尿蛋白的实验室检测 - Beckman Coulter

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尿蛋白的实验室检测

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尿微量蛋白的临床运用

肾小球ACR（MA/Ucear）

UTRF IGU

肾小管 A1M B2M RBP

中文名称英文名称临床意义

微量白蛋白 MA肾小球电荷屏障受损的标志物，写进多指南，预示血管内皮细胞改变

尿转铁蛋白 TRU肾小球电荷屏障受损标志物，在2型糖尿病病人中，其敏感性高于MA

α1-微球蛋白 A1M 肾小管受损标志物，稳定易检测

尿免疫球蛋白G IGU 肾小球分子筛屏障受损的标志物，通常预示预后不好

β2微球蛋白 B2M肾小管受损敏感标志物；血清标志物为高通量透析评估疗效的标志物

视黄醇结合 RBP 肾间质纤维化的独立标志物


尿白蛋白---“白蛋白尿概念的提出”

2010年美国糖尿病协会（ADA）发布糖尿病临床诊治的准则中将微量白蛋白尿定义为：

› 随机尿UAE 30~299ug/mg肌酐；

› 低于此范围下限认为是正常，高于此范围上限认为大量白蛋白尿

2012年K/DIGO指南也使用了同样的定义

美国肾病教育计划（NKDE）和国际临床化学联合会（IFCC）建议使用术语“尿白蛋白”，以避免

“微量白蛋白”与“小白蛋白分子”相混淆。


尿蛋白的实验室检测

检测前因素检测中因素检测后因素


尿蛋白的检测前因素

方法学的选择个体间的

生物学变异

尿液中蛋白

分子结构的变化

尿液标本的

存储及处理


方法学选择

干化学法

（试带法）

利用尿蛋白与染料相结合而产生的颜色变化来测定蛋白含量

干化学法检测尿白蛋白的阴性似然比为0.26（95%CI，0.16~0.40），阴

性结果不能排除白蛋白尿

免疫化学方法

散射比浊法采用特异性的抗体与尿中的白蛋白形成复合物，用专

业的特定蛋白仪，散射比浊法进行检测，灵敏度高，

线性范围宽，检测项目全，抗原过量检测

透射比浊法采用特异性的抗体与尿中的白蛋白形成复合物，常运

用生化检测仪，透射比浊法进行检测，灵敏度不够，

检测项目缺陷，无抗原过量检测功能

对白蛋白更为敏感，特异性不高

难以区分与白蛋白分子量相当的蛋白质分子，会形成高估的现象

液相色谱串联质谱法（LC-MS）

同位素稀释质谱法

运用15N同位素标记的方法对尿白蛋白进行绝对定量

——参考方法

检测方法

体积-排阻高效液相色谱法（SE-HPLC）

中华检验医学杂志 2 0 1 5 年 9 月第 3 8 卷第 9 期 .


散射比浊法与透射比浊法

透射比浊法朗伯-比尔定律

散射比浊法 • 最适合血浆蛋白小分子胶体溶液的检测方法——散射比浊法；

• 同时运用近红外波长，配合胶乳颗粒使用，提升更小分子检测的灵敏度；

• 速率法检测，避免寻找反应终点的难题。


散射比浊与透射比浊法在尿蛋白检测中的比较

线性范围及灵敏度的比较

IMMAGE Siemens AU Roche

IGU 0.3 - 1,296 0.4 / /

MA 0.2 - 864 0.2 0.5 - 30 0.3 - 40

TRU 0.2 - 864 0.2 / /

A1M 0.4 -1,728 0.6 / 0.5 - 20

B2M 0.04 - 2.4 0.2 0.05 -1.6 /

RBP 0.01 - 2 / 0 - 2 /

• 散射比浊法检测尿项目丰富

• 散射比浊法灵敏度更好

• 散射比浊法线性范围更宽


以尿白蛋白为例比较各种检测方法的差异

› 在一项蛋白尿的评价研究中发现散射比浊法是所有免疫反应方法测定尿白蛋白偏倚最小的，较候选参考方法：

同位素稀释质谱法和体积排阻色谱法

免疫化学法与SE-HPLC检测MA的性能特征

方法学检测原理检测限假阴性假阳性低浓度

（批内CV值）高浓度

（批内CV值）

放射免疫分析法免疫反应性 0.1~0.3mg/L 23% 09.2%

(12.2mg/L)

