Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Иван Зоров МГУ 1
ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ В КОРМОПРОИЗВОДСТВЕ
Области применения и методы анализа
Иван ЗОРОВ
Московский Государственный
Университет им. М.В Ломоносова
Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН
МИНСК, 9 СЕНТЯБРЯ, 2015
Иван Зоров МГУ 2
Механико-математический факультет
Ф-т вычислительной математики и кибернетики
Физический факультет
Химический факультет Факультет наук о материалах
Биологический факультет
Факультет фундаментальной медицины
Факультет почвоведения
Геологический факультет
Географический факультет
Исторический факультет
Филологический факультет
Философский факультет
Экономический факультет
Социологический факультет …
Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова
Химический факультет
17 кафедр, включая:
Кафедра химической энзимологии
Химии природных соединений
Физической химии
Аналитической химии
Химической технологии …
Иван Зоров МГУ 3
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. Баха РАН Старейший Российский институт в области наук о жизни
Около 25 лабораторий и исследовательских групп
Более 300 человек, из них 206 научных сотрудников, 175 докторов и кандидатов наук
>30 аспирантов
>180 студентов
>80 федеральных и международных программ и грантов
Июль 2015 года
ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР
БИОТЕХНОЛОГИИ РАН
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ
ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ ЦЕНТР БИОИНЖЕНЕРИИ
Иван Зоров МГУ 4
ПРОМЫШЛЕННАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ лаборатория биотехнологии ферментов
Целлюлозо-бумажная промышленность:
Биоотбеливание бумаги, удаление красок и тонеров, рефайнинг целлюлозы, наноцеллюлоза, переработка целлюлозосодержащих отходов .
Пищевая и кормовая промышленность:
Ферменты для обработки кормов на основе зерновых, сои, кукурузы;
ферменты для получения спиртов;
ферменты в хлебопечении;
ферменты для получения соков;
ферменты в производстве вин;
ферменты для переработки белковых отходов.
Ферменты для моющих средств.
Ферменты для получения жидкого топлива и продуктов тонкой химии на основе растительной биомассы.
Иван Зоров МГУ 5
Создание штаммов микроорганизов - продуцентов ферментов
Скрининг диких
микроорганизмов
Мутагенез
и селекция мутантов
Генетическая инженерия
штаммов
Иван Зоров МГУ 6
Лабораторные исследования
- Изучение каталитических свойств ферментных препаратов;
- Хроматографическое выделение индивидуальных ферментов и
определение их биохимических, адсорбционных, каталитических и
прочих характеристик с использованием современных
аналитических методов;
- Оптимизация условий получения и использования ферментов;
- Разработка, оптимизация и миниатюризация методов скрининга;
- Моделирование / имитация стадий технологических процессов в
лабораторных масштабах.
Прикладные испытания
- Оптимизация дозировок, условий, схем применения ферментных
препаратов в производственных условиях
Исследование свойств и функций ферментов
Иван Зоров МГУ 7
Питательные вещества кормов
Белки растительного и животного происхождения – источник аминокислот, строительного материала для организма;
Жиры (преимущественно растительные) – источник энергии и базовые элементы для синтеза многих гормонов;
Сахара и растительные полисахариды в т.ч. - простые сахара (глюкоза, галактоза и пр., а также сахароза) - крахмал и амилопектин – источники энергии для функционирования клеток организма
Иван Зоров МГУ 8
Антипитательные факторы кормов
Ингибиторы протеаз растительного
происхождения (напр. соевый ингибитор)
Ингибиторы карбогидраз (ингибиторы
ячменя, ржи, кукурузы)
Некрахмальные полисахариды в т.ч.
