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High PerformanceLiquid Chromatography
Introduction.
Classification of Chromatography.
Theory
LC System
Troubleshooting.
ContentsContents
원리 . - 시료가 칼럼을 지나는 동안 , 각 성분의 이동도 차이를 이용해 혼합물의 각 성분을 분리하는 방법 . - 분리과정은 각 성분의 이동상과 정지상 사이의 분배 , 흡착 , 이온교환 , 시료 의 크기차이에 의존 .
역사 . - 1903 년 소련의 식물학자 Tsweltt 가 최초로 유리관에 흡착된 흡착제 ( 탄산 칼슘 ) 를 충진 시키고 석유에테르를 사용하여 식물잎에 있는 엽록소 ( 클로로 필과 크산토필등 ) 를 분리 하는 최초의 크로마토그래피 실험을 실시 . - 주목할 만한 발전은 1941 년 Martin 과 Synge 에 의해 발전된 하나의 흡착제 대신에 불용성 흡착제를 고정상에 결합시킨 고정액상을 사용한 액체 - 액체 크로마토그래피 (LLC) 이다 . - 최근에는 High performance liquid chromatography(HPLC) 가 널리 각광 받고 있는데 이는 비휘발성 용질이나 열에 약한 시료의 신속한 분리 기술 .
ChromatographyChromatography
이동상의 종류에 따라 분류 할 수 있으면 , 이동상이 gas 인 경우에는 Gas chromatography(GC) 이고 , liquid 인 경우에는 Liquid chromatography(LC) 이고 , gas 와 liquid 의 중간의 성질을 갖는 유체를 사용하는 Superitical fluid chromatography 로 분류 .
GC 는 사용되는 고정상의 종류에 따라 고정상을 고체인 담체를 사용하여 기 체 - 기체 흡착평형이 분배과정을 통하여 이루는 GSC 와 불활성인 고체 지지 체 (Solid support) 에 엷은 막으로 입혀진 액체를 고정상으로 사용하여 기체 와 액체 사이의 시료 성분들이 평형을 이루어 분리가 일어나는 GLC 로 구분 .
Classification of ChromatographyClassification of Chromatography
Figure 1. Classification of Chromatography.
Chromatography
Gas Chromatography Liquid Chromatography Supercritical Fluid Chromatography
Gas-solid Gas-liquid
Adsorption Partition Ion exchange Size exclusion Affinity
Gel Filtration Gel permeation
원리 . - 가장 오래된 chromatography 형태로 , 이동상인 액체와 고정상인 고체 사이에서 시료가 고정상에 흡착되는 정도에 따라 분리 . - 흡착제를 유리관 등의 관 (column) 에 충진시켜 , 위쪽으로부터 시료용액을 흘려내려 보내면 시료가 흡착된다 . 흡착제에 흡착된 시료는 용매를 관의 상부로부터 흘러내리게 함으로써 전개되어 관에 분리된 물질의 크로마토 그램를 형성 . - GSC 의 경우 이동상은 비활성 기체를 이용하므로 고정상에 대한 시료의 친화력 차이로 분리 .
흡착제 (Adsorbent) 의 종류 . - 고정상으로 사용하는 물질은 실리카 (SiO2), 알루미나 (Al2O3), 마그네슘 옥사 이드 등이며 , 그 중 실리카겔과 알루미나가 대표적 .
Adsorption ChromatographyAdsorption Chromatography
Figure 2. Adsorption chromatography.
