세포 배양 / 발효 기술

아주대학교 대학원

분자과학기술학과 (BK사업단)

발효대사공학실험실

교 수 유 연 우

종배양 (seed culture)

• 선별배지

• 오염확인(바이러스 등)

• 생리적 특성확인

• 생성물의 수준확인

Production fermenter

• 생산성, 수율 및 최종농도

확인

균주 (cells and spores)

• 균주의 획득

• 균주의 관리보존

• 균주의 개량

I. 세포배양/발효기술

Bench-scale fermenter

• Inoculum 준비

• 생산용 배지조성 및

배양조건 최적화

• 배양방법의 선정

Scale-up 단계

KLa 등

II. 균주 ( cells or spores )

1. 균주의 획득

1) 자연계에서 분리

① Sources : 대기, 토양, 특수지역, 식물 및 동물세포

② 미생물의 순수 분리

- Continuous enrichment culture (연속농화배양)

- Plate culture (단일 colony분리를 반복) : 선별배지의 이용

③ 새로운 metabolites를 얻기 위한 미생물 탐색

- 새로운 미생물의 탐색 : 30 ∼40%

예 1) 꿀 벌집의 삼투압 내성 효모 : 당알콜 생성

예 2) Sea and fresh water의 Actinoplanes strains :

20,000 strains 중에서 13,000 strains 가 항생제 생성

⇒ 41개의 새로운 항생제 분리

- 새로운 test system에 의한 new metabolites 탐색

예 1) Omura et al. (1979) : cell wall 합성 inhibitor 탐색

Bacillus subtilis의 성장억제.

Cell wall이 없는 Acholeoplasma laidlawii 의 성장

⇒ 미생물 배양액으로 test

⇒ 분자량 10,000 이상인 것은 제외 (의약품으로서 항체생성 등의 부작용 우려)

⇒ Azureomycin 발견

예 2) Fleck and Strauss (1975) : antitumor metabolite 탐색

균주: λ-phage가 prophage 상태의 E. coli 이용

- test substance 를 첨가하여 배양

- lytic cycle 을 유도하는 물질 분리

⇒ Antitumor activity 가 존재하는 Leukaemomycin 발견

④ 형태관찰 및 생리적 시험

- 형태상의 특성 및 염색에 의한 관찰

- 생리적 특성 검사

- 탄소원의 이용 능력 및 발효 능력 검정

- 요구되는 mineral salts 및 growth factors

- 기타 물리 화학적 특성 ( pH, 온도, 산소 요구성, foam 생성 등)

⑤ 동정(Identification) 과 명명 (Nomenclature)

- 동정 : Bergey’s manual, The yeast 등

- 명명 : Genus, species, strains 등

2) 관련분야에 종사하는 연구자로부터 분양

3) 미생물 보존기관에서 분양 ( 종균협회, KTCC 등)

AddressCulture Collection

Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London, NW95HT, UKNational Collection of Type Culture (NCTC)

Institute of Microbiology, USSR Academy of Sciences, Prosojuznaja 7, Moscow b-133, USSRUSSR All-Union Collection of Microorganism

Institut Pasteur, 28 Rue du Cocteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, FranceCulture Collection of the Institute for Fermentation

J.E. Purkyne University, 66243 Brno, CzechoslovakiaCzechoslovak Collection of Microorganisms

Oosterstraat 1, PO Box 273.3740 AG Baarn, NetherlandsCentraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)

Grisebachstrasse 8, Göttingen 3400, GermanyDeutsche Sammlung von Microorganismen

1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604-39999, USANational Center for Agricultural Utilization Research (NRRL)

12301 Parklane Drive, Rockville, Marryland 20852, USAAmerican Type Culture Collection (ATCC)

Food Research Institute, Colney Lane, Norwich NR47UA, Norfolk, UKNational Collection of Yeast Culture (NCYC)

Commonwealth Microbiological Institute, Ferry lane, Kew TW93AF, Surrey, UKCollection of the Commonwealth Mycological Institute (CMI)

Torry Research Institute, 135 Abbey Road, PO Box31, Aberdeen AB98DG, UKNational Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB)

