Upload
awen
View
198
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
第十四章 基 因 诊 断 和 基 因 治 疗 Gene diagnosis and Gene Therapy 第一节 基因诊断 第二节 基因治疗. 第一节 基因诊断 重组 DNA 技术极大地丰富了我们对人类遗传病分子病理学的知识,同时也提供了从 DNA 水平对遗传病进行基因诊断的手段。 基因诊断 : 就是利用 DNA 重组技术从 DNA 水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷,又称 DNA 分析法。. 一、直接诊断. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
11
第十四章 第十四章
基 因 诊 断 和 基 因 治 疗基 因 诊 断 和 基 因 治 疗Gene diagnosis andGene diagnosis and
Gene Therapy Gene Therapy
第一节 基因诊断第一节 基因诊断第二节 基因治疗第二节 基因治疗
22
第一节 基因诊断第一节 基因诊断 重组重组 DNADNA 技术极大地丰富了我们对人技术极大地丰富了我们对人
类遗传病分子病理学的知识,同时也提类遗传病分子病理学的知识,同时也提供了从供了从 DNADNA 水平对遗传病进行基因诊水平对遗传病进行基因诊断的手段。断的手段。
基因诊断基因诊断::就是利用就是利用 DNADNA 重组技术从重组技术从DNA DNA 水平检测人类遗传性疾病的基因水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷,又称缺陷,又称 DNADNA 分析法。分析法。
33
一、直接诊断一、直接诊断
直接检测致病基因本身的异常。通直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近的常使用基因本身或邻近的 DNADNA 序列作序列作为探针,或通过为探针,或通过 PCR PCR 扩增产物,以检扩增产物,以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。它主要适用于已知基因异常疾病质。它主要适用于已知基因异常疾病
的诊断。的诊断。
44
11 、、 Gene Gene 缺失遗传病的诊断缺失遗传病的诊断 11 )) αα 地贫的地贫的 GeneGene
诊断诊断 αα 基因不同程度的基因不同程度的
缺失引起不同类型缺失引起不同类型的的 αα 地贫,地贫, αα 基因基因缺失缺失 11 ~~ 44 个。正个。正常常 GeneGene 组用组用 BamBamHIHI 切割,可得到切割,可得到 114kb4kb 的片段,而缺的片段,而缺失一个失一个 α Geneα Gene 时时可得到可得到 10kb10kb 片段。片段。
BamHI BamHIα2 α1
α2
10 kb
14 kb
probe
55
以以 αGeneαGene 为探针,为探针, Southern blot Southern blot 方法检方法检测测
αα/αα αα/α- αα/- - α- /- - - - / - -αα/αα αα/α- αα/- - α- /- - - - / - -
正常 缺正常 缺 1 1 缺缺 2 2 缺缺 3 3 缺缺 44
14kb
10kb
66
22 )) DMD/BMDDMD/BMD 的缺失诊断(进行性肌的缺失诊断(进行性肌营养不良或假肥大型)营养不良或假肥大型)
DMDDMD 是一种严重致死性疾病(是一种严重致死性疾病( XRXR ),临),临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。 BMDBMD临床症状与临床症状与 DMDDMD 相似,但症状较轻。相似,但症状较轻。
Gene Gene 定位定位 Xp21 Xp21 , , Gene 2300kb,79 Gene 2300kb,79 个个Exon Exon ,, cDNAcDNA 全长全长 13974bp 13974bp 编码编码 3685 3685 AaAa ,分子量,分子量 427kD427kD 。。
DMD/BMD 70%DMD/BMD 70% 左右为缺失型,基因很大,左右为缺失型,基因很大,缺失可能发生在不同的部位。应用多重缺失可能发生在不同的部位。应用多重 PCPCRR 扩增检测,判断缺失状态。扩增检测,判断缺失状态。
77
多重多重 PCRPCR 扩增后电泳检测结果扩增后电泳检测结果病例
外显子 1 2 3 4 5 6 7 8
Pm
3
43
50
13
6
47
60
52
bp
535
113
88
22 、突变型遗传病的基因诊断、突变型遗传病的基因诊断例 如:例 如:
镰形细胞贫血的镰形细胞贫血的 GeneGene 诊断诊断已知突变基因编码已知突变基因编码 ββ 珠蛋白链的珠蛋白链的
第第 66 位密码子位密码子 GAG——GTGGAG——GTG
谷谷 Aa——Aa—— 缬缬 AaAa
99
11 )) RFLPRFLP 诊断诊断 已知限制酶已知限制酶 MstIIMstII 识别序列 识别序列 MstII 1.15kbMstII 1.15kb CCTGCCTG A AGG 1.35kb xGG 1.35kb x probeprobe CCTGCCTGTTGGGG 突变后不能识别,突变后不能识别, 酶切位点消失,限制酶切片段长度发生变化。酶切位点消失,限制酶切片段长度发生变化。
1010
限制酶切片段电泳后,经限制酶切片段电泳后,经 Southern BlotSouthern Blot 检检测,结果:测,结果:
1.35kb1.35kb
