荧光定量 PCR 实验原理及数据分析

Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.

荧光定量 PCR 实验原理及数据分析

Marketing Dep.

Icy Wu

内容概要

荧光定量 PCR 的原理

荧光定量 PCR 的标记方法

荧光定量 PCR 解析方法

荧光定量实验流程及注意事项

生工荧光定量产品选择指南

2www.sangon.com

荧光定量 PCR 原理－－定义

实时定量 PCR 技术：

利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过 Ct 值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析

与常规 PCR 技术比较：

对 PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测

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荧光定量 PCR 原理－－常用名词概念

扩增曲线

荧光阈值

Ct 值

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荧光定量 PCR 原理－－扩增曲线

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Cycle （循环数）

Rn

（荧

光强

度）

Baseline

Lg － liner phase

平台期

荧光基团

荧光检测元件

荧光定量 PCR 原理－－荧光阈值

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Rn

（荧

光强

度）

Baseline

Lg － liner phase

平台期

前 15 个循环信号作为荧光本底信号（ baseline ）

荧光阈值的缺省设置是 3 ～ 15个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍

手动设置 : 大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段

真正的信号 : 荧光信号超过阈值

Threshold

荧光定量 PCR 原理－－ Ct 值

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Rn

（荧

光强

度）Ct 值的定义：

PCR 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数

Ct value

荧光定量 PCR 原理－－ Ct 值的重现性

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横轴： PCR 反映循环数

纵轴：荧光信号量

Ct 值的特点：

• 相同模板进行 96 次扩增，终点处产物量不恒定；

• Ct 值极具重现性

荧光定量 PCR 原理－－ Ct 值定量的数学原理

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理想的 PCR 反应 Xn ＝ X0 2n*

Xn ：第 n 次循环后扩增产物数量

X0 ：起始模板数量

n ：扩增循环数


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非理想的 PCR 反应 Xn ＝ X0 （ 1 ＋ En ） n

*

Xn ：第 n 次循环后扩增产物数量

X0 ：起始模板数量

n ：扩增循环数En ：扩增效率


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在扩增产物达到荧光阈值时

XCt ＝ X0 * （ 1 ＋ En ） Ct ＝ M （ 1 ）

整理方程式（ 2 ）：

方程式（ 1 ）两边同取对数得：

XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，它是一个常数，定为 M

Log2M ＝ Log2X0 * （ 1 ＋ En ） Ct （ 2 ）

Log2X0 = Log 2M - Ct Log2 （ 1 ＋ En ）

荧光定量 PCR 原理－－ Ct 值与起始模板量的关系

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Cyc

le n

um

be

r

Ck 104Ck 102

Sample

Lg of DNA concentration

模板 DNA 量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即 Ct 值越小。

Log 模板起始浓度与 Ct

值呈线性关系。

荧光定量 PCR 原理－－荧光定量反应性的确认

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• 线性关系、扩增效率确认– 相关系数（ R2 ）：大于 0.98

– 标准曲线斜率： -3 － -3.5

– PCR 扩增效率（ E ）： 0.9-1.2

• 检测灵敏度确认– 35Cycles 内可得到好的定量结果– 如果采用 SYBR 检测方法， 30Cycles 内无非特异性产物扩增

• No template control 确认– 35 Cycles 内无引物二聚体产生

内容概要






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常用荧光定量标记方法

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• 非特异性荧光标记• SYBR Green I

• 特异性荧光标记• TaqMan Probe

SYBR Green I 染料法－－原理

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• SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。

SYBR Green ISYBR Green I

SYBR Green I 染料法－－作用机理

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热变性热变性

引物退火引物退火

延伸反应延伸反应

SYBR Green I 染料法－－问题点与关键点

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• 问题点：– SYBR Green I 与双链 DNA 进行结合后散发荧光，因此如果反应

体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。

• 关键点：– 设计合适引物，防止非特异性扩增！

SYBR Green I 染料法－－融解曲线

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将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)

原始图谱对数图谱

SYBR Green I 染料法－－融解曲线

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融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光：

