Quiero agradecer a mi comité de tesis al Dr. Manuel Martínez Estévez; Dr. Víctor M.
Loyola Vargas; Dra. Nancy Santana Buzzy; Dr. José Luis Andrade Torres; Dra. Sara
Solís; Dr. Luis Leonardo Pinzón López. Primero por haber aceptado ser parte de mi
comité de tesis, por su confianza, apoyo y sugerencias en la corrección de mi tesis y
sobre todo, gracias por regalarme su valioso tiempo y dedicárselo a la revisión de escrito.
Gracias.
Quiero agradecer a la Dra. Lourdes Miranda, por su apoyo en el artículo de tesis, sobre
todo en esas porras y comentarios para seguir adelante.
Quiero agradecer a la M.C. Mildred Carrillo Pech por su apoyo y enseñanza en el
laboratorio y su gran amistad , esas pequeñas conversaciones para enriquecer mi trabajo
de tesis. Y sobre todo el hacer un ambiente de amistad en el laboratorio.
Quiero agradecer a Lucy Sánchez, por su apoyo en el laboratorio, por su valioso apoyo
incondicional y sus consejos, sobre todo por ese gran aprecio a mi hija y valioso apoyo
personal. Gracias.
Quiero agradecer a mis compañeros y amigos. Ernesto Palacios, Teresita , Anahi , Luz
María, Fanny, Ernesto, Ángel , Ricardo, Luis Fernando, Emanuel , Enid , Nancita, Fátima,
Marta, Bety, Camilo, Víctor, Celsi, Luis Garnica, Jennifer, Mildred , Lucy, Erin , Francisco,
con quienes compartimos largas conversaciones, en las que muchos de nuestros
planteamientos y convicciones se vieron reforzadas, acompañados de esas pequeñas
reuniones. Gracias compañeros, porque con ustedes se hizo más ameno estos años, más
allá de lo que asignaban nuestras obligaciones. Agradezco a mis compañeros del CICY,
por su amistad y esas conversaciones amenas.
Quiero agradecer a laboratorios que me brindaron su espacio, en materiales y quipos de
laboratorio; a los técnicos MC. Fátima medina, Armando Muñuz, Ángela Ku, Roberth A.
Us, Rosa Ma. Galáz, Miriam Monforte, Adriana Canto, Luis C. Gutiérrez. Gracias.
Dejo para el final , por ser el más importante de los agradecimientos, a Dios, por trazar el
camino por los que mis pies avanzan y en el que mi mente y corazón viven la felicidad.
Cada uno de ustedes, directa e indirectamente, han sido fundamental en la realización de
esta tesis , por lo tanto, sólo les libro de los errores y omisiones de la memoria que mi
escritura pudiese conllevar.
DEDICATORIAS
A Dios. Por su amor incondicional y darme la libertad de expresarme, pensar y sentir, así
como enseñarme a compartir con amor el conocimiento adquirido, pero sobre todo por la
oportunidad de culminar una meta más.
Con cariño y amor a mi hija Alexia. Por ser el ser más maravilloso que tengo y que dios
me prestó para hacer de mi vida algo excepcional , y enseñarme día a día como ser una
mejor mamá.
A mi esposo Martin. Por el apoyo incondicional que me brindó, por compartir conmigo
todo su tiempo, por ser un amigo y al mismo tiempo brindarme su gran amor.
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ... ..... ...... .. .... ........ ..... .. ...... ... .. ... ...... .... ............. ......... ..... ..... ........... 1
BIBLIOGRAFÍA ....... .... ......................... .......... .... ... .... ... .... ... .... .... .. .... .... .... .... ...... .. ... . 3
CAPÍTULO 1 ...................................................................................................................... 5
ANTECEDENTES .... ......... ... .................... ............ .. .. ..... .. .... .. ......... .. .... ................ .. ... 5
1 .1 EL NITRÓGENO COMO NUTRIENTE ESENCIAL PARA LAS PLANTAS ......... 5
1.1.1 Problemática mundial ... .. ...... ....... .. ... .... .. .... .. .... ..... ........................................ .. 5
1.1.2 Concepto y componentes de la eficiencia en el uso de nitrógeno .................... 5
1 .1 .3 Estructura de la raíz ... .. .. ... .. .. .. ... .... ..... .... .. ..... .. ... .. .. ......... ................................ 7
1.1.3.1 Respuesta radicular a la presencia de nutrimentos .. ............ .... ..................... 9
1.1.4 Distribución y disponibilidad de nutrientes en el suelo ..................................... 9
1.1.4.1 Nitrógeno en el suelo ... .. .... ......... .. .. .. ... .. ........ .. .. ......................................... 1 O
1.1.4.1 .1 Nitrógeno inorgánico ..... .... ... ...... .. .... .... ........... ............................. ...... .... .. 11
1.1.5 Transportadores de nitrógeno .............. .. .. .. ...... .. ......... ..... .. .. .... .. ......... ... ... .. ... 13
1.1.5.1 Transportadores de nitrato ............. ............ ....................... .... .. .... ... ...... .. .. .. 13
1.1 .5.2 Transportadores de amonio ............ .. .. .. ...................................................... 15
1.1.6 Procesos de asimilación del nitrógeno .......... .. .... .. .... ................ .... ................. 16
1.1.6.1 Removilización del nitrógeno dentro de la planta .......... .. .. .. .................... .. .. 18
1.1 .7 Estrategias para mejorar la eficiencia en el uso del nitrógeno ........................ 21
1.1.8 Modelo de estudio: chile habanero .. ........................ .............. ........................ 24
1.1.8.1 Clasificación taxonómica ... ...... ... .. .. ............... ................. ..................... ...... .. 24
1.1.8.2 Descripción morfológica .... .. .... .. .. .... ... ... ... ... ..... ........... .. .... ...... .. ..... ............. 25
1.1.8.3 Estudios de nutrición en el chile habanero .................................. .. .............. 26
HIPÓTESIS ..... ........... .. .. ...... ....... .. ......... ...... .. ......... ..... ... .. ... ....... .... .. .. .. .......... ... .... 27
OBJETIVO GENERAL ... .. .. .. ... .... .. .. ........ ......... ..... .. ......................... ...... ... .............. 27
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......... ... .. ..... .......... ... ... .. .. ..... .. .... ... .. .... .. ............ ... ... .... 27
JUSTIFICACIÓN .. ..................... ..... ................... .. ..... ........ ......... ... ...... .... .. ... ..... .. ..... 27
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ...... ... ........ .... .. .. .. .. ... .. ........ .......... .......... .. ............. 28
BIBLIOGRAFÍA .............. .... .. .... ..... .............. .. ........ .. .. ...... ......... .................... ........... 30
CAPÍTULO 11 ... .................... ............................................................................................ 45
VARIACIÓN NATURAL DE LA RESPUESTA DE CHILE HABANERO (Capsicum
chinense Jacq.) A UN DÉFICIT DE NITRATO ............ .. .......................... .. .. .. .. .. ...... 45
2.1 INTRODUCCIÓN ..... .. ....... .............. .... ....... .. .............................. ...... ... .. .. ...... .... 45
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS ......... .............. ..... ........................... ........ .............. 48
2.2.1 Material vegetal , condiciones de crecimiento y tratamiento experimental ...... 48
2.2.2 Medición de los pesos fresco y seco y determinación de la velocidad media
relativa de crecimiento ..... .. ........... ........... ..... .. ... .. ............... ...... .. ... ............... ....... .. . 50
2.2.3 Análisis de nitrato, aminoácidos y proteínas totales ....... ............ ... ........ ......... 50
2.2.4 Ensayo de absorción neta de nitrato .................. .. ...... ........... ........ ........ ......... 51
2.2.5 Análisis de los niveles de transcripto del CcNRT2.1 por RT-PCR ........ .. .. ..... . 51
2.2.6 Análisis estadístico ................ ............ .......... ... ........... ........ ... ... ... .. .... ..... ....... . 53
ii
2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .. .. .. .. .. .. .. ...................... .. .. .. ...... .. .. .. .. .. ...... .. ...... . 53
2.3 .1 Diferencias en el crecimiento entre las variedades de chile habanero
sometidas a un déficit de N .. .... .. ....... .. .... ......... .... .... .......... .. ... ............. ..... ..... ......... 53
2.3.2 Variabilidad de metabolitos nitrogenados entre las variedades de chile
habanero en respuesta al déficit de N .... .. .............. .. ........ .. .. .. ........ .... .. .. .... ...... ....... 60
2.3.3 Caracterización de la absorción neta y evaluación de los niveles de
transcritos de CcNRT2.1 de las variedades de chile habanero .. .. ............ .. ............ . 68
BIBLIOGRAFÍA ...... .. ......... ...... .. .... ... ..... .. ... ............................ .... ... .. ... ....... .. ..... ... .... 73
CAPÍTULO 111 .................................................................................................................. 81
DISCUSIÓN GENERAL .... ... ... .. ... ........ .... ..... ...... ................ ... ........ ......... ...... ... .... .. . 81
BIBLIOGRAFÍA ....... .. ... ...... ........ .... .. .... ..... ................... ..... .. .. .. .. ..... .... ..... .... ............ 85
CAPÍTULO IV .................................................................................................................. 89
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ..... ............................ .. ...... ... .... ..... ...... .... ..... 89
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 Estructura de una raíz .. .. ... ..... ........ .. ...... ... .......... ... .. ....... .. .... .... ... .. ... .. ... .. .... .. ... 8
Figura 1.2 Los transportadores de nitrato y su localización en Arabidopsis thaliana . .... ... 15
Figura 1.3 Esquema de la absorción , acumulación y asimilación de nitrato por las plantas
superiores .... ........ .. .. .. .... ..... .. ....... .. ... ........ ........ ....... ...... .. .... .. ... ... .. .. ... ......... ... .. ..... .. ...... .. 17
Figura 1.4 Presentación esquemática de las principales enzimas involucradas en la
re movilización del nitrógeno en hojas jóvenes y senescentes ............ ............ ... .. ..... .. ... ... 20
Figura 1.5 Esquema de la estrategia experimental. .......... .. ..... .... .. ...... .... .. .... ..... .. ........... 28
Figura 2.1 Dinámica de la respuesta de crecimiento de tres variedades de chile habanero
sometidas a un déficit de N ......... ......... .. .. ......... ........... ... .. .. .. .......... ..... ... ...... .... .. .. .. ......... 55
Figura 2.2 Comparación de las respuestas de crecimiento de las variedades de chile
habanero sometidas a un período de déficit o en presencia de N .. ... ....... .... ... ... ... .. ..... .. .. 58
Figura 2.3 Imagen de las plántulas de las tres variedades de chile habanero ....... ......... . 59
Figura. 2.4 Niveles de nitrato, aminoácidos totales y proteínas totales en las variedades de
chile habanero durante un período de 10 días de déficit de N ............... ..... .. .......... ... ... ... 63
Figura. 2.5 Comparación entre las plántulas testigos cultivadas en presencia de N y las
expuestas a déficit. ....... .. ... .... .. .... ... ... ... ........ .... ... ........ ........ .... ... .. .. .. .. ....... ...... ... ... .. ........ 66
Figura 2.6 Relación entre el crecimiento de las plántulas de chile habanero y los valores
totales de en la planta de nitrato, aminoácidos totales y proteínas totales ... ................. ... 67
Figura 2.7 Caracterización de la capacidad de absorción neta y de los niveles de
transcritos de CcNRT2.1 de las variedades de chile habanero sometidas a un déficit de
nitrógeno ... ...... .... ............... ...... ....... ..... .... ...... ..... ..... .... .... .. ...... .. .. ..... ....... .. .......... .. .... ...... 70
iv
Figura 2.8 Diferencias en las secuencias de CcNRT2.1 entre las variedades de chile
habanero .. ... .... ... .. .. ................... ....... ..... .................. ...... ... .. .. .. .... ... .. ... ....... ...... ... ... .......... 71
Figura 3.1 Modelo de la respuesta adaptativa de la variedad NP4EC ante un periodo de
déficit. .............. ...... ...... ................................. .. ... ........... ... ...... ....................... ....... ..... ....... 84
V
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro1.1 Cambio en el NUE al transformar plantas monocotiledóneas con genes que
codifican para enzimas que participan en el metabolismo nitrogenado
... .... ......... .. ... .. .. ... ... .... .. ...... ........... ..... ........ ..................... .. ... .. ... .. .... ...... ..... . 22
Cuadro 1.2 Cambio en el NUE al transformar plantas dicotiledóneas con genes que
codifican para enzimas que participan en el metabolismo
nitrogenado .... .............. ... .. ....... ... ..... . .... .. ................................... ........ .. ........... 23
Cuadro 2.1 Secuencia de los cebadores que se usaron para amplificar por PCR los
niveles de transcripto del CcNRT2.1 ............. .............. ..... ................... .... ...... ... .. ... 53
Cuadro 2.2 Valores medios de la velocidad relativa de
crecimiento ....... ....... ........... .. .... ......................... ... ........... ....... ... ... ....... ....... .. ... 60
vi
ABREVIATURAS
Adenosina trifosfato
Apagado
Aspargino sintasa
Carbomoilfosfato sintetasa
Eficiencia en el uso de nitrógeno
Eficiencia en la toma del nitrógeno
ATP
KO
AS
CPSace
NUE
N U pE
Eficiencia en la utilización del NUtE
nitrógeno
Glutamato deshidrogenasa
Glutamato sintasa
Glutamina sintetasa
GDH
GOGAT
GS
Nicotinamida adenina dinucleótido NADPH
fosfato
Nitrato reductasa NR
Nitrito reductasa N iR
Nitrógeno N
Peso fresco PF
Peso seco PS
Raíces laterales RL
vii
Ribulosa 1 ,5-bifosfato-carboxilasa- Rubisco
oxigenasa
Sobreexpresión
Transportador de alta afinidad
Transportador de amonio
Transportador de baja afinidad
vii i
xo
HATS
ATM
LATS
RESUMEN
El chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) es una de las especies vegetales más
cultivadas en el mundo y un constituyente fundamental en diversas industrias
alimentarias. Debido a que los suelos de Yucatán son pobres en nitrógeno, la demanda
de fertilización nitrogenada para mejorar los rendimientos de este cultivo es alta. En este
estudio se evaluó la respuesta fisiológica y molecular de tres variedades de chile
habanero, dos obtenidas en Yucatán y una comercial , durante un período de déficit de
nitrógeno. La variedad NP4EC de origen yucateco presentó una mayor producción de
materia seca total de la planta (parte aérea + parte radicular) que las otras variedades,
siendo de cuatro o de dos a tres veces mayor a los 1 O días, con respecto al valor inicial al
día O, para la primera o las otras dos variedades, respectivamente. Las cantidades de los
metabolitos nitrogenados (nitrato, aminoácidos y proteína) indicaron que el mecanismo
adaptativo de esta variedad parece ser una mayor asimilación del nitrógeno cuando crece
en presencia de éste y una mayor removilización de sus reservas, fundamentalmente de
las reservas de nitrato en la raíz y de aminoácidos en ambas partes de la planta, cuando
existe déficit de nitrógeno. Además, los contenidos de aminoácidos totales parecen ser
una de las características importantes que determinan la biomasa seca total en esta
especie, independientemente de la variedad y de la exposición al nitrógeno. Por otro lado,
la otra variedad yucateca, REX, presentó la mayor toma de nitrato por el mecanismo de
alta afinidad cuando estuvo expuesta al déficit, lo que sugiere la presencia de una
estrategia adaptativa diferente en esta variedad . Todas las variedades fueron capaces de
aumentar los niveles de transcriptos del transportador de nitrato de alta afinidad
CcNRT2.1 , si bien esta inducción fue diferente entre ellas. A partir de este trabajo se
identificaron características morfológicas y moleculares importantes que podrían aumentar
los rendimientos del chile habanero cuando es cultivado en suelos con disponibilidad de
nitrógeno restringida. Estas características pudieran ser utilizadas en futuros programas
de mejoramiento genético para aumentar la eficiencia en el uso de nitrógeno en esta
especie.
·.;:
·.· t.:.:
ABSTRACT
Habanero pepper (Capsicum chinense Jacq.) is one of the most cultivated plants in the
world , being a key constituent in many food industries. Because Yucatan , Mexico, soils are
poor in nitrogen, nitrogen fertilizer demand to improve yields of this crop is high. Here we
evaluated the physiological and molecular response of three varieties of habanero pepper,
two obtained in Yucatan and one commercial , to a period of nitrogen deficiency. The
"Yucateca" variety NP4EC had a higher dry matter production (tour times greater in both
root and aerial parts of the plant) during the period of deficit, compared to the other
varieties (less than three times on all occasions). The results in terms of nitrogen
metabolites (nitrate, amino acids and protein) suggest that the adaptive mechanism in this
variety seems to be a greater nitrogen assimilation when grown in the presence of this
nutrient, and a further re-mobilization of their nitrogen reserves when deficit exists, mainly
from root nitrate and amino acids in both parts of the plant. Moreover, the total amino acids
content seems to be an important trait for determining the total dry biomass in this species,
regardless of the variety and the degree of exposure to nitrogen. REX, the other
"Yucateca" variety, showed a higher high-affinity nitrate uptake when exposed to a deficit,
thereby revealing a different adaptive mechanism in this variety. All varieties could
increase their transcript levels of the high-affinity nitrate transporter CcNRT2.1, but its
induction differed among the varieties. From this work we identified significant
morphological and molecular traits that could increase yields of habanero pepper growing
on soils with restricted nitrogen phytoavailability. These traits could be used in future
breeding programs to increase the nitrogen use efficiency of this species.
