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慈虫病の感染免疫の研究

宮崎医科大学第2内 科

横 田 勉 橘 宣祥 志 々 目栄一

岡 山 昭彦 津 田 和 矩

(平成1年2月27日 受付)

(平成1年3月22日 受理)

Key words: tsutsugamushi disease, immunity, sensitized lymphocyte, activated macrophage

要 旨

惹 虫病 患者 に おけ る感 染 免疫機 構 を 明 らか にす る 目的で,本 症 患者 の血 清,末 梢血 単核 細胞,T細 胞

お よび これ らの培 養上 清 につ いて,invitroで の正常 ヒ ト末梢血 由来 マ ク ロファー ジ内に おけ るRiche族

SiatsutεugmuShiの 増殖 に及 ぼ す影響 を調 べ,以 下 の よ うな成績 を えた.

(1)回 復期 早期例 で は,血 清,末 梢 血単 核細 胞,T細 胞 お よびT細 胞培 養上 清 のいず れ も強い リケ ッ

チ ア増 殖 抑制 作用 を示 した.し か しR.tsutsugamushiに 対す る抗体 価 の低 い血清 に は,こ の作 用 は認 め

な か った.

(2)回 復 後1年 か ら3.5年 の長 期間 経過 した 例 では,T細 胞 お よびT細 胞 培 養上 清 に リケ ッチ ア増殖

抑 制 作用 を認 めた が,血 清 や非T細 胞 に は,こ の よ うな活性 は ほ とん ど検 出 され な か った.

これ らの成 績 は,慈 虫病 で は,リ ケ ッチ アに対 す る血 清 の抗体 価 は回復 期 の比較 的早 い時期 におい て

のみ 高 く,ま た抗 リケ ッチ ア作 用 を示 した.一 方,感 作T細 胞 由来 の リソ フォカ インに よ るマ ク ロファー

ジの活性 化 とい う免疫 機構 は,回 復期 早期 よ りみ られ,3.5年 の長 期 間持続 す る こ とが 明 らかに な った.

この よ うに ヒ ト悪 虫病 に おい て も,感 染 免疫 と くに感染 防御 の主 体 が細胞 性免 疫 であ り,マ ウスを始 め

とす る動 物 を用 いた実 験 で報 告 され て い る成績 とほぼ一 致 す る もの と考 え られ た.

はじめに

昭和50年 頃を境 として,宮 崎地方1)をは じめほ

ぼ全国的に慈虫病患者の発生が急増 している2).

これ らは新型慈虫病と呼ぼれ,予 後の比較的良好

なことで知 られていた.し かしなが ら,重 症例の

みならず死亡例 も散見されるに及び,改 めて惹虫

病についての関心が高まっている.こ のような現

況において,慈 虫病患者における感染免疫の様相

の解析は意義ある課題 と考えられる.

これまでの報告によると,悪 虫病などの リケッ

チア感染症における感染免疫の主体は細胞性免疫

であることが報告 されている.す なわち,1967年

のWissemanら3)の 発疹熱 と発疹チフスの患者に

おける遅延型過敏反応の検討をはじめ として,実

験動物 における リンパ球幼弱化反応4),感 作 リン

パ球移入実験5)6),リ ケッチア抗原刺激脾単核細胞

培養上清中のマクロファージ活性因子の証明7)～11)

がなされてきた.

他方,体 液性免疫の役割に関 して,抗 体で予め

処理 した リケッチアは,マ クロファージ内での増

殖抑制を うけることが悪虫病12)13)や発疹熱14)で報

告されている.

しかし,こ れまでの多 くの研究成績は実験動物

を用いてのものであ り,ヒ ト惹虫病患者の感染免

疫についてはほとんど解析されていない.そ こで,

私達は惹虫病患者について,ど のような免疫機構

が感染防御の主体 となっているかを明 らかにする

目的で,患 者血清あるいは末梢血 リンパ球が,末

別刷請求先:(〒880)宮 崎市北高松町5-30

県立宮崎病院内科 横 田 勉

平成元年10月20日

1150 横田 勉 他

梢血単 球 由来 マ ク ロファージ内 でのRichettsia

tsutsugamushiのin vitroひこおける増殖にいかな

る影響を及ぼすか解析した.さ らに,こ の免疫応

答の経時的推移についても検討を加えた.

材料 と方法

1.被 験対象者:1979年 から1980年 にかけて罹

患した宮崎地方の惹虫病患者18名(男6名,女12

名)で,平 均年齢は48.9歳 である.悪 虫病の診断

は,刺 し口,皮 疹,局 所 リンパ節腫大などの臨床

所見のほかに,間 接螢光抗体法15)16)による血清抗

Rtsutsugamushi抗 体価 の測定 によ り行 なった

(Table1).血 清抗体価の解析から,18例 中13例 が

Irie株,5例 がHirano株 による感染 と判断され

た.交 差反応に基づ くGilliam株 に対する抗体価

は,罹 患後半年以内の回復期早期の例において高

い傾向にあった.各 症例は臨床診断がなされた後,

テ トラサイク リン系薬剤で治療 された.