4.8%

(33mg/L)

免疫散射比浊法免疫反应性 0.5~1mg/L 无报道无报道4.2%

(12.1mg/L)

5.3%

(45mg/L)

免疫透射比浊法免疫反应性 5~8mg/L 36% 08.5%

(8mg/L)

3.4%

(35mg/L)

体积排阻高效液相色谱色谱法

（非）免疫反应性

2mg/L参比方法

参比方法5.6%

(44.7mg/L)

6.0%

(141mg/L)中华检验医学杂志 2 0 1 4 年 6 月第 3 7 卷第 6 期

› Bakker等以同位素稀释质谱法作为参考方法比较17种尿白蛋白定量常规检测方法的性能，结果显示尿蛋白在低

中高浓度时，各方法间的差异达40%左右，且在ACR30mg/g阈值浓度时各方法与参考方法间的差异高达约10%，

可能是由于目前没有较好的参考检测程序和物质造成的。

中华检验医学杂志 2 0 1 5 年 9 月第 3 8 卷第 9 期


以尿白蛋白为例比较各种检测方法的差异

• 与参考方法IDMS（同位素稀释质谱法）方法相比，

IMMAGE800的微量白蛋白偏差非常小，显著优于其

他平台

Clin Chem 60:3 471-480 (2014)

State of the Art for Measurement of Urine Albumin: Comparison of Routine Measurement Procedures to Isotope Dilution Tandem Mass Spectrometry

Lorin M. Bachmann, Goran Nilsson, David E. Bruns, Matthew J. McQueen, John C. Lieske, Jack J. Zakowski, and W. Greg Miller


贝克曼库尔特特定蛋白平台提供4项尿蛋白的抗原过量检测

速率峰

时间

速率

加入标准抗原

抗体过量OK!

抗原过量-做更高倍数的稀释 IgA

IgG

IgM

IgALC

IgMLC

MA

A1M

TRU

IGU

ALB

HPT

KAP

LAM

• 在前端反应达到速率峰后在加入标准抗原，监测是否出

现再一次速率峰值。

• 真正的通过实时反应来检测前段反应是否发生抗原过量。

• 这项成果代表Beckman-Coulter公司在抗原过量检测方

面的典型成就。

假阴性漏诊风险


个体间的生物学变异大

个体间变异系数大（4%~~103%）

各种生理情况下对白蛋白的影响

› 体位、剧烈运动、血压、高蛋白饮食对白蛋白有影响

› 发热、紧张、注射去甲肾上腺素对白蛋白的排出有增加

› 存在昼夜周期变化，但均在正常范围内波动

因个体测定值存在正常波动,在出现临界值时应通过复检加以确认

• 推荐在排除以下临床情况后，再筛查ACR ：24小时内的剧烈运动、长时间站立、感染

（尤其是泌尿系统感染）、发热、慢性心力衰竭、血糖过高、血压过高、血脂过高等

• 推荐DKD的诊断或A分期应当以3~6月内的2~3次ACR结果作为基础

• ACR可以使变异减少到38.6%


尿液中白蛋白分子结构的改变

正常的白蛋白分子

› 由肝脏合成

› 585个氨基酸，无糖基

› 分子量：66KDa

› 等电点：接近5，高度可溶性

› X光晶体成像显示，富含a螺旋使得其结构稳定

› 在溶液中表现类似一个14nm长的圆柱体，伸长的形状和增加的水动力可能对于减少肾小球过滤很重要

› 白蛋白等位基因突变率1/1000，故很少影响白蛋白的定量方法


尿液中白蛋白分子结构的改变

尿液采集后，蛋白酶的降解、化学修饰都可能发生，白蛋白失去部分或全部的免疫原性。

› 尿液中修饰的Alb百分比较血液高

› 糖尿病患者尿中Alb异构体和酸性Alb较多

› 尿中存在多种类型的Alb片段

› 尿液中富含能结合白蛋白的配体

› 尿液内易发生N-端和C-端末端的断裂

› 血浆内白蛋白形式影响其受体介导的肾小管重吸收

› 尿液中存在不同分子大小的白蛋白片段和二聚体

› 完整的白蛋白分子具有5个抗原表位，而被修饰过的白蛋白及白蛋白碎片往往会失去部分或全部免疫原性

（免疫非反应性白蛋白），无法被免疫比浊法完全测出


尿液标本的存储与处理

容器的影响

› 白蛋白易吸附在塑料

容器表面，导致尿白

蛋白检测结果偏低

存储条件的影响

› PH值，温度，时间，

防腐剂影响

样本类型的影响

› 24小时尿，晨尿，

随机尿

中华检验医学杂志 2 0 1 5 年 9 月第 3 8 卷第 9 期 .