~· 1'
.¡
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
En los últimos 50 años, la población mundial ha crecido por encima de las proyecciones.
Actualmente, existen aproximadamente 7,000 millones de habitantes en el mundo y se
pronostica que para el año 2050 seamos 9,000 millones (Godfray et al., 201 0). Esto ha
provocado una demanda creciente de alimentos. Para atender esta demanda, en los
últimos 50 años los agricultores han utilizando una mayor cantidad de fertilizantes,
fundamentalmente del tipo nitrogenado (Giass, 2003). Este uso indiscriminado de
fertilizantes ha llevado a una contaminación del suelo y del manto freático.
Este problema ha generado el interés por disminuir el uso de fertilizantes nitrogenados.
Una estrategia ha sido incidir en la mejora de la eficiencia en el uso de nitrógeno (NUE)
de los cultivos. La NUE es un parámetro importante en la agronomía, que evalúa el
rendimiento obtenido (grano, fruto o follaje) por la cantidad de nitrógeno (N) aplicado. Este
parámetro incluye dos factores importantes: la eficiencia en la toma de N y en su
utilización. Actualmente, existe un gran interés en conocer cuáles son las bases
fisiológicas, bioquímicas y moleculares que determinan estos factores, para poder
modificarlos.
El chile habanero es un cultivo de gran importancia económica para los productores de
hortalizas del estado de Yucatán. La mayor superficie de cultivo se encuentra en la parte
norte del estado y contribuye con más del 90% de la producción estatal (Borges-Gómez et
al., 2008). El suelo, es el principal factor limitante para la producción de chile habanero en
Yucatán (Tun , 2001 ), pero a pesar de su poca profundidad , pueden obtenerse altos
rendimientos mediante ciertas prácticas de manejo (Borges-Gómez et al., 2008;
Latournerie et al., 2001).
El género Capsicum pertenece a la familia Solanaceae y contiene 30 especies, de las
cuales sólo cinco han sido domesticadas: C. annum L., C. chinense Jacq. , C. frutescens
L., C. baccatum L. y C. pubescens R. (Estrada et al. , 2000; Bosland, 1996). Actualmente,
existe una gran demanda por esta hortaliza y su consumo está aumentando
constantemente. Recientemente, se han reportado bajos rendimientos de esta especie en
los suelos donde ésta se cultiva. Algunos autores plantean que entre un 30 y un 50% de
esta disminución se debe a problemas en la nutrición del chile en estos suelos (Borges-
1
INTRODUCCIÓN
Gómez et al., 2008; Latournerie et al. , 2001 ; Tun , 2001 ).
De los macronutrientes requeridos por las plantas, el N es el elemento que se consume
en mayor cantidad y el que limita de manera más significativa su crecimiento (Crawford,
1998). Diversas especies vegetales son capaces de absorber y asimilar nitrato (N03-},
amonio (NH/}, urea y aminoácidos como fuentes de N; la respuesta en absorción a cada
forma de N en particular varía de una especie a otra (Miller et al. , 2007) .
A pesar de ser un producto tradicional y arraigado a la cultura de nuestro país, el cultivo
del chile es poco estudiado en México. El objetivo principal de este proyecto fue evaluar el
comportamiento fisiológico y molecular de tres variedades de chile habanero que son
cultivadas en la península de Yucatán , ante condiciones de déficit de N una de fruto color
naranja variedad Mayan Ek (NP4EC), otra de color rojo variedad Mayan Chan (REX) y
una tercera de color naranja comercializada por la empresa SEMINIS.
En este trabajo se evaluó el crecimiento y los contenidos de aminoácido, nitrato y
proteína, así como la capacidad en la toma de nitrato en estas variedades durante
diferentes intervalos de tiempo hasta finalizar el período de tratamiento.
2
INTRODUCCIÓN
BIBLIOGRAFÍA
Borges-Gómez, L. , C.L. Cervantes., N.J. Ruiz., F.S. Soria ., R.O. Vicente y C.E. Villanueva
(2008). Capsaicinoides en chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) bajo
diferentes condiciones de humedad y nutrición. Terra Latinoamericana, 28, 35-41.
Bosland , P.W. (1996). Capsicums: lnnovative uses of an ancient crop. J. Janick. Progress
in New Crops, 4 79-487.
Crawford, N y A.D.M. Glass (1998). Molecular and physiological aspects of nitrate uptake
in plants. Trends Plant Sci , 3, 389-395.
Estrada, A. , Ma.A. Bernal y F. Merino (2000) . Maduración del pimiento Padron:
transformaciones bioquímicas. Serv Public, Univ Coruña. 1-18 y 72-83 p.
Glass A.D.M. (2003). Nitrogen use efficiency of crop plants: physiological constraints upon
nitrogen absorption . Plant Sci , 22, 453-470.
Godfray, C.J.H. , R.J . Beddington. , R.l. Crute., L. Haddad ., D. Lawrence. , F.J. Muir. , J.
Pretty., S. Robinson ., M. Thomas y S. Toulmin . (2010). Food security: the
challenge offeeding 9 billion people. Science, 327, 812.
Latorneire, L. , J.L. Chávez. , M. Pérez., C.F. Hernández., R. Martínez. , L. M Arias y G.
Casta ñon (2001 ). Exploración de la diversidad morfológica de chiles regionales en
Yaxcabá, Yucatán , México. Agron Mesoamericana, 12, 41-48.
Miller, A. J., X. Fan., Q. Shen y S. Smith (2007). Amino acids and nitrate as signals for the
regulation of nitrogen acquisition . J Exp Bot, 59, 111-119.
Tun, D.J.C. (2001). Chile habanero: características y tecnología de producción . Secretaría
de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural , Pesca y Alimentación. Instituto
Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias. Yucatán. México.
Centro de Investigación Regional del Sureste. Mococha, Yucatán, 5-17.
3
INTRODUCCIÓN
4
CAPÍTULO 1
ANTECEDENTES
1 .1 EL NITRÓGENO COMO NUTRIENTE ESENCIAL PARA LAS PLANTAS
1.1.1 Problemática mundial
CAPÍTULO 1
Debido a la demanda creciente por alimentos, los agricultores han aplicado una mayor
cantidad de fertilizantes, fundamentalmente nitrogenados, con el objetivo de incrementar
los rendimientos de los cultivos (Giass, 2003). Este uso indiscriminado de fertilizantes ha
llevado a una contaminación por N tanto de la tierra como del manto freático. La
producción de los principales granos (cebada, trigo, arroz, maíz y avena) incrementó tres
veces entre 1961 y 2009 (Godfray et al., 201 O) y este aumento en la productividad se
asoció con un incremento de 20 veces en el uso global de fertilizantes nitrogenados
(Giass, 2003). Por ejemplo, el uso de N aumentó de 3.5 millones de toneladas métricas en
el año 1960 a 87 millones en el año 2000 y se proyecta un incremento de hasta 249
millones para el año 2050 (Tilman et al., 2001 ).
No obstante lo logrado, se vislumbra que el aumento en la productividad de los cultivos
para los próximos 50 años será más difícil , debido a la existencia de problemas, tales
como: disminución de la superficie de tierra arable, incremento en la escases de agua, el
cambio climático, entre otros factores (Kant et al., 201 O).
Por lo menos el 60% de las tierras cultivables del mundo tienen deficiencias minerales o
problemas de toxicidad por el exceso de sales aplicadas a los cultivos (Fageria et al. ,
2008) . Por otra parte, además del alto impacto ambiental que provoca la aplicación
excesiva de fertilizantes (Spiertz y Ewert, 2009; Fageria et al., 2008), el aumento en el
costo de los mismos ha encarecido la producción de alimentos (Garnett et al., 2009). Esta
situación ha generado el interés por disminuir el uso de fertilizantes nitrogenados. Una
estrategia ha sido incidir en la mejora de la eficiencia en el uso de nitrógeno (NUE por sus
siglas en ingles) de los cultivos.
1.1.2 Concepto y componentes de la eficiencia en el uso de nitrógeno
La NUE es un parámetro importante en la agronomía, que para el caso de los cultivos
5
CAPÍTULO 1
agrícolas se define como el rendimiento obtenido (grano, fruto o follaje) por la cantidad de
N aplicado; mientras que para Arabidopsis y otras plantas modelo, se expresa en función
de la materia fresca o seca producida por la cantidad de N aplicado a la planta (Masclaux
Daubresse et al. , 201 0) . En ambos casos, este parámetro está dado por la multiplicación
de dos componentes importantes: las eficiencias en la toma (NUpE, por sus siglas en
inglés) y en la utilización (NUtE , por sus siglas en inglés) del N. La NUpE es la relación
entre la cantidad de N absorbido y la cantidad de N aplicado, mientras que la NUtE es la
relación entre el rendimiento obtenido y la unidad de N absorbido (Brauer y Shelp, 201 O;
Masclaux-Daubresse et al., 201 0). El conocimiento de la NUE de un cultivo puede
contribuir a mantener una adecuada nutrición del mismo (Hirel et al. , 2007) y a reducir el
uso indiscriminado de fertilizantes químicos en la agricultura.
La capacidad de la planta para tomar N del suelo depende de diversos factores, entre los
que se encuentran, las diferentes movilidades del N en el suelo, las condiciones medio
ambientales, la especie, etc. (Shi et al. , 2010; Borges-Gómez et al., 2008; Richard-Molard
et al., 2008; Hirel et al. , 2007; Ramírez et al. , 2005.)
Se calcula que del 50 al 70% del N que se aplica a los cultivos se pierde, por lo que si se
aumentara el NUE de los cultivos, se estaría reduciendo el daño causado por la lixiviación
del N en forma de nitrato, la saturación de los ecosistemas y la contaminación del agua
(Masclaux-Daubresse et al., 201 0). Por otra parte, Kant et al. , (201 O) sugieren que un
aumento del 1% en la NUE podría conllevar a un ahorro de aproximadamente $1 ,100
millones de dólares anuales por concepto de menor aplicación de fertilizantes y menor
gasto en manejo agrícola.
Existen diversos factores que influyen en la NUpE, tales como el cambio climático, la
tolerancia a factores bióticos y abióticos, entre otros (Spiertz y Ewert, 2009; Ramesh et al. ,
2008). Sin embargo, este parámetro está fuertemente determinado por la arquitectura de
los sistemas radicales y por la existencia de transportadores en las raíces de las plantas
que sean eficientes en el transporte de este recurso. La NUtE a su vez está determinada
por los procesos de asimilación , almacenamiento y removilización del N durante el ciclo
de vida de la planta (Ramesh et al. , 2008). El conocimiento de cómo ocurren estos
procesos es necesario para poder diseñar estrategias que permitan mejorar la NUE de los
cultivos en el campo.
6
CAPITULO 1
1.1.3 Estructura de la raíz
En las plantas podemos observar tres partes fundamentales: la raíz, el tallo y las hojas. El
tallo y las hojas conforman la parte aérea, cuya función prioritaria es la captación de
energía y la fotosíntesis, que fundamentalmente se lleva a cabo en las hojas. La raíz
realiza varias funciones entre las que se encuentran: la adquisición de los recursos del
suelo (principalmente iones y agua), el anclaje de la planta, almacenamiento de reservas,
establecimiento de las interacciones bióticas en la rizósfera y la síntesis de reguladores
del crecimiento, entre otras (Gregory, 2006; López-Bucio et al. , 2003). La relación que se
establece entre la raíz y la parte aérea suele ser muy compleja, intercambiándose
reguladores del crecimiento y otros metabolitos entre ambas partes, lo cual conduce a una
regulación del crecimiento estrictamente coordinada.
La gran mayoría de las raíces se desarrollan en el suelo en condiciones de oscuridad, por
lo tanto, son totalmente dependientes de la energía asimilada y producida por la
fotosíntesis realizada en la parte aérea. En contraste, la parte aérea, que crece expuesta
al aire y a la luz, es completamente dependiente del agua y los nutrientes minerales
absorbidos del suelo por la raíz. En conjunto, estas actividades son decisivas para
garantizar el aumento en masa y volumen , tanto de la raíz como de la parte aérea (Kolek
y Kozinka, 1992).
Existen procesos que afectan a la arquitectura general del sistema radical : 1) la división
celular en el meristemo de la raíz primaria (células iniciales) que permite el crecimiento
indeterminado mediante la incorporación de nuevas células de la raíz; 2) la formación de
raíces laterales que incrementa la capacidad de exploración del sistema radicular; y 3) la
formación de pelos radiculares aumentando la superficie total de la raíz primaria y lateral.
La alteración de cualquiera de estos tres procesos puede tener un profundo efecto sobre
la arquitectura del sistema radical , y la capacidad de crecimiento en la planta para crecer
en suelos cuando la fuente nutritiva es limitada (Lopéz-Bucio et al., 2003) .
Además, la raíz está formada por otros tipos de tejido, los cuales se ubican del exterior al
interior en el siguiente orden: epidermis, corteza, endodermis, periciclo y la estela o haz
7
CAP[TULO 1
vascular (figura 1.1 ).
Zona de diferenciación
Zona de elongación {
Zona meristemática {
/ Raíces laterales
Figura 1.1 Estructura de una raíz. La ra íz está conformada por la cofia, la zona
meristemática, la zona de elongación y la zona de diferenciación . En la zona de
diferenciación se forman los pelos radiculares y las raíces laterales (modificado
de Alda, 2010) .
Los pelos radiculares son estructuras finas que se diferencian a partir de las células
epidérmicas de la raíz y son capaces de realizar funciones como la de absorber
nutrimentos y agua, interaccionar con los microorganismos y participar en el anclaje físico
de la planta al suelo (lshida et a/., 2008).
Las raíces laterales (RL) juegan un papel importante en la exploración para adaptarse al
medioambiente del suelo (Dubrovsky et al. , 2009). Se ha estudiado a profundidad el
proceso de formación de esta estructura en Arabidopsis y se sabe que las RL emergen de
las células del periciclo, lugar en donde se inicia la formación del primordio que origina
esta estructura (Péret et al., 2009). Las RL tienen el papel de exploradoras del suelo,
permitiendo la absorción de los nutrientes; además, también actúan para el anclaje de la
planta al suelo (Malamy, 2009).
8
CAPITULO 1
La cofia o caliptra es una estructura que tiene forma de dedal y está situada en el extremo
terminal de la raíz. Su función es proteger al tejido en crecimiento y abrir paso a la raíz a
través del suelo, para así facilitar su desarrollo. También , la cofia es el sitio de percepción
de numerosos estímulos ambientales, tales como la gravedad (Biancaflor et al., 1998) y
gradientes de humedad (Takashashi y Scott, 1993).
1.1.3.1 Respuesta radicular a la presencia de nutrimentos
El desarrollo del sistema radicular es sensible a la disponibilidad y distribución de
nutrimentos en el suelo (Robinson , 1994). La respuesta en el desarrollo radical depende
de la especie y el nutrimento, entre otros factores. Se ha reportado que las RL de
Arabidopsis proliferan en zonas ricas en nitrato (N03.), aumentando la longitud pero no el
número de las mismas (Zhang y Forde, 1998). Sin embargo, en cebada, el N03. indujo un
aumento, tanto en el número como en la longitud de RL (Drew y Saker, 1975).
El amonio (NH4 +) es otra fuente de N inorgánico que contribuye a la nutrición de las
plantas, pero no es capaz de provocar efectos tan drásticos sobre el crecimiento radicular
como los atribuidos al N03• . Sin embargo, en cebada este nutrimento estimuló, tanto la
iniciación como la elongación de las RL en las zonas de la raíz que estuvo expuesta al
mismo (Drew y Saker, 1975).
El fósforo también provoca cambios significativos en la arquitectura de los sistemas
radiculares . Se ha reportado que, bajo condiciones de baja disponibilidad de fósforo los
pelos radiculares en Arabidopsis son más largos y densos (Bates y Lynch , 1996; Ma et al. ,
2001 ). Además, se ha reportado un cambio en la formación de las RL en respuesta a la
presencia de fósforo, dependiendo de la concentración de este nutrimento (López-Bucio
et al., 2003; Williamson et al. , 2001 ).
1.1.4 Distribución y disponibilidad de nutrientes en el suelo
El suelo es un elemento de enlace entre los factores bióticos y abióticos y se le considera
un hábitat para el desarrollo de las plantas. Presenta diversos estados físicos, ya que
contiene gases, líquidos y componentes sólidos, minerales, materia orgánica y
organismos. Los nutrimentos se pueden dividir en macronutrimentos y micronutrimentos,
de acuerdo con las cantidades en las que son requeridos por las plantas. La
9
CAPÍTULO 1
concentración de macronutrimentos en tejidos vegetales, N por ejemplo, puede ser hasta
de mil veces mayor que la concentración de un micronutrimento (Mengel y Kirkby, 2001 ).
En el suelo, la disponibilidad de nutrimentos presenta un alto grado de heterogeneidad
(Jackson y Caldwell , 1993). La concentración de éstos puede variar hasta 1,000 veces, en
una distancia de centímetros o en horas, tal como sucede por ejemplo con el N03- (Bloom
et al., 2006). La disponibilidad de los diferentes nutrimentos en suelos orgánicos varía en
función del pH, la actividad microbiológica, las condiciones de óxido-reducción y
climáticas, el drenaje de los suelos y las variaciones estacionales (Kolek y Kozinka , 1992).