正常対照として,3名 の男子健康成人を用いた.

2.Rtsutsugamushi浮 遊 液 の 作 製:ミ ド リザ

ル 腎 細 胞 由来 のBSC-1細 胞 に20代 以 上 継 代 した

R.tsutsugamushi Gilliam株 を10%FCS加RPMI

1640培 養 液 に 浮 遊 させwaring blender(池 上 製 作

所,東 京)に て5分 間 ホ モ ジ ナ イ ズ した 後,ホ モ

ジネ ー トの遠 心 上 清 を リケ ッチ ア浮 遊 液 と して え

た.こ の リケ ッチ ア 浮 遊 液 は,2.5×106MLD50

(50%mouselethaldose)/0.2ml,あ るい は1.25×

106MLD5。/0.2m1に 調 整 した.前 者 は,回 復 期 早

期 例,後 者 は 回復 後 長 期 経 過 例 の実 験 に お い て,

マ ク ロ フ ァー ジ 感 染 材 料 あ るい は リンパ 球 刺 激 材

料 と して 用 い た.

3.血 清 の分 離:末 梢 静 脈 よ り採 血 し,30分 間

室 温 に放 置 後,3,000rpm10分 間 遠 心 し血 清 を 分

離 した.得 られ た血 清 は実 験 に 供 す る ま で 一70℃

で 保 存 した.

4.抗R.tsutsgamushi抗 体 価 の測 定:螢 光 抗

体 間 接 法 に よ っ て行 な った.抗 原 と し て,Gilliam

Table 1 Patients with tsutsugamushi disease examined in this experiment

1: Serum antibody titers against R . tsutsugamushi measured by indirect

immunofluorescent technique, 2: Gilliam strain, 3 : Karp strain , 4: Kato strain, 5: Iriestrain, 6: Hirano strain, 7: not done.

感染症学雑誌 第63巻 第10号

惹虫病の感染免疫の研究 1151

株,Karp株,Kato株 の標 準3株 の ほ か にIrie株,

Hirano株 を 加 え た5株 を用 い た.抗 体 価 は,被 験

血 清 の段 階 希 釈 に よ り表 示 した.

5.末 梢 血 単 核 細 胞 の 分 離:矢 田 ら の 方 法17)を

用 い た.す なわ ち,末 梢 静 脈 よ りえ られ た ヘ パ リ

ン加 血 を,採 血 後6時 間 以 内 に 同量 のphosphate-

bufferedsaline,pH7.5(PBS)に て 希 釈 した 後,

同 量 のFicoll-Paque(Pharmacia Fine Chemi-

cals,Uppsala,Sweden)の 上 に重 層 し,400×g,

30分 間 室 温 で 遠 心 した.遠 心 後,単 核 細 胞 分 画 を

分 離 しPBSに 浮 遊 させ,160×g,10分 間 遠 心 して

洗 浄 した.こ の洗 浄 操 作 を3回 繰 り返 した 後,10%

胎 児 牛 血 清(FCS:Boeringer,Manheim,West

Germany)加RPMI1640培 養 液(RPMI medium

1640with25mM HEPESbuffer&L-glutamine:

Gibco Laboratories,New York,U.S.A.)中 に

2×106/mlの 細 胞 数 に 調 整 した.こ うし て え られ

た 単 核 細 胞 浮 遊 液 は た だ ち に 以 下 の 実 験 に 供 し

た.

6.T細 胞 分 画,非T細 胞 分 画 の 分 離:ノ イ ラ

ミニ ダ ー ゼ(Test-Neuraminidase aus Vibrio

comma〔choleme〕:Behringwerke AG,Marbur-

g,West Germany)処 理 羊 赤 血 球 を 用 い た ロゼ ッ

ト形 成 法18)を 用 い て上 記 単 核 細 胞 浮 遊 液 よ り,ロ

ゼ ッ ト陽 性 細 胞 をT細 胞,ロ ゼ ッ ト陰 性 細 胞 を非

T細 胞 と し て え た.ヒ トT細 胞 ・B細 胞 分 離 用

キ ッ ト(日 本 抗 体 研 究 所,高 崎)を 用 い た 検 定 で

は,T細 胞 分 画 は 約95%がT細 胞 で,非T細 胞 分

画 に は 最 大40%の 単 球 が 混 入 して い た.そ れ ぞ れ

の 分 画 は 細 胞 数2×106/mlに 調 整 し て,10%FCS

加RPMI1640培 養 液 に 浮 遊 させ た.

7.単 核 細 胞 ・T細 胞 培 養 上 清 の 調 整:1mlの 単

核 細 胞 あ る い はT細 胞 の浮 遊 液 に,0.1mlの 上 記

リケ ッチ ア浮 遊 液 を 加 え て,5%CO2,37℃,48時

間 で培 養 後,1,700×g,30分4℃ で 遠 心 し,培 養

上 清 を えた.