2. 균주의 관리보존

1) 균주 보존시 유의점

① 보존중의 사멸이나 변이 방지

② 보존기간을 가능한 한 길게

③ 접종원으로 반복해서 사용할 수 있도록

④ 오염되지 않도록

⑤ 조작이나 용기가 가능한 한 간편하게

2) 균주의 보존방법

① 계대배양법: Slnat에 배양하여 보관 (4℃, 55% 습도, 2 ∼ 6개월)

② Test tube 배양법 : 액체배양 후 밀봉하여 저온 보관

③ 냉동보존법 (Deep freezing method) : 장기간 보존이 가능

- 액체배양 후 영하180℃에 보존 (액체 질소에 의한 급속냉동)

- ice crystal이 형성되지 않도록 cryoprotectants 이용

• Bacteria : glycerol, ethylene glycol

• Yeast, Fungi, Plant & Animal cells : Dimethylsulfoxide

④ 냉동건조법 (Lyophilization) : 미생물의 장기간 보존방법

미생물 배양 → 배지에 현탁 → 급속냉동 → 냉동건조 → N2 gas 주입

→ ample 보관 → 다시 이용시에는 멸균증류수에 넣어 배양

3. 균주의 개량

1) 목적 : 경제성

① 균주의 산물생성 향상

- 수율(고가의 원료), 생산성(배양기 용량), 최종농도(분리정제)

② 발효특성 개선

- 부산물의 생성 억제 (분리정제 용이)

- Foam 생성, 산소요구량, 낮은 viscosity (통기 교반에 용이)

- 값싼 기질 이용과 고농도 탄소원과 질소원에 내성

- Phage에 저항성인 균주 (phage 오염방지),

예) Wako 등(1998) ; 산업적인 생산에 이용

- 곰팡이인 Aureobasidium sp. 가 40%의 수율로 erythritol 생산

⇒ 균주개량에 의한 foam 생성제거에 의하여 45%로 수율향상

2) 돌연변이(Mutation)

① Mutagens

- Physical mutagens : UV, γ-ray

- Chemical mutagens : HNO2, alkylating agents (EMS, NTG 등),

Acridine orange (frame-shift)

② 변이유도 조건

- mutagen 처리에 대한 strain specificity

예) Bacteria : HNO2, UV

Yeast, Eukaryote cell : EMS, NTG, UV, γ-ray 등

- mutagen 처리 조건 : pH, buffer composition, mutagen 농도,

미생물의 growth phase, 처리시간 등

Histogram of sisomicin production by Micromonospora inyoensis (control strain=100%) in relation to mutagen treatment with nitrous acid

Killing of Micromonospora inyoensis by nitrous acid

③ 균주개량 원칙

- 서로 다른 mutagen을 처리

- step by step으로 수행

- 원하는 배지 조성 및 배양 조건에서 test할 것

④ 변이균주의 선별

Random selection : 직접 metabolite나 발효특성의 측정에 의한 선별

- 일의 양이 많지만 현재까지도 산업체에서 균주개량에 많이 이용

- 계속적인 mutation과 selection을 가장 좋은 strain을 가지고 반복하여

균주의 생산능력을 점차 증가시킴

Isolation of resistant mutants

예) Catabolite resistant mutants (2-deoxyglucose 이용)

Antimetabolite (Feedback) resistant mutants (metabolite analog 이용)

Examples of analogues used select mutants that overproduce metabolites

PyrithiamineThiamine

Sulfonamidep- Aminobenzoic acid

IsoniazidPyridoxine

3-ActetylpyridineNicotinic acid

8-AzaxanthineGuanosine

5-Fluorouracil ; 8-azaguanineHypoxanthine, inosine

5-FluorouracilUracil

2,6-DiaminopurineAdenine

Canavanine ; arginine hydroxamate ; D-arginineArginine

Ethionine ; norleucine ; α-methylmethionine; L-methionine-D,L-sulphoximineMethionine

α-Amino-β-hydroxyvaleric acid Threonine

Trifluoroleucine ; 4-azaleucineLeucine

Valine : isoleucine hydroxamate ; α-aminobutyric acid ;