Robinson (1994) analizó la frecuencia y los tipos de respuesta exhibidas cuando la fuente
de nutrimentos del suelo es heterogénea y Hodge et al., (2000) compararon las
respuestas de partes del suelo con diferentes características físicas y químicas. Estos
autores utilizaron N marcado con 15N como fuente de N en Lolium perenne y determinaron
la importancia de que la relación C:N sea baja durante la toma del N para que ésta se vea
favorecida , así como la capacidad de las raíces para competir con los microorganismos
por nutrimentos.
1.1.4.1 Nitrógeno en el suelo
El N se encuentra en el suelo como una compleja mezcla de formas químicas orgánicas e
inorgánicas. La transformación de una forma a otra integran el ciclo del N, e involucran la
acción de microorganismos sobre el N orgánico y su reabsorción por las plantas. La
mayor parte del N en el suelo está presente en forma de moléculas orgánicas complejas;
las bacterias y los hongos que están presentes en el suelo lo convierten a NH4 +.
Posteriormente, el NH/ es oxidado a N02- y éste a N03- en el proceso de nitrificación ,
producido por bacterias del género Nitrosomonas spp. (2 NH3 + 3 0 2 ~ 2 N02- + 2 H20 +
2 H+) y del género Nitrobacter spp. (2 N02- + 0 2 ~ 2 N03-) (Strong y Fillery, 2002).
La nitrificación está regulada negativamente por diversos factores tales como: valores
bajos de pH en el suelo , condiciones de anaerobiosis, falta de agua en el suelo y
temperaturas por debajo de los 5 oc y superiores a 40 oc (Lewis, 1986). A su vez, el N03-
puede ser convertido en gas (N2, N20 , NO, N02), utilizando al N03- como aceptor de un
electrón del 0 2. Este proceso se denomina desnitrificación y ocurre cuando la
disponibilidad de 0 2 es limitada, la concentración de N03- es alta , la humedad del suelo es
10
CAPÍTULO 1
elevada, existan carbohidratos disponibles en el suelo y temperaturas elevadas, entre
otros factores (Strong y Fillery, 2002; Luo et al. , 2000).
1.1.4.1.1 Nitrógeno inorgánico
El N es el principal componente de los nutrimentos absorbidos por la raíz. La mayoría de
éste se incorpora a la materia orgánica de la planta y es utilizado para la síntesis de
aminoácidos, bases nitrogenadas y proteínas que son esenciales para la vida de la planta.
Algunas plantas no leguminosas requieren absorber entre 20 y 50 g de N para producir un
kg de biomasa seca (Robertson y Vitousek, 2009; Kolek y Kozinka, 1992).
La disponibilidad de N es el principal factor limitante para el crecimiento de las plantas y la
producción de los cultivos. Las dos fuentes primarias de nitrógeno inorgánico (NI) para las
plantas son el NH4 + y el N03- ; sin embargo, en la mayoría de los suelos utilizados para la
agricultura, el N03- es la principal fuente de N (Hirsch y Sussman, 1999; Crawford y Glass,
1998).
La distribución del N en el suelo está dado por el gradiente de concentración y el
coeficiente de difusión , el NH/ y el N03- solubles en el agua presentan un coeficiente de
difusión igual , en el suelo estos valores se determinan por la carga, el tamaño del ión , la
temperatura , la humedad del suelo, la viscosidad del agua y la capacidad amortiguadora
del suelo (Owen y Jones, 2001 ).
El coeficiente de difusión del N03- en el suelo es de 3.26 x 1 o-10 m2 s-\ y del NH/ es de
1 O a 100 veces menor, esto quiere decir que el NH4 + se lixivia menos que el N03- en el
suelo. En la mayoría de los suelos agrícolas la concentración de N03- se encuentra en un
rango entre 1 y 5 mM (Owen y Jones, 2001). Las concentraciones de N03- son muy
variables en el suelo ya que es utilizada por las plantas y microorganismos. Este ión al
tener carga negativa se lixivia rápidamente (Miller y Cramer, 2004). El NH/, al poseer
carga positiva, interacciona con las partículas del suelo , permaneciendo así más tiempo
disponible, su concentración en el suelo es de entre 20 y 200 IJM (Owen y Jones, 2001 ).
Por otro lado, la contaminación de los suelos por el uso agrícola e industrial ha provocado
una mayor acumulación de NH/ y estas altas concentraciones de NH/ son altamente
toxicas para algunas especies vegetales (Chaillou y Lamaze, 2001 ). Se ha reportado que
11
CAPÍTULO 1
la nitrificación se inhibe cuando el pH del suelo se acidifica, la temperatura es baja y
existe una gran concentración de fenoles en los suelos aeróbicos. Esto hace que se
acumule mayor cantidad de NH4 + (Brito y Kronzucker, 2002; Chaillou y lamaze, 2001 ), y
que la pérdida de energía induzca a un flujo de salida de los iones (Brito y Kronzucker,
2002) .
También se sabe que en los suelos, la disponibilidad de N para las plantas está en forma
de NH/ y No3- y en menor cantidad como aminoácidos (Miller et al., 2007) . Una
característica de estos nutrientes en el suelo es que se distribuyen en parches
heterogéneos (Hutchings y John, 2004; Bloom et al., 2003; Schortemeyer y Feil , 1996).
Las plantas deben tener habilidad para aclimatarse a estas condiciones heterogéneas del
suelo (de Kroon et al. , 2009; Sakakibara et al., 2006). Se han realizado trabajos en los
que los investigadores dividen el sistema radicular de la planta para medir la toma
simultánea de N suplementado como N03- y NH4 + en forma separada (Guo et al., 2007;
Walch-Liu et al., 2001). La toma de N todavía no es muy clara cuando la raíz está
expuesta en condiciones de sola o mixta de N03- y NH/, ya sea bajo condiciones
homogéneas o heterogéneas (Dong et al., 2012).
En las plantas, el metabolismo del NH/ consume menos energía que el de N03- (Bloom
et al. , 1992); teóricamente la nutrición con NH/ parece ser la fuente preferida de N. Sin
embargo, sólo algunas especies de plantas pueden tomar NH/ como única fuente de N
(Kronzucker et al., 1997), además, se pudieron observar síntomas de toxicidad con
amonio en la mayoría de las plantas terrestres , mostrando una fuerte inhibición del
crecimiento (Guo et al., 2007; Rahayu et al. , 2005; Walch-Liu et al., 2000). En plantas
también se han realizado estudios con N03- y se ha observado que previene la
acidificación de la superficie de la raíz (lmsande, 1986) y aumenta la actividad de algunas
enzimas implicadas en la asimilación de NH/ (Kronzucker et al., 1999). El crecimiento y
desarrollo de las plantas podrían mejorarse cuando ambas formas de N se proporcionan
simultáneamente (Coruzzi y Bush, 2001 ), incluyendo el cultivo de arroz para el que se
reporta que la nutrición parcial con N03- podría mejorar el crecimiento del arroz con
mayores características fotosintéticas (Zhang et al., 2011 ). En general , la mayoría de los
cultivos se desarrollan favorablemente con una mezcla de NH/ y N03- (Dechorgnat et al.,
2011 ; Crawford y Glass, 1998).
12
1.1.5 Transportadores de nitrógeno
1.1.5.1 Transportadores de nitrato
CAPiTULO 1
El N03- es transportado activamente a través de la membrana plasmática de las células
de la epidermis y de las células corticales de la raíz, pero la absorción neta es el equilibrio
entre la entrada activa y la salida pasiva del mismo. La toma de N03- requiere energía y el
paso de dos protones en contra del gradiente electroquímico, por lo que depende del ATP
suministrado por la W-ATPasa que mantiene el gradiente de W a través de la membrana
plasmática (Miller y Smith , 1996; Meharg y Blatt, 1995; McCiure et al. , 1990).
Para el almacenamiento de N03- en las células vegetales, el transporte a través de las
membranas se lleva a cabo a través de un mecanismo antiporte N03-/H+ (Miller y Smith,
1996). El mecanismo de toma de N03- está asociado a una bomba de protones-ATPasa
(W-ATPasa) que mantiene el gradiente del potencial electroquímico para permitir el ca
transporte (Miller y Cramer, 2004).
Se han clonado los genes de varios transportadores de N03- de diferentes especies, los
cuales se pueden agrupar en dos familias: NRT1 (baja afinidad) y NRT2 (alta afinidad)
(Williams y Miller, 2001 ; Forde, 2000; Forde y Clarkson, 1999; Huang et al. , 1999;
Crawford y Glass, 1998; Daniei-Vedele et al., 1998). La familia NRT1 actúa cuando las
concentraciones de N03- en el exterior son mayores a 1 mM, mientras que los
transportadores de la familia NRT2 operan cuando las concentraciones de N03- son
menores a 1 mM, con excepción de CHL 1 (AtNRT1 .1), que es un transportador de N03-
de doble afinidad (Liu et al., 1999). Los estudios fisiológicos también demuestran que
ambos sistemas están formados por componentes constitutivos e inducibles por N03-
(Giass y Siddiqi , 1995).
En Arabidopsis thaliana , se conocen cuatro transportadores que llevan a cabo la función
de absorción del N03- desde el suelo hacia la raíz: NRT1.1 , NRT1.2, NRT2.1, NRT2.2 y el
NRT2.4 que es un transportador dual regulado a nivel transcripcional (Kiba et al., 2012;
Dechorgnat et al. , 2011). Sin embargo, otros transportadores son los responsables del
transporte del N03- para su almacenamiento en la vacuola de las células (NRT2.7, CLCa),
la entrada (NRT1.5) y la salida (NRT1.8) de este ión del xilema, la removilización desde
13
CAPÍTULO 1
las hojas senescentes hacia las hojas nuevas (NRT1.7, NRT1.4) y hacia la semilla
(NRT1 .6, NRT2.7) (figura 1.2) (Wang et al., 2012) . Se han caracterizado o al menos un
tercio de estos genes, de los que siete genes son de la familia NRT2, y 53 de la familia
NRT1 (Tsay et al., 1993).
Desde la identificación del primer miembro de la familia NRT1 en 1993, se han realizado
grandes esfuerzos para la caracterización y función de las actividades de los
transportadores in vivo en otros miembros de esta familia. Por ejemplo, en arroz ( Oryza
sativa) existen al menos 80 genes del transportador de la familia NRT1 (Zhao et al., 201 O;
Tsay et al., 2007). Sin embargo, hasta la fecha sólo dos de ellos se han caracterizado
funcionalmente (Li et al. , 2009 ; Lin et al., 2000). Otra especie en la que se ha identificado
es Nicotiana plumbaginifolia (Freiser et al. , 2001 ).
El primer miembro de la familia de genes NRT2 se identificó en el hongo Aspergillus
nidulans en 1991 por UnKies et al. Una vez identificado el gen y a partir de las regiones
más conservadas en los mismos, se diseñaron cebadores que han permitido clonar otros
miembros de la familia NRT2 en las plantas, como Hordeum vulgare (Trueman et al. ,
1996) y N. plumbaginifolia (Quesada et al. , 1997). La caracterización funcional en A.
thaliana del gen NRT2.1 mostró que era un componente mayoritario del HATS para N03-,
desempeñando una función importante en el control de la absorción de N03- desde el
suelo hacia la raíz (Lejay et al., 2003; Cerezo et al., 2001 ; Filleur et al., 2001 ).
Las proteínas NRT1 y NRT2 presentan una topología similar con 12 dominios
transmembranales putativos altamente conservados (Farde, 2000); con los extremos N y
C terminales citosólicos, así como un gran lazo central entre los dominios seis y siete,
característico de los transportadores del tipo NRT2 (Pao et al., 1998; Trueman et al.,
1996). Aunque la estructura topológica de estas proteínas es común , la estructura
primaria es diferente y esto podría reflejar la diferencia entre la función y/o la regulación
de las proteínas (Tsujimoto et al. , 2007).
Las proteínas NRT2 se clasifican en dos grupos, el primero está formado por proteínas
que tienen un segmento de aminoácidos hidrofílicos conservados, de aproximadamente
20 aminoácidos, en la región N-terminal y el segundo grupo carece de este segmento
(Farde, 2000) .
14
CAPITULO 1
{b)
NO · '
Xilem~
Band~ de casp~ri
Figura 1.2 Los transportadores de nitrato y su localización en Arabidopsis
thaliana . a) Representación esquemática de los transportadores que participan
en la ruta de movilización de nitrato dentro de la planta de Arabidopsis y b)
transportadores que participan en la absorción y movimiento del nitrato en la
raíz (redibujado de Wang et al., 2012) .
1.1.5.2 Transportadores de amonio
En las plantas superiores la toma de NH4 + ocurre por dos sistemas de transporte: uno de
alta afinidad (HATS) y otro de baja afinidad (LATS) (Miller et al., 2001). Los HATS para
15
CAPÍTULO 1
NH/ son saturables en el rango micromolar (Wang et al. , 1994). Adicionalmente, los
LA TS no son saturables a concentraciones mili molares (Wang et al. , 1993).
Para prevenir la acumulación de NH/, los transportadores de NH/ (AMT, por sus siglas
en inglés) son regulados tanto a nivel transcripcional como postranscripcional (Tsay et al.,
2011 ). En A. thalíana , cuatro de los seis AMT que tiene esta planta (AMT1 ;1, AMT1 ;2,
AMT1 ;3 y AMT1 ;5) están involucrados en la toma de NH/ a partir del suelo (Yuan et al.,
2007). La expresión de AtAMT1:1 es reprimida por una concentración elevada de N y de
reprimida por una baja concentración de este elemento (Laque et al., 2006; Gazzarrin i et
al., 1999).
1.1.6 Procesos de asimilación del nitrógeno
Como bien se sabe entre las diversas formas de N disponible para la planta, el N03- es la
fuente principal para la mayoría de las plantas que crecen en suelos aeróbicos. Una vez
absorbido por las raíces, este ión tiene cuatro destinos: a) puede ser almacenado en las
vacuolas de las células de la raíz, b) puede ser transportado a otras partes de la planta, e)
puede ser metabolizado en la ra íz y entonces los productos de su metabolismo ser
translocados hacia la parte aérea de la planta, vía xilema (Miller y Cramer, 2004) o d)
puede ser excretado de la raíz hacia el suelo nuevamente (Huang et al. , 2012; Chapman y
Miller, 2011 ; Segonzac et al., 2007).
Debido a la abundante disponibilidad de reductores provenientes de la fotosíntesis, se
plantea que las células del mesófilo de la hoja son los sitios principales de la reducción de
N03- (Masclaux-Daubresse et al. , 201 O; Ramesh et al. , 2008). Sin embargo, el destino del
N03- depende en gran medida de la especie, ya que algunas llevan a cabo la reducción
de este nutrimento principalmente en la raíz, mientras que en otras este proceso se lleva
a cabo en las hojas (Epstein y Bloom, 2004). Por otro lado, el NH/ es fundamentalmente
metabolizado en la raíz y los productos de su metabolismo son translocados a la parte
aérea de la planta (Kiyomiya et al., 2001 ).
Dentro de la célula , la asimilación de N03- es iniciada por la enzima nitrato reductasa (EC
1.6.6.1 ; NR) dependiente de NAD(P)H, la cual cataliza la reducción del N03- a N02- en el
citosol. El N02- es transportado al cloroplasto, en donde es reducido a NH/ por la nitrito
reductasa (EC 1.7.2.1 ; NiR) , dependiente de ferredoxina (figura 1.3) (Masclaux-Daubresse
16
CAPITULO 1
et al., 201 O; Miller y Cramer, 2004).
El producto final , el NH4 +, es convertido a glutamato por medio de dos vías; cuando la
concentración intracelular de NH4 + es baja (Hochman et al., 1988) dos enzimas funcionan
acopladamente, la glutamina sintetasa (EC 6.3.1.2; GS) y la glutamato sintasa (EC
1.4.1.13; GOGAT) (Lea y Miflin , 2003) . Si el NH/ está disponible para la célula en
grandes cantidades, es asimilado vía la glutamato deshidrogenasa (EC 1.4.1.2; GDH). La
GS cataliza la aminación dependiente de ATP del glutamato para producir glutamina, en
tanto que la GOGAT cataliza la transferencia del grupo amida de la glutamina al
oxoglutarato para producir dos moléculas de glutamato (figura 1.3). La GDH cataliza la
reacción de aminación del a-cetoglutarato/la desaminación del glutamato. Para que la
asimilación del N se lleve a cabo es indispensable la disponibilidad de ácidos orgánicos
para el suministro de los esqueletos de carbono para la síntesis de los aminoácidos
(Ramesh et al., 2008) .
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Figura 1.3 Esquema de la absorción , acumulación y asimi lación de nitrato por
las plantas superiores (modificado de Miller y Cramer, 2004) .