8.マ ク ロ フ ァー ジ ・モ ノ レ ー ヤ ー の 作 製:前 述

の よ うに,正 常 ヒ ト静 脈 血 よ り比 重 勾 配 遠 心 法 に

て単 核 細 胞 を 分 離 した.こ の 単 核 細 胞 分 画 に含 ま

れ る単 球 の割 合 を,細 胞 浮 遊 液 塗 抹 標 本 に ギ ー ム

ザ 染 色 を 施 し て 顕 微 鏡 下 に 確 認 した 後,単 球 が

0.5×106/mlと な る よ う に10%FCS加RPMI

1640培 養 液 に浮 遊 させ た.こ の 単 核 細 胞 浮 遊 液0.1

mlを,ペ トリ・デ ィシ ュ内 の直 径14mmの プ ラ ス

チ ック ・シ ー ト(和 光 純 薬 工 業,東 京)上 に滴 下

し,5%,CO2,37℃ で2時 間 静 置 した 後,培 養 液

で 充 分 洗 浄,非 付 着 細 胞 を 除 去 した.こ の プ ラ ス

チ ック ・シ ー ト3枚 を,直 径6cmの ペ ト リ ・デ ィ

シ ュ に 入 れ,3m1の10%FCS加RPMI1640培 養

液 を 加 え,5%CO2,37℃ で24時 間 培 養 後,引 き続

き以 下 の実 験 に 供 した.

9.マ ク ロフ ァー・ジ内 に お け るRtsutsugamu-

shi増 殖 の 観 察:血 清,単 核 細 胞 浮 遊 液,T細 胞 浮

遊 液,非T細 胞 浮 遊 液,単 核 細 胞 ま た はT細 胞 の

培 養 上 清 そ れ ぞ れ1mlを,マ ク ロ フ ァ ー ジ 付 着

シ ー トを 容 れ た ペ トリ ・デ ィ シ ュに加 え て,5%

CO2,37℃ で24時 間培 養 した.全 体 と して の 実 験 共

通 の 対 照 と して10%FCSを 添 加 した 群 を 用 い た.

ま た,血 清 添 加 群 で は健 康 成 人 血 清 を,単 核 細 胞

添 加群 で は健 康 成 人 末 梢 血 単 核 細 胞 を 対 照 と し て

同 時 に 用 いた.

次 い で,感 染 材 料 と して0.1m1の リケ ッチ ア浮

遊 液 を 加 え て培 養 を 続 けた.リ ケ ッチ ア感 染9日

目に,シ ー トを取 り出 し,乾 燥,メ タ ノ ール 固 定

後,ギ ー ム ザ染 色 を 施 し,顕 微 鏡 下 に リケ ッチ ア

を観 察 した.そ の 際,個 々 の マ ク ロ フ ァ ー ジ内 で

の リケ ッチ ア の増 殖 度 を0か ら3ま で の4段 階 の

scoreで 評 点 し,50個 の マ ク ロ フ ァ ー ジ か ら得 ら

れ たscoreの 総 計 を リケ ッチ ア の増 殖 度 と した.

実験 は,そ れ ぞ れ につ い て,3～4回 行 な い,

平 均 増 殖 率 ±標 準 誤 差 と して表 記 し た.

個 々の マ ク ロ フ ァ ー ジ 内 で の リケ ッチ ア 増 殖 は

次 の よ うに判 定 した.す な わ ち,scoreOは,マ ク

ロ フ ァ ー ジ内 に リケ ッチ ア粒 子 を 全 く認 め な い も

の(Fig.1-A),score1は30個 以 下 の リケ ッチ ア

粒 子 を 認 め る もの(Fig.1-B).score2は,30個

以 上 の リケ ッチ ア粒 子 を 認 め るが,塊 状 の 増 殖 を

示 す に 至 っ て い な い も の(Fig.1-C),score3は,

リケ ッチ アが 一 塊 りと な っ て増 殖 し,著 しい 場 合

は細 胞 質 内 に リケ ッチ ア粒 子 が 充 満 し て い る も の

と した(Fig.1-D).

平成元年10月20日

1152 横田 勉 他

Fig. 1 Growth of Rickettsia tsutsugamushi (Gilliam strain) in peripheral

monocyte-derived macrophages from normal human.

(A) No rickettsial particle is detected in macrophages. (B) Rickettsiae of less

than 30 are observed in a macrophage. (C) More than 30 rickettsiae proliferate

in a macrophage but not massively. (D) Rickettsiae proliferate massively and

the macrophages were filled with them.

Rickettsial growth is classified into 4 grades shown above and each grade is

termed score 0, 1, 2 or3.