定量准确

融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光：

定量不准确

SYBR Green I 染料法－－优缺点

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使用方便，不必设计复杂探针

具有价格优势

优点

无模板特异性

对引物特异性要求较高

不能进行多重定量

灵敏度相对较低

缺点

Taqman 探针法－－原理

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• 5′端标记有报告基团 (Reporter, R) ，如 FAM 、 VIC等 • 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)

• 探针完整， R 发射的荧光能量被 Q 基团吸收，无荧光， R 与 Q 分开，发荧光• Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针

Taqman 探针法－－工作机理

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热变性热变性

引物和探针与模板退火引物和探针与模板退火

延伸反应延伸反应

探针探针

报告基团报告基团淬灭基团淬灭基团

探针探针DNADNA聚合酶聚合酶

引物引物RR

RR

RR

RR

Taqman 探针法－－ PCR 体系的建立

1. 引物、探针的设计：– 探针 Tm 为 68-70 , <30 bp, 5’℃ 不能有 G, G 可能会淬灭荧光素– 引物尽量靠近探针 , 扩增片段 <400 bp, 引物 Tm 为 59-60℃

2. 反应参数的确定：– 一般为： 94 ℃ ， 10-20S

60℃ ， 30-60S

（ Taq 酶 5′→3′外切核酸酶活性在 60 ℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度

3. 优化引物和探针浓度：获得最小 Ct 值，最大信号 / 背景比值– 引物浓度： 100-900nM

– 探针浓度： 50-300nM

4. 其他与常规 PCR 相同

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Taqman 探针法－－优缺点

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高度特异性

重复性好

灵敏度高

可进行多重定量

优点

只适合一个特定的目标

委托公司标记，价格较高

不易找到本底低的探针

缺点

实时荧光定量 PCR 分类－－分子信标

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标记荧光的发夹探针

环与目标序列互补

茎由互补配对序列组成

环

茎

荧光素淬灭剂


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FRET


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高特异性：对目标序列

检测 SNP 最灵敏的试剂之一

荧光背景低

优点

只能用于一个特定目标

设计困难

价格比较高

缺点

几种荧光定量 PCR 方法的应用比较

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方法优点缺点适用范围

SYBR Green I 适用性广灵敏方便便宜

引物要求高易出现非特异性带

适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基

因重组动植物的研究

TaqMan 特异性高重复性好

价格高只适合特定目标

病原体检测，疾病耐药基因研究 ,药物疗效考核遗传疾病的诊断

分子信标高特异性荧光背景低

只适合特定目标设计困难价格高

特定基因分析SNP分析

荧光定量 PCR 技术的主要应用

• 定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（ SNPs ）分析等

• 绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量， GMO 定量检测等

• 相对定量研究： mRNA表达量分析， siRNA 效果确认，差异显示结果验证等

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内容概要






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荧光定量 PCR 的解析方法

绝对定量解析方法

相对定量解析方法

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绝对定量的定义

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Sample

25

Log （起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 ,即得到该扩增反应存在的线性关系

根据样品 Ct 值，就可以计算出样品中所含的模板量

绝对定量分析几要素

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• 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。

• 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、 PCR 产物、基因组 DNA等。

• 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。

• 标记方法的选择 —— SYBR Green I 法或 Taqman 探针法均可。

• 实验结果显示 ——扩增曲线；标准曲线；融解曲线 ( 探针法不需要 )

。

绝对定量质粒标准品的制备

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PCR

目的基因克隆

目的基因

目的基因

目的基因目的基因

质粒

目的基因目的基因

基因组 DNA

质粒提取， OD 值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用

质粒标准品稀释方法与拷贝数计算

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• 倍比梯度稀释方法：– 1v 原液 ( 标准品 i) +9v稀释缓冲液，得标准品 ii