17
CAPÍTULO 1
1.1.6.1 Removilización del nitrógeno dentro de la planta
El N requerido para la síntesis de proteínas que se acumulan en el grano en desarrollo
proviene mayormente de la removilización del N previamente asimilado y acumulado en
las hojas. Esta removilización tiene lugar a través del floema (sistema de conducción
activo) mayormente en la forma de aminoácidos. De esta forma , la eficiencia de la
removilización del N desde las hojas, se convierte en la principal determinante de la
concentración de proteínas del grano al final del ciclo del cultivo (Maclaux-Daubresse et
al., 2010)
Los procesos de removilización en el almacenamiento de N dentro de la planta varían
entre cada especie y puede estar influenciado por la disponibilidad de este nutriente en el
suelo, la aplicación de fertilizantes y las condiciones ambientales en los distintos períodos
del desarrollo de la planta. En consecuencia , una importante proporción del N presente en
los órganos vegetativos no es aprovechada y se pierde en los restos vegetales. Pero
cuando la concentración de N en el suelo es baja, el proceso de removilización vía floema
cobra importancia (Feller y Fischer, 1994 ). En este caso la eficiencia de dicha etapa de
removilización se convierte en el factor principal en la determinación de la concentración
final de proteínas en el grano (Fitzgerald et al. , 2001 ; Feller y Fischer, 1994)
En la removilización del N, las proteínas que se encuentran presentes en las hojas,
particularmente aquellas que participan en la fotosíntesis, son degradadas durante la
senescencia, proporcionando una fuente de N que puede ser utilizada para apoyar la
nutrición de los órganos en crecimiento , como las nuevas hojas y las semillas. La
removilización del N se ha estudiado en varias especies de plantas mediante el método
de la "removilización aparente" , que es la determinación de la cantidad de N total presente
en los órganos de la planta en diferentes estadios de desarrollo y por medio de marcaje
con 15N a largo plazo, lo cual permite la determinación de los flujos de los compuestos
orgánicos (Gallais et al. , 2006) .
En A. thaliana , se ha demostrado que el N puede ser removilizado desde las hojas
senescentes a las hojas jóvenes durante la fase de crecimiento vegetativo; en tanto que
durante la etapa reproductiva puede ser movilizado desde las hojas senescentes a las
semillas (Díaz et al. , 2008; Malagoli et al., 2005). Junto con otras proteínas relacionadas
18
CAPÍTULO 1
con la fotosíntesis, la enzima ribulosa 1 ,5-bifosfato carboxilasa-oxigenasa (Rubisco) es
una importante fuente de N para la nueva movilización. Los cloroplastos muestran los
primeros síntomas de deterioro durante la senescencia; sin embargo, los mecanismos
responsables de su degradación aún no se conocen. La degradación de las proteínas en
el cloroplasto se apoya en el hecho de que los cloroplastos contienen un número bastante
alto de proteasas; la expresión de algunas de ellas es regulada positivamente durante la
senescencia (Masclaux-Daubresse et al., 201 0).
La removilización del N entre hojas senescente y las hojas jóvenes es un proceso
bastante estudiado y hoy se conocen las enzimas claves que intervienen para que se
lleve a cabo este proceso (figura 1.4) (Masclaux-Daubresse et al., 201 0). Entre ellas se
encuentran las dos isoformas de la GS: GS1 , la cual se localiza en el citosol y participa en
la generación de glutamina, tanto en la hoja como en el floema, para que ésta sea
removilizada a las hojas jóvenes y la GS2, que se localiza en los plástidos. El NH/ en la
mitocondria tiene por lo menos dos fuentes, la degradación de los aminoácidos y la
fotorrespiración , este NH/ es utilizado por la GS1 y lo convierte en glutamina. También,
se ha reportado que la enzima asparagina sintetasa (EC 6.3.5.4; AS) participa en este
proceso (McAIIister et al., 2012; Foyer et al. , 2011 ; Masclaux-Daubresse et al. , 201 0).
19
CAPÍTULO 1
20
Glutamato aspartato 4····-
Asparag ina + ·· ··
AS
Glutamina • · '"' •
+ GS1
1
Glutamina
-1 "' ¡¡; "' <"' a;· o a.¡;¡ ~ Q . :::. O • o :::l CD a. ¡¡¡~
"'
~
S:
·-·-·-·-· ... ·-·-~-· -
... ........ "
8 Glutamina 5. :::> .
GS1 "' 1 1 GDH f
Citosol
Asparagina Glutamina Glutamato A
AS i ...... ¿ ··
Glutamina
_ ... --···v "1.1
r• ' _ , ,... •'
NIR...... -
'~¡ \ CPSase
~ Carbamo il fosfato
tfR/ .. .. .. · .. . .~-·
~
Di M;
B
Citosol
Figura 1.4 Presentación esquemática de las principales enzimas involucradas
en la removilización del nitrógeno en hojas jóvenes (A) y senescentes (B);
asparagina sintetasa (AS), isoenzima 1 de la glutamina sintetasa (GS1 ),
glutamato sintasa (GOGAT), isoenzima 2 de la glutamina sintetasa (GS2), nitrito
reductasa (NiR) , nitrato reductasa (NR) , carbamoilfosfato sintetasa (CPSace) ,
glutamato deshidrogenasa (GDH), senescencia asociada a vacuola (SAV) ,
amonio (NH/) , glutamato (GLU) , glutamina (GLN) , asparagina (ASN), nitrato
(N03' ) , nitrito (N02' ) (Masclaux-Daubresse et al., 201 0) .
CAPÍTULO 1
1.1. 7 Estrategias para mejorar la eficiencia en el uso del nitrógeno
Debido a la gran importancia que representa una mejora en la NUE de los cultivos, se han
realizado numerosos esfuerzos con este objetivo. Uno de estos esfuerzos ha sido
caracterizar la variabilidad genética presente en las especies en cuanto a la arquitectura
de los sistemas radicales y su repercusión en la NUE. Hirel et al. , (2007) reportaron la
variabilidad genética que existe en la arquitectura radical entre diferentes líneas de maíz y
sugieren que esta variabilidad podría ser explotada para poder contar con una mayor
comprensión del control en la NUpE. Sin embargo, el impacto que pueden tener algunos
parámetros de la arquitectura radical (densidad de la longitud radical , vigor, número de
pelos radicales , etc.) sobre la NUE no es muy claro aún , ya que depende mucho del tipo
de suelo, las condiciones de crecimiento, la dificultad para evaluarlos en el campo, etc.
(Garnett et al., 2009).
Una estrategia ampliamente explotada ha sido la obtención de plantas transgénicas que
sobreexpresen, tanto los transportadores de N03-, como algunas de las enzimas que
participan de manera importante en el metabolismo nitrogenado. En los cuadros 1.1 y 1.2
se resumen algunos de los principales resultados obtenidos usando especies mono y
dicotiledóneas, respectivamente.
Esta estrategia, a pesar de que puede conllevar a impactos importantes tanto en la NUpE
como la NUtE y por lo tanto a una mejora de la NUE, no necesariamente ha conducido a
alcanzar los resultados esperados. Esto se ha debido principalmente a que puede existir
una red regulatoria compleja que controla tanto la toma, como la asimilación y la
redistribución del N en la planta (Garnett et al., 2009).
21
CAPÍTULO 1
Cuadro 1.1 Cambio en el NUE al transformar plantas monocotiledóneas con genes que codifican
para enzimas que participan en el metabolismo nitrogenado (modificado de Brauer y Shelp et al.,
201 0) .
Gen Especie
GS1 KO Arroz
GS1 ox Arroz
GS1 KO Maíz
GS1 ox Maíz
GS1 ox Trigo
NADH-GOGAT OX Arroz
NADH-GOGAT KO Arroz
AlaAT ox Arroz
ENOD93-1 ox Arroz
Cambio en la actividad enzimática (%)
t 98
i 36-46 LN
t 74
i 78-145
i 250
i 20-80
t 68
i 8-22
Cambio en el NUE (%)
t 72 NUE
t 25-28 NUE
t 85 LN NUE
i 42 LN NUE
j 29 UpE
t 36-61 UpE
j 19-23LN NUE i 13-14 HN
Referencia
Tabuchi et al., 2005
Cai et al. , 2009
Martin et al. , 2006
Martin et al., 2006
Habash et al., 2001
Yamaya et al., 2002
Yamaya et al., 2002
Shrawat et al., 2008
Bi et al., 2009
XO: sobreexpresión; KO: apagado; AS: antisentido; ¡: aumento; ¡: disminución.
22
CAPÍTULO 1
Cuadro 1.2 Cambio en el NUE al transformar plantas dicotiledóneas con genes que codifican
enzimas que participan en el metabolismo nitrogenado (modificado de Brauer y Shelp et al. , 201 0).
Cambio en la Cambio Genes Especie actividad
en Referencia enzimática (%)
el NUE (%)
GS1 ox Álamo i 62-81 Man et al., 2005
GS1 ox Tabaco i 800-1300 Fuentes et al. , 2001
GS1 ox Tabaco i 25-50 Olivera et al., 2002
GS1 ox Loto i 43 Vincent et al., 1997
GS1 ox Chícharo ¡ 0-350 ! 29- i 30 Fei et al., 2003, LN , HN Fei et al., 2006
GS2 OX Tabaco ! 93 Olivera et al., 2002
NADH-Tabaco i 15-40 i 29-53 Chichkova et al. , 2001 GOGATOX
NADH-Alfalfa ! 39-66 ! 0-38 Cordoba et al., 2003 GOGATAS
NADH-Arabidopsis ! 31 Lancien et al., 2002 GOGAT KO
AlaAT ox Cano la i 125-170 i 21 - 67 LN
Good et al., 2007 UpE (shoot)
Dof1 ox Arabidopsis i 60 * i 20-30 HN Yanagisawa et al., 2004
U pE
GDH ox Arabidopsis i 27-318 Ameziane et al., 2000
XO: sobreexpresión; KO: apagado; AS: antisentido; ¡: aumento; !: disminución.
Por esta razón , se han hecho diversos esfuerzos para caracterizar las bases fisiológ icas,
bioquímicas y moleculares que sustenten la variación en la NUE y que pueden ocurrir
dentro de una misma especie.
Richard-Molard et al. , (2008) estudiaron dos líneas de A. thaliana que contrastaban en su
contenido de N en los brotes y detectaron que la que presentaba los mayores contenidos
de N era capaz de presentar una mayor toma de N03- en condiciones de alta afinidad,
cuando era sometida a un período de déficit de este nutrimento. Este comportamiento
coincidió con una mayor expresión de los transportadores de la familia NRT1 y NRT2. En
arroz, se caracterizaron a nivel de plántula dos cultivares de arroz, los cuales difieren en
23
CAPÍTULO 1
la NUE en el campo y se demostró que el que tenía mayor NUE, presentaba una mayor
expresión del transportador NRT2.1, así como una mayor actividad de las enzimas GS y
GOGAT-NADH en las raíces, cuando las plántulas eran sometidas a un período de déficit
de nitrógeno (Foyer et al., 2012; Shi et al. , 2010) . Los autores sugieren a partir de estos
resultados que se podrán diseñar estrategias futuras que permitan elucidar el papel de
estas proteínas en la NUE de estos cultivos (Foyer et al., 2012; Brauer y Shelp, 2010; Shi
et al., 201 O; Richard-Molard et al., 2008) .
1.1.8 Modelo de estudio: chile habanero
El chile habanero que se cultiva en la Península de Yucatán es codiciado por su calidad y
picor, y debido a esto tiene una gran demanda en los mercados local, nacional e
internacional. Por ello, se ha tratado de obtener un mayor rendimiento en la producción de
chile habanero para satisfacer dicha demanda, ya que la introducción del cultivo en otras
regiones no ha sido aceptado por el mercado regional (Trujillo y Pérez, 2005).
En los últimos años en el estado de Yucatán se han estado cultivando diferentes
variedades de chile habanero criollas regionales, de las cuales se han caracterizado
genotipos diferentes, colectados en la Península. A estos cultivares se le midieron
algunas características fenológicas y morfológicas. Las dos variedades locales que se
utilizaron en nuestro trabajo fueron obtenidas por el grupo de la Dra. Nancy Santana
Buzzy de la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular del Centro de Investigación
Científica de Yucatán. Estas dos variedades difieren genéticamente y fueron colectadas
en suelos con características diferentes en la península de Yucatán. El nombre con el cual
se identificó a las variedades son : variedad NP4EC (fruto color naranja) , variedad REX
(fruto color rojo) ; se utilizó una variedad comercial de la empresa SEMINIS (fruto color
naranja, SEMINIS Vegetable Seeds, lnc. 2700 Camino del Sol , Oxnard , CA 93030,
USA).
1.1.8.1 Clasificación taxonómica
La clasificación del cultivo del chile puede establecerse fácilmente hasta el nivel de
género (Capsicum) , pero debido a su gran diversidad, la diferenciación a nivel de especie
y variedad es muy complicada. La clasificación taxonómica para el cultivo del chile
habanero es la siguiente (USDA, 2006):
24
CAPÍTULO 1
Reino Plantae
Familia Solanaceae
Género Capsicum
· Especie C. chinense
1.1.8.2 Descripción moñológica
La planta de chile habanero es de ciclo anual , tiene un periodo de vida de 12 meses,
dependiendo del manejo agronómico. La altura de la planta es variable , pero en los
cultivares comerciales puede oscilar entre 75 y 120 cm.
El chile es un fruto carnoso, hueco, en forma de cápsula y lleno de aire en cuyo interior se
encuentran las semillas (López, 2003; Ayala, 2002). Las semillas son lisas, ovaladas,
miden de 2.5 a 3.5 mm, su periodo de germinación varía entre ocho y quince días en
cultivos a cielo abierto. Tiene raíz pivotante, cuyo tamaño puede alcanzar longitudes
mayores a los 2 m, aunque depende de la edad de la planta, las características del suelo
y las prácticas de manejo que se le proporcionen (Tun, 2001). Su tallo es grueso, erecto,
glabro, robusto y tiene un crecimiento indeterminado. Las hojas tienen un tamaño variable
y son simples, lisas, alternas y de forma lanceolada. Las flores son de color blanco y su
tamaño varía entre 1.5 y 2.5 cm de diámetro de la corola (Tun, 2001). Estos órganos se
emiten en cada ramificación y se pueden presentar racimos de hasta seis flores, dando
lugar a un promedio de tres frutos. Cada flor produce gametos masculinos y femeninos
(López, 2003).
El picor es la sensación de calor que provocan los chiles debido a la presencia de
alcaloides conocidos como capsaicinoides y su concentración es influenciada por el
25
CAPITULO 1
genotipo, las prácticas de cultivo y el medio ambiente. Los dos capsaicinoides
responsables del 90% de la pungencia de los chiles, son la capsaicina y la
dihidrocapsaicina (Borgez-Gómez et al., 2008a; Alpizar et al., 2002; Tun , 2001 ).
1.1.8.3 Estudios de nutrición en el chile habanero
Medina-Lara et al. , (2008) demostraron que existe una relación dosis-dependiente entre el
N que se les proporciona a las plantas de chile habanero y su contenido de capsaicina. La
fertilización con N aumentó significativamente el crecimiento de la planta y la producción
de frutos, manteniendo los niveles de capsaicina elevados. La respuesta óptima se
produjo con 15 mM de urea como fuente de N. Este parámetro puede ser un indicador
importante de productividad del chile habanero y requiere el estudio de diferentes
regímenes de fertilización.
Por otro lado, se observó que la acumulación de capsaicina está relacionada con el
conten ido de N03- en las placentas de chile habanero (Monforte-González et al., 201 O).
En este trabajo se utilizaron plantas de chile habanero en cultivos hidropónicos con varias
dosis de N03-. Los tratamientos no produjeron mayores efectos en el rendimiento o en el
tamaño de los frutos.
En cuanto a la dosis de fertilización , se ha reportado un paquete tecnológico para la
producción de chile habanero, en el que los autores recomiendan una dosis de
fertilización de 120 - 100 - 150 kg ha-1 de N-P-K, respectivamente, acompañado con 1 O t
ha-1 de cerdaza u otro estiércol (Soria et al., 2002) para obtener un rendimiento de 18 t ha-
1 de fruto en suelos pedregosos. Otros autores recomiendan una dosis de 120 - 120 -
120 kg ha-1 de N-P-K a base de fertilizantes inorgánicos en suelos pedregosos,
acompañados de 5 t de gallinaza ha-1 (Tun , 2001 ).
El pH de los suelos en los que se cultiva el chile habanero en Yucatán es neutro o
ligeramente alcalino y son suelos fundamentalmente arcillo-arenosos (Borges et al.,
2008) .
En una investigación realizada por Celis-Arámburo et al., (2011 ) en chi le habanero,
utilizando como fuente de N el N03- y como testigo al KCI , se obtuvieron los siguientes
resultados; cuando las raíces fueron colocadas en cajas segmentadas con la fuente de
26
CAPÍTULO 1
N03- en forma heterogénea, este anión inhibió el crecimiento de la raíz primaria,
observando que este efecto dependió del tiempo de exposición y la dosis de N03-; por
otro lado, el N03- estimuló la elongación y formación de la raíces laterales en forma
localizada. Se propone que esta estimulación pueda deberse a que el N03- esté
funcionando como una molécula señal.
HIPÓTESIS
Si las variedades de chile habanero que crecen en diferentes tipos de suelos presentan
características genéticas bien diferenciadas, entonces es posible que éstas no presenten
una misma respuesta fisiológica y su respuesta molecular sea diferente cuando sean
expuestas a un periodo de déficit de N.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el comportamiento fisiológico y molecular de tres variedades de chile habanero
bajo condiciones de déficit de N.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Medir el efecto de un período de déficit de N sobre el crecimiento de las tres
variedades de chile habanero.
2. Estudiar la capacidad en la toma de N03- de alta afinidad , así como la expresión de
un transportador de nitrato del tipo NRT2 en las raíces de las dos variedades,
sometidas a tratamientos de déficit de N.
