Протеини в храни - publishing.arbilis.com · Наука Диететика 4 2013 29 Всички видове протеини, както от животински,

28 Наука Диететика 4 2013

Протеини в храниМетодология, избор на подходящ аналитичен метод и документиране в базата данни за химичен състав на храни

Гл. ас. инж. хим. Десислава ГюроваДирекция „Аналитични лабораторни дейности“, НЦОЗА, София

Анализ на храните

Резюме

Настоящата работа има за цел да акцентира върху необходимостта от правилното тъл-куване на дефинициите и методите за анализ на протеини в храни. Използването на подходя-щи фактори за превръщане на азота в протеин, специфичен за дадени храни, и употребата на универсален фактор 6.25 е от огромно значение за коректни аналитични резултати при документирането им в базите данни или таблици за химичен състав на храни. Представен е подробен списък с методи за определяне на азот и протеин в храни, като ясно са формулира-ни предимствата, недостатъците и ограниченията при тяхната употреба в аналитичната практика.

Ключови думи: протеин, фактор за превръщане, метод, храни

Proteins In Foods. A Methodology, Selection Of An Approriate Analytical Method And Documentation In Food Chemical Composition Database

Assis. Prof. Desislava Gyurova, PhDDepartment „Analytical laboratory activities“, NCPHA, Sofia

Abstract

The aim of this work is to highlights the need for the proper interpretation of the definitions and methods of analysis of proteins in foods. Using appropriate conversion factors of nitrogen in protein for specific foods and universal factor 6.25 is crucial for correct analytical results documented in food chemical composition databases or food tables. A detailed list of methods for determination of nitro-gen and protein in foods is presented; as well as the advantages, disadvantages and limitations in analytical practice which are clearly defined.

Key words: protein, conversion factor, method, foods

Протеините, освен основната пластична функ-ция, която играят като най-важна съставна част на протоплазмата, ядрото, органелите и мембраните на клетките, са материална основа на много жизне-ни процеси, като мускулно съкращение, хормонална регулация, храносмилане, дразнимост на клетката, съсирване на кръвта и др. Те са единствен източник на хранителен азот за организма. При разграждане-

то на 1 g белтък се получават 17.48 kJ (4 kcal) енер-гия. Относителният дял на енергията от белтъци от общия енергиен внос е 10–15%3.

Аминокиселините са основна структурна едини-ца на протеините, което обуславя хранителната им стойност3, 57. Протеините играят функционална роля и в храните – свързани са с процесите на емул-гиране, визкозитет, желиране и др.

29Наука Диететика 4 2013

Всички видове протеини, както от животински, така и от растителен произход, се състоят от приблизително 20 познати аминокиселини. Относи-телният състав на тези аминокиселини варира във всеки отделен източник на протеин. Стойности-те за протеини са необходими на всички нива при изграждане на базите данни за химичен състав на храни. Като правило тези стойности се базират на стойностите на общия азот, използвайки фактор на преобразуване (превръщане)15, като всички фак-тори следва да бъдат записани в базите данни на ниво „храна“.

Защо са необходими анализи на протеините в храните?

Свързани са с доставката на аналитични данни за нутриенти в храни;

Съставна част са от таблици за химичен със-тав и бази данни за храни;

Участват при формулирането и реформулира-нето на храни и хранителни продукти;

Подобряват условията за добив и качеството на храните;

Отличителен белег са за проследяване на фал-шификации в състава на храните.

Това поставя пред аналитиците много отговор-ната задача да предоставят в таблиците за хи-мичен състав на храните възможно най-обектив-ните данни за съдържанието на белтъци в сурови и готови за консумация храни. Обективността на тези данни е изключително важна за диетологична-та практика и е пряко свързана с методологията на анализите.

Оценката на протеина36 е много важна и в ос-новните биохимични изследвания, както и в рутин-ната клинична лабораторна практика. Преди използ-ването на всякакъв анализ за определяне на протеин, по-специално сравнителни техники, е важно да се определи точното количество на протеина в про-бата. Наблюдава се увеличение на броя на техники-те за анализ на протеин през последните 20 години,

довело до увеличаване на чувствителността и точ-ността с възможна автоматизация на аналитични-те техники11, 43, 47.