원리 . - 가장 많이 사용되는 크로마토그래피 방법이고 , 고정상과 이동상인 사이에 시료가 분배되는 차이를 이용하여 , 시료 성분은 끊임없이 고정상과 이동상 사이를 왕복하면서 컬럼내를 이동 하게 되고 , 마침내 분리가 일어남 . 순상 (Normal phase). - 고정상이 극성이고 이동상이 비극성이고 , 비극성 화합물이 먼저 분리 . - 고성상으로 사용되는 물질의 작용기는 Nitrile, Diol, Amino 등의 극성 작용 기로 이루어짐 . 역상 (Reverse Phase). - 고정상이 비극성이고 이동상이 극성이고 , 극성화합물이 먼저 분리 . - 작용기는 탄소수가 8 개 또는 18 개인 비극성 체인으로 이루어짐 . 컬럼 . - 고정상으로 사용되는 막이 쉽게 손상된다는 것이 단점이나 지지체와 화학 적으로 결합된 고정상을 사용하는 결합
Partition chromatographyPartition chromatography
Figure 3. Partition chromatography.
원리 . - 이온교환수지를 고정상으로 하고 산 , 염기 또는 완충용액을 이동상으로 하 여 용질 이온상과 고정상 이온간의 이온교환에 의해 용질 이온을 분리 . 이온교환 과정 . - 하전된 용질 이온 P- 가 반대이온 X- 와 대치되어 교환체 R+ 의 반대 전하 자 리에 부착 .
- 용질 이온은 경쟁적으로 작용하는 염 이온 S- 로 대치 되고 , 칼럼으로 부터 용질을 분리하는 원리 .
이온 교환체 . - 교차 결합된 polystyrene, polydextrans, cellulose, silica 등의 합성수지를 포함하는 다양한 물질들이 이온 교환체로 사용 .
Ion-exchange chromatographyIon-exchange chromatography
R+X- + P- R+ P- + X-
R+P- + S- R+ S- + P-
Figure 4. Ion-exchange chromatography chromatography.
정지상에 공유결합된 양이온 근처에 있는 이동성음이온
+
음이온 교환수지
+
+
++
+
++
+ ++
+
원리 . - 다공성 비이온성 겔을 고정상으로 사용하며 , 진동으로 분자를 크기에 따라 분리 . - 큰 분자는 겔에 들어가지 않고 통과 하고 작은 분자가 겔 속에 들어 갈수 있어 컬럼을 빠져 나올 때 까지는 많은 양의 이동상이 필요 하다 .
분류 . - Gel filtration chromatography(GFC) : 수용성 물질을 수성용매로 사용 하여 분리 . - Gel permeation chromatography(GPC) : 비수용성 물질을 유기용매를 사용하여 분리 .
Size exclusion chromatographySize exclusion chromatography
Figure 5. Size exclusion chromatography.
원리 . - 가장 최근에 발전되었으며 , 가장 선택적인 방법 . - 특정의 생체고분자에 친화성 있는 물질을 불용성의 담체에 화학적으로 결합시켜 고정상으로 하고 이것에 생체고분자 혼합물의 용액을 흐르게 하여 고정상에 친화력 있는 것과 없는 것으로 분리 . - 예를 들면 천 종류의 단백질을 포함한 혼합물이 컬럼을 통과할 때 , 단지 항체와 반응하는 하나의 단백질만 컬럼에 결합된다 .
사용되는 지지체 . - 물리 , 화학적으로 안정하고 견고한 유기물 또는 무기물의 고분자 수지 . - 사용되는 예로써는 젤 , 유리구슬 , 나일론 섬유등이 대표적인 물질 .
Affinity chromatographyAffinity chromatography
Figure 6. Affinity chromatography.
LC 의 기본원리 . - 고정상은 다공성 고체 분말이 길고 작은 튜브에 충진 되어 있고 , 투입된 소량의 용액을 컬럼에 주입하면 각 성분은 충진물에 흡착과 탈착이 연속적 으로 이루어지면서 충진물과의 친화력의 차이만큼 각각 이동속도가 차이가 생겨 분리 .
분배계수 (Partition coefficient). - 각 성분 X 는 컬럼을 통과하면서 고정상 (s, 충진물 ) 과 이동상 (m) 사이에 분배 가 이루어지고 , 분배가 어느 정도가 어느 쪽으로 치우쳤는지를 분배 계수로 나타 낼 수도 있다 .