α-amino-β-hydroxyvaleric acid ; 0-methylthreonine

Isoleucine

α-Aminobutyric acidValine

3,4-DehydroprolineProline

2-Thiazolealanine ; 1,2,4-triazole-3-alanineHistidine

5-Methyltryptophan ; 6-methyltryptoohan ; 5-fluorotryptophanTryptophan

p-Fluorophenylalanine ; D-tyrosineTyrosine

p-Fluorophenylalanine ; thienylalaninePhenylalanine

Analogues for selctionAccumulated product

Isolation of auxotrophic mutant

- Replica plating method

- Enrichment method

예) spore인 경우에 filtration enrichment, antibiotics를 이용한 enrichment

기타 specific methods

예) 항생제, 효소, pigments 등

3) Genetic recombination

- 서로 다른 두개의 genotype을 재조합시켜 새로운 genotype을 갖는 strain으로 개발

① 생성물은 증가시키고 대립 유전자가 하나의 strain에 존재할 수 있으므로 유전자의

누적효과에 의하여 high yield strain을 얻을 수 있다.

② Mutation에 의하여 생산성 증가가 어려운 경우 mutant와 parent간의 recombination

에 의하여 생산성이 증가되면서 발효특성이 개량된 strain을 얻을 수 있다.

예) Fungi의 sexual 또는 parasexual recombination

4) 세포융합 (Protoplast fusion)

① 모든 세포를 이용한 genetic recombination이 가능

② 방법 : 원형질체 형성 → Ca++, PEG 존재하에서 융합 → cell wall regeneration

→ 선별

5) 유전자 조작 기술

① 균주개량 : Metabolic pathway에서 rate limiting step의 유전자 증폭

② 외래 유전자 주입 재조합 미생물 : 외래 단백질의 생산 (재조합 단백질 의약품 등)

☞ 외래 유전자 이용시 고려사항

- Foreign DNA : cDNA, synthetic DNA, PCR , codon usage, mRNA의 stability,

ribosome과의 affinity

- Expression vector : copy number, selection marker, stability

- Promoter : regulation (repressible & constitutive), strength

- Host cell : low protease, GRAS (generally regarded as safety), auxotroph, etc.

- Secretion : signal peptide, glycosylation, proteolytion.

6) 대사공학 기술

대사과정의 흐름(metabolic flux)을 분석하여 원하는 방향으로 재조정하는 기술

① metabolic flux 분석 : DNA chip 이용

② 균주 개량 : 유전자 조작과 단백질 공학 기술 이용

③ 이용 범위

- 대사경로의 활성화에 의한 산물의 과량생산

- 기질의 이용범위 확대

- 유해 물질에 대한 저항성 향상

- 새로운 물질의 생산 능력 부여

- 균주의 배양조건 특성 변형 등

Ⅲ.종배양 (Flask culture)

1. 선별배지에서 사용 균주의 확인

2. 오염 확인 (바이러스 등)

3. 생리적 특성 확인 (morphology, 배양 특성 등)

4. 생성물의 생성량 및 수율 확인

Ⅳ. Bench-scale fermenter (1 ~ 5 L)

1. Inoculum 준비 (5 ~ 10%, v/v)

1) 접종용 배지의 선정기준

① lag phase를 최소화

② 균주가 health하고 세포성장이 우수해야함

③ 대량 volume의 배양이 가능

④ 균주의 morphological form이 적당해야 함

⑤ contamination이 없는 원료 이용

⑥ 균주의 생성물 생성 능력이 유지되어야 함

2) 접종용 균주의 배양조건, 세포농도, 배양시간 결정

2. 생산용 배지조성 최적화

☞ 세포성장, 산물생성, 에너지 공급 및 생명 유지에 이용

1) 산업용 배지의 선정 기준

① 산물의 생산수율과 최대 농도 고려

② 부산물 생성을 최소화

③ 저렴한 가격과 년중 구입이 용이

④ 생산공정상의 문제점 최소화 (통기 및 교반, 분리정제 과정, 폐수처리 등)

2) 물 (Water)

① 가장 많은 양이 소모되므로 permanent하게 공급이 필요

② pH, solids양, contamination 정도, mineral content 등의 확인이 필요

3) 탄소원 (Carbon source)

① Glucose & sucrose : 가격이 비싸다

② Molasses : 아미노산 및 핵산 발효에 이용

③ Hydrol : 액상임

④ Malt extract : 곰팡이, 효모, 방선균에 좋은 기질임

⑤ Starch & dextrin : amylase 생산, ethanol 생산

⑥ Sulfite water liquors : yeast 배양에 이용

⑦ Cellulose : 볏짚, 옥수수속, bagasse 등

⑧ Whey : lactose로 이용

⑨ 동물 및 식물 기름 : 기질 보조제로 많이 이용

⑩ Methanol : 가격이 가장 저렴하지만 이용할 수 있는 균주가 제한

⑪ Ethanol : 식초생산 원료

⑫ Alkanes : 원유가격 상승으로 이용 가능성이 희박

4) 질소원 (N-Source)

① Chemical compounds :

(NH4)2SO4, urea, nitrate salts, 암모니아수(과량 첨가시에 미생물 생육이 저해됨)

② 유기 질소원

- Light steep water (LSW), corn steep liquor (CSL), corn steep powder (CSP)

- Yeast extract : 가장 우수하지만 가격이 비싸다.