3. Cuantificar el contenido de distintas formas de N en los tejidos de la planta para
conocer la capacidad que presentan dichas variedades en el almacenamiento y la
removilización de este nutrimento bajo un déficit del mismo.
JUSTIFICACIÓN
La demanda de alimentos y la necesidad de obtener mejores rendimientos ha conducido
al uso indiscriminado de fertilizantes en la agricultura, reduciendo paulatinamente la
fertilidad de los suelos y los rendimientos por hectárea, además de causar severos daños
ambientales. Como estrategia, se requiere el desarrollo de cultivares que posean una alta
27
CAPÍTULO 1
eficiencia en el uso de los nutrimentos, particularmente del N. Para lograr esto, es
necesario contar con un conocimiento profundo de la respuesta fisiológica y molecular de
los cultivares a diferentes condiciones de N. No existen estudios de este tipo para el chile
habanero, a pesar de ser una especie importante para la región y para el país. El
conocimiento del comportamiento de chile habanero ante condiciones de escases de N
podrá ayudar a la selección de variedades que sean capaces de ser cultivadas en
condiciones de bajo contenido de N en el suelo sin afectar los rendimientos.
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
En la figura 1.5 se presenta un esquema de la estrategia experimental que se seguió para
cumplir con los objetivos que se propusieron .
Plántulas de NP4EC, REX V SEMINIS de 45 d ías
1 mM KN03
durante 4 días
almacenamiento v removlllzadón de N
Cosechar raíz y hoja (0, 2, 4, 6, 8 v 10 días)
Figura 1.5 Esquema de la estrategia experimental.
Estos experimentos se realizaron en condiciones controladas en el laboratorio. Se
utilizaron plántulas de aproximadamente 30-45 días de edad, las cuales se cultivaron en
condiciones de hidroponía en una solución de nutrientes completa. Estas plantas se
sometieron a condiciones de déficit del nutrimento, durante un período de 1 O días. Las
cosechas del material para los análisis se realizaron cada 48 horas después del
tratamiento de déficit de nitrógeno. El experimento testigo consistió en plantas que se
28
CAPÍTULO 1
mantuvieron en la solución de nutrientes completa (1 mM KN03).
Los parámetros que se evaluaron fueron las siguientes:
~ Crecimiento: se evaluaron los pesos fresco y seco de la raíz y de la parte aérea,
~ Metabolitos y nutrimentos: el contenido de nitrato, aminoácidos y proteínas solubles.
Estas evaluaciones se realizaron en la raíz y las hojas de las plantas.
~ Toma de nitrato. Para evaluar la capacidad de absorción de N03-, se utilizaron
plántulas de cada variedad sometidas a los diferentes períodos de déficit
previamente mencionados y se colocaron durante 15 minutos en una solución de
nutrientes que contenía 200 ¡.JM N03-. La toma se expresó en ¡.Jmoles de N03- g-1 PF
de la raíz.
~ Expresión de un transportador de alta afinidad de N03-, del tipo NRT2. Estos tipos de
transportadores son los responsable de aproximadamente el 90% de la toma de
nitrato por el sistema de alta afinidad en Arabidopsis. En el grupo se obtuvo
previamente un gen a partir de las raíces de chile habanero de la variedad SEMINIS ,
con similitud elevada a la familia de transportadores NRT2. Con el objetivo de
explorar las bases moleculares de la toma de N03- bajo diferentes condiciones de
déficit, se evaluó la expresión de este transportador a través de la metodología de
PCR punto final , en las raíces de chile habanero, previo a someterlas a tratamiento
de déficit de N03- y durante los momentos posteriores al déficit del nutrimento.
29
CAPITULO 1
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CAPITULO 1
44
CAPÍTULO 11
CAPÍTULO 11
VARIACIÓN NATURAL DE LA RESPUESTA DE CHILE HABANERO (Capsicum chinense Jacq.) A UN DÉFICIT DE NITRATO
2.1 INTRODUCCIÓN
El N es la molécula más abundante en las plantas después del carbono, el oxígeno y el
hidrógeno y es un macronutrimento esencial para las mismas, al igual que el fosforo, el
potasio, el calcio, el magnesio y el azufre, entre otros nutrientes (White y Brown, 2010), el
cual es suministrado como fertilizante en los sistemas agrícolas. El N es un constituyente
de varios compuestos importantes en la célula, tales como los aminoácidos, las proteínas
(enzimas y proteínas estructurales), los ácidos nucleicos (ADN y ARN) , la adenosina
trifosfato (ATP), la clorofila y algunas fitohormonas (auxinas y citocininas). Además, los
contenidos de este elemento se consideran un determinante indirecto de la tasa
fotosintética , la acumulación de biomasa y el rendimiento, ya que es requerido
precisamente para la biosíntesis de clorofila y de las enzimas que fijan el co2 en la
fotosíntesis (Evans, 1983).
Se ha reportado que la duplicación de la producción agrícola mundial durante las últimas
cuatro décadas está asociada con un aumento de siete veces en el uso de fertilizantes
nitrogenados (Hirel et al., 2007) y se espera que este uso incremente aproximadamente
tres veces más para el 2050 (Good et al., 2004). La necesidad de su aplicación para una
producción vegetal óptima radica en que la fitodisponibilidad de este elemento en la gran
mayoría de los suelos agrícolas no es suficiente para suplir las cantidades requeridas
durante el rápido crecimiento de los cultivos (Mueller et al., 2012; Foley et al., 2011 ; White
y Brown, 201 0).
Sin embargo, actualmente existen dos grandes retos para la aplicación de una mayor
cantidad de fertilizantes nitrogenados a los cultivos, como una alternativa para continuar
incrementando la productividad agrícola. El primer reto es el impacto ambiental negativo
provocado por una aplicación excesiva de fertilizantes nitrogenados; se estima que los
cultivos vegetales son capaces de utilizar únicamente del 30 al40% del N aplicado (Raun
y Johnson, 1999); el 60% restante se pierde por lixiviación, denitrificación, volatilización,
etc. (Kant et al. , 201 0) . La pérdida de N por lixiviación, junto con la de fósforo , son las que
45
CAPITULO 11
más contribuyen a los procesos de eutrificación en el agua (Conley et al. , 2009). También,
los fertilizantes nitrogenados son la mayor fuente de emisión de gases de invernadero en
la agricultura (Galloway et al. , 2008). El otro reto en el uso de fertilizantes conteniendo N
inorgánico ha sido el enorme incremento en su precio, haciendo la agricultura poco
sustentable (Anbessa y Juskiw, 2012; White y Brown, 201 0).
Una alternativa para obtener una agricultura sustentable que permita minimizar la pérdida
de N, reducir el daño ambiental y el costo de las cosechas, sin comprometer la producción
y la cal idad de los alimentos, es desarrollar y/o cultivar variedades que realicen un uso
eficiente de N (NUE) , definido éste como el rendimiento (grano, fruto o follaje) por unidad
de N disponible en el suelo (Kant et al., 201 0) .
Para lograr este objetivo es necesario tener un conocimiento profundo de los mecanismos
regulatorios que controlan el NUE, particularmente cuando este elemento mineral es
limitado. El NUE es un parámetro complejo, regulado por diferentes genes (Gallais y Hirel ,
2004), y que involucra diferentes etapas, dentro de las que se encuentran , la toma, la
asimilación, la translocación, el reciclamiento y la removilización de N. El mejoramiento de
cada uno de estas características es muy específico para cada tipo de planta (Chardon et
al. , 2012), es por ello que el mejoramiento de cada cultivo individualmente requiere un
conocimiento global de las diferentes etapas antes mencionadas, así como un
conocimiento de las especificidades de cada especie vegetal en términos del metabolismo
del N.
Se ha estudiado la variabilidad genética que presentan diferentes especies vegetales para
crecer ante condiciones de déficit de N, con el objetivo de entender los procesos que
regulan el NUE y poder desarrollar cultivares con un mejor uso de N en suelos que tienen
bajos contenidos del mismo (lkram et al., 2012; Shi et al., 201 O; Anbessa et al., 2009;
Namai et al. , 2009; Richard-Molard et al., 2008 ; Presterl et al., 2003).
Por ejemplo, usando dos variedades de arroz que diferían en el NUE en el campo, Shi et
al. , (2010) reportaron que dos de las enzimas claves que participan en la asimilación del
N, la GS y la NADH-GOGAT tuvieron una función importante en la asimilación del N
cuando el cultivo se sometió a un déficit del mismo. Estos autores demostraron que la
regulación de estas enzimas parece ocurrir a nivel postranscripcional y no transcripcional
46
CAPITULO 11
en dichas condiciones. También sugirieron que el transportador de nitrato de alta afinidad
OsNRT2.1 tiene una función importante en la adquisión de N en esta especie, regulando
parcialmente la toma de N, el crecimiento y el desarrollo de la raíz.
Se ha reportado que la eficiencia en la utilización del N parece ser el parámetro que más
contribuye cuando las plantas de cebada son cultivadas en condiciones de poco N, en
comparación con la eficiencia en la toma de este elemento (Beattly et al., 201 0). Beattly et
al., (201 O) lograron observar diferencias en los contenidos de aminoácidos entre los
genotipos de cebada que podrían estar relacionados con la eficiencia en la utilización del
N que presentaron estos genotipos.
Recientemente, se estudió la variación de la respuesta en el crecimiento que presentaron
23 accesiones de Arabidopsis a la limitación y déficit de nitrato, evaluando diferentes
características morfológicas y metabólicas (lkram et al., 2012). Estos autores lograron
caracterizar diferentes respuestas adaptativas entre los ecotipos de Arabidopsis, las
cuales les permitían tolerar el desequilibrio en el suplemento de N exógeno. Estas
respuestas adaptativas fueron agrupadas en cuatro clases, dependiendo de la
condiciones de N a las que se expusieron y se demostró que el crecimiento en esta
especie estuvo regulado por algunas características principales, tales como la relación del
contenido de nitrato entre los brotes y la raíz, el peso fresco y el contenido de
aminoácidos de la raíz y el peso fresco del brote junto con el grosor de la raíz (lkram et
al., 2012).
A pesar de los trabajos descritos anteriormente, la mayoría de los estudios encaminados
a conocer la respuesta a un déficit de N se han llevado a cabo comparando la respuesta
entre plantas sometidas a un déficit de N versus plantas en condiciones no limitantes de N
(Krapp et al., 2011 ; Ding et al., 201 O; Bi et al. , 2007; Peng et al., 2007; Scheible et al. ,
2004; Wang et al., 2001 ). Este tipo de estudio permite conocer detalladamente cómo
ocurren estos procesos, pero no la importancia que ellos pudieran tener en la adaptación
de las plantas a la disponibilidad de N.
El género Capsicum, nativo de América subtropical y tropical , es uno de las especies
vegetales más cultivadas en el mundo y tiene un papel fundamental como constituyente
en muchas de las industrias alimentarias (Wang y Bosland , 2006). Además, Capsicum
47
CAPÍTULO 11
presenta un alto valor nutritivo, es una excelente fuente de vitaminas C, A, del complejo B,
y minerales como el fosfato, el potasio, el manganeso y el molibdeno, entre otros (Kothari
et al., 201 O) . Se sabe que el chile habanero, como cualquier otro cultivo, es vulnerable a
la escases de N, disminuyendo la producción de flores y frutos, así como los contenidos
de capsaicinoides en sus frutos (Monforte-González et al. , 201 O; Medina-Lara et al.,
2008) ; sin embargo, no existe un estudio detallado de la respuesta de esta especie a
condiciones de déficit de N en suelos. En el presente estudio se investigó la respuesta al
crecimiento en un déficit de nitrato, la principal fuente de N en los suelos agrícolas, en tres
diferentes variedades de chile habanero (Capsicum chinense Jacq .), con el objetivo de
identificar respuestas contrastantes que pudieran representar diferentes estrategias
adaptativas en esta especie a estas condiciones.
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS
2.2.1 Material vegetal, condiciones de crecimiento y tratamiento experimental
Para este estudio se utilizaron tres variedades de chile habanero, una fue el cultivar
naranja que comercializa la empresa SEMINIS (SEMINIS Vegetable Seeds, lnc. 2700
Camino del Sol , Oxnard , CA 93030, USA), que se cultiva comúnmente en México y otras
partes del mundo y, las otras dos variedades fueron colectadas en diferentes localidades
de Yucatán , México, y forman parte de la colección de chile habanero de la Dra. Nancy
Santana Buzzy (Centro de Investigación Científica de Yucatán) . La variedad NP4EC es un
chile habanero de color naranja altamente pungente, mientras que la variedad REX es de
color rojo .
Las semillas fueron esterilizadas superficialmente usando etanol al 80% (v/v) por cinco
minutos. Después de cuatro lavados con H20 destilada estéril , permanecieron 15 minutos
en hipoclorito de sodio [30% (v/v) , Cloralex™, Alen del Norte, S.A. de C.V.], y nuevamente
se lavaron por cuatro ocasiones con H20 destilada. Estas semillas se sometieron a un
proceso de estratificación en agua a 4 °C, por tres días. Las semillas fueron colocadas en
cajas de Petri de cristal (50 semillas por caja) que contenían una capa fina de algodón ,
papel filtro estéril y 1 O mi de H20 destilada y se mantuvieron en un cuarto oscuro a 24 ± 2
oc hasta que ocurrió la germinación (aproximadamente al quinto día de incubación) .
Las semillas germinadas fueron colocadas en recipientes de 400 mL conteniendo
48
CAPÍTULO 11
vermiculita estéril (70 g de vermiculita y 15 semillas por recipiente) y las plántulas fueron
cultivadas durante 45 días en un cuarto de crecimiento a 25 ± 2 oc. con una humedad
relativa del 50% y un ciclo de fotoperíodo de 16 h luz 1 8 h oscuridad. La intensidad de luz
fue de 123 !Jmol m·2 s·1. Se utilizó la solución nutritiva Hoagland (50 mL por recipiente)
modificada por Richard-Molard et al., (2008) , a 1/5 de su fuerza iónica, la cual contenía 1
mM de CaCI, 2.5 1-1M de H3803, 0.2 1-1M de MnS04. H20 , 0.2 1-1M ZnS04, 0.1 1-1M de CuS04.
HzO, 0.02 1-1M de NazMo04.2HzO, 21-1M de Fe-EDTA, 4 mM de KHzP04, 4 mM de MgS04 y
1 mM de KN03 como fuente de N y el pH se ajustó a 5.8. La solución nutritiva fue
reemplazada por una solución fresca una vez en los primeros quince días de crecimiento
y posteriormente cada semana, hasta los 45 días. La vermiculita se mantuvo
completamente húmeda adicionando H20 desti lada estéril (aproximadamente 50 mL) al
cuarto día después de cada renovación del medio, para evitar una acumulación de sales
por evaporación del agua. Posteriormente, la vermiculita fue retirada y las plántulas se
trasfirieron por cuatro días a condiciones de hidroponía en el medio descrito previamente,
pero a ~de su fuerza iónica, manteniendo el N como 1 mM de KN03.
Para el tratamiento de déficit de N, un grupo de plántulas de cada variedad se transfirió a
una solución nutritiva (5 mM de CaCI, 12.5 !JM de H3803 , 1 1-1M de MnS04.H20 , 1 !JM
ZnS04, 0.5 1-1M de CuS04. 5 H20 , 0.1 1-1M de Na2Moü4.2H20 , 10 !JM de Fe-EDTA, 20 mM
de KH2P04, 20 mM de MgS04), en la cual el KN03 fue eliminado del medio y se le
adicionó 1 mM de KCI para mantener los niveles de K. La cosecha del material se realizó
a los O, 2, 4 , 6 , 8 y 1 O días del tratamiento de déficit y el material vegetal fue rápidamente
congelado en N líquido y almacenado a -80 oc para el posterior análisis de metabolitos y
estudio molecular. Se usaron 20 plántulas en cada cosecha (180 plántulas totales) .
Como testigo , otro grupo de plántulas se transfirió a la solución nutritiva descrita
anteriormente, pero en este tratamiento el KN03 fue mantenido a 1 mM. La cosecha del
material se realizó únicamente a los 1 O días de exposición y el material vegetal fue tratado
de igual manera a lo expuesto anteriormente.
Se realizaron tres experimentos independientes bajo las mismas condiciones.
49
CAPITULO 11
2.2.2 Medición de los pesos fresco y seco y determinación de la velocidad media relativa de crecimiento
Las plántulas sometidas a los tratamientos anteriores fueron fotografiadas (cámara Canon
EOS, Rebel Tli) en cada tiempo de cosecha (tres plántulas por tratamiento). Las raíces de
estas plántulas fueron secadas con papel toalla y se separaron de los brotes
inmediatamente después de cosechadas, y se pesaron para obtener el peso fresco de
ambas partes. Para determinar el peso seco, el material fue colocado en estufa a 70 oc hasta peso constante.
El valor medio de la velocidad relativa de crecimiento ( R) fue calculado de acuerdo a la
fórmula reportada por Gregory (1992):
t2 - t1
donde W 1 y W2 son el peso seco al tiempo O (t1) y a los 1 O días de tratamiento (t2) ,
respectivamente.
2.2.3 Análisis de nitrato, aminoácidos y proteínas totales
Para el análisis de nitrato se maceraron 100 mg de raíz y hoja con N líquido, se
adicionaron 2 mL de H20 destilada y desionizada y la muestra se hirvió durante 2 minutos.