– 1v 标准品 ii+9v稀释缓冲液，得标准品 iii

– 1v 标准品 iii +9v稀释缓冲液，得标准品 iv

– 1v 标准品 iv +9v稀释缓冲液，得标准品 v

• 拷贝数的计算：– 待测样本浓度（ ng/ul ） =OD260×40×稀释倍数

– 样本分子量 =碱基数 ×324

– 待测样本拷贝数（ copies/ul ） =待测样本浓度 /样本分子量 ×6×1014

绝对定量实验例－－乙肝病人血液中 HBV 的绝对定量

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• 方法：从血液中提取病毒 DNA ，以 TaqMan 探针法进行荧光定量检测

• 标准品：质粒标准品浓度为 106 、 105 、 104 、 103 ； 2 个重复；设阴性空白对照

• 实验步骤：提取 HBV DNA ；

设计特异引物；

设计 TaqMan 探针并标记探针；

荧光定量扩增；

结果分析：获取血液样品中 HBV DNA 的精确 copy 数。


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Sample copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD

标准品 5×103 28.18 28.64 28.41 0.16

标准品 5×104 25.25 25.14 25.19 0.04

标准品 5×105 22.11 22.46 22.28 0.12

标准品 5×106 18.63 18.92 18.77 0.10

未知样品 ? 20.56 20.45 20.5 0.05

空白对照 None None


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扩增效率（ E ）计算 E =10-1/ 斜率 -1

=10-1/-3.29 -1 =2.01-1

=1.01

标准曲线制作：利用 Mean Ct 作图可得到标准曲线

y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978

15

20

25

30

5×103 5×104 5×105 5×106

Copi es

Ct

相关系数（相关系数（ RR22 ）：大于）：大于 0.980.98 ，越接近，越接近 11 ，结果可信度越高。，结果可信度越高。扩增效率（扩增效率（ EE ）：）： 0.8-1.2, 0.8-1.2, 越接近越接近 11 ，越理想。，越理想。


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未知样品拷贝数的计算

将 Ct 值带入线性方程：

20.5= -3.29 X + 40.33

QuantityUnknown=10 6.03

=1,071,519 copies

X=20.5-40.33

-3.29=6.03

荧光定量 PCR 的解析方法

绝对定量解析方法

相对定量解析方法

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相对定量的必要性

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Sample BSample BSample ASample A

目的基因扩增效率相同

RNA提取效率相同

细胞起始数相同

实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析实际目的基因表达量分析

相对定量分析方法

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•比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！

•关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！

相对定量分析几要素

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• 一个参照样本

• 一个或一个以上的未知样本

• 一个目的基因

• 管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量

• 重复反应孔——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性

• 标记方法的选择—— SYBR Green 法或探针法均可

• 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）

• 一组标准样本（有些分析方法不需要）

相对定量分析－－管家基因筛选

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• 管家基因

– 维持细胞基本代谢活动所必须的基因，

– 如： GAPDH 、 Actin 、 18S rRNA等

• 筛选方法

– 根据文献提供

– 通过具体实验筛选

00112233445566

Sample1Sample1 Sample2Sample2 Sample3Sample3 Sample4Sample4

实验组实验组

实验

值实

验值

β-Actinβ-Actin

GAPDHGAPDH

β-2-microglobulinβ-2-microglobulin

HPRTHPRT

相对定量分析－－两种常用的分析方法

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•双标准曲线法

•2 - Ct△△ 法

相对定量分析－－双标曲线法

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• 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。

• 公式：

相对值 =

校正值 =目的基因定量结果

管家基因定量结果

待测样品的校正值

对照样品的校正值

相对定量分析－－双标曲线法

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优点：分析简单，实验优化相对简单缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一

检测样品管家基因 H 目的基因 X

定量结果定量结果校正值相对量

对照样品 6391.5 343.4 0.0537 1.000

待测样品 1 8589.7 17.3 0.0020 0.037

待测样品 2 7432.9 1946.1 0.2618 4.874

实验数据

相对定量分析－－ 2 －△△ Ct 法

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假设目标序列与内参序列扩增效率相同：

或

最后用任一样本 q 的 XN 除以参照因子（ calibrator ， cb ）的 XN 得到：

对于一个少于 150bp 的扩增片断而言，如果 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于 1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：