TheoryTheory
mXsXK
][][
[X]s : 고정상에 분배된 시료의 농도 .[X]m : 이동상에 분배된 시료의 농도 .K : 분배 계수 .
Figure 7. Procedure of separation for a three component mixture.
C component
B component
A component
검출기검출기
Figure 8. A typical chromatogram for a three component mixture.
tM : 이동상이 칼럼을 빠져 나오는데 걸리는 시간trB : 용질 B가 컬럼을 빠져 나오는데 걸리는 시간twB : 용질 B 피크의 폭 , h : 피크높이
용량인자 (Capacity factor). - 각 성분이 컬럼에서의 머무는 정도를 나타내는 척도로 용질이 고정상과 이 동상에 각 각 머무르는 시간의 비를 말함 . - 한 성분이 칼럼에 오래 머물수록 Capacity factor k 는 커지고 , 용량인자가 커질수록 분리가 잘 되지만 , 띠폭이 넓어짐 .
TheoryTheory
M
MrB
tttk
tM : 이동상의 머무름 시간trB : 시료 B의 머무는 시간
- K = 0 : 시료가 칼럼에 전혀 머무르지 않고 tM 에 용출됨 . K = 1 : 시료가 tM 의 2 배가 되는 곳에서 용출됨 . 1< K <6 : 시료가 적합하게 용출됨 .
단 이론 - 단 이론이란 컬럼내에 단 (theorecal plate) 가 연속적으로 연결 되어 있고 , 분배 평형이 일어나 물질이 분리되는 것을 말한다 . - 컬럼의 분리 능력을 지칭하는 하는 컬럼 효율은 단 이론으로 설명된다 . - 이론 단수가 많을 수록 컬럼 효율이 높고 , 단 수가 높을 수록 효율은 낮다 .
컬럼 효율을 증가시키는 방법 .- 칼럼 충진물의 크기가 작을수록 증가 : 작은 입자 일 수록 높은 흐름속도를 허용하고 , 작은 입자와의 평형은 보다 빠르기 때문에 정지상 입자가 작을 수 록 더 많은 이론단수를 준다 .- 이동상의 점도가 감소할수록 , 온도가 높아 짐에 따라 .- 용질의 크기가 작을 수록 .
TheoryTheory
Figure 9. Calculation of a theoretical plate.
여기서 L : 컬럼의 길이 , N : 이론단수 , HETP : 단 이론 높이 (the Height equivalent to a theoretical plate).
분리도 (Resolution). - 상호간의 서로 다른 두 봉우리의 분리도는 다음과 같이 정의 될 수 있다 .
- 시료의 분리상태를 표시하는 지표로서 Capacity factor, Selectivity, 이론단 수 등과 관련이 있고 , 관계는 다음과 같이 표시 할 수 있다 .
TheoryTheory
11
41 2
avekkNR
BA
rArB
WWttR
)(2
- 여기서 는 selectivity, k2 는 머무름이 더 긴 두번 째 인자의 capacity factor 이고 , kave 는 두 성분의 capacity factor.
Figure 10. Column resolution of chromatographic separation.
Figure 11. Separation of a three component mixture with gradient elution.
Figure 12. A criterion of choice of HPLC method.
분자량 >2000
유기용매에 용해 물에 용해
비극성 –약한극
용매에 용해(hexane 에서 CHCl
3)
비이온성 또는이온쌍
약한 극성 용매 – 극성 용매에 용해
(CHCl3 에서 CH3OH)
Bondedreverse-phase
chromatography
이온성
CHCl3 에 용해 Alcohol, acetonirile , ethyl acetate 에 용해
Adsorptionchromatography Bonded
normal-phasechromatography
Bondednormal-phase
chromatography
C18, C8, C2,C1, phenyl, cyano Silica
Cyano, amino, diol
Cyano, amino
Ion-exchange orion chromatography
Figure 13. A criterion of choice of method.