С цел да се направи коректна оценка на качест-вото на общите резултати за стойностите на про-теин, пет метода са били тествани и приложени към сборна проба плазма. За тази цел са използвани методи на Bradford (Coomassie Brilliant Blue), Lowry (Folin-Ciocalteau), Bi ret, Pesce and Strande (Ponceau–S/TCA) и модифициран метод на Schaffner–Weismann (Amido Black 10B).

Въпреки че използването на Биурет-реакцията за определяне на концентрацията на протеин датира от 80-те години, се счита за непрактично методът да се прилага поради необходимия голям обем от проба (до 2 ml)18. Интензитетът на сигнала е линеен в широк диапазон от концентрации на протеин.

Анализът на Брадфорд се основава на свързва-нето с багрило, което води до образуването на багрилен протеинов комплекс с повишена моларна абсорбция5, 59. Този метод се счита за практически лесен за изпълнение, но обхватът на сигнала е в линейния диапазон и точността на резултатите е по-лоша в сравнение с Биурет-анализа.

Анализът на Lowry се основава на амплификация на Биурет-анализа с последващата реакция с Folin-фенолов реагент (Folin-Ciocalteau)32. Проблемът при този анализ е отражението на определени амино-киселини (тирозин, триптофан) върху развитието на цвета на разтвора. Използването на метода на Lowry е намаляло през последните години, тъй като вече са достъпни повече повърхностни и чувст-вителни тестове за определяне на протеини и е доказано, че анализът на Lowry е по-податлив на смущения в сравнение с другите анализи.

Анализът на Pesce и Strande се основава на едно-временното смесване на протеини и Ponceau-S-баг-рило с трихлороцетна киселина, като впоследствие остатъчната утайка се разтваря в натриев хидрок-сид и се получава виолетово оцветяване12, 38, 60. Този анализ е практичен за изпълнение и с подходяща точност.


Реакцията Шафнер-Вайсман се използва по-специ-ално в точка блот-анализи на протеини и се ос-новава на утаяване на протеините с амидо черно багрило (в метанол/оцетна киселина), последвано от разтваряне на утайката в NaOH44. Анализът се счита за лесен за изпълнение.

Методите за определяне на концентрацията на протеин в биологични течности, които използват утаяването на протеина (Pesce и Strande, Schaffner-Weissman), са точни и подходящи за разредени про-би като урина. Багрилно-свързващите методи (т.е. Bradford)5, 59 са бързи, прости и лесно могат да бъ-дат автоматизирани, но са налице много смуще-ния, които влияят върху резултатите от анализа. Биурет-реакцията е непрактична заради границата на откриване и големи обеми от проби. Lowry-ана-лизът е по-чувствителен в сравнение с другите ме-тоди, използвани за биологични течности.

Протеомиката – дисциплината, която се зани-мава с анализа на геномни допълнения на протеини, се налага върху научната сцена с невероятна бързи-на през последните няколко години, наред с почти мигновеното преобразуване на геномната последо-вателност в набор от прогнозирани протеини26,

39. Но докато всеки фрагмент от ДНК се държи биохимично като всеки друг, протеините притежа-ват уникални свойства и по своята индивидуалност

създават огромно препятствие за методологиите, които се стремят да присвоят дадена дейност за групи от протеини47.

От химична гледна точка стойностите за про-теина се основават на изчисление на общия азот минус не-протеиновия азот, умножен по специфичен фактор на превръщане, който зависи от състава на аминокиселините в дадена храна или от сумата от същите аминокиселини. През 1990 г. Sosulski and Imadifon48 предлагат фактор от 5.7, а Salo-Vaananen and Koivistoinen42 – от 5.33, наред с индивидуални фактори за превръщане за различните храни и групи храни.

Азот и азотни компоненти

През 1978 г. Lakin31 предоставя изчерпателно оп-исание на методите за анализ на азот и азотни компоненти, като методите са дискутирани още от Sullivan, Chang и Southgate6, 49, 51. Списъкът от методи е представен в табл. 1.