- целлюлоза
- ксиланы, маннаны и b-глюканы, частично
пектины
Фитин
Иван Зоров МГУ 9
Структура некоторых НПС
Арабиноксилан
b-глюкан
O
H
OHH
H
O
OH
H H
OH
CH2OH
O
H
O
HH
OOH
H H
CH2OH
O
H
OHH
H
O
OH
H H
CH2OH
O
H
O
HH
O
OH
H H
CH2OH
O
H
OHH
H
OH
OH
H H
CH2OH
O
H
HH
OH
H
OH
H OH
CH2OH
O
H
HH
OH
H
OH
H OH
CH2OH
Галактоманнан
Иван Зоров МГУ 10
Некрахмальные полисахариды
Арабиноксилан b-глюкан Целлюлоза Пектин
Пшеница 6.0-6.6 0.7-0.8 ~2.5 -
Ячмень ~4.4 5.7-7.0 4.3 -
Рожь ~8.7 2.2-2.8 ~3.0
Соя 3.6 - 4.6 9.3-14.0
Кукуруза 4.9 - 2.6
Пшеничныеотруби
22.0-26.0 1.9-2.4 н/д н/д
Соеваяшелуха
~35.0 ~9 ~12 н/д
Иван Зоров МГУ 11
Типы и функции основных ферментов для использования в кормах
ПРОТЕАЗЫ – расщепление белков на полипептиды и аминокислоты
КАРБОГИДРАЗЫ
Целлюлазы – разрушение молекул целлюлозы
Гемицеллюлазы (ксиланазы, b-глюканазы, пектиназы)
расщепление ксилана, b-глюкана и пектина
соответственно
Амилазы – для расщепления крахмала
Фитаза – для высвобождения растительного фосфора,
связанного в фитине
Иван Зоров МГУ 12
отщепление по концевым связям
Механизмы ферментативного гидролиза
полисахаридов на примере гидролиза целлюлозы
ЭНДОДЕПОЛИМЕРАЗЫ
“статистическая” деполимеризация по внутренним связям
ЭКЗОДЕПОЛИМЕРАЗЫ
Субстраты: кристаллические и низкомолекулярные
(авицел, олигосахариды)
Эффект: образование простых сахаров – гексоз и пентоз
Субстраты: высокомолекулярные (КМЦ, b-глюкан, галактоманнан)
Эффект: снижение вязкости растворов полисахаридов
Иван Зоров МГУ 13
Ферментативный гидролиз полисахаридов клеточной стенки
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
O O
O
OH
OH
OH
OHm (m
Иван Зоров МГУ 14
Метод определения активности ферментов в кормах при помощи окрашенных субстратов
Иван Зоров МГУ 15
Принцип метода измерения ферментативной активности по окрашенным субстратам
Окрашенный полисахарид, растворимый в буфере,
нерастворимый в органическом “осадителе”
Е
Олигосахарид, раство-
римый в “осадителе”
Полисахарид, нераство-
римый в “осадителе”
Иван Зоров МГУ 16
Окрашенные субстраты
Окрашенные
активным
оранжевым
карбоксиметилцеллюлоза
аморфная целлюлоза
арабиноксилан
галактоманнан
лихенан
Окрашенные
бриллиантовым
голубым
карбоксиметилцеллюлоза
арабиноксилан
b-глюкан
крахмал
Иван Зоров МГУ 17
Схема проведения эксперимента
Раствор окрашенного
субстрата
Измерение оптической
плотности супернатанта
Осаждение
Центрифугирование
Гидролиз окрашенного
субстрата экстрактом корма
Центрифугирование
Отбор супернатанта
Экстракция
Приготовление
суспензии корма
Условия: рН 5,0 ацетатный буфер,
температура 42оС,
перемешивание
Иван Зоров МГУ 18
Анализ активности ферментов в кормах
на примере ROD-КМЦ
Окрашенная КМЦ
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Соя 1 Соя 2 Корм №1 Корм №4 Корм №5 Корм №7 Корм №8 Корм
№10
А490
Иван Зоров МГУ 19
1 Премикс 1 с ФП1
2 Комбикорм с ФП1 престартер после
миксера
3 Комбикорм с ФП1 престартер в
гранулах
4 Премикс 2 в ФП2
5 Комбикорм Стартер с ФП2 до
гранулирования
6 Комбикорм Стартер с ФП2 крупка
7 Премикс 3 с ФП1
8 Комбикорм с ФП1 Стартер до
гранулирования
9 Комбикорм с ФП1 Стартер гранулы
ОБРАЗЦЫ ПРЕМИКСОВ И КОМБИКОРМА
ДО И ПОСЛЕ ГРАНУЛИРОВАНИЯ
Ксиланазная активность в кормах
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Образец
А485
Эндоглюканазная активность в кормах
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
0,3500
0,4000
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Образец
А4
85
Иван Зоров МГУ 20
Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа
Окрашенные субстраты