분자량 < 2000
유기용매에 용해 물에 용해
분자크기< 30 nm
비이온성 또는 이온쌍
Bondedreverse-phase
chromatography
이온성
C18, C8, C4
Molecular exclusionchromatography
분자크기30 nm – 400 nm
분자크기< 30 nm
Bondedreverse-phase
chromatography
C18, C8, C4
or Phenyl or poly-ether resin
분자크기30 nm – 400 nm
Molecular exclusionchromatography
Ion-exchange chroamtography
LC 의 응용 . - 비휘발성 물질 , 열에 약한 물질 등의 분리 및 분석에 이용 . - 분리된 성분의 정량 , 정성 분석에 응용 . - 혼합물에서 순수한 물질을 분리 할 경우 .
HPLC 시스템 구성 . - HPLC system 은 이동상 (solvent) 저장용기와 기체제거장치 (degasser), 펌 프 (pump), 고정상 (column), 시료주입장치 (injector), 검출기 (detector), 기 록기 (recorder) 의 기본 장치들로 구성 . - HPLC system 에서는 고정상 (column 내 충진제 ) 의 입자의 크기를 10 ㎛ 이 하의 것을 사용하므로 이동상 (solvent) 가 흐를 수 있도록 수십 기압의 압력 을 가하여 물질의 분리할 수 있게 해주는 장치 .
Liquid chromatographyLiquid chromatography
HPLC 에 사용되는 용매가 갖추어야 할 조건 . - 점도가 낮아야 하고 , 이동상이 고정상을 녹여서는 안된다 . - HPLC grade 의 용매 이어야 한다 . - 분리하고자 하는 시료는 반드시 이동상에 녹아야 하고 , 이동상 용매는 시 료에 대해 일정한 조건을 유지해야 한다 . - 극성 물질이나 , HPLC 칼럼에서 이온화 될 수 있는 물질을 분리하고자 할 때 에는 보통 buffer 용매를 사용한다 .
등용매 분리 (isocratic elution) 와 기울기 용리 (gradient elution). - 등용매 분리 : 이동상으로 한가지 용매만 흘려 주는 것 . - 기울기 용리 :용매의 조성을 계속적으로 바꾸어 주는 방법 .
Mobile phaseMobile phase
펌프가 갖추어야 할 조건 . - 안정하고 재현성 있는 흐름 . - 펌프 내부는 용매와의 화학적 상호 반응이 없어야 한다 . - 일정한 압력과 유속으로 용매를 밀어 줄 것 . - 경제성이 있어야 하고 , 재현성 있는 retention time 을 얻을 수 있어야 한다 .
- 펌프에서 나오는 용매의 공급은 펄스가 없어야 한다 .
Reciprocating 펌프의 작동원리 . - 피스톤이 뒤로 움직이면 inlet ball check valve 가 열려 펌프의 작은 공간에 용매가 펌핑되고 피스톤이 다시 앞쪽으로 나오면 outlet check valve 가 열 려 펌핑된 용매를 컬럼에 흘려 보낸다 .
PumpPump
Figure 14. The configuration of pump.
시료 주입 장치 (Injector). - 밸브에 일정 부피를 갖는 loop 를 달아 시료의 양을 정확히 주입 . - Injector 를 load 위치에 놓고 주사기를 밀어 넣어 시료를 load 하면 시료는 injector 의 loop 안에 남고 이동상은 펌프에서 컬럼으로 loop 를 거치지 않고 흐르나 injector 를 inject 위치로 돌리면 이동상이 loop 를 지나면서 시료와 섞 여 시료를 컬럼으로 운반한다 .
InjectorInjector
Figure 15. The configuration of injector.