Общ азот

„Приблизителната“ система, в която „протеинът се определя като общ азот, умножен със специфичен фактор“, продължава да доминира в различните хра-

Процедура Приложимост Ограничения Капиталови разходи

Общ азотKjeldahl Ръчен, всички храни Незначителна намеса от

неорганичен азотНиски

Автоматизиран в няколко нива на сложност

Незначителна намеса от неорганичен азот

Средни

Dumas Автоматизиран, всички храни

Включва неорганичен азот, размер на аналитичната порция

Високи

Радиохимични методи Повечето храни Изисква се апаратура Много високиПротеин Общ N* х фактор Всички храни Вариации в NPN ** Ниски Белтъчен N* х фактор Предпочитан за

зеленчуци, някои видове риба, хранителна среда за дрожди, кърма

Избор на процедура за определяне на NPN, по-добре да се използва аминокиселинен N

Ниски

Методи, приложими за специфични храниФормолно титруване Mлечни продукти Специфичност Ниски Биурет-реакция Mлечни продукти Специфичност Ниски Реагент на Folin Mлечни продукти Специфичност Ниски Алкална дестилация Зърнени храни Специфичност Ниски Багрилно свързване Специфични храни,

някои зърнени, някои бобови растения

Специфичност Ниски

Табл. 1. Методи за определяне на азот и протеинЛегенда: N* – азот; NPN ** – непротеинов азот


нителни проучвания. Повечето цитирани стойности за „протеин“ в базите данни в действителност са получени от общия азот или от стойността на об-щия органичен азот1. В повечето случаи тоталният азот се определя с помощта на метода на Келдал29, който измерва тоталния органичен азот. При този метод органичната материя се разтваря с гореща концентрирана сярна киселина. Към киселината се до-бавя „катализаторна смес“ за повишаване на точ-ката на кипене, като цялото количество органичен азот се превръща в амоняк, който обикновено се определя чрез титруване или по-рядко – колориме-трично. При оригиналния метод на Келдал се използва относително голямо количество аналитична порция (1–2 g), което изисква и голямо количество киселина.

Микро-Келдал методите са използвани по-често, тъй като при тях се изискват редуцирани количе-ства киселина и катализаторна смес. Факторите на околната среда налагат изискването за гарантирано безопасно обезвреждане на живака и занижено коли-чество на използваната киселина.

Микрометодите могат да бъдат автоматизи-рани на няколко нива6, 14. Етапите на автоматизация на дестилацията и титруването „работят“ добре, но автоматизацията на самото разтваряне се оказ-ва по-трудно осъществима.

Методът на Dumas измерва общия азот, като азот – газ, след пълно изгаряне на храната. Резул-татите, получени при този метод, са сравними с тези по метода на Келдал и показват добра съпос-тавимост27. Методът е успешно автоматизиран и, въпреки скъпоструващата апаратура, е възможна висока пропускателна способност на пробата с доб-ра прецизност на резултатите. Оборудването из-исква малки аналитични порции, като задължително условие е финото им разделяне.

От развитието на „приближените“ системи за анализ, стойностите на „суровия“ протеин са били изчислявани чрез умножение на общия азот (N) с определен фактор. Този фактор първоначално се равнява на 6.25, основаващ се на презумпцията, че протеините съдържат около 16% от наличния азот. За дълъг период от време протеините от расти-телен произход и желатин съдържат повече азот и следователно се нуждаят от по-нисък фактор. През 1942 г. Jones, Munsey and Walker25 определят азотното съдържание на широка гама от изолирани протеини и предлагат списък от специфични фак-тори за различните категории храни. Тези фактори са одобрени и широко използвани29. Няколко автори са критикували използването на тези фактори за индивидуалните храни53.

Heidelbaugh и сътрудници22 оценяват и предла-гат три различни подхода за изчисление:

С използване на фактор 6.25; Използване на традиционни фактори и сумира-

нето на стойностите на аминокиселини; Използване на фактор 5.70 за смесени храни.

Приниципно би било подходящо да се изготвят приблизителни оценки за протеина на база стойно-сти на аминокиселини, какъвто консенсус е постиг-нат на Втората международна конференция за бази данни храни, проведена във Финландия през 1995 г. и дискутирала дефинициите на хранителните веще-ства, включени в базите данни за състав на храни-те9, 19, 30, 42, 50.