- Peptones (protein hydrolylate)

- Soy meal : 항생제 발효에 많이 이용

5) Minerals

① 기본적인 minerals : Mg2+, Pi, K+, Ca2+, Cl-

② Trace elements : Co, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn 등

6) Vitamin source

① 기본적으로 C-source와 N-source에 존재

② Cofactor로 꼭 필요한 경우에는 첨가

7) Precursor 및 metabolic regulators 첨가

예) Penicillin → Phenylacetic acid, Enzyme → inducer

8) 산소(호기성) : 교반과 통기에 의하여 제공

9) Antifoam : foam 발생시 첨가

내압 (0.1 ~ 0.4 bar) - foam 제거 및 KLa 증가

3. 배양조건 최적화

☞ 산물의 수율, 생산성 및 최종 농도를 고려하여 설정

1) 배양 pH : Non-control 또는 control

- CaCO3 첨가 : 산 생성에 의한 pH 저하 방지

- Phosphate 및 protein, amino acid : buffer 능력이 존재

2) 배양 온도 : 균주에 따라 다양하여 세포 성장과 산물의 생성조건이

다를 수도 있음

3) 통기 (Aeration) : 호기성 미생물에서는 세포성상에 매우 중요

세포내 oxido-reduction potential에도 영향

4) 교반 (Agitation) : 방선균 및 곰팡이 에서는 morphology와 산물의

생성에 큰 영향을 줌

4. 배양 방법

1) 회분식 배양 : 높은 수율 및 최종농도, 생산성이 낮음

2) 유가식 배양 : 높은 최종농도와 생산성

① Intermittent feeding 방법

② Continuous feeding 방법 (constant, linear, exponential)

③ pH-stat

④ Glucose-stat

⑤ Two-stage (growth stage → production stage)

3) 연속배양 (continuous culture) : 가장 높은 생산성, 최종산물의 농도가 낮음

고정화 세포의 이용에 가장 적합함

5. Scale-up

1) Scale-up 단계

① Bench scale : slant → 500 mL flask

② Pilot plant scale : 5 L → 50 L → 500 L

③ Production scale : 5,000 L → 50,000 L∼100,000 L

2) Scale-up의 basis

① Constant volumetric power imput (Pg/v)

알코올과 유기산 발효에서 발효조의 geometric similarity와 Pg/v로 scale-up

② Constant volumeteric oxygen transfer coefficient (KLa)

산소요구량이 높은 항생제 발효에서 scale-up에 이용

③ Constant impeller tip speed (πDii)

곰팡이의 morphology 유지 (pellet)

④ Constant mixing time (t )

Ⅴ. Production fermenter

1. 결정된 배지 조성, 배양조건, 배양방법에 의한 생산

2. 수율 확인 (g-product/g-substrate)

3. 생산성 확인 (g-product/ L-hr)

4. 산물의 최종농도 확인 (g/L)

Ⅵ. Examples

1. Erythritol 생산 (Fed-batch process)

1) 균주 : 벌집에서 꿀 분리 (Candida magnoliae)

↓ Mutagenesis (EMS 처리)

고농도 KCl에서 선별

↓

염내성 변이균주로 개량

0 20 40 60 80 100 120 140 160

pH

2

3

4

5

6

7

8

DO (%

)

0

20

40

60

80

100

pH DO

Fermentation Time (hr)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Cell

Con

cent

ratio

n (g

/L)

0.1

1.0

10.0

100.0

Eryt

hrito

l and

Glu

cona

te Co

ncen

tratio

n (g/

L)

0

20

40

60

80

100

120

140

Gluc

ose C

once

ntra

tion(

g/L)

0

50

100

150

200

250

300

DCW Erythritol Glucose Gluconic a.