Large porous. - 충진 입자의 크기가 50 ~ 250 m 정도의 다공성 실리카 겔을 사용 . - 컬럼내 걸리는 압력은 0.1 ~1 atm 정도 이고 , 이동상의 유속은 약 0.1mL / min 으로 낮아 분석 시간이 오래 걸림 . - 정지상의 표면적이 넓어 한번에 분리 할 수 있는 시료의 양이 많다 . Pellicular. - 지름 40 m 정도의 단단하고 porous 하지 않은 유리 구슬 위에 1~3 m 두 께로 실리카젤 , 수지 , 폴리 아미드 등의 다공성 물질을 입힌 충진제 . - 충진물의 크기가 작아 짐에 따라 컬럼의 효율이 좋아 졌으나 압력이 많이 걸 려 펌프의 사용이 대두되고 , HPLC 가 등장 . - 표면적이 적어짐에 따라 분리할 수 있는 시료양이 적다 . Porous microparticle. - 5 ~ 10 m 크기의 다공성 입자로서 , 입자 크기가 작기 때문에 컬럼 효율이 높고 다공성으로 표면적이 넓어 분리 할 수 있는 시료 용량이 크다 . - 크기가 큰 다공성 입자 보다 가격이 비싸고 충진 하기가 어려운 단점 .
Packed materialsPacked materials
Figure 16. The configuration of packed materials. (a)Large porous (b) pellicular (c) Porous microparticle
(a) (b) (c)
Figure 17-1. The configuration of inside HPLC column.
Packed material
Mobile Phase
Stationary Phase
Column
Figure 17-2. Types of open capillary column.
Flow I.D 100 ~ 700 m
Stationary phase Wall of column Solid support
(a) Wall coated open tube (b) Support coated open tube (c) Porous layer open tube
분석용 칼럼 (Analytical column). - 실제로 많이 쓰이는 컬럼은 길이 25Cm, 내경 4.6mm, 충진제의 크기 5 m, 이론단수 400, 000 ~ 60, 000 plate/m. - 최근에는 분리 속도와 분리능이 훨씬 좋은 Micro LC 를 위한 내경 1~ 4.6 mm, 길이가 3~7.5cm, 충진제의 크기가 3~5 m 인 칼럼이 사용 .
보호칼럼 (Guard column). - 칼럼의 오염을 줄이거나 수명을 연장시키기 위하여 사용되고 , 보호 칼럼을 injection system 과 analytical column 사이에 설치한다 . - 정지상에 비가역적으로 흡착된 용매와 시료안에 있는 불순물은 보호 컬럼 안에 남에 있게 되고 , 주기적으로 버린다 . - 길이가 5~10cm 정도로 짧으며 pellicular 충진제로 이루어져 있다 .
ColumnColumn
원리 . - 광원에서 특정 파장의 빛이 광로를 거쳐 검출기 셀 내의 시료에 투입되면 특정 파장의 빛이 시료에 흡수 . - 검출기에 얼마 만큼 빛이 흡수 되었는가를 전기적인 신호로 나타내고 이 신호의 크기를 이용하여 시료의 정량 분석이 이루어짐 .
사용 범위 . - 많은 용질들이 자외선을 흡수 하고 , 검출기의 감도가 상당히 높기 때문에 HPLC 검출기로 가장 많이 사용되고 있음 . - 사용이 간편하고 , baseline 안정화 시간이 짧고 파장 선택 조절이 가능 . - 흡수가 없는 용매를 사용한 기울기 용리 (gradient elution) 에 적합 .
UV-Vis detectorUV-Vis detector
원리 . - Reference cell 과 sample cell 에 포함된 시료와 용매의 굴절률 차이가 존재하게 되고 , 비임이 광전관 중심으로부터 deflect 되고 검출기의 신호가 변한다 . - 자외선 검출기 보다 감도 약 1000 배 낮고 , 검출기가 이동상의 조성에도 영향을 받기 때문에 기울기 용리에는 사용되지 않음 . - 압력과 온도 변화에 민감하여 흐름 속도가 일정해야 하며 , 온도 변화도 0.01 oC 이 내로 일정해야 한다 .