Понастоящем може би е по-разумно да се запази сегашният начин на изчисление с уточнението, че той дава „стандартни“ стойности за протеин и че стой-ностите не са протеин в биохимичен смисъл. Важно е да се отбележи, че този метод не е подходящ за някои храни, по-богати на не-амино-протеинов азот, например хрущялни риби, миди, ракообразни и др.

Редица „директни“ методи за анализ на проте-ини са били разработени за специфични храни, бази-рани на реакции, включващи функционални групи на присъстващите аминокиселини, като по този начин те не са приложими за определяне на протеин като цяло. Такива методи включват формолно титрува-не52 и т.нар. Биурет-реакция35.

Голяма група колориметрични методи се осно-вават на взаимодействието с реагент на Фолин, един от най-използваните биохимични реагенти в млечната индустрия23, 32.

Багрилно-свързващите методи са широко из-ползвани в млечната индустрия54, като багрилното свързване се явява по-чувствително при извличане на багрилото33, а методите са били включени по-късно в АОАС – официалните методи за анализ на протеин4. Повечето от тези методи зависят от начина на калибриране и се противопоставят на метода на Келдал. През 1977 г. Pomeranz, Moore and Lai40 са публикували сравнение на Биурет-методите, багрилно-свързващите методи и алкалната дести-лация при определяне на протеин в ечемик и малц. Ribadeau-Dumas and Grappin през 1989 г.41 са предос-тавили стойности на протеин в мляко. Като цяло, багрилните методи имат най-широко приложение в контрола на качеството на анализите на серийни с почти идентичен химичен състав храни55.

Номенклатура и установени практики

Азот (общ) обикновено се определя с методи на Келдал или Dumas или чрез техни модификации.

Протеинът обикновено се изчислява от стой-ността на общия азот, умножена с коефициент на


превръщане за азота. Разработени са фактори за спе-цифични храни на основата на природата и състава на протеините, съдържащи се в различни мат рици24. Специфичният фактор за бадеми е 5.18, а за мляко – 6.38. Факторите на Jones са широко използвани в ана-литичната практика и в базите данни за химичен състав на храни. При липса на специфични фактори за храни се прилага универсалният фактор 6.252. Някои бази данни за състава на храните използват универ-салния фактор при всички изчисления на протеин, а в други страни и региони нормативните документи, касаещи етикетирането на храни, изискват използва-нето на универсален фактор13. Полезно и необходимо е в базите данни за състава на храните „протеинът“ да се „докладва чрез използването едновременно на специфичните фактори и фактор 6.25“16.

Накратко представяме едни от най-използваните методи за определяне на протеин в аналитичната практика10, 20, 56, 57.

Метод на Kjeldahl–Wilforth–GunningХраната се хомогенизира с помощта на мелница-

смесител. Органичната материя от тестова порция се разтваря в гореща концентрирана киселина за пре-връщане на органичната материя в амоняк, последвано от дестилация в киселинен абсорбиращ разтвор, и об-щият органичен азот се определя чрез титруване17.

Целта на етапа на разлагане е да се разкъсат химичните връзки на протеина и други форми на органичният азот, превръщайки се в амоняк. Лабо-раторна проба храна се поставя в дигестационна колба (Kjeldahl-колба) с концентрирана сярна кисе-

лина, метален катализатор (мед) и калиев сулфат. Дигестационната колба се поставя в дигестационен блок, където се загрява до температурата (370–400°С). Съдържанието на азота обикновено се оп-ределя чрез титруване на амоняка със стандартен разтвор на солна киселина (0.1 N).

Метод на DumasОпределя общия азот под формата на газ – азот.

Методът се състои в изгаряне на лабораторна про-ба храна в присъствие на кислород. Органичната ма-терия се превръща във въглероден двуокис, вода и азот. Газът – азот, се измерва чрез топлопроводим детектор, който го превръща в общ протеин с по-мощта на специфичните фактори на Jones17.

Съпоставимост на данните Методите, основани на определяне на общия

азот, в общи линии са сравними. Използването на неподходящи фактори за преобразуване на азота в протеин може да доведе до значителни различия. По-следни научни изследвания правят сравнение на ме-тодите на Келдал и Dumas в риба и соеви продукти. Методът на Dumas дава по-реални стойности от тези на Келдал.