Después de enfriar y aforar a 1 O mL con H20 destilada y desionizada , la muestra se filtró
con papel filtro (Whatman no. 2) . El extracto proveniente de hoja fue tratado con 0.02 g de
carbón activado previo a ser filtrado para eliminar el efecto de la clorofila. La
determinación de nitrato (mg-1 g de peso fresco) se realizó siguiendo la metodología
descrita por Cawse (1967) , usando una curva estándar de KN03 (Sigma-Aidrich) .
Para el análisis de los aminoácidos se pulverizaron 200 mg de raíz y hoja con N líquido,
se adicionó un mL de metanol al 80% (v/v) y se centrifugó a 10.000 x g por 20 minutos. El
sobrenadante fue usado para la determinación de los aminoácidos (mg-1g de peso fresco)
siguiendo la metodología de Yemm y Cocking (1955). Brevemente, 0.5 g de ninhidrina
(Sigma-Aidrich) fueron previamente disuelto en 12.5 mL de metilcelosolve (Sigma
Aidrich) . El reactivo de ninhidrina fue preparado adicionando a esta solución 12.5 mL de
un amortiguador de citrato (0.2 M, pH 5) , conteniendo 0.4 g de cloruro de estaño. Para la
50
CAPITULO 11
reacción, el volumen de muestra se completó a un mL, se le adicionó un mL del reactivo
de ninhidrina y se colocó en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos. Después de
enfriar, se adicionaron 2.5 mL de isopropanol al 50 % (v/v) y se mezcló. Después de
reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente, se leyó la absorbancia a 570 nm.
Para la determinación se usó una curva patrón con glutamato de potasio (Sigma-Aidrich).
Para la extracción de proteínas, se maceró un g de raíz y hoja en N líquido, adicionando
1% de polivinil pirrolidona (p/v) , se adicionaron 2.5 mL del amortiguador de extracción (50
mM de NaCI, 1 mM EGTA, 50 mM Tris-HCI (pH 7.4), 250 mM sacarosa, 10% de glicerol, 1
mM de feniletanolsulfonil fluorida (PMSF), 1 O mM de Na4P20 7 , 0.2 mM de NaN04 , 1 mM
13--mercaptoetanol) y se homogenizó en un politrón. El sobrenadante obtenido después
de centrifugar a 12.000 x g por 30 minutos a 4 oc fue usado para la determinación de
proteínas totales (mg·1g de peso fresco) , mediante el método de Bradford (1976),
siguiendo el protocolo del fabricante (BioRad, No. Cat. 500-0006). Para la cuantificación
se realizó una curva patrón usando albúmina sérica bovina como estándar.
Se realizaron dos extractos diferentes para todas las determinaciones y los ensayos se
realizaron por triplicados.
2.2.4 Ensayo de absorción neta de nitrato
Para evaluar la absorción neta de nitrato, las plántulas expuestas a un déficit de N por los
diferentes tiempos, fueron colocadas en una solución conteniendo 0.2 mM de KN03
durante 15 minutos. El contenido de N03- en el medio fue evaluado antes y después de la
toma, siguiendo el protocolo descrito anteriormente y usando 1.5 mL del medio filtrado
previamente. La tasa de absorción neta de N03- (1Jmoles de nitrato g·1 de peso seco de la
raíz minuto-1) fue calculado a partir de la diferencia entre el contenido inicial y el final de
N03- en el medio. Después de la toma, el peso seco de la raíz fue determinado como se
describió anteriormente. En este ensayo, se usaron seis plántulas por tratamiento.
2.2.5 Análisis de los niveles de transcripto del CcNRT2.1 por RT -PCR
Para evaluar los niveles de expresión del transportador de N03-de alta afinidad de chile
habanero CcNRT2.1 se utilizaron las plántulas sometidas a los diferentes períodos de
déficit de N03-. El ARN total se aisló a partir de tej ido de raíz de estas plántulas usando el
51
CAPÍTULO 11
reactivo TRIZOL (lnvitrogen) . La síntesis del ADNc se realizó partiendo en todos los casos
de 1 IJg de ARN total , utilizando la enzima transcriptasa reversa SuperScrip TM
(lnvitrogene) usando oligo-dT y , siguiendo las indicaciones del protocolo provistas por el
fabricante. Para la PCR, se usaron los cebadores específicos F4 y R1 (Cuadro 2 .1), los
cuales fueron diseñados previamente a partir de la secuencia de un ADNc total de
CcNRT2.1 aislada en el laboratorio a partir de raíces de chile habanero de la variedad
SEMINIS. Se partió de un IJI de ADNc (-100 ng) y se usó la Taq polimerasa Platinum
(lnvitrogen) . Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 96 oc por 2 min ; 35 ciclos de
94 oc por 30 s, 56 oc por 30 s, 72 oc por 40 s, y 72 oc por 1 O m in . El producto de
amplificación fue separado y visualizado en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro
de etidio. La tubulina sirvió como control de cantidad del ADNc en la reacción , usando los
cebadores: F-5' GACCTTGAA TCGGCTTATGG 3' y R-5' TATCCTGGGTGAACGCTTTG
3'.
Para este estudio, la RT-PCR se realizó partiendo de dos extractos diferentes de ARN de
cada tratamiento y las PCR se hicieron por duplicado para cada extracto.
Para profundizar en las características de este transportador en las variedades NP4EC y
REX, en comparación con la variedad SEMINIS a partir de la cual se aisló esta secuencia,
se diseñaron varios cebadores para amplificar diferentes regiones del transportador. Para
ello, se seleccionó el ARN de las muestras sometidas durante dos días de déficit de
nitrato para cada variedad . Se realizaron PCRs usando las siguientes combinaciones de
cebadores (Cuadro 2.1): F1-R5 (Tm =55 oc), F1-R4 (Tm =56 oc), F2-R3 , F3-R2 (Tm =
58 °C) , F1-R1 (Tm = 55 OC) y el tamaño esperado para estos productos de PCR fueron :
454, 609 , 442 , 418 y 1593 pb, respectivamente. Las condiciones de PCR fueron similares
a las anteriores, cambiando solamente el tiempo de reacción de la polimerasa de acuerdo
al tamaño del producto esperado y en esta ocasión el número de ciclos fue de 40.
52
CAPÍTULO 11
Cuadro 2.1 Secuencia de los cebadores que se usaron para amplificar por PCR los niveles de
transcripto del CcNRT2.1
CEBADOR
Fl
F2
F3
F4
SENTIDO
5' ATG GCT GAT GTG GAA GGA GA 3'
5 ' GCT GCC GCC CCT TIA GTC CC 3'
5 ' TCC TTI GTI TCG TCT GC 3'
5' ATA TIC GGC ATG AGA GGG AGA CTI T 3'
ANTISENTIDO
Rl 5 'TCA GAC GCG GCT CGG TGT CA 3'
R2 5' CGA AGA TCC ACG TCC TG 3'
R3 5 ' ACG CAA TIC TCC AAG CAG TG 3'
R4 5 ' TIG AGT TGC ACC GCC ACC CAT GTI T 3'
RS 5' CGG CAG ACG AAA CAA AGG ACA TACA 3'
2.2.6 Análisis estadístico
Todos los datos fueron sometidos a un análisis de varianza (ANOVA) y las diferencias
entre las medias fueron comparadas en una prueba de rangos múltiples Tukey (P s 0.05)
usando el paquete estadístico SIGMA STAT v.11 .
2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
2.3.1 Diferencias en el crecimiento entre las variedades de chile habanero sometidas a un déficit de N.
En este estudio se analizaron los cambios en el peso fresco y la producción de biomasa
seca de tres variedades de chile habanero, cultivados en hidroponía bajo condiciones de
déficit de N. En la figura 2.1 se observa que existieron diferencias en el crecimiento entre
las tres variedades cuando fueron sometidas a dicho tratamiento. La variedad NP4EC
mostró los mayores valores de peso fresco y seco al décimo día de tratamiento, tanto de
53
CAPITULO 11
la parte aérea (figuras 2.1 A y B), como de la raíz (figuras 2.1 C y D).
A pesar de que el peso fresco de la parte aérea fue diferente entre las variedades al inicio,
la variedad NP4EC prácticamente duplicó su peso inicial al final del experimento, mientras
que las variedades REX y SEMINIS alcanzaron un aumento entre el 1.4 y 1.7 veces,
respectivamente con relación a su peso inicial (figura 2.1 A) . Sin embargo, la diferencia
entre estas variedades fue aún mayor en los incrementos presentados en el peso seco de
la parte aérea al final del experimento, donde éstos fueron de alrededor de 4, 2 y 3 veces
para NP4EC, REX y SEMINIS, respectivamente (figura 2.1 B).
NP4EC también produjo mayor crecimiento radicular en condiciones de déficit, comparado
con las otras dos variedades, en las que presentó una ganancia de alrededor de 5 y 4
veces en el peso fresco y la producción de materia seca, respectivamente; mientras que
la ganancia en las otras variedades fue similar entre ellas de aproximadamente 3 y 1.7
veces para peso fresco y seco, respectivamente (figuras 2.1 C y D).
Por otro lado, la variedad REX presentó mayor masa fresca y seca de la parte aérea y
radicular, al décimo día de tratamiento, comparada con SEMINIS (figura 2. 1 ). Sin
embargo, la ganancia en ambos pesos durante el período de déficit, fue similar entre
ambas variedades y en algunos casos fue ligeramente superior en SEMINIS. Los datos al
inicio del experimento, los cuales fueron siempre superiores para la variedad REX
comparada con SEMINIS parecen explicar este comportamiento (figura 2.1 ).
54
CAPITULO 11
1.6 ....¡r NP4EC aAA B ....... REX a A
~ SEMINIS 0.24
1.2
0.18
0.8 0.12
-t'n0.4 0.06 -o o (/)
~ 0.0 o 8:89 - aA o ID o.9 a.
0.04
0.6
0.02 0.3
0.0 L-....___..__ ........ _....._ ....... _ ...... ....L__,_....__....._ ....... _....._ ........ __, 0.00 o 2 4 6 8 10 o 2 4 6 8 10
Tiempo (días)
., ('D (/)
o (/) ('D o o -ca
Figura 2.1 Dinámica de la respuesta de crecimiento de tres variedades de chile
habanero sometidas a un déficit de N durante un período de 1 O días, seguido
por la evolución del peso fresco (A) y seco (B) de la parte aérea y, el peso
fresco (C) y seco (D) de la parte radicular. Los datos representan el valor
promedio ± error estándar (n=3) . Las letras minúsculas representan diferencias
significativas (P :s 0.05) entre los diferentes días de déficit de N dentro de una
misma variedad, mientras que las letras mayúsculas representan diferencias
significativas entre variedades dentro de un mismo día de tratamiento.
En conjunto, estos datos indican que la variedad NP4EC fue menos susceptible a un
déficit de N, comparada con las otras dos variedades. Además, la capacidad para crecer
55
CAPÍTULO 11
en ausencia de una fuente externa de N demuestra que es capaz de removilizar sus
reservas endógenas de N.
Diferencias en los parámetros de crecimiento entre cultivares de una misma especie
cuando las plantas son sometidas a condiciones limitantes o a déficit de N han sido
reportados previamente (Sales et al., 2011 ; Shi et al., 201 O; Richard-Molard et al., 2008).
Dos cultivares de arroz aumentaron el peso seco de la parte aérea y radicular cuando
fueron sometidos en condiciones de hidroponía a concentraciones limitantes de N (Shi et
al., 201 0) . Sin embargo, uno de éstos, que previamente demostró un mayor NUE en
condiciones de campo, logró alcanzar una mayor materia seca durante el mismo período
(Shi et al., 201 0). En Arabidopsis también se ha observado un aumento en los pesos
fresco y seco de ambas partes de la planta cuando ésta crece en déficit de N (Krapp et
al., 2011).
Se observó que todas las variedades alcanzaron un peso seco total mayor cuando se les
cultivó durante 1 O días en presencia de 1 mM de KN03, comparadas con el tratamiento de
déficit de N (figura 2.2 A). Estos datos indican que aun cuando el valor de peso seco de
ambas partes de la planta fue aumentando durante el periodo de déficit, estos sí son
afectados por esta condición. Los valores mayores fueron obtenidos nuevamente para la
variedad NP4EC, siendo 1.6 y 2.2 veces superiores a los encontrados para las variedades
REX y SEMINIS, respectivamente. Estos resultados indican que cuando esta variedad se
le cultiva bajo condiciones normales de nitrato podría ser capaz de absorber y/o utilizar
mejor el N que las otras dos. Además, aunque esta estrategia puede favorecerla cuando
crece en presencia de este elemento, también parece hacer un mejor uso de N bajo
condiciones de escasés.
También , se observaron diferencias significativas en la relación peso seco radicular 1 peso
seco aéreo entre los diferentes días de exposición al déficit de N y entre variedades, lo
cual refleja diferencias en las velocidades de crecimiento entre ambas partes de la planta
(figura 2.2 B). La variedad NP4EC redujo significativamente esta relación desde el
segundo día de tratamiento, manteniendo niveles bajos hasta el octavo día. Al décimo día
estos valores fueron similares a los presentados al in icio del tratamiento, pero
significativamente menores al de las plántulas testigo cultivadas en presencia de N (figura
2.2 B).
56
CAPÍTULO 11
Este comportamiento no coincide con lo reportado previamente en gramíneas (Jarvis y
Macduff, 1989), té (Anandacoomaraswamy et al. , 2002) y Arabidopsis (Krapp et al., 2011 ;
Richard-Molard et al. , 2008), donde los autores reportan un aumento en la relación peso
seco radicular 1 peso seco aéreo ante condiciones de déficit de N, planteando que ocurre
un desvío de carbono hacia la parte subterránea de la planta para que la elongación de la
raíz se pueda mantener o estimular. En nuestro caso, la variedad NP4EC mantuvo
constante el peso seco de la raíz durante los primeros cuatro días del tratamiento de
déficit; sin embargo, aumentó el de la parte aérea en este período (figuras 2.1 8 y D),
provocando la reducción observada en esos días para esta relación (figura 2.2 8).
Para la variedad REX esta relación disminuyó solamente al octavo día; además, cuando
se comparó al décimo día en ambos tratamientos esta relación fue mayor a la de las
plántulas testigo creciendo en presencia de N (figura 2.2 8). La variedad SEMINIS redujo
la relación al cuarto día de tratamiento, posterior a lo ocurrido con la variedad NP4EC,
manteniendo niveles bajos a los 8 y 1 O días de tratamiento. Al final del experimento, esta
variedad tuvo un comportamiento similar a REX, comparada con su testigo, creciendo en
presencia de N (figura 2.2.8).
57
CAPITULO 11
0.4
-O) -...J <( 0.3 l-o l-o ~ 0.2 tJ)
o tJ) w D.. 0.1
0.0
A
a A
NP4EC
Ooo - 010 (·N) D D10(+N}
REX SEMINIS
8 O ayo
o
~ -l'l
10
+N 10
0.0
O ayo o
-l'l
10
+N 10
0.0
O ayo o
-N
10
10 +fl
0.0
NP4EC
aA
b6
bA
b6
abA
AbA
' A
0.1 0.2 0.3 0.~
REX
lA
o A
abA
lA
cA
a ' A
A
0.1 0.2 0.3 0.4
SEMINIS
ocA
odA
bA
abAS
bcA
bcd • A
j-< A
0.1 0.2 0.3 0.4
RELACIÓN PESO SECO BROTE:RAÍZ
Figura 2.2 Comparación de las respuestas de crecimiento de las variedades de
chile habanero sometidas a un período de déficit o en presencia de N (testigo).
A. Peso seco total de las plántulas al día O (DO) y al día 1 O de cultivo en
condiciones de déficit de N [010 (-N)] o no limitantes de N [1 mM de KN03, 0 10
(+N)]. B. Relación peso seco de la raíz /peso seco de la parte aérea durante los
diferentes días de déficit de N y a los 1 O días de cultivo en presencia de 1 mM
de KN03. Los datos en A y B son el valor promedio ± error estándar (n=3). Las
letras minúsculas representan diferencias significativas (P s 0.05) entre los
tratamiento dentro de una misma variedad , mientras que las letras mayúsculas
representan diferencias significativas entre variedades dentro de un mismo día
y/o condición de tratamiento.
Estos resultados demuestran respuestas adaptativas diferentes entre variedades, en
cuanto a partición de materia seca, siendo NP4EC la que mostró un impacto más rápido
58
CAPÍTULO 11
del déficit de N al modificar este parámetro desde los dos días de déficit.
En las plántulas mostradas en la figura 2.3 se pueden observar los cambios morfológicos
descritos previamente para las plántulas sometidas por 1 O días a ambos tratamientos. Se
observa un mayor crecimiento en las plántulas que se cultivaron en presencia de N por 1 O
días, comparadas con aquellas que lo hicieron en déficit. NP4EC presentó un sistema
radicular más desarrollado, comparado con las otras dos variedades y en cualquier
condición . Este sistema radicular más desarrollado podría mantener un mayor crecimiento
en la parte aérea, así como optimizar la adquisición de N del suelo a concentraciones
reducidas de este elemento. En cebada se ha reportado que genotipos identificados como
relativamente eficientes para el uso de N en el campo presentan un peso seco de la raíz
superior a los demás (Anbessa y Juskiw, 2012).
NP4EC REX SEMINIS
Figura 2.3 Imagen de las plántulas de las tres variedades de chile habanero al
inicio del experimento (A) y a los 1 O días de cultivo en presencia (B) o déficit (C)
de N.