사용 범위 . - 굴절률에 의하여 분석하므로 거의 모든 물질에 사용할 수 있으나 , 감도가 낮기 때문에 미량 분석에는 사용되지 않고 , 자외선 흡수가 없는 거의 없는 탄수화물과 지방족 중합체와 같은 물질에 일반적으로 적용 .
Refractive index detectorRefractive index detector
원리 . - 분석 물질이 쉽게 산화 되거나 환원되어야 하므로 약간 선택적 . - 예를 들어 페놀 , 방향족 아민 과산화물 , 머캅탄은 산화에 의해 검출되고 , 케톤 , 알데히드 , 방향족 할로겐은 환원에 의해 검출 .
특징 . - 검출될 수 있는 분석 물질에 대해서는 아주 감도가 높고 , 검출 한계가 나노 암페어 까지 측정할 수 있다 . - 전해질이 녹아 있는 수용액이나 다른 극성 용매가 필요하며 , 이것은 산소 가 전혀 없어야 한다 . - 이 검출기는 흐름 속도와 온도 변화에 민감 .
Electrochemical detectorElectrochemical detector
원리 . - 시료에서 발광하는 형광의 세기는 시료의 양 (농도 ) 에 비례하는 원리 . - 시료가 형광을 방출 할 때 혹은 시료를 형광을 낼 수 있는 화학기를 원하 는 분석 물질에 붙여서 형광 유도체로 만들었을 때 사용 . - 감도가 아주 좋지만 , 오직 형광을 내는 제한된 범위의 분석 물질에 대해 서만 사용 가능 .
사용 범위 . - Uv detector 보다 100 ~ 1000 배 정도 선택성이 좋다 . - 생화학 , 의학 , 공중보건 , 약리학 , 석유 화학 분야 . - Polycylic armatic, Aflatoxin 류 , Amino acid 류 .
FluorescenceFluorescence detectordetector
원인 . - Frit 막힘 . - 컬럼 오염 . - 충진물 막힘 . 압력이 높은 경우 조치 사항 . - 컬럼 세척 : 컬럼 오염 물질과 막힌 입자 제거 , 고분자 물질과 흡착제 제거 , 시료나 버퍼 침전물 제거 . - 역방향 세척 : Frit 막힘 해결 . - Frit 교체 : Frit 막힘 해결 . 압력 증가를 막는 방법 . - 컬럼 보호 장치 사용 (Guard column). - 시료 여과 . - 적절한 컬럼 세척 . - 이동상 여과 .
Troubleshooting(Pressure)Troubleshooting(Pressure)
현상 . - 한 개의 피크임에도 불구하고 두 개의 성분이 같이 용리된 것 처럼 나타남 . 원인 . - 컬럼 오염 - 주입 용매에 의한 영향 : 이동상 보다 강한 용매를 주입하면 피크 쪼개짐 이나 띠 넓어짐 (Broadening) 등의 피크 모양의 문제가 생길 수 있다 . - 컬럼 앞 부분이 부분적으로 막힘 . 피크 쪼개짐 원인 제거 . - 매트릭스가 복잡한 시료 분석 후 또는 많은 양의 시료 분석 후 : 컬럼 오염 또는 frit 막힘 . - 이동상 pH>7 : 실리카 용해에 의해 컬럼에 불감 부위 (Void)생성 하는데 , 특수 컬럼 사용으로 방지 가능하다 . - 시료 용해 용액이 이동상 보다 강한 경우 : 피크의 쪼개짐과 확산 .