Десет проби рибно брашно за съдържание на протеин са анализирани от 18 лаборатории, които използват метода на Дюма. Тринадесет от лабора-ториите анализират същите проби чрез метод на Келдал. Стойностите на относителните стандарт-ни отклонения за повторяемост и възпроизводимост са както следва: за Дюма 1.48 и 2.01% и 1.62 и 2.37% съответно за Келдал34.

Метод Дължина на вълната

Предимства Недостатъци

Близка UV 280 nm Бърз, неразрушителен, не изисква допълнителни реагенти

Влияние на аминокиселинния състав; вмешателство на UV-абсорбиращи съединения (нуклеонови киселини, нуклеотиди)

Далечна UV 205–235 nm Бърз, неразрушителен, високочувствителен, слаба зависимост от аминокиселинен състав, слаби смущения от нуклеинови киселини и нуклеотиди

Ясна нужда от чиста проба за анализ; висококачествени диутериеви лампи; смущение от буферни соли

IR спектроскопия 2.5–16 μm Бърз многокомпонентен анализ; не изисква предварителна подготовка на пробата, неразрушителен

Силна намеса на вода; влияние от липиди и размер на частиците; комплексна процедура за калибриране

Близка инфрачервена спектроскопия (NIR)

0.75–2.5 μm Бърз, многокомпонентен анализ.Приложим за твърди материали Определя протеин количествено в присъствие на вода. Ограничена подготовка на пробите

Намеса на нишесте и липиди; влага и размер на частиците; комплексна процедура за калибриране

Табл. 2. Спектроскопски методи за определяне на протеин


Спектроскопски методи за определяне на протеин Спектроскопските методи за определяне на про-

теин са представени в табл. 2.

Близка UV-абсорбцияОпределяне на количеството на протеина в раз-

твор е възможно с помощта на прост спектро-метър. Абсорбцията в близката UV на протеини зависи от съдържанието на тирозин и триптофан. Предимствата на този метод са, че той е прост за изпълнение и пробата може да бъде възстановена. Методът има някои недостатъци, като смущения от други хромофори, и специфичната стойност на абсорбцията за дадения протеин трябва да бъде определена28, 58.

Оценка на протеина в близка UV-абсорбция (280 nm)Необходим е надежден спектрофотометър. Про-

теиновият разтвор трябва да се разрежда в буфер с такава концентрация, която е в рамките на точния обхват на инструмента при следните уточнения:

Най-добре е да бъде измерена абсорбцията в диа-пазон (0.05–1.0). При приблизително абсорбция 0.3 (пог-лъщане 50%) точността е най-голяма2.

Говежди серумен албумин най-често се използва като протеин – стандарт с концентрация 1 mg/ml.

Далечна UV-абсорбцияПептидната връзка абсорбира силно в далечната

UV с максимум при дължина на вълната от около 190 nm. Тази силна абсорбция при тези дължини на вълните се използва за количествено определяне на протеина. Поради трудностите, причинени от пог-лъщането на кислород и ниската полезна мощност на стандартни спектрофотометри, са направени измервания при 205 nm, където абсорбцията е около половината от тази при 190 nm45. Предимствата на този метод са простота и чувствителност. Не-достатъците включват необходимостта от точно калибриране на използвания спектрофотометър в далечния UV-диапазон.

Колориметрични методи1. Биурет-методи: по-малко чувствителни в

UV-област, пречки? от амоняка;2. Метод на Lowry: по-чувствителен от Биу-

рет-методи, с висока степен на пречене.Методът на Lowry и сътр.32 не е изключение

и притежава умерено постоянна чувствителност от протеин до протеин. Протеиновите оценки на Lowry са напълно приемлива алтернатива при поч-ти всички случаи, при които белтъчни смеси или сурови екстракти са били използвани. Основава се на реакцията Biuret, при която пептидните връзки на протеините реагират с мед при алкални усло-

вия до получаване на Cu+, който реагира с реагента на Фолин. Реакциите притежават силно изразен син цвят, който отчасти зависи от съдържанието на тирозин и триптофан. Методът е чувствителен при приблизително около 0.01 mg протеин/ml и се използва най-добре при разтвори с концентрации в интервала 0.01–1.0 mg/ml протеин.

