第六节 动物 胚胎干细胞的分离培养技术 第六节 动物 胚胎干细胞的分离培养技术

Embryonic Stem cellsEmbryonic Stem cells （（ ES cellsES cells ））一、概述 一、概述 二、二、胚胎干细胞研究的意义胚胎干细胞研究的意义三、三、胚胎干细胞研究的历史胚胎干细胞研究的历史四、胚胎干四、胚胎干细胞分离培养的基本程序 细胞分离培养的基本程序 五、五、胚胎干胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远细胞技术目前存在的问题和发展远

景景

第六节 胚胎干细胞技术 第六节 胚胎干细胞技术 Embryonic Stem cells (ES cells)Embryonic Stem cells (ES cells)

一、概述一、概述哺乳动物胚胎干细胞（哺乳动物胚胎干细胞（ embryonic stem cells, embryonic stem cells,

ESES 细胞） 一般是指从早期胚胎经细胞） 一般是指从早期胚胎经体外分化抑体外分化抑制制培养分离出来的具有全能性的细胞。培养分离出来的具有全能性的细胞。

ESES 细胞是由细胞是由 EvansEvans 和和 Kauf-man1981Kauf-man1981 年首次年首次从延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，从延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当时称之为当时称之为 EKEK 细胞。以后称之为胚胎干细胞。细胞。以后称之为胚胎干细胞。

人胚胎干细胞分离技术途径人胚胎干细胞分离技术途径

ICM PGCs

ESES 细胞的特点：细胞的特点：ESES 细胞具有胚胎细胞的特性细胞具有胚胎细胞的特性，在，在形态上形态上表现表现

为体积小、核大，核仁突出，培养时呈克隆状为体积小、核大，核仁突出，培养时呈克隆状生长；在生长；在功能上功能上，， ESES 细胞具有发育的全能性，细胞具有发育的全能性，即具有分化为成年动物体内任何一种细胞类型即具有分化为成年动物体内任何一种细胞类型的能力。的能力。

ESES 细胞具有细胞系的特征细胞具有细胞系的特征，在饲养层上能维，在饲养层上能维持未分化状态并实现自我更新。因为可无限增持未分化状态并实现自我更新。因为可无限增殖，也可冷冻保存。殖，也可冷冻保存。

二、二、胚胎干细胞研究的意义胚胎干细胞研究的意义ESES 细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究

中极有价值的工具；中极有价值的工具；ESES 细胞是研究细胞是研究细胞分化细胞分化的理想手段；图的理想手段；图ESES 细胞是研究基因功能的首选细胞；细胞是研究基因功能的首选细胞；EsEs 细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；ESES 细胞治疗技术将引起一场医学革命；细胞治疗技术将引起一场医学革命；ESES 细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的

筛选。筛选。

• 二、胚胎干细胞研究的历史二、胚胎干细胞研究的历史

1 、 1981 年 Evans 和 Kaufman 获得小鼠 ES 细胞系2 、 1988 年 Doetschman 获得仓鼠 ES 细胞系3 、 1994 年 Wheeler 和 Robert 获得猪 ES 细胞系4 、 1998 年 Thomson 获得人的 ES 细胞系5 、 2007 年 日本的 Yamanaka 研究小组和美国的 James Thomson 研究小组分别获得诱导多能性干 细胞 （ induced pluripotent stem cell ， iPS 细胞）

• 四、胚胎干细胞分离培养的基本程序四、胚胎干细胞分离培养的基本程序

• (( 一一 )) 选择抑制细胞分化的培养体系选择抑制细胞分化的培养体系• 11 、饲养层培养体系、饲养层培养体系• 22 、条件培养体系、条件培养体系• 33 、培养液中添加分化抑制因子体系、培养液中添加分化抑制因子体系

• 四、胚胎干细胞分离培养的基本程序四、胚胎干细胞分离培养的基本程序

• （二）早期胚胎的选择（二）早期胚胎的选择• （三）胚胎干细胞的分离（三）胚胎干细胞的分离• （四）胚胎干细胞的保持（四）胚胎干细胞的保持• （五）胚胎干细胞的鉴定（五）胚胎干细胞的鉴定• （六）胚胎干细胞的分化潜力验证（六）胚胎干细胞的分化潜力验证

五、五、胚胎干胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远景细胞技术目前存在的问题和发展远景

• 11 、根据细胞的分化特点建立更有效的培养体、根据细胞的分化特点建立更有效的培养体系系

• 22 、加强胚胎干细胞体外诱导分化研究、加强胚胎干细胞体外诱导分化研究• 33 、提高家畜胚胎干细胞的分离水平、提高家畜胚胎干细胞的分离水平• 44 、加速胚胎干细胞在医学上的应用、加速胚胎干细胞在医学上的应用

第七节 嵌合体 第七节 嵌合体 ChimeraChimera

嵌合体动物：嵌合体动物：指由指由 22 个以上不同的受精卵或个以上不同的受精卵或 33个以上的配子相结合，有不同基因型的细胞个以上的配子相结合，有不同基因型的细胞群所构成的复合体。群所构成的复合体。

嵌合体动物制作方法：嵌合体动物制作方法：11 、集合（凝集）法、集合（凝集）法 ：：在卵裂阶段使在卵裂阶段使 22 个以上个以上

的胚胎发生粘着和结合。的胚胎发生粘着和结合。22 、、注入法注入法：：在临近着床的胚泡期，用显微操作在临近着床的胚泡期，用显微操作

方法将另一个体的细胞注入到囊胚腔中。方法将另一个体的细胞注入到囊胚腔中。

研究现状：研究现状： 家畜的嵌合体不但已在个体间和品种间取家畜的嵌合体不但已在个体间和品种间取

得成功（绵羊、牛等），而且在异种间也得成功（绵羊、牛等），而且在异种间也得到了活的后代，如绵山羊人工嵌合体，得到了活的后代，如绵山羊人工嵌合体，该技术对遗传学研究具有重要意义，塑造该技术对遗传学研究具有重要意义，塑造特异性状的新奇物种特异性状的新奇物种，从而为动物园展示，从而为动物园展示了新的前景，嵌合体也被用来研究免疫学了新的前景，嵌合体也被用来研究免疫学系统的机理。系统的机理。

哺乳动物嵌合体生产基本方法示意图哺乳动物嵌合体生产基本方法示意图1

2

小鼠胚小鼠胚胎囊胚胎囊胚腔注入腔注入嵌合法嵌合法

嵌合体猪嵌合体猪

(A) Female piglet 6899 developed from a Duroc-Pietrain blastocyst (red and black pigmentation) injected with German Land-race PGCs (white pigmentation on head and legs).

(B) Chimeric piglets 7003 (male) and 7006 (female) with red areas across the back developed from ‘‘red’’ Duroc cells injected into Landrace blastocysts.

利用胚胎聚合和类胚胎干细胞制备嵌合体牛利用胚胎聚合和类胚胎干细胞制备嵌合体牛

四细胞期胚胎与类干细胞聚合后，培养成为桑椹胚和囊胚，移植后生出嵌合体牛犊。