Fermentation Time (hr)0 10 20 30 40 50 60 70

Cell

Conc

entra

tion (

g/L)

0.1

1.0

10.0

100.0

Gluc

ose C

once

ntrati

on (g

/L)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Eryth

ritol

and G

lycero

l Con

centr

ation

(g/L

)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

DCW Glucose Erythritol Glycerol

2) Batch fermentation 3) Fed-batch fermentation

Profiles of the concentrations of cell, glucose, erythritoland glycerol during the two-stage fed-batch fermentation of C. magnoliae SR 101. The glucose concentration in the culture broth was 400 g/L after feeding of 800g glucose powder.

Profiles of cell growth, erythritol, glucose andgluconic acid concentration, DO and pH changes during the batch fermentation of C. magnoliaeSR 101.

4) Comparison of fermentation parameters in batch and fed-batch fermentation

2.79(5.72)0.76Productivity (g/L-hr)

41(48)51Yield (%, w/w)

187127Erythritol produced (g/L)

11025.5Cell mass (g/L)

68167Fermentation time(hr)

Fed-batchBatchFermentation parameters

2. Ornithine 생산 (Scale-up)

1) 균주 : Brevibacterium ketoglutamicum (glutamic acid 생산균주)

⇒ L-citrulline auxotroph이면서 arginine hydroxamate 내성 변이 균주

L-Glutamic acid → N-acethylglutamic acid → → → → L-Ornithine

→ Citrulline → → Arginine

☞ Ornithine : 간장 질환 치료제의 주원료

2) Fed-batch culture

약 15시간 회분식 배양 후에 continuous feeding (glucose 및 arginine

등이 포함된 복합배지)에 의한 유가식 배양 시작

Time profile of cell mass, glucose, and L-ornithine concentration during fed-batch

culture with continuous feeding of the complex media in 5L jar fermenter.

3) Scale-up (5 L → 50 L)

- KLa 값을 기준으로 수행

- 발효조의 geometric ratio

- Aeration & agitation

- 유체의 특성

(배지조성 및 사용균주)

Effect of agitation speed to volumetric transfer coefficient(KLa) at 5L and 50L fermenter

4) Results of scale-up

1.111.14Productivity (g/L-hr)

2728Yield (%, w/w)

7173L-ornithine produced (g/L)

4748Cell mass (g/L)

6464Fermentation time(hr)

50L5LFermentation parameters

5) Scale-up : 50 L → 300 L → 2,500 L

Mixing에 문제점이 발생. 즉 limiting substrate인 arginine의

분포가 문제 ⇒ 생산 수율 및 생산성 저하 요인

3. Xylitol 생산 (유전자 조작 및 대사공학)

1) 일부의 효모

XR XDH XKXylose Xylitol Xylulose Xylulose-5-P ⇒ 오탄당 회로

NAD(P)H NAD(P)+ NADP+ NADPH ATP ADP

2) Saccharomyces cerevisiae :

XR과 XDH가 존재하지 않아

xylose를 이용 못함

3) 재조합 균주 :

Saccharomyces cerevisiae

에 XR 유전자 주입Genetic map of plasmid pY2XR

4) Batch fermentation 5) Fed-batch fermentation

Batch fermentation profiles of S. cerevisiaeEH13.15:pY2XR in O’Connor’s medium at 30℃.(○:dry cell mass, ▲:glucose, ▼: xylose,

△: ethanol, ▽:xylitol)

Fed-batch fermentation profiles of S. cerevisiaeEH13.15:pY2XR grown in O’Connor’s medium at 30℃. Glucose was maintained at 0.35g/L throughout the fermentation.(○:dry cell mass, ▲:glucose, ▼: xylose, △:

ethanol, ▽:xylitol)

4. Tyrosine과 Phenylalanine 생산

[ M. Ikeda and R. Katsumata. Appl. Environ. Microbiol. 58(3), 781-785(1992) ]

1) 균주 : Corynebacterium glutamicum

1. DAHP synthetase(DS):

Trp,Tyr, Phe에 의한 concerted FI

세종류의 아미노산이 모두 존재하면 90% 활성억제

2. Chorismate mutase(CM): Trp에 의한 activation phenylpyruvate

Trp에 의한 FI, phe에 의한 FR

3. Anthranilate synthetase(AS): Trp에 의한 FI과 FR

4. Prephenate dehydrogenase: Tyr에 의한 partial FI

5. Prephenate dehydratase: Tyr에 의한 activation

Phe와 Trp에 의한 FIRegulation of aromatic amino acid biosynthesis in Corynebacterium glutamicum.