3. Багрилно-свързващ метод: Косвен Сулфо-багрила: амидочерно, киселинно-оранже-

во 12. Взаимодейства с: e-аминогрупа на лизин Гуанидинова група на аргинин Имидазолова група на хистидин. Директен Метод на Bradford („Кумаси“ брилянт синьо

G250).Методът на Bradford е бърз и точен за изчисля-

ване на концентрацията на протеин и се превръща в предпочитан в много лаборатории5. Този метод е по-лесен, по-бърз и по-чувствителен от метода на Lowry. Нещо повече, в сравнение с него, налице са по-малко пречения от общите реагенти и непроте-инови компоненти при следното уточнение:

Анализът на Bradford е относително свободен от пречения на биохимични реактиви. Въпреки това, някои химикали, като детергенти и амфолити8, 46, могат значително да променят абсорбцията на празната проба или реакцията на протеини към багрилото. Те могат да бъдат отстранени от раз-твора на пробата чрез гел-филтрация, диализа или утаяване на протеин с калциев фосфат37, 61.

Анализът на Брадфорд се основава на свързва-нето на багрилото „Кумаси“ брилянт синьо G250 с протеини. Детайлни проучвания показват, че сво-бодното багрило може да съществува в четири раз-лични йонни форми, за които рКа стойностите се равняват на 1.15, 1.82 и 12.47.

В съвременната практика на химичния анализ на храни най-широко приложение намира методът на Kjeldahl в неговите многобройни модификации. За го-ляма част от животинските храни, които са главни източници на пълноценни по аминокиселинен състав хранителни белтъци, този метод се посочва за ре-ферентен и е прилаган в по-голямата част от бази-те данни и таблици за състава на храните, които се ползват от диетолозите.

Заключение

Редица учени17, 38, 44 предлагат дефинициите за протеина и методите за анализ да бъдат още усъ-вършенствани. Мнозина други смятат, че сумата

34 Наука Диететика 4 201334 НННННаааааукукуккккуууу ааа аа ДиДиДиДиииетететететтетеееететее икикикикккккаааааНаНаНаНаНаНаН 4444444 2020222 1313333333

от аминокиселини най-пълно представлява съдържа-нието на протеина в храните38.

Във всички случаи изборът на подходящ анали-тичен метод за определяне на протеини в храни е от компетенцията на конкретния специалист аналитик, а отговорност на компилатора на база данни за състава – правилния избор на факторите за превръщане на азота в протеин и коректното документиране на стойностите в базата данни и прилежащите към нея литературни източници.

Книгопис1. Гюрова, Д. Съвременен преглед и актуални препоръки към аналитичните

методи за определяне на макронутриенти в храни. Наука Диететика, 2012, № 2 (10), 30–33.

2. Гюрова, Д., Т. Панев. Съвременни бази данни за химичен състав на храните – необходимост и критерии за изграждане. Науката за хранене, между дискусиите и доказателствата. Състав и безопасност на храните. Оценка на риска. Генно модифицирани храни, 2012, 53–55.

3. Попов, Б., П. Николова. Физиология и биохимия на храненето. Хранителни вещества. Антивитамини, Белтъчини. – В: Хигиена и екология. Том 1. 1. изд. Под ред. на Д. Цветков. София: Знание, 1999, с. 145.

4. AOAC.1990.Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists,15 th ed. 1990.

5. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein–dye–binding. Anal Biochem., 1976, № 72, 248–254.

6. Chang, S. K. C. Protein analysis. – In: S. S. Neilson, ed. Food analysis, 1998, 2nd ed, 237–249.

7. Chial, H. J., H. B. Thompson, and A. G. Splittgerber. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analyt. Biochem., 1993, № 209, 258–266.

8. Compton, S. J. and, C. G. Jones. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analyt. Biochem., 1985, № 151, 369–374.

9. Darryl, M., D. E. Carpenter. Methods of analysis for nutritional labeling. Proximate and Mineral analysis, 1993, Ch. 6, 105.

10. Dierckx, S. et al. Analysis of proteins, peptides and amino acids in foods (R.A. Mey-ers, ed.), John Wiley & Sons, Chichester, 2000, 4182–4203.

11. Doetsch K., RH. Gadsden. Determination of total urinary protein, combining

Lowry sensitivity and Bi ret specificity. Clin Chem., 1973, № 19, 1170–8.