A B

C D

結 果

1.正 常 ヒ ト ・マ ク ロ フ ァ ー ジ 内 で のR.♂snおu-

gam薦hiの 増 殖

10%FCS添 加 し た 場 合 の マ ク ロ フ ァ ー ジ 内 で

のR.tsutsugammushi Gilliam株 の 経 時 的 な 増 殖 度

をFig.2に 示 した.1.25×106MLD5。 のR.tsutsu-

gamushiを マ ク ロ フ ァ-ジ に 感 染 さ せ た 場 合,

scoreは 感 染3日 目 で22.5±6.0,6日 目 で64.1±

8.4,9日 目 で91.1±9.1と 増 加 し た.0.625×106

MLD5。 の 感 染 量 の 場 合scoreは,そ れ ぞ れ,

11.8±2.0,34。6±7.9,49.9±12.2で あ っ た.以

下 の 実 験 で は,こ れ ら のscoreの 数 値 を 対 照 に し

て,そ れ ぞ れ の 実 験 系 に お け る リ ケ ッ チ ア 感 染9

日 目 のscoreと 比 較 し た.培 養 期 間 を9日 間 と し

Fig. 2 Growth of Rickettsia tsutsugamushi (Gil-

liam strain) in normal human peripheral macro-

phages.

0.1m1 of the rickettsial suspensions (2.5 •~ 106

MLD50 C50% mouse lethal dose)/0.2m1 or 1.25 •~

106 MLD5o/0.2m1) was added to the macrophage

cultures.

感染症学雑誌 第63巻 第10号

慈虫病の感染免疫の研究 1153

た の は,こ の 期 間 で は マ ク ロ フ ァ ー ジ内 に リケ ッ

チ アが 充 満 した 場 合 を 除 い て,マ ク ロ フ ァー ジ の

死 滅 脱 落 が み られ な か った こ とに よ る.

II.回 復 期 早 期 例 の感 染 免 疫 の検 討

罹 患 後 半 年 以 内 の 回復 期 早 期 患 者 の 血 清,末 梢

単 核 球,T細 胞 及 び そ れ らの 培 養 上 清 な どに つ い

て抗 リケ ッチ ア作 用 を検 討 した.こ の 実 験 に お い

て は,Rtsutsugamushiは マ ク ロ フ ァ ー ジ感 染 お

よび リンパ 球 刺 激 に際 して1.25×106MLD50の 量

を用 い た.

1.血 清 の 影 響

50病 日以 内 の 回 復 期 早 期 例(症 例1,2,3,

5)の 血 清 を添 加 した 群 で は,い ず れ も リケ ッチ

ア増 殖scoreは10以 下 と,強 い 増 殖 抑 制 が み られ

た(Table2).こ れ らの 症 例 のR.tsutsufamushi

Gilliam株 に 対 す る血 清 抗 体 価 は症 例1,2,3で

1:160と 高 値 で あ り,症 例5で は1:40で あ った

(Table1).症 例4は44病 日 と回 復 後 間 もな い 例

で あ る に もか か わ らず,増 殖scoreが132.5±10.8

と増 殖 抑 制 を 認 め られ な か った.こ の 例 の血 清 抗

体 価 は,1:10と 低 か った.75病 日以 後 の 症 例2,

7,8で は い ず れ も,血 清 に は リケ ッチ ア増 殖 抑

制 作 用 は み られ ず,FCS添 加 の 対 照 群 よ りも リ

ケ ッチ ア増 殖 が む しろ 強 か っ た.こ れ ら3例 の 血

Fig. 3 Effect of lymphocyte subpopulations and Tcell culture supernatants from patients on rickett-sial growth in normal human peripheral macro-

phages.Numbers in the parentheses denote the day ofillness.T: T cell enriched fraction, N ; non T cell enri-ched fraction, S : T cell culture supernatant.

0.1m1 of the rickettsial suspensions (2.5 x 106MLD50 [50% mouse lethal dose] /0.2m1 or 1.25 x106 MLD50/0.2m1) was added to the macrophagecultures.

=清抗 体 価 は低 く,症 例2及 び7で1:40,症 例8

で1:10で あ った.

な お,正 常 ヒ ト血 清 を添 加 した 群 で は,scoreは

Fig. 4 Effect of lymphocyte subpopulations and T cell culture supernatants from

patients after long periods from onset on rickettsial growth in normal humanperipheral macrophages.Numbers in the parentheses denote years after the onset. T ; T cell enrichedfraction, N ; non T cell enriched fraction, S ; T cell culture supernatant.0. lml of the rickettsial suspensions (1.25 x 106 MLD50/0.2m1) was added to the

macrophage cultures.

平成元年10月20日

1154 横田 勉 他

131.0±16.1と,10%FCS添 加の対照群に比較 し

て高度なぜ殖が強かった.