También se observa un mayor crecimiento de la parte aérea en esta variedad (figura 2.3).
En este sentido, un incremento en la biomasa ha sido implicado como la mayor base
fisiológica de la ganancia genética en el rendimiento de los cultivos, siendo un
componente importante del NUE (Tollenaar et al. , 2004). La alta producción de biomasa
que presenta NP4EC debe ser el resultado de una mayor utilización del N absorbido,
comparado con las otras variedades.
59
CAPÍTULO 11
Los valores medios de velocidades relativas de crecimiento fueron siempre superiores en
NP4EC que en el resto de las variedades (Cuadro 2.2). En todas las variedades estos
valores disminuyeron cuando éstas crecieron en ausencia de N (Cuadro 2.2), siendo este
comportamiento un indicativo de que los recursos necesarios para el crecimiento no están
disponibles en razón proporcional al crecimiento de la planta. Se plantea que las
diferencias en estos valores entre especies pueden ser importantes en los ecosistemas
naturales, siendo precisamente las especies de crecimiento rápido las dominantes en
hábitats alterados o con elevado potencial productivo (Gregory, 1992).
Cuadro. 2.2 Valores medios de la velocidad relativa de crecimiento : N+: plantas testigo
cultivadas durante 1 O días en presencia de N; N- : plantas sometidas a déficit de N por
10 días.
R {g PS/día}
VARIEDADES A E REO RAÍZ N+ N- N+ N-
NP4EC 0.14 0.11 0.14 0.09
REX 0.07 0.04 0.06 0.05
SEMINIS 0.11 0.07 0.08 0.05
2.3.2 Variabilidad de metabolitos nitrogenados entre las variedades de chile habanero en respuesta al déficit de N
Con el objetivo de explicar la variación entre las tasas de crecimiento de chile habanero
presentadas durante el período de déficit en y entre variedades, se determinaron los
niveles de metabolitos relacionados con la asimilación del N, tales como N03-,
aminoácidos totales y proteínas totales en las raíces y parte aérea de las plantas.
Al inicio del experimento, (día O) los valores de N03- en la raíz de todas las variedades
fueron superiores a los de las hojas, siendo 3.6, 6 y 9 veces mayores entre estos órganos
en la variedad NP4EC, REX y SEMINIS, respectivamente (figuras 2.4 A y B) . NP4EC
presentó los mayores contenidos de N03- en este día, siendo prácticamente el doble a los
presentados por las otras variedades en ambas partes de la planta (figuras 2.4 A y B).
60
CAPÍTULO 11
Estos datos muestran que esta variedad es capaz de tener una mayor absorción de No3-
y /o almacenamiento en sus tejidos cuando crece expuesta a condiciones normales de
N03-, en comparación con las otras dos variedades.
La dinámica de este metabolito en la parte aérea durante el período de déficit fue similar
en todas las variedades, observándose un aumento del mismo cuando incrementó el
período de exposición al déficit, excepto para las variedades REX y SEMINIS, en las que
este aumento fue menor o no ocurrió a partir del día 8 (figura 2.4 A). El aumento del
contenido de N03- en la parte aérea al final del período de déficit fue similar en las tres
variedades, correspondiendo a aproximadamente a 0.55 mg de N03- por g de peso fresco
de la parte aérea (figura 2.4 A) .
Sin embargo, la dinámica del contenido de N03- en el sistema radicular en las variedades
expuestas al déficit fue dependiente de la variedad (figura 2.4 B). NP4EC redujo los
niveles de este compuesto durante todo el período de déficit, alcanzando una disminución
de aproximadamente 0.6 mg de nitrato por g de peso fresco (figura 2.4 B). Estos
resultados sugieren que esta variedad podría estar removilizando el N03- almacenado en
la raíz hacia la parte aérea para mantener el crecimiento en condiciones de déficit de N.
En cambio, la variedad REX aumentó los niveles de N03- en las raíces durante los
primeros cuatro días de déficit y posteriormente estos niveles disminuyeron alcanzando al
décimo día valores menores a los de la variedad NP4EC (figura 2.4 B). Al final del período
de tratamiento, no se encontraron cambios significativos en el contenido de N03- en la
variedad REX, comparado con los que estaban presentes al inicio del experimento (figura
2.4 B) . La variedad SEMINIS presentó un comportamiento similar a NP4EC, ya que los
niveles de N03- disminuyeron en las raíces de las plántulas expuestas a 'déficit,
equivaliendo esta disminución a aproximadamente 0.48 mg de N03- por g de peso fresco
de la raíz (figura 2.4 B). Sin embargo, la dinámica no fue similar; SEMINIS redujo estos
niveles al día 2 de tratamiento, pero posteriormente aumentaron , manteniéndose altos
hasta el día 6, a partir del cual comenzaron a disminuir nuevamente (figura 2.4 B).
Una reducción en los niveles de N03- ha sido reportada tanto en la parte aérea como en el
sistema radicular, de varias especies vegetales cuando son sometidas a un período de
déficit de N03- y esta disminución ha sido mucho más rápida que la de otros compuestos
nitrogenados. Los resultados obtenidos en este trabajo para la variedad NP4EC y
61
CAPÍTULO 11
SEMINIS en el sistema radicular coinciden con los trabajos reportados previamente
(Krapp et al., 2011 ; Din et al. , 201 O; Richard-Molard et al., 2008; van der Leij et al., 1998;
Macduff et al. , 1989; Mackown, 1987). Este comportamiento es una evidencia de que las
plantas de chile habanero movilizan sus reservas para mantener el metabolismo
nitrogenado en los primeros días de déficit, particularmente NP4EC. Sin embargo, en la
parte aérea esto no ocurre. Los valores iniciales de N03- detectados para chile habanero
demuestran que esta especie acumula más en la raíz cuando es expuesta a No3·,
sugiriendo una menor asimilación del N03- en la raíz y/o una mayor asimilación en las
hojas y/o una menor translocación de este nutrimento desde la raíz hacia las hojas.
Debido a que este nutriente se acumula mayoritariamente en la raíz en esta especie es
probable que ésta y no la de la parte aérea sea la poza de N03- que se removilice en
condiciones de déficit, siendo este mecanismo dependiente de la variedad.
Arabídopsís acumuló tres veces más nitrato en la parte aérea que en la raíz después de
35 días cultivo en presencia de 6 mM de nitrato, pero los niveles de este compuesto se
redujeron en un 70%, tanto en la parte aérea como en la radicular durante las primeras 24
horas (Krapp et al., 2011 ). Una mayor acumulación de nitrato en la hoja también parece
ser una característica general en cereales (Fan et al., 2007).
62
CAPITULO 11
u:Q.
~
1.2 -9- NP4EC
~REX
-9- SEMINIS 1.0
0.8
0.6
0.4
A a A 4
3
u:- 2 a. c::n 0,1 .§.
e 8
u:Q. c::n2 -c::n E
~ 0.0 ~ o~------~~~~ B 02.0 aA D
;(o~------~~~~ z
·¡¡¡ 5 lo 0:::4 a.
o 1.5
z 1.2
0.6
0.3
o ·< o ~1.5
::::!!: <(
1.0
0 .5
3
2
0.0 f~..._.___._ .................. ___.__........_;Jf o 2 4 6 8 10 o 2 4 6 8 10 o 2 4 6 8 10
TIEMPO (DÍAS)
Figura. 2.4 Niveles de nitrato (A y 8) , aminoácidos totales (C y D) y proteínas
totales (E y F) en las variedades de chile habanero durante un período de 1 O
días de déficit de N. Los datos representan el valor promedio ± error estándar
(n=3). Las letras minúsculas representan diferencias significativas (P ::; 0.05)
entre los tratamiento dentro de una misma variedad , mientras que las letras
mayúsculas representan diferencias significativas (P ::; 0.05) entre variedades
dentro de un mismo día de tratamiento.
El nitrato no sólo es considerado como una fuente de nutriente, sino también se reporta
que tiene una función como señal en las plantas. El nitrato regula en minutos la expresión
de 300 a 600 genes de manera específica, perteneciendo a diferentes categorías
funcionales como transporte de iones, metabolismo primario y secundario, homeostasis
de hormonas, transcripción y procesamiento de ARN , entre otras (Krouk et al. , 201 Oa;
Gutierrez et al. , 2007; Wang et al., 2004). El nitrato también estimula el número de raíces
laterales (Krouk et al. , 201 Ob; Zhang et al., 1999) y la elongación radicular (Remans et al. ,
2006; Zhang et al. , 1999; Zhang y Forde, 1998). Por otro lado, el crecimiento de la parte
aérea es igualmente dependiente de la señalización por N03-, donde éste regula la
63
CAPÍTULO 11
expansión de la hoja, a través de la estimulación de la biosíntesis de citocinina en la raíz y
su translocación hacia la parte aérea (Kiba et a/., 2011 ). La función señalizadora del N03-
no debe de ser descartada en este trabajo, dada la variación de los contenidos
endógenos de este elemento entre las variedades con diferentes tasas de crecimiento.
Por otro lado, los niveles de aminoácidos fueron menores en la raíz, comparado a los de
la hoja al inicio del tratamiento y en todas las variedades (figura 2.4 8) . Estos resultados
corroboran que chile habanero presenta una mayor asimilación del N en la parte aérea
que en la parte radicular, como se planteó anteriormente. Nuevamente, la variedad
NP4EC presentó los mayores valores en este metabolito nitrogenado en ambas partes de
la planta, lo cual indica que esta variedad presenta una asimilación de N más alta,
comparada a las otras dos, cuando crece en presencia de N03-.
La dinámica del contenido de aminoácidos durante el período de déficit fue similar entre
las variedades y en ambas partes de la planta; se observó una reducción en el contenido
de los mismos durante el período (figura 2.4 8) . La reducción fue prácticamente lineal en
la raíz en las tres variedades y en la hoja en la variedad REX; sin embargo, en NP4EC se
observó una reducción en la hoja en los primeros dos días de déficit, los valores se
mantuvieron hasta el día seis, disminuyendo posteriormente y, para SEMINIS, la
reducción continuó hasta el día cuatro, permaneciendo similar hasta el sexto día y
disminuyendo posteriormente como sucedió en NP4EC (figura 2.4 8). La mayor
removilización ocurrió en NP4EC y en tejido de hoja, siendo aproximadamente de 2 mg de
aminoácidos por g de tejido fresco (figura 2.4 8) . NP4EC mantuvo los mayores niveles de
aminoácidos al final del período de déficit en ambas partes de la planta (figura 2.4 8) y
esta poza mínima de aminoácidos podría ser vital para la síntesis de proteínas esenciales
u otros compuestos con una alta tasa de recambio bajo estas condiciones. Nuestros
resultados concuerdan con los reportados para Arabidopsis (Krapp et a/. , 2011 ; Richard
Molard et al. , 2008) y tabaco (Fritz et al., 2006). Recientemente, se reportó que el
contenido de aminoácidos en las raíces fue una característica regulatoria que coordinaba
el crecimiento en Arabidopsis cuando ésta se sometía a un suplemento limitante de N
(lkram et al., 2012).
En cuanto al contenido de proteínas, aunque los niveles mostraron cambios significativos
durante el período de déficit (figura 2.4 C) , éstos no fueron tan dramáticos como aquellos
64
CAPÍTULO 11
observados para N03- y aminoácidos, lo cual fue similar a lo reportado para Arabidopsis
(Richard-Molard et al. , 2008). NP4EC presentó los mayores valores de proteínas en la
raíz y las hojas al inicio del experimento, corroborando nuevamente que esta variedad
presenta una mayor asimilación de N03- cuando crece en presencia de éste (figura 2.4 C).
Al final del período de déficit éstos también permanecieron mayores en la raíz de NP4EC,
comparado con las otras dos variedades, mientras que en las hojas estos valores fueron
similares entre NP4EC y REX y mayores que los de SEMINIS.
El contenido de proteínas es un parámetro importante a tener en cuenta , ya que por
ejemplo cultivares de trigo con altas concentraciones de proteínas fueron más eficientes
para translocar N del tejido vegetativo al grano (Kade et al. , 2005; Wang et al. , 2003;
Deckard et al. , 1996). Wang et al., (2009) reportaron que un cultivar de trigo con alto
contenido de proteína en la parte vegetativa tuvo un índice de cosecha (porcentaje de
materia seca desviada al grano) mayor, comparado con los de menor concentración.
Suprayogi et al. , (2011) también reportaron que la concentración de proteínas en el grano
de trigo fue mayor en aquellas variedades que presentaron una mayor concentración de
proteínas.
En la figura 2.5 se pueden observar claramente los procesos de removilización de
metabolitos nitrogenados antes mencionados con las variaciones en los contenidos de
éstos entre el inicio y el final del período de déficit. También se describen los contenidos
de estos metabolitos en las hojas y las raíces de las plántulas testigos cultivadas durante
1 O días en presencia de 1 mM de N03-. Cuando la variedad NP4EC es expuesta a 1 mM
de nitrato, fue capaz de presentar niveles de aminoácidos y proteínas mayores a los 10
días de tratamiento que el resto de las variedades, fundamentalmente en la parte aérea
(figura 2.5 A) , aunque este comportamiento también ocurre en la raíz (figura 2.5 8). Este
resultado ratifica la mayor asimilación de N que se produce en esta variedad bajo estas
condiciones.
65
CAPÍTULO 11
A ~>•v • NP4EC
• =:::J eA
""" ===:;-::~ aA '"" ;:::::::;:=~a~B:__ ~· .. •.• 1?
____ _¡ aA -Nto=:::JcA
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o , a , ..
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___ ____, aA.
D•r• REX • :J ea
-"'0
===~b=B~ .. N ,.,======:_:bA
0.0 .,... ... u NO; (mg/g PF)
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•Mto~bB
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AMINOACIDOS (mglg PF)
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o••• SEMINIS •]be
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0.0 OA. 0.1 U
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O 1 a: S <4 $
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AMIN•OAeiDOS (mg/ g PF)
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·••• -=:Jbe 0.0 u u 1) lAI
----'"e .N1o~bC
__ _, bC
.4f't0 aC
.==.==.==)::'..:. ~. -= •
Figura. 2.5 Comparación entre las plántulas testigos cultivadas en presencia de
N y las expuestas a déficit a los 1 O días de tratamiento , en cuanto al contenido
de metabolitos nitrogenados en las raíces y parte aérea. Los valores
representan el valor promedio ± error estándar (n=3). Las letras minúsculas
representan diferencias significativas (P ::; 0.05) entre los tratamiento dentro de
una misma variedad, mientras que las letras mayúsculas representan
diferencias significativas (P::; 0.05) entre variedades dentro de un mismo día de
tratamiento .
Al estudiar la relación entre el peso seco total de las plantas y los contenidos totales de
estos metabolitos, tanto en las plantas testigos como las sometidas al tratamiento de
déficit, por un período de 10 días, se observa que a medida que aumentaron los
contenidos de nitrato en estas plantas aumentó el peso seco de las plantas (figura 2.6 A).
Cuando las plantas se cultivaron en presencia de N, hubo una relación directa entre el
contenido de este elemento y la producción de materia seca y esta relación fue
66
CAPITULO 11
independiente de la variedad . Sin embargo, cuando se les cultivo en presencia de N, el
efecto de los contenidos de nitrato en la planta sobre la producción de materia seca
dependió de la variedad , no observándose una relación en la variedad REX bajo esta
condición (figura 2.6 A).
Los conten idos totales de aminoácidos en las plantas tuvieron un impacto directo sobre el
peso seco de las mismas; a medida que aumentaron estos valores incrementó
linealmente el peso seco de las plantas (r2=0.894, figura 2.6 8) y esta relación no
dependió de la variedad ni de la condición de N a la cual estuvieron expuestas. Este
resultado sugiere que aquellas variedades de chile habanero que logren aumentar el
contenido total de aminoácidos, bajo cualquier condición a la que estén expuesta, podrán
presentar una mayor acumulación de peso seco total.
En cuanto a la relación entre el peso seco y los contenidos totales de proteína se observó
que ésta fue dependiente de la condición de N a la que estuvieron expuestas las
variedades y dentro de una misma condición , la relación no dependió de la variedad
(figura 2.6 C). Se observó que cuando las plántulas están creciendo en presencia de N el
impacto que tiene el contenido de proteína sobre la producción de peso seco es mayor,
comparado con la condición de deficiencia de N; esto es, pequeños cambios en este
parámetro provoca cambios grandes en el peso seco de la plántula (figura 2.6 C).
.-. 0.4 S ..J < 1- 0.3 o 1-o u 0.2 w (/)
o (/) w 0.1
a.
0.0
r2= 0.485 r2 = 0.894 r2 = 0.562
e SEMINIS (+N) A .-. 0.4 B .-. 0.4 e
O SEMINIS (·N) S S A REX(+N) • • ll REX (-N) ..J • ..J
• NP4EC (+N)
~ ~ c::l NP4EC (-N) 0.3 0.3 o o G o o 1- 1-
... o ... o ... u 0.2 u 0.2
•" w .. w " (/) (/) • o o (/) w 0.1 o o
(/) w 0.1 o
a. a.