12. Dube, J. et al. Problems with the estimation of urine protein by automated assays. Clin Biochem., 2005, № 38, 479–85.

13. European Commission. Measurement and testing (available at http://europa.eu.int/comm/research/growth/gcc/ga03.html#top, 2003.

14. Egan, H., R. S. Kirk, R. Sawyer. Pearson s chemical analysis in foods, 8th edition. Har-low, UK, Longman Scientific and Technical, 1987.

15. FAO/WHO. Energy and protein requirements. Report of a Joint FAO/WHO Ad Hoc Expert Committee, 1973, FAO Nutrition Meetings Report Series No.52 Rome, FAO.

16. FAO/WHO/UNU. Energy and protein requirements. Report of a joint FAO/ WHO/UNU expert consultation. WHO Technical Report Series No 724, 1985.

17. FAO Food and Nutrition Paper, Food energy – methods of analysis and conversion factors, Rome, 2003, ISSN 0254–4725.

18. Gornall, A. G., C. J. Bardawill, M.N. David. Determination of serum proteins by means of the Bi ret reaction. J Biol Chem., 1949, № 177, 751–66.

19. Greenfield, H., D. A. T. Southgate. Food composition data: production, management and use. Barking, UK, Elsevier Science Publishers. 1992.

20. Greenfield, H., D. A. T. Southgate. Food Composition Data. 2nd ed. FAO, 2003, 101–106.

21. Greenfield, H., D.A.T. Southgate. Food composition data: production, management and use. Food and Agriculture Organisation of the United Nations, Rome, 2003.

22. Heidelbaugh, N. D. et al. Comparison of three methods of calculating protein con-tent of foods. J. Agric. Food Chem., 1975, № 23, 611–623.

23 Huang, et al. Automated modified Lowry method for protein analysis of milks. J. Food Sci., 1976, № 41, 1219–1221.

24. Jones, D. B. 1931. Factors for convening percentages of nitrogen in foods and feeds into percentages of protein. United States Department of Agriculture Circular No 183, updated in 1941.

25. Jones, D.B., V. E. Munsey, L. E. Walker. Report of Committee of Protein Factors. J. As-soc. Off. Agric. Chem., 1942, № 25, 118–120.

26. Kenyon, G. L. et al. Defining the mandate of proteomics in the post–genomics era. Workshop Report: National Academy of Sciences, Washington DC, USA. Mol. Cell. Proteomics, 2002, № 1, 763–780.

27. King–Brink, M., J. G. Sebranek. Combustion method for determination of crude pro-tein in meat and meat products: collaborative study. J.AOAC International, 1993, № 76(4), 787–793.

28. Kirschenbaum, D. M. Molar absorptivity and A1%/1 cm values for proteins at select-ed wavelengths of the ultraviolet and visible regions. Analyt. Biochem., 1975, № 68, 465–484.

29. Kjeldahl, J. A new method for determination of nitrogen in organic matter. Z. Anal. Chem., 1883, № 22, 336.

30. Koivistoinen et al. Memorandum of terms, definitions and analytical procedures of protein, fat and carbohydrate in foods for basic composition data, issues and recom-mendations. Food Chem., 1996, № 57, 33–35.

31. Lakin, A. L. Determination of nitrogen and estimation of protein in foods. In: R.D.King,ed. Developments in food analysis techniques. Vol. 1, 1978, 43–74.

32. Lowry et al. Protein measurements with the Pholin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, № 193, 263–275.

33. McKnight, G.S. A colorimetric method for the determination of sub–micro gram quantities of protein. Anal. Biochem., 1977, № 78, 86–92.

34. Miller, E.L. et al. Repeatability and Reproducibility of Determination of the Nitrogen Content of Fishmeal by the Combustion (Dumas) Method and Comparison with the Kjeldahl Method: Interlaboratory Study. J AOAC Int., 2007, № 90(1), 6–20.

35. Noll, J.S., D. H. Simmonds, W.C. Bushuk. A modified biuret reagent for the determi-nation of protein. Cereal Chem., 1974, № 52, 610–616.

36. Okutucu, B. et al. Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. J. Biochem. Biophys. Methods, 2007, № 70, 709–711.

37. Pande, S. V. and, M. S. R. Murthy. A modified micro–Bradford procedure for elimina-tion of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids. Ana-lyt. Biochem., 1994, № 220, 424–426.