以上の成績は,血 清抗体価が高い場合,血 清は

マクロファージ内での リケッチアの増殖を抑制す

ることを示 した.こ れに対 して,回 復後間 もない

例で も,血 清抗体価が低い場合や回復後一定期間

経過 し血清抗体価が低下した例では,血 清には抗

リケッチア作用は認められなかった.症 例2に お

いて,血 清抗体価が1:160で あった17病 日では,

血清は リケヅチア増殖を抑制 したが,1:140と 低

下 した117病 日では抑制作用が認められなかった.

2.末 梢血単核細胞の影響

単核細胞の リケッチア増殖に対す る抑制作用を

Table3に 示 した.正 常 ヒト末梢血単核細胞を加

えた群では,増 殖scoreは88.9±20.7と 対照群 と

ほぼ同等の値を示した.

50病 日以内の血清に強い抗 リケッチア増殖抑制

作用を認めた症例1,2,3,5の 単核細胞を添

加すると,リ ケッチアの増殖scoreは10以 下 と,強

い増殖抑制作用が認められた.ま た,血 清に抑制

作用を認めなかった症例4(抗 体価1:10)も,

増殖scoreは31.0±13.9と,対 照群に比べ低い値

を示 した.さ らに,50病 日以後の例の中にも,増

殖抑制を示した例(症 例8,抗 体価1:10)が 認

め られた.

3.末 梢血単核細胞培養上清の影響

単核細胞による抗 リケッチア作用がそれに由来

する液性因子によるものであるか検討 した.結 果

は,Table4に 示す ように,単 核細胞および血清の

いずれにも強い リケッチア増殖抑制がみられた症

例1,2,3,5か らの末梢血単核細胞の培養上

清には,著 明な抗 リケッチア作用(増 殖score1.0

以下)が 検出された.ま た,単 核細胞のみに抑制

作用を認めた症例4,8の 培養上清に も,増 殖

scoreが そ れ ぞ れ15.0±6.7,25.3±6.7と 抗 リ

ケッチア作用がみ られた.さ らに,単 核細胞に作

用がほとんど検出されなかった症例7の 単核細胞

培養上清にも,リ ケ ッチア増殖scoreが48.0±9.0

と,強 くはないが,活 性が認められた.

4.末 梢血T細 胞分画,非T細 胞分画およびT

細胞分画培養上清の影響

末梢血単核細胞 の リケッチア増殖抑制作用 が

T細 胞 によるものか否 かを検討 した.そ のため

に,単 核細胞をT細 胞分画 と非T細 胞分画に分

け,さ らに,T細 胞分画についてはその培養上清

を作製 し,そ れぞれについて,抗 リケッチア作用

を調べた(Fig.3).

34病 日の症例2で は,T細 胞分画添加時の リ

ケッチア増殖scoreは0.5±0.4,非T細 胞分画添

加で も0.5±0.3と,と もに著 しい増殖抑制を示 し

た.ま た,同 一症例の117病 日においても,T細 胞

分画を加 えるとscoreは3.0±1.5と 強い増殖抑制

がみ られた.非T細 胞分画の場合は リケッチア増

殖sdoreは21.7±3.5で,T細 胞分画の場合ほ ど

抗 リケヅチア作用は強 くはなかった.74病 日の症

例6で はT細 胞分画添加時のscoreが7.5±5.3,

一方 ,非T細 胞分画ではscoreが61.5±10.3と,

T細 胞分画に強い抗 リケッチア作用が検 出され

た.143病 日の症例9で は,T細 胞分画,非T細 胞

分画を添加 した場 合,scoreは それぞれ44.0±

9.8,64.0±7.5で あ り,弱 い リケッチア増殖抑制

作用を示すにとどまった.

つぎにT細 胞分画培養上清の影響をみると,34

病 日の症例2,74病 日の症例6,117病 日の症例2

および143病 日の症例9の いずれの症例において

も,増殖scoreは4.0以 下 と強い リケッチアの増殖

抑制が認められた.T細 胞培養上清を添加した場

合の成績は,T細 胞分画の成績に比べ より強い抗

リケッチア作用を示 した.

以上の成績を小括すると,回 復後間 もない抗体

価の高い時期では血清にもリケッチア増殖作用を

認めた.ま た,T細 胞分画やその培養上清にも同

様に回復後間 もない時期から強い抗 リケッチア作

用が検出された.非T細 胞分画にも抑制作用をみ

る例 も存在 したが,T細 胞分画 より弱かった.ま

た抗体価が低 く血清の抗 リケッチア作用が見 られ

ない例でも,末 梢血単核細胞,T細 胞分画あるい

はその培養上清に強い抗 リケッチア作用を示す例

の存在が証明された.

III.回 復後長期経過例の感染免疫の検討

発症後1～3.5年 経過 した症例 について,血 清,

T細 胞,非T細 胞,T細 胞培養上清の抗 リケッチ

感染症学雑誌 第63巻 第10号

志虫病の感染免疫の研究 1155

Table 2 Effect of patients' sera on growth of R.

tsutsugamushi in peripheral monocyte-derived

macrophages from normal men

NHS ; normal human serum.