0.0 0.0 1.0 1.5 2.0 2.5 2 3 4 5 6 8 10 12 14 16
[N031 TOTAL AMINOÁCIDO TOTAL PROTEÍNA TOTAL
(mg/g) (mg/g) (mg/g)
Figura 2.6 Relación entre el crecimiento de las plántulas de chile habanero y
los valores totales de en la planta de nitrato (A), aminoácidos totales (B) y
67
CAPÍTULO 11
proteínas totales (C). En estos gráficos se usó la suma de los valores
promedios de cada determinación en la raíz y la parte aérea
2.3.3 Caracterización de la absorción neta y evaluación de los niveles de transcritos de CcNRT2.1 de las variedades de chile habanero
Una de las respuestas tempranas de las plantas ante un período de déficit de N03- es un
aumento en el transporte de N03- de alta afinidad el cual es diferenciado en Arabidopsis
básicamente por los transportadores AtNRT2.1 y AtNRT2.2 debido a la diferencia entre
los niveles de metabolitos nitrogenados detectado en este trabajo entre las variedades de
chile habanero, en este estudio se evaluó la capacidad de las mismas para tomar N03- en
condiciones de alta afinidad cuando fueron sometidas a un período de déficit de N,
medida como tasa de absorción neta.
La tasa de absorción neta aumentó en todas las variedades al segunda día del período de
déficit, encontrando los mayores valores para REX, seguido de SEMINIS y NP4EC, para
posteriormente disminuir, observándose un segundo pico en todas las variedades al
décimo día de déficit (figura 2.7 A) . La estimulación de la toma de alta afinidad detectada
en las variedades de chile habanero a tiempos de tratamiento cortos coincide con lo que
ocurre en otras plantas como arroz (Shi et al. , 201 O) y Arabidopsis (Richard-Molard et al.,
2008) ; no así la que ocurre a tiempos largos. Este segundo incremento en la toma de
nitrato de alta afinidad durante períodos prolongados de déficit de N pudiera indicar un
nuevo mecanismo regulatorio , que al parecer es común en chile habanero, pues este
comportamiento fue similar para todas las variedades.
Sorprendentemente, se obtuvieron valores negativos en la tasa de absorción neta para las
plántulas de NP4EC sometidas durante seis y ocho días al tratamiento de déficit (figura
2.7 A) . Estos valores indican que el eflujo de nitrato fue superior al influjo en estos
tiempos. A pesar de que este comportamiento ha sido reportado para diferentes plantas
en condiciones de estrés (Aslam et al. , 1996; Aslam et al. , 1995; Dehlon et al. , 1995;
Macduff y Jacksson, 1992) no se conoce el significado biológico de esta respuesta . En
Arabidopsis se ha caracterizado un transportador responsable del eflujo de N03-, el cual
pertenece a una subclase de siete miembros NAXT (NITRATE EXCRETION
TRANSPORTER), pero esta familia aún no se conoce en el género Capsicum. Este
resultado es novedoso y nosotros no podemos aún explicar este eflujo para NP4EC
68
CAPITULO 11
cuando se somete a un período relativamente largo (seis días) de déficit y sería
interesante estudiar los diferentes transportadores de nitrato que se encuentran bajo esta
condición en las raíces de esta variedad.
Una posible explicación podría ser que se active un transportador responsable del eflujo
de nitrato en las raíces, debido a un incremento en la concentración de este ión en el
citosol de la célula . Este aumento podría producirse como resultado de la removilización
que sucede por el tratamiento de déficit, durante la cual el N03- es sacado de la vacuola
para que éste sea asimilado en el citosol. La removilización de N03- de la vacuola al
citosol en condiciones de déficit ya ha sido reportado previamente (Richard-Molard et a/.,
2008). NP4EC presenta mayores valores de N03- en las raíces y una mayor
removilización durante este déficit, como se describió anteriormente, por lo tanto
alcanzaría mayores valores del ión en el citosol , comparado con las otras variedades.
Esto explicaría por qué no se obtuvieron valores negativos en las otras especies, a pesar
de observar una reducción en la tasa de absorción neta en este período. El eflujo de N03-
como un mecanismo para regular la homeostasis de este ión en condiciones externas
fluctuantes de N03-, ya ha sido propuesto previamente (Huang et al., 2012). Para explorar
las bases moleculares de esta respuesta, se estudiaron los niveles de transcritos de
CcNRT2.1 en las tres variedades. CcNRT2.1 es un ADNc total que fue aislado
previamente a partir de las raíces de la variedad SEMINIS que presentó una alta identidad
con la familia de transportadores de nitrato de alta afinidad del tipo NRT2 y es el primero
que se reporta en el género Capsicum. Cuando se evaluaron los niveles de transcritos se
observó un aumento en los mismos por el tratamiento de déficit, el cual fue dependiente
de la variedad (figura 2.7 B). En NP4EC los niveles de transcritos de CcNRT2.1
aumentaron al día 2 y 4 y éstos desaparecieron posteriormente (figura 2.7 B). Este
comportamiento ha sido reportado previamente (Shi et al. , 201 O; Richard-Molard et al.,
2008; Lejay et al. , 1999). En cambio, en REX los valores de transcritos de este
transportador aumentaron durante el período de déficit, y se alcanzaron los mayores
valores al décimo día, al igual que para SEMINIS (figura 2.7 B), lo que no coincide
completamente con los valores de absorción neta. Esta pobre correlación entre los niveles
de transcritos de un transportador y su actividad transportadora ha sido reportada
previamente (Kaiser et al. , 2002; Rawat et al., 1999). También se conoce que el
transportador NRT2.1 de Arabidopsis puede ser regulado postraduccionalmente (Barbier-
69
CAPITULO 11
Brygoo et al., 2011; Wirth et al., 2007).
Otros transportadores podrían contribuir además a la absorción de alta afinidad de nitrato
en esta especie.
Los datos obtenidos sugieren que aún cuando NP4EC estimula la absorción de N03- de
alta afinidad cuando se le cultiva en condiciones de déficit, este parece no ser el
mecanismo mayor en esta variedad . En este caso, NP4EC parece preferir el mecanismo
de removilización de sus reservas endógenas. En cambio , dado que las reservas
endógenas son menores en la variedad REX, esta variedad parece preferir la activación
de los mecanismos de tomar N03- de alta afinidad como una respuesta adaptativa en
condiciones de escases de N.
70
10
8 ca ...... ... "';-
C1> .E 6 e E CrJ'J 4 •O a.. ·- ... (.) Cl ~ 111 2 o~ fn o .C E o <C~
-2
-4
A
o 2 4
-& NP4EC ;f- REX
~SEMINIS
6 8 10
Tiempo (días)
B
Figura 2.7 Caracterización de la capacidad de absorción neta y de los niveles
de transcritos de CcNRT2.1 de las variedades de chile habanero sometidas a
un déficit de nitrógeno. A. Tasa de absorción neta de nitrato. Los datos
representan el valor promedio y la barra de errores indica el error estándar de la
media (n=6) . B. Niveles de transcritos de CcNRT2.1 usando la combinación de
cebadores F4-R 1. Se utilizó al gen de la tubulina como control de carga.
CAPÍTULO 11
Para profundizar en las posibles diferencias en este transportador entre las variedades, se
realizaron amplificaciones por PCR del mismo, usando diferentes combinaciones de
cebadores, previamente diseñados en el laboratorio para la secuencia de SEMINIS. Estas
combinaciones incluyeron todas las regiones de este transportador, que tiene 1593 pb.
Para este estudio se seleccionó el ARN de las plántulas provenientes del día 2 del periodo
de déficit de cada variedad . Como se observa en la figura 2.8, no se logró obtener el
fragmento esperado todas las veces; esto sucedió para REX con los juegos de cebadores
F2-R3 y para NP4EC con F3-R2. Tampoco fue posible amplificar el ADNc del
transportador con los cebadores F1-R1 . Esto sugiere que los dos transportadores de las
variedades obtenidas en Yucatán tienen regiones diferentes a las de la variedad SEMINIS
y también entre ellos. Las diferencias parecen concentrarse en la región central de dicho
transportador (figura 2.8).
Cc.NRT2 J '
ATG TGA
Tamaño del fragmento 1593 pb Fl
N R S -.. - 454 pb N R S Fl ... - 609 pb N R S Fl ..
pb
- 418 pb N R S FJ ..
Rl - 561 pb F4 ..
Figura 2.8 Diferencias en las secuencias de CcNRT2.1 entre las variedades de
chile habanero. En el esquema se presenta la estructura de este transportador
con los 12 dominios transmembranales (gris) y los diferentes fragmentos que se
aplicaron con sus respectivos tamaños. En el extremo derecho de cada
Rl
71
CAPÍTULO 11
fragmente se incluye el resultado de la PCR obtenida en cada caso. N: NP4EC;
R: REX; S: SEMINIS.
En el futuro será interesante estudiar la regulación en la toma de nitrato de estas
variedades, considerando las variaciones observadas en este estudio, y de la función que
tienen los transportadores en este proceso.
72
CAPÍTULO 11
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79
CAPITULO 11
80
CAPÍTULO 111
DISCUSIÓN GENERAL
CAPÍTULO 111
Los resultados obtenidos en esta investigación indican que la variedad NP4EC parece
hacer un uso más eficiente de N, aún cuando se le cultiva en ausencia del mismo, ya que
bajo las mismas condiciones de déficit presenta un mejor comportamiento que las otras
dos variedades.
El chile habanero es un producto de gran importancia económica para los productores de
hortalizas del estado de Yucatán , El suelo, es el principal factor limitante para su
producción (Tun, 2001 ). En la actualidad este cultivo ha mostrado una gran demanda de
consumo en el mercado y ésta va aumentando constantemente. Sin embargo, en años
recientes se han reportado bajos rendimientos en las superficies dedicadas al cultivo
(Ramírez et al., 2005; Latourneri et al. , 2001 ; Tun , 2001). Los productores con el fin de
aumentar el rendimiento del cultivo aplican indiscriminadamente grandes cantidades de
fertilizante nitrogenado (Mulvaney et al. , 2009), lo que ha aumentado significativamente el
rendimiento, pero con un impacto negativo sobre el medio ambiente en todo el mundo.
Esto, junto con el aumento de los costos de fertilizantes nitrogenados, ha creado la
necesidad de aumentar la eficiencia en el NUE en los cultivos, es decir, cultivos que son
más capaces de tomar, utilizar y remover el nitrógeno disponible. Este parámetro tiene
una gran importancia para aumentar la productividad en los cultivos (Zeigler y Mohanty,
201 0).
Debido a la gran importancia que representa una mejora en la NUE de los cultivos, se han
realizado diversos estudios. Uno de estos ha sido caracterizar la variabilidad genética
presente en las especies en cuanto a la arquitectura de los sistemas radicales y su
repercusión en la NUE (Hirel et al., 2007). También se ha observado que cuando se le
aplica una gran cantidad de N al cultivo presentan menor tasa de crecimiento en materia
seca (Brauer y Shelp, 201 O; Masclaux-Daubresse et al. , 201 O; Cai , 2009; Gua, 2009;
Wang , 2007; Ju , 2003; Zhu, 2000). Estudios fisiológicos han demostrado que existen
transportadores que son responsables de la toma de N03- por la raíz (Farde, 2000;
Crawford y Glass, 1998; Daniei-Vedele et al., 1998).
81
CAPÍTULO 111
El N03• es la fuente principal para la mayoría de las plantas que crecen en suelos
aeróbicos. Una vez absorbido puede ser almacenado, transportado y metabolizado en
raíz y entonces los productos de su metabolismo ser translocados hacia la parte aérea de
la planta, vía xilema (Miller y Cramer, 2004) o ser excretado de la raíz hacia el suelo
nuevamente (Huang et al., 2012; Chapman y Miller 2011 ; Segonzac et al., 2007). El
destino del N03. depende en gran medida de la especie, ya que algunas de ellas llevan a
cabo la reducción de este nutrimento principalmente en la raíz, mientras que en otras este
proceso se lleva a cabo en las hojas (Epstein y Bloom, 2004). La autofagia juega un papel
importante en la planta en el manejo de N a nivel de planta completa a trevés del control
de la removilización de N (Guiboileau et al., 2012)
Las características fisiológicas y morfológicas que presentaron las tres variedades de
chile habanero sometidas a un déficit de N fueron: el peso fresco y seco de la parte aérea
y radicular de la variedad NP4EC fue mayor, esto quiere decir que esta variedad puede
soportar un déficit de N mayor teniendo la capacidad de almacenar y removilizar el N
endógeno cuando lo necesita. Esto también ha sido reportado por Krapp et al., (2011) en
Arabidopsis, donde observaron un aumento en los pesos fresco y seco de ambas partes
de la planta cuando éste crece en déficit de N.
También se observaron diferencias significativas cuando estas variedades se colocaron
en presencia de N, la variedad NP4EC siguió presentando un mejor comportamiento
comparada con las dos variedades, los cambios morfológicos observados en el
crecimiento de la variedad NP4EC en ausencia y presencia de N, fue mayor presentando
un sistema radicular más desarrollado, comparado con las otras dos variedades. Este
desarrollo de la raíz es importante para esta variedad , ya que puede tener la capacidad de
tomar, almacenar y removilizar más N, cuando esta se encuentre en déficit del mismo.
Esto se pudo observar en cebada (Anbessa y Juskiw, 2012).
El contenido de N03. en hoja y raíz presentó un comportamiento muy similar entre las
variedades, aumentando su contenido en las hojas y disminuyendo en la raíz; pero la
variedad NP4EC presentó un mayor contenido de este nutrimento. Esto se pudo observar
claramente al décimo día de tratamiento. La variedad NP4EC presenta un mayor
crecimiento, ya que el N03. se almacena en mayor cantidad en la raíz, y este N03• puede
ser removilizado cuando la planta se encuentre en déficit. En Arabidopsis se ha reportado
82
CAPITULO 111
una disminución en el contenido de No3- en hoja y raíz cuando es sometida a déficit de N
(Richard-Molard et al., 2008), y en cereales se reporta una mayor acumulación de nitrato
en la hoja (Fan et al., 2007).
El contenido de aminoácidos en la raíz y la hoja fue mayor en la variedad NP4EC, lo cual
indica que esta variedad presenta una asimilación de N más alta, comparada a las otras
dos. Esto comprueba la removilización en la variedad NP4EC. Resultados similares han
sido reportados por lkram et al., (2012) en Arabidopsis. La variedad NP4EC presentó los
mayores valores de proteínas en raíz y tallo , corroborando nuevamente que esta variedad
presenta una mayor asimilación de N03-, comparado con las otras dos variedades.
La tasa de absorción neta presentó dos momentos importantes uno al segundo día de
tratamiento, cuando la variedad REX fue capaz de tomar mayor absorción neta de N03-
cuando se encuentra en déficit de N comparada con las otras dos variedades, esto
coincide con lo que ocurre en otras plantas como arroz (Shi et al. , 201 O) y Arabidopsis
(Richard-Molard et al. , 2008). El segundo momento se presentó en los días seis y ocho
donde se observó un eflujo neto en la variedad NP4EC, el cual no se presentó en las
otras. Estos valores indican que el eflujo de nitrato fue superior al influjo; este
comportamiento ha sido reportado para diferentes plantas en condiciones de estrés
(Aslam et al., 1996; Aslam et al., 1995; Dehlon et al. , 1995; Macduff y Jacksson, 1992).
A continuación se presenta un modelo en el que se describe la probable adaptación de la
variedad NP4EC ante condiciones de déficit de N (figura 3.1 ).
83
CAPÍTULO 111
84
RECICLAMIENTOJ REMOVILIZACIÓN ?{ PROTEOL.ISIS
t' AUTOFAGIA
ASIMILACIÓN ?{ NR, NiR • . GS, GOGAT
DÉFICIT DE NITRATO
Figura 3.1 Modelo de la respuesta adaptativa de la variedad N P4EC ante un
periodo de déficit.
CAPITULO 111
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CAPITULO IV
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos en este trabajo indican que la variedad NP4EC tuvo un uso más
eficiente del N cuando creció en ausencia del mismo, ya que bajo las mismas condiciones
de déficit que las demás, produjo una mayor cantidad de materia seca. Los mecanismos
más importantes para contender con el déficit de nitrógeno en esta variedad parecen ser
el poseer una alta capacidad de almacenar nitrato y los productos de su asimilación
(aminoácidos y proteínas) previo al período de déficit, así como una alta capacidad de
removilización de nitrato en la raíz y aminoácidos cuando está en ausencia.
REX, la segunda mejor variedad para soportar el período de déficit, evaluado igualmente
por la producción de materia seca, presentó como mecanismo adaptativo prioritario la
estimulación de la toma de nitrato de alta afinidad , así como inducir a nivel transcripcional
al transportador CcNRT2.1, a períodos largos de déficit.
Este es el primer trabajo realizado en chile habanero en los que se evalúan los cambios
en el crecimiento bajo un déficit de nitrato usando características morfológicas, fisiológicas
y moleculares; además de ejemplificar la variabilidad de esta respuesta entre variedades
de esta especie. Este trabajo sienta las bases para programas futuros de mejoramiento
genético, con el objetivo de obtener y cultivar plantas que hagan un uso más eficiente del
N en condiciones limitantes de este nutrimento, como son los suelos de Yucatán .
Estos conocimientos generados permitieron conocer el efecto del déficit de N en las tres
variedades; sin embargo, para profundizar en este tema se debe evaluar la actividad
enzimática de las proteínas responsables en la asimilación de N03- como la NR, NiR y
GS/GOGAT en las variedades estudiadas. De igual manera, el obtener y secuenciar el
ADNc de CcNRT2.1 en estas variedades permitirá conocer las diferencias entre estas
secuencias y su posible regulación en la toma de alta afinidad de N03-.
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