Корма чистые и с добавлением
ферментов для калибровки
Термостат (водяной или контактный)
Лабораторный фотометр
Центрифуга (или микроцентрифуга)
Лабораторная посуда (или микропосуда)
Мерные пипетки (или микропипетки)
Иван Зоров МГУ 21
Метод определения активности ферментов в кормах вискозиметрическим методом
Иван Зоров МГУ 22
Оборудование для определения вязкости
Иван Зоров МГУ 23
Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа
Корма, дающие высоковязкие экстракты
Водяной термостатируемый шейкер или
термостатируемая магнитная мешалка
Капиллярный вискозиметр
Секундомер
Центрифуга (или микроцентрифуга)
Лабораторная посуда (или микропосуда)
Мерные пипетки (или микропипетки)
Иван Зоров МГУ 24
Вязкость экстрактов муки (100 г/л)
Время
истечения, сек
Относительная
вязкость
Рожь, №1 155 6,3
Рожь, №2 127 5,2
Ячмень 97 4,0
Пшеница 33,5 1,4
Кукуруза 25 1,0
вода 24,5 1,0
Время истечения экстракта
Относительная вязкость =
Время истечения воды
Иван Зоров МГУ 25
Схема проведения эксперимента
ДОБАВЛЕНИЕ
ФЕРМЕНТА
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАДЕНИЯ
ВЯЗКОСТИ ОТ ВРЕМЕНИ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЯЗКОСТИ
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
ОТБОР ЖИДКОЙ ФРАКЦИИ
ЭКСТРАКЦИЯ
ПРИГОТОВЛЕНИЕ
СУСПЕНЗИИ МУКИ
Иван Зоров МГУ 26
Анализ активности ферментов
на примере экстракта ржи
Г20Х
90
100
110
120
130
140
0 500 1000 1500
Г20Х
0,95
1,05
1,15
1,25
1,35
1,45
1,55
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750t'
Fr
t ист., сек
t реакции, сек
Пример высокой
активности и
стабильности
фермента
Иван Зоров МГУ 27
PentoХ
80
85
90
95
100
105
110
0 500 1000 1500
Анализ активности ферментов на примере экстракта ржи
t ист., сек
t реакции, сек
PentoХ
0,95
1,05
1,15
1,25
1,35
0 250 500 750 1000 1250t'
Fr
Пример высокой
активности фермента, но
малой стабильности
фермента
Иван Зоров МГУ 28
GrinХ
107
108
109
110
111
112
113
0 200 400 600 800 1000
Анализ активности ферментов на примере экстракта ржи
t ист., сек
t реакции, сек
0,95
1
1,05
1,1
1,15
1,2
1,25
1,3
0 200 400 600 800 1000
Пример низкой
активности фермента
Иван Зоров МГУ 29
Ингибирование ксиланаз экстрактами зерновых культур
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
бо
лее,
чем
на
90%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
на 5
0%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
бо
лее,
чем
на
90%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
на 5
0%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
бо
лее,
чем
на
90%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
на 5
0%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
бо
лее,
чем
на
90%
Ин
гиб
ир
ов
ан
ие
на 5
0%
Кси
лан
азн
ая
акти
вн
ость
,
Ед
/мг
Bio ACE Dyadic 0.95
ЦелловиридинАрсенал
Гольджи +- +- +- +- 1.9
Cellustar XL Dyadic X + X + + X + 36
Xylanase 2 XP Dyadic X + X + + X + 63
Cellustar XL Dyadic X + X + + X + 36
NCE L600 Dyadic + X + + 5.4
C1, dry Dyadic + X + + 4.6
Pentopan, Mono BG Novozymes X + + X + + 129
Econase HCP 4000 AB Enzymes X + + + X + 164
Provimi feed enzyme Provimi X + + +- 52
Avizyme 1200 Finnfeeds X + X + + X + 12
Porzyme PT 100 Finnfeeds X + X + + X + 60
Rovabio Excel, UF Aventis + 19
Allzyme PT , A.niger, Alltech X + + + +- 6
Sumizyme X, dryShin-Nihon
(Bioshigen) X + +- + + 92
Genencor Xylanase Genencor X + X + + + 134
Endopower, dryHyndaifeed
(Eazy
Biosystems)X + + + 7
Рожь КукурузаЯчменьПшеница
Иван Зоров МГУ 30
БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!
ЗОРОВ Иван Никитич