0.1 ml of the rickettsial suspension of 2.5 x 106 MLD50/

0.2 ml was used as the infectious materials to macro-

phages.

Table 3 Effect of patients' peripheral mononu-

clear cells on growth of R. tsutsugamushi in

peripheral macrophages from normal men

N-HMC ; normal human mononuclear cell

0.1 ml of the rickettsial suspension of 2.5 x106 MLD50/

0.2 ml was added to the macrophage culture as the

infectious materials.

ア 作 用 を 検 討 した.以 下 の 実 験 で は マ ク ロ フ ァ ー

ジ 感 染 材 料 お よ び リ ン パ 球 刺 激 材 料 と し て の リ

ケ ッチ ア量 は0.625×106MLD50と した.

1.血 清 の 影 響

発 症 後1年 以上 経 過 した 回 復 後 長 期 経 過 例10例

の血 清 に は リケ ッチ ア増 殖 抑 制 作 用 が 全 く認 め ら

れ な か った(Table5).な お,Rtsutsugamushi

Gilliam株 に 対 す る血 清 抗 体 価 は,症 例13の1:

40が 最 高 で,そ の 他 は1:10以 下 と低 値 で あ っ た

(Table1).

Table 4 Effect of patients' peripheral mononu-

clear cell culture supernatants on growth of R.

tsutsugamushi in normal human peripheral ma-

crophages

0.1 ml of the rickettsial suspension of 2.5 x 106 MLD50/

0.2 ml was added to the macrophage culture as the

infectious materials.

Table 5 Effect of sera from patients after long

periods from onset on rickettsial growth in

normal human peripheral macrophages

0.1 ml of the rickettsial suspension of 1.25 x 106 MLD50/

0.2 ml was added to the macrophage culture as the

infectious materials.

2.T細 胞 分 画,非T細 胞 分 画,T細 胞 分 画 培 養

上 清 の 影 響

回 復 後1～3.5年 経 過 した11症 例 で の 末 梢 血T

細 胞 分 画 の 抗 リケ ッチ ア作 用 を 調 べ た(Fig.4).

リケ ッチ ア増 殖scoreは 症 例12で10.0±2.5,症 例

15で26.0±4.1,症 例18で12.0±4.2とscoreが10

以 上 を示 す 例 も み られ た.そ れ 以 外 の8例 で は ほ

とん ど10以 下 で あ り,マ ク ロ フ ァ ー ジ内 で の 強 い

リケ ッチ ア増 殖 抑 制 が 観 察 され た.一 方,非T細

胞 添 加 群 で 増 殖 抑 制 を 認 め られ た の は,発 症 後1.5

年 経 過 の 症 例10の1例 の み で,そ の 増 殖 抑 制 も増

平成元年10月20日

1156 横田 勉 他

殖scoreが21.7±3.5と 弱 く,同 一例のT細 胞分

画添加の場合(score 3.0±1.5)に 比較 しても抗 リ

ケ ッチア作用は明らかに弱かった.

またT細 胞培養上清にも,T細 胞分画とほぼ同

様の増殖抑制作用を認めた.回復後1.5年 以上経過

した例 では リケッチ ア増殖scoreが,症 例17の

6.7±2.6を 除き9例 中8例 が10.0～18.0で あった

のに対 し,回 復後1年 の2例 は,scoreが4.3±

0.7(症 例4),5.3±2.0(症 例2)と リケッチア

増殖抑制が比較的強い傾向がみ られた:抗 リケッ

チア作用について,T細 胞分画 とT細 胞培養上清

を比較 してみると,回 復後長期経過例では,前 者

の方に強い傾向がみ られた.

以上の成績か ら回復後最長3.5年 経過 した場合

でも,R.tsutsugamushiに 対す る抗 リケッチア作

用はT細 胞分画に保持 されていることが明 らか

になった.そ して,こ の作用は液性因子を介して

マクロファージに作用していると思われた.他方,

血清に関しては,抗 体価が全ての例で低 く,抗 リ

ケッチア作用はほとんどみられなかった.

考 案

偏性寄生病原体による感染症では,感 染細胞内

での病原体の増殖抑制が感染の病態の観点か ら重

要 な意味をもつ とされている.と くに,マ クロ

ファージをeffector cellと する細胞性免疫は,こ

のような感染症において最 も効果的に病原体を生

体内から排除する機構 として知 られている.

恙虫病を始めとする リケッチア感染症において

も,動 物実験により,主 としで細胞性免疫が感染

防御の主役を演 じてお り,と くに感作Tリ ンパ球

によるマクロファージの活性化 と,マ クロファー

ジによる殺菌作用の発現がその重要な機構である

ことが示 されてきた7)～9).しかし,ヒ ト恙虫病にお

いてはこれらの ことについてほとんど充分な検討

が加えられていない.ま た,新 型恙虫病の流行に

もかかわ らず,感 染免疫の成立時期およびその持

続期間 も明らかにされていない.