XT 是目标分子达到设定的阈值时的分子数RT 是内参分子达到设定的阈值时的分子数


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• 公式：

F = 2－

• 优点：无需作标准曲线• 缺点：假定扩增效率为 100 % ；• 假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；• 实验条件优化较为复杂。• 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一

待测组目的基因平均 Ct 值

待测组内参基因平均 Ct 值

对照组目的基因平均 Ct 值

对照组内参基因平均 Ct 值

－－－


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• 实验数据：

• 2 - Ct△△ 法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近 100%• △Ct （处理前）＝ 18 － 17 ＝ 1 Ct△ （处理后）＝ 16 － 17.4= － 1.4

• △△Ct= Ct△ （处理后）－△ Ct （处理前）＝－ 1.4 － 1＝－ 2.4

• 比率（处理后 / 处理前）＝ 2 －△△ Ct ＝ 2 －（－ 2.4 ）＝ 5.3

• 所以 Jun 基因在处理后表达水平是处理前的 5.3 倍• 修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等

于 2 ，那么 2 －△△ Ct 可以修正为： E －△△ Ct ，例如扩增效率为 1.95 ，那么计算公式可修正为 1.95 －△△ Ct

SampleJun

(Mean Ct)

GAPDH

(Mean Ct)E

处理前 18 17 1.95

处理后 16 17.4 1.95

内容概要






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荧光定量 (SYBR Green) 实验流程及注意事项

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样品制备

定量体系配备

引物设计

反应条件优化

浓度确定

技能要求

环境要求

误差控制

数据分析仪器介绍

RT

上机

反应体系优化

试剂选择

分析方法


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样品制备环境要求

定量体系配备

数据分析

RT

上机

浓度确定无 RNase 环境使用无 RNase耗材专用 RNase-free 工具

纯度高、完整性好的纯度高、完整性好的 RNARNA

分光光度计检测电泳检测


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样品制备

试剂选择

定量体系配备

数据分析

RT

上机

反应体系优化 AMV M-MLV

高效，全长的高效，全长的 cDNAcDNA

下游反应数确定反转录体积引物的选择


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样品制备

误差控制定量体系配备

数据分析

RT

上机

浓度确定

引物设计

环境要求

使用 mix降低系统误差设置重复（≥ 3 次）设置空白和阴性对照

均一的反应液和模板混合物均一的反应液和模板混合物

制作标准曲线设定浓度区间

GC％： 50 － 60％ Tm ： 50 － 65℃ 单个碱基重复＜ 4 个无二级结构扩增长度： 100 －

200bp 核酸制备区反应液制备区


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样品制备

定量体系配备

数据分析

RT

上机反应体系优化

反应条件优化

标准品

待测样本

阳性对照

阴性对照

退火温度优化：梯度 PCR 延伸时间：产物长度决定反应体积＞ 5ul ，推荐 20 －

50ul 引物浓度优化，模板量优化 Mg2＋调节，酶活调节

扩增效率： 90％－ 110％重复性： std ＜ 0.2 标准曲线： R ＞ 0.99 或 R2 ＞

0.98


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样品制备

定量体系配备

数据分析

RT

上机

自配购买即用型

RCHO-Lightcycler series ROTOGEN-RG series BIO-RAD Opticon series ABI-7series Bioer － Linegene series

分装控制

内参控制机器校正控制

可靠，准确的数据可靠，准确的数据

技能要求

误差控制

仪器介绍

试剂选择


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样品制备

定量体系配备

数据分析

RT

上机

仪器介绍分析方法

平滑曲线，重复性好，灵敏度高平滑曲线，重复性好，灵敏度高

相对定量： 2 －△△ Ct 法绝对定量：标准曲线法


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ABI 7500 ABI StepOne Roche Lightcycler 1.5

Roche Lightcycler 480 Corbett Rotor-gene3000 Corbett Rotor-gene6000


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Bio-rad MiniOpticon

杭州博日LINE-GENE FQD-66A

Bio-rad iQ5

Stratagene Mx3005PStratagene Mx3005PTMTM Cepheid SmartCycler

内容概要






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Thanks ！

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