Troubleshooting(Peak split)Troubleshooting(Peak split)
원인 . - 2 차 머무름 효과 - 컬럼 불감 부피 (void volume). - 컬럼 오염 . - 컬럼 노화 . 피크 쪼개짐 원인 제거 . - 이동상 효과 검토 : 이동상 pH 와 첨가제 추가로 2 차 효과 제거 . - 칼럼 선택 검토 : 초순수 실리카 컬럼 또는 작용기 결합 방법이 다른 컬럼 선택 . - 시료 주입량 감량 . - 컬럼 세척과 컬럼 불감 부피 , 노화 확인 .
Troubleshooting(Peak tailing)Troubleshooting(Peak tailing)
원인 - 컬럼 노화 . - 컬럼 오염 . - 컬럼과 이동상의 부적절한 조화 . - 이동상 , 유속 변경 .
Troubleshooting(Retention time)Troubleshooting(Retention time)
머무름 시간 변동시 ( 컬럼간 ) - 측정할 피크의 capacity factor, selectivity,tr 결정 . - 컬럼 세척 . - 새컬럼 테스트 - lot number 확인 . - 매분석시 새로 만든 이동상 사용 .
머무름 시간 변동시 ( 로트간 ) - 컬럼 사용 정도의 차이 (노화 ). - 불충분한 컬럼 평형 . - 컬럼과 이동상의 부적절한 조화 . - 이동상 , 유속 변경 .
정의 . - 주어진 흡착제로 부터 용질을 치환시킬 수 있는 용액의 상대적 능력의 세기 를 비교한 것이다 . - 용리액 세기 (eluent strength, o ) 는 용매의 흡착 에너지의 척도 인데 , 펜탄 의 값을 0 으로 정한다 . - 일반적으로 용리액의 세기가 클수록 용질은 더 빨리 컬럼으로 부터 용리됨 . 과정 . - 처음에는 약하게 머무르는 용질이 약한 용리액 세기를 갖는 용매에 의해 용리 된다 .- 두번째 용매를 첫번째 용매와 섞어 불연속적 , 또는 연속적인 단계로 용리액 세기를 증가 시키고 이러한 과정으로 매우 강하게 흡착된 용질이 컬럼으로 부터 용리된다 .
Eluotropic seriesEluotropic series
Solvent Fluoroalkanesn-Pentanei-Octanen-Heptanen-DecaneCyclohexaneCyclopentaneCarbon disulfideCarbon tetrachloride1-Chloropentanei-Propyl chlorideToluene1-ChloropropaneChlrobenzeneBenzeneBromoethaneDiethyl etherChlroform
Solvent DichlromethaneTetrahydrofuran1,2-Dichloromethane2-ButanoneAcetoneDioxaneEthyl acetateMethyl acetate1-PentanolDimethyl sulfoxideAnilineNitromethaneAcetonitrilePyridine2-PropanolEthanolMethanol1,2 Ethanediol
Table 1. Eluotropic series.
컬럼선택 . - 역상 컬럼의 종류는 Methyl, butyl, octyl, octadecylsilane, phenyl, amine, cyano column 등이 있고 , 실리카에 결합된 alkyl silane 작용기를 가지고 있어 , retention time, component elution 을 변화 시킴 . - 컬럼을 선택 할 때는 octadecylsilane 로 시작하여 retention time 이 너무 길 으나 분리도가 우수 할 경우에는 chain 이 더 짧은 otyl silane column 을 사 용한다 . - 컬럼 길이를 선택함은 resolution, 피크모양 , 재현성을 잃지 않고 retention time 을 줄일 수 있는 방법 .
이동상의 선택 . - 역상 HPLC 의 이동상은 물과 CH3CN, CH3OH, Tetrahydrofuran(THF) 과 같 은 organic modifier 의 혼합물로 구성 . - 비극성인 target 인 경우에는 물과 하나 또는 그 이상의 organic modifier 의 혼합물로 분리가 수행됨 .
Practical analytical method developmentPractical analytical method development
Practical analytical method developmentPractical analytical method development
THF
ACN MEOH