今回の実験は,こ れまでにえられている動物実

験による恙虫病や他の リケッチア症の免疫機序に

関する知見をふまえ,ヒ ト恙虫病においても感作

T細 胞一マクロファージ系が生体 か らの リケッ

チア排除機構の中核を成しているか否か検討する

ことを目的とした.す なわち,T細 胞のほかに血

清,非T細 胞 についても,in vitroで の末梢血由

来マクロファージ内 リケッチア増殖に及ぼす影響

について分析 し,相 互に比較検討した.な お,マ

クロファージ感染材料,リ ンパ球刺激材料 として

は,R.tsutsugamushi標 準株の1つ であるGil-

liam株 を用いた.

先ず,血 清についての成績では,恙 虫病回復後

間 もない時期の抗 リケッチアGilliam株 抗体価の

高い血清は,マ クロファージ内での リケッチアの

増殖を抑制 した.回 復期早期例の血清であっても

抗体価が低い場合は,血 清は抗 リケッチア作用を

示 さなかった.ま た,回 復後長期間経過 し,抗 体

価が低下 した時期の血清も同様に リケッチアの増

殖を抑制 しなかった.抗 リケッチア作用を認めた

血清抗体価の下限は1:40で あった.

免疫血清の抗 リケ ッチア作用に関する報告の4一

っにNacy&Osterman12)の マウスのin vitroの

実験がある.そ れによれば,R.tsutsugamushiを

予め免疫血清存在下で一定時間培養すると,マ ウ

ス腹腔 マクロファージへの取 り込みが促進 され

る.さ らに引 き続いた培 養 によ り感染 マ ク ロ

ファージの数は,対 照(正 常マウス血清処理)に

比べ,50%に 減 じたとい う.こ の実験において,

免疫血清は予め56℃,30分 の処理を受けてお り,

従って,補 体は関与 していないと考えられる.

他の リケッチア症では,発 疹チフスにおいて,

R.prowazehiを 発疹チフス回復期患者血清で予

め処理すると,正 常 ヒト末梢血 由来マクロファー

ジの貧食能及び殺菌能が促進 されるとい う報告が

ある13).同様のことは,発 疹熱で も検討 されてお

り,回 復期患者血清でR.mooseriを 処理す ると,

末梢血由来マクロファージ内での リケッチアの増

殖が抑制されるという14).

これまでのところ,ヒ ト恙虫病についての成績

の報告はみられないが,今 回の私達の ヒト恙虫病

に関する成績は,以 上のような実験的恙虫病や他

の リケッチア症患者においてえられている回復期

血清についての成績 とほぼ一致す るものである.

すなわちヒ ト恙虫病においてはR.tsutsugamushi

感染症学雑誌 第63巻 第10号

恙虫病の感染免疫の研究 1157

感染後,血 清抗体価の高い時期では,血 清抗体 も

有効に感染防御に関与 していると考 えられた.し

かし,回 復後長期間経過 した例では,血 清抗体価

も低 く,血 清にこのような作用は検出されなかっ

た.

なお,今 回の実験では,マ クロファージ感染材

料 として標準株 の1つ で あるR.tsutsugamushi

Gilliam株 を用いた.R.tsutsugamushiの 各株は

免疫学的に種 として共通 な抗原 と株特異抗原を有

していることが知 られてお り19)20),Table1に 示

されるように螢光抗体法による患者血清抗体価の

測定で,血 清はかなりの程度交差 して反応した.

ところで,従 来か らの報告では,血 清抗体が志

虫病の感染免疫において一義的なものとはみなさ

れていない.マ ウスの実験では免疫7日 目でR

tsutsugamushiに 対す る感染抵抗性が生 じるのに

対 し,血 清抗体は7日 目以降でしか検出されない

ことや,感 染抵抗性の獲得が証明さるにもかかわ

らず,血 清抗体価が低かった り,あ るいは血清抗

体が検 出されない例が存在す るとい う報告 があ

る5).

他 の リケッチア症 について も,Q熱 において

Coxiella burnetii感 染 モルモ ットの腹腔 マ クロ

ファージ遊走阻止能(直 接法)は,感 染3日 目か

ら検出され るのに対 して,血 清抗体は解熱 した後

よ り検 出されることから,感 染防御の中心は細胞

性免疫だ と推測 されている21).私たちの報告 した,

R.sennetsu感 染実験では,十分量の免疫血清を正

常マウスに予め投与しても感染防御能が獲得され

ず,ま た感染マウスは血清抗体価の上昇にかかわ

らず致死的経過をたどった22).