1.15kb1.15kb
βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS
正常 镰状 镰状贫血正常 镰状 镰状贫血
1111
22 )) ASOASO 探针诊断探针诊断
已知突变已知突变 GeneGene 部位和性质,合成寡和苷酸部位和性质,合成寡和苷酸探针,探针, 3232PP 标记,进行标记,进行 Southern Blot Southern Blot 杂杂交交 // 斑点杂交。斑点杂交。
Normal βNormal βΑΑGene Probe——Gene Probe—— 与正常 与正常 ββΑΑ杂交杂交 Mutation βMutation βSS Gene Probe—— Gene Probe—— 与异常 与异常 ββSS杂交杂交
1212
斑点杂交结果:斑点杂交结果: ββΑΑ/β/βΑΑ β βΑΑ/β/βS S β βSS/β/βSS
正常探针正常探针
突变探针突变探针
1313
二、间接诊断二、间接诊断 主要通过主要通过 GeneGene 和和 DNADNA 多态的连锁分析多态的连锁分析
作出诊断。当致病基因虽然已知,但其异常作出诊断。当致病基因虽然已知,但其异常尚属未知时,或疾病尚属未知时,或疾病 GeneGene 本身尚属未知时,本身尚属未知时,可通过对受检者及其家系进行连锁分析,推可通过对受检者及其家系进行连锁分析,推断受检者是否获得了带有致病基因的染色体断受检者是否获得了带有致病基因的染色体或或 DNA DNA 片段。片段。
连锁分析是基于连锁分析是基于遗传标记与遗传标记与 GeneGene连锁连锁,子,子代是否获得遗传标记间接地判断做出诊断。代是否获得遗传标记间接地判断做出诊断。
这些遗传标记是基因组中的这些遗传标记是基因组中的 DAN DAN 多态,如:多态,如:RFLPRFLP ,, VNTR VNTR 等。等。
1414
11 、、 GeneGene 异常不明确的遗传病的诊异常不明确的遗传病的诊断断
例:成年型多囊肾病——例:成年型多囊肾病—— APKDAPKD ,, AD AD ,临,临床表现为腰痛,蛋白尿,血尿,高血压,肾床表现为腰痛,蛋白尿,血尿,高血压,肾盂性肾炎,肾结石。最终导致肾功能衰竭和盂性肾炎,肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。尿毒症。
APKD——GeneAPKD——Gene 定位定位 16p1316p13 ,但致病基因,但致病基因尚未克隆,基因产物的生化性质和疾病发病尚未克隆,基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明,但已证实机理也尚未阐明,但已证实 APKD GeneAPKD Gene 与与αα 珠蛋白基因珠蛋白基因 3`3` 端附近的一段小卫星端附近的一段小卫星 DNADNA序列(序列( 3`HVR3`HVR )紧密连锁,因此,可以通)紧密连锁,因此,可以通过过 RFLPRFLP连锁分析进行诊断。连锁分析进行诊断。
1515
以以 3`HVR3`HVR 为为 probeprobe 与与 PvuIIPvuII 酶切后的酶切后的家系有关成员的家系有关成员的 GeneGene 组组 DNADNA 杂交——杂交——Southern BlotSouthern Blot 杂交杂交
GeneGene 组组 DNA probe DNA probe (( 3`HV3`HVRR ))
PvuIIPvuII 酶切酶切 DNADNA 片段片段
杂交 杂交
结果 结果
1616
结 果 结 果 1 21 2
1 2 3 4 51 2 3 4 5
55 .. 7kb7kb 33 .. 4kb4kb 22 .. 3kb3kb
1717
结果分析结果分析
患者(患者( I1I1 、、 II1II1 和和 II2II2 )有)有 3.4kb3.4kb 片段片段 ,,说明致病基因与说明致病基因与 3.4kb3.4kb 片段连锁片段连锁 ,, 并按孟并按孟德尔方式遗传德尔方式遗传 .II5.II5 不含不含 3.4kb3.4kb 片段片段 ,, 产前产前诊断正常诊断正常 ..
1818
PCR—RFLPPCR—RFLP 诊断诊断
甲型血友病的基因诊断,已知甲型血友病甲型血友病的基因诊断,已知甲型血友病 XRXR ,,获得家系成员基因组获得家系成员基因组 DNA DNA 。。
PCR 142 bpPCR 142 bp BcLIBcLI 142bp 99 bp 43bp142bp 99 bp 43bp
电泳电泳
结果分析结果分析??
p1
p2
142bp
99bp 43bp
Bcl I
Bcl I -
Bcl I +
1919
问问 ::1/1/ 2Ⅱ 2Ⅱ 、Ⅲ、Ⅲ 11 诊断;诊断; 2/2/ 1Ⅲ 1Ⅲ 是男或是女发病?是男或是女发病?
142bp
99bp
1 2
1 2 3
Ⅰ
Ⅱ
III 1
2020
结果分析结果分析11 )先症者)先症者 II2II2具有具有 99bp99bp 片段而发病,片段而发病,该片段来自母亲。该片段来自母亲。
22 )) II2II2有有 142bp/99bp142bp/99bp 杂合子。杂合子。 142b142bpp来自父亲,为正常片段,来自父亲,为正常片段, 99bp99bp 片段片段是来自母亲而成为携带者。是来自母亲而成为携带者。
33 )Ⅲ)Ⅲ 11 为为 99bp99bp 片段片段 如果是 男性 为患者(如果是 男性 为患者( 99bp99bp 片段来自片段来自母亲);女性为携带者(来自父母双母亲);女性为携带者(来自父母双方)方)
2121
基因诊断意义基因诊断意义
现证病人的诊断:争取有效、针对性现证病人的诊断:争取有效、针对性治疗。治疗。
产前诊断:意义更为重要,预防遗传产前诊断:意义更为重要,预防遗传病患儿的出生 病患儿的出生