2) Host cell : C. glutamicum KY10865 → Trp 생성 mutant

(CM defective, AS는 Trp에 의한 FI를 부분적으로 제거)

3) 사용한 Genes

DAHP synthetase(DS) : Trp와 Phe에 의하여 FI 가 거의 제거됨.

Chorismate mutase(CM) : Trp와 Phe에 의하여 FI 가 거의 제거됨.

Prephenate dehydrate(PD) : Phe에 의하여 FI 가 거의 제거됨.

4) Construction of recombinant plasmids containing aromatic

amino acid-biosynthetic genes.

5) Jar fermenter에서 fed-batch6%의 cane molasses에서 시작하여 20%까지 feeding

18g/L Trp 26g/L Trp, 28g/L Phe

5g/L Phe

Time course of aromatic amino acid production by strain KY10865 and its

plasmid-carrying strains in jar fermenters.

Symbols: ●, tryptophan; ▲, tyrosine; ■, phenylalanine; ○, growth(OD660); x, sugar.

Arrows indicate the points at which solution containing 44% sucrose began to be

fed continuosly.

4. 곰팡이의 고농도 배양 (Scale-up)

1) Batch culture

2.5L → 19L → 500L

Comparison of the production of cell, lipid and arachidonic acid

in the batch culture of M. alpina in the size of fermenter.

3.5940.58.9044.819.3500L (200rpm, 0.5vvm)

3.4038.38.8946.019.319L (200rpm, 0.5vvm)

3.2731.510.3953.919.32.5L (400rpm, 0.5vvm)

Ara

(g/L)

Ara*

(%)

Lipid

(g/L)

Lipid

(%)

DCW

(g/L)

Fermentor size

(operation conditions)

* Ara : arachidonic acid

Profiles of cell growth, and lipid and arachidonic acid production during the batch culture

of M. alpina DSA-12 in a 500L fermenter under 0.5vvm and 200rpm

Fermentation Time (hr)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Lipi

d (g

/L) a

nd A

rach

idon

ic a

cid

(g/L

)

0

2

4

6

8

10

Dry

Cel

l Wei

ght (

g/L)

0

5

10

15

20

25

30

Glu

cose

Con

cent

ratio

n (g

/L)

0

10

20

30

40

50

60

Lipid ARA DCW Glucose

2) Fed-batch culture

19L → 500L

pH-stat (Ammonia)

Intermittent feeding ( glucose)

12.030.040.064.462.1FBC II

(140g/L glucose)

7.034.820.649.741.4FBC I

(100g/L glucose)

Ara(g/L)

Ara*

(%)Lipid(g/L)

Lipid(%)

DCW(g/L)

Intermittent fed-batch culture of M. alpina DSA12 for the production of lipid and arachidonic acid in a 19 L fermenter under 0.5vvm aeration rate and 150 rpm agitation at 25℃.

* Ara : arachidonic acid

Fermentation Time (hr)0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

Dry

Cel

l Wei

ght (

g/L)

0

10

20

30

40

50

60

Glu

cose

Con

cent

ratio

n (g

/L)

0

40

80

120

160

200

Tota

l Lip

id (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100A

rach

idon

ic A

cid

(g/L

)

0

2

4

6

8

10

12

14 DCW Glucose Lipid ARA

DO

(%)

0

20

40

60

80

100

pH

5

6

7

8

Agi

tatio

n Sp

eed

(rpm

)50

100

150

200DO pH Agitation

Profiles of cell and glucose concentrations, and lipid and arachidonic acid productionduring

the intermittent fed-batch culture of M. alpina DSA-12 for the final glucose concentration of

140g/L. The pH was maintained at 6.0 by adding of 14% ammonia solution. The composition

of initial medium was 20g/L glucose and 10g/L CSP.

Ⅶ. Conclusion

1. Development of strain

- Gene manipulation

- Protein Engineering

- Molecular(Directed) Evolution

- Metabolic Engineering

2. Culture strategies

- Batch culture

- Fed-batch culture

- Continuous culture

- Automation by computer system