そ こで次に,細 胞性免疫能についての検討を行

な う目的で,悪 虫病患者よ りえられた末梢血単核

細胞 のマク ロファージ内R.tsutsugamushi増 殖

に対する影響を検討 した.そ の結果,血 清に抗 リ

ケッチア作用が認められない例でも,そ の単核細

胞 はマク ロファージ内でのR.tsutsugamushiの

増殖を著明に抑制 した.ま た,単 核細胞をR.tsut-

sugamushiで 刺激 してえ られた培養上清 もほぼ

同様の活性を示 した.こ のことから,慈 虫病患者

では,単 核細胞か らの液性因子がマクロファージ

を活性化 し,そ の結果 としてマクロファージのR.

tsutsugamushi増 殖抑制作用が作動す るものと考

えられた.

実験的悪虫病の研究では,熱 処理を うけたR.

tsutsugamushiで 免疫 したマウスの脾細胞の培養

上清は,正 常マウス腹腔 マクロファージ内での リ

ケッチア増殖を抑制す ると報告されてい る7)～9).

また,こ の培養上清には,マ クロファージ遊走阻

止能,イ ンターフェロン活性および抗腫瘍活性が

証明されている8)9)23).

次に,末 梢血単核細胞の リケッチア増殖抑制作

用がどの分画の細胞によるか検討した.117病 日以

内の回復後間もない時期の症例では,T細 胞分画

に強い増殖抑制作用が検出され,そ の培養上清に

も,同様に著明な抗 リケッチア活性が認められた.

一方,一 部の症例で非T細 胞分画にも強い抑制作

用をみたもの(症 例2の34病 日,117病 日)が あっ

たが,ほ かの2例 ではこの作用は強 くはなかった.

また,恙 虫病罹患後1年 以上経過 した例で も,

T細 胞分画およびその培養上清は,マ クロファー

ジにおける リケッチアの増殖を強 く抑制 した.し

かし,非T細 胞分画はほとんど抗 リケ ッチア作用

を示 さなかった.な お,回 復期早期例に見られた

非T細 胞分画の リケッチア増殖抑制作用は,こ の

細胞分画に含まれる活性化マクロファージの作用

によるもの と考えられた.事 実,実 験的悪虫病で,

免疫マウスの腹腔マクロファージにR.tsutsuga-

mushiを 感染させたところ,リ ケッチア増殖が見

られなかった とす る報告がある12).また,私 たちの

実験でR.sennetsu免 疫マウス腹腔マクロファー

ジは リケッチアの増殖を抑制 した11).

このように今回の実験では,非T細 胞分画はB

細胞だけから成るのではなかった.同 様iに,T細

胞分画にも単球の混在がある程度存在し,T細 胞

での リンフオカイン産生に際しaccessary cellと

しての機能を果た した ものと考えられる.

以上の成績から,末 梢血単核細胞によるリケッ

チア増殖抑制がT細 胞に起因 し,こ の感作T細

胞から産生されるリンフォカインによ り,マ クロ

ファージの抗 リケッチア作用が作動するものと考

えられた.こ の免疫機序は15病 日以前 より発現 し,

平成元年10月20日

1158 横田 勉 他

少な くとも3.5年 の長期にわた り感染防御に働い

ていると思われた.

R.tsutsugamushiの 再感染実験では,感 染免疫

はヒ トについては約100日24),マ ウス25)やサル26)に

ついては約1年 間持続す ると報告されている.し

かし,自 然感染では,新 潟県地方の恙虫病患者に

関する調査結果27)より,再 感染はほ とんど10年 以

上経過した例に見 られ ると推定されている.今 回

の私達の研究はこのよ うな長期にわたるものでは

ないが,ヒ ト恙虫病における感染免疫機序の一端

を明らかにしたものと考える.

文 献

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A Study on Immunity in Tsutsugamushi Disease

Tsutomu YOKOTA, Nobuyoshi TACHIBANA, Eiichi SHISHIME, Akihiko OKAYAMA &

Kazunori TSUDA

The Second Department of Medicine, Miyazaki Medical Collge

The immune response in human tsutsugamushi disease (scrub typhus) was studied. Anti-rickettsial activity of sera, peripheral mononuclear cells and their culture supernatants from patientson in vitro growth of Rickettsia tsutsugamushi proliferating in normal human peripheral macrophageswas examined. The results obtained were as follows.

1) Sera from patients at the early convalescent stage, which exhibited high antibody titersagainst R. tsutsugamushi, effectively inhibited their growth in macrophages.

2) Sera from patients after a long period from the onset showed low antibody titers and did notinhibit rickettsial growth.

3) Mononuclear cells and T cell enriched fractions suppressed rickettsial growth when they wereobtained from the patients at the early convalescant stage and even after as long as 3.5 years from theonset.

4) The culture supernatants of the T cell-enriched fractions which were collected from the

patients mentioned above, exhibited a similar antirickettsial activity.These findings indicate that sensitized T lymphocytes and macrophages might play a funda-

mental role in immunological defense mechanism in tsutsugamushi disease. And the results obtainedin our experiments are compatible with those previously reported in experimental scrub typhus inlaboratory animals such as mice and monkeys.

平成元年10月20日