38. Pesce, M.A., C.S. Strande. A new micromethod for determination of protein in cer-ebrospinal fluid and urine. Clin Chem., 1973, № 19, 1265–7.

39. Phizicky, E. et al. Protein analysis on a proteomic scale. Nature, 2003, vol. 422, www.nature.com/nature

40. Pomeranz, Y., R.B. Moore, F.S. Lai. Reliability of five methods for protein determina-tion of barley and malt. Am. Soc. Brew. Chem., 1977, № 35, 86–93.

41. Ribadeau – Dumas, B., R. Grappin. Milk protein analysis. Lait, 1989, № 69, 357–416.

42. Salo–Vaananen, P.P., P.E. Koivistoinen.determination of protein in foods: compari-son of net protein and crude protein (Nx 6.25) values. Food Chem., 1996, № 57, 27–31.

43. Sapan, CV. et al. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appl Biochem., 1999, № 29, 99–108.

44. Schaffner, W., C.Weissmann. A rapid, sensitive, and specific method for the determi-nation of protein in dilute solution. Anal Biochem., 1973, № 56, 502–14.

45. Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrometry at 205 nm. Analyt. Biochem., 1974, № 59, 277–282.

46. Spector, T. Refinement of the Coomassie Blue method of protein quantitation. A simple and linear spectrophotometric assay for <0.5 to 50 μg of protein. Analyt. Bio-chem., 1978, № 86, 142–146.

47. Sperlingova, I. et al. Reference material totalprotein in human urine. Fresenius‘ J Anal Chem., 1998, № 361, 756–60.

48. Sosulski, F.W., G.I. Imadifon. Amino–acid composition and nitrogen to protein con-version factors for animal and plant foods. J. Agric. Food Chem., 1990, № 38, 135–136.

49. Southgate, D.A.T. Food composition, caloric value and macronutrient content. In: K.van der Heijden, M.Younes, L. Fishbein & S.Miller, eds. International food safety handbook, 1999, 493–504.

50. Southgate, D.A.T. Guidelines for the preparation of food composition tables. Basel, Switzerland, Karger, 1974.

51. Sullivan, D. M. Proximate and mineral analysis. In: D.M. Sullivan &D.E. Carpenter, eds. Methods of analysis for nutritional labeling, 1993, 105–109.

52. Taylor, W.H. Formol titrations: and evaluations of its various modifications. Analyst., 1975, № 82, 488–498.

53. Tkachuk, R. Nitrogen to protein conversion factors for cereals and oilseed meals. Ce-real chem.,1969, № 46, 419–423.

54. Udy, D.C. An improved dye method for estimating protein. J. Am. Oil Chem. Soc., 1971, № 48, 29A–33A.

55. Van Camp, J., A. Huyghebaert. Analysis of protein in foods. In L.M.L. Nollet ed. Handbook of food analysis, vol. 1. Physical characterization and nutrient analysis, 1996, 277–309.

56. Van Camp, J., S. Dierckx. Analysis of Proteins in Foods. In: L. Nollet (Ed.) Handbook of Food Analysis, Vol. 1: Physical Characterization & Nutrient Analysis. Marcel Dekker Inc., New York, 2004, Ch. 7, 167–202.

57. Van J. Camp. Nitrogen, protein and amino acids. EuroFIR Composition course, 2008.

58. Walker, J. M. Quantitation of proteins. The protein Protocols Handbook, 2002, № 2, 27–48.

59. Zaia, D.A.M., F.R. Marques, C.T.B. Zaia. Spectrophotometric determination of total proteins in blood plasma: a comparative study among dye–binding methods. Braz Arch Biol Technol., 2005, № 48, 385–8.

60. Zhong, H., J. Xu, H. Chen. A rapid and sensitive method for the determination of trace proteins based on the interaction between proteins and Ponceau 4R. Talanta, 2005, № 67, 749–54.

61. Zuo, S.-S. and l, P. Lundah. A micro–Bradford membrane protein assay. Analyt. Bio-chem, 2000, № 284, 162–164.

Documents

Протеини в храни - publishing.arbilis.com · Наука Диететика 4 2013 29 Всички видове протеини, както от животински,