尿液标本的存储条件影响尿蛋白的检测---PH值

› pH值在碱性环境（PH＞8.0）, 在-20 ℃条件下, 1年内白蛋白浓度无明显下降。

› pH值在酸性环境（PH在 2.3~2.5）, 会导致室温下尿白蛋白迅速降解。

› PH在5.5~6.0，室温条件下β2-微球蛋白4小时降解至40%

CLIN. CHEM. 28/6, 1330-1333 (1982)


尿液标本的存储条件影响尿蛋白的检测---温度

室温存储24小时，尿蛋白（a1-微球蛋白）含量发生差异

4度保存，最多只能一周（白蛋白， a1-微球蛋白）

-20度存放，有争论

› 4周后浓度发生差异（白蛋白，转铁蛋白，a1-微球蛋白），且不同浓度的样品，稳定性液不一致，在-20度环

境下存储尿液6个月后, 白蛋白浓度高的尿液白蛋白下降率比白蛋白浓度低的尿液要低，-20度长期保存会有各

种白蛋白修饰产物产生

-80度存放，报道结果较一致

› 检测尿样在-80 ℃环境下保存6-12个月的变化情况, 发现白蛋白浓度没有显著变化。（白蛋白，a1-微球蛋白）

IFCC工作组对尿白蛋白提出贮存温度的影响

• -80度冰冻可长期保存，

• -20度，可形成变异体

• 2-8度，可稳定7天

检验医学２０１４年１月第２９卷第１期


尿液标本的存储条件影响尿蛋白的检测---防腐剂的使用

› 应尽可能避免使用防腐剂，除非在标本收集后两小时内无法进行尿液分析，如尿标本需分析的成分不稳定

或要进行细菌培养，标本中可加入特定的化学防腐剂，如使用商品化的含防腐剂的器具，实验室应预先对

该器具的适用性进行评估。

› 有多种防腐剂适用于该分析时，应选择危害性最小的防腐剂。


说明书中推荐的尿液标本存储方式及处理过程

尿蛋白类型保存方式处理过程

尿微量白蛋白

• 不可使用防腐剂

• 建议不使用冷冻样本

• 2-8度储存不超过72小时

• 3000*g （g代表离心力）10分钟；

• 除去任何细胞和其它碎片

尿免疫球蛋白G 同上同上

尿转铁蛋白同上同上

尿a1-微球蛋白

• 不可使用防腐剂

• 建议不使用冷冻样本

• 2-8度储存不超过7天

同上，最好使用24小时内采集的样本


尿液标本类型对尿蛋白的检测影响

› 24小时尿---很好的消除了个体一天内不同时段生理变异因素影响，因而一直被视为尿白蛋白检测

“金标准”，但是患者依从性不好，留取并不方便，难以筛查

› 晨尿---其优势在于几乎可以固定每天的采集时间，此外它受到饮水稀释和生理活动的影响相对小，

可以降低由这些因素引起的个体变异

› 随机尿---留取便利，便于筛查，临床对于单次尿标本通常使用尿肌酐进行校正，以白蛋白/肌酐

（ACR）来反映白蛋白排泄的情况。ACR与24h尿白蛋白定量之间呈高度相关（r=0.903，P<0.05）



尿蛋白的检测中因素

方法学的差异

尿液标准品的差异


方法学的差异

检测方法

› 尚无尿白蛋白检测的参考方法，候选参考方法—液相色谱串联质谱法（LC-MS法）

› 市售的17中常用检测方法间偏倚的调查：30mg/g 决定水平浓度时与参比方法比偏倚超过10%，

不同浓度偏倚中位数更达40%

› 散射比浊法，偏倚最小

方法的灵敏度

› 2009年，由美国NKF和FDA发起，将MA参考区间作了调整，由<30mg/d（或Alb mg/g Cr）降为

<10mg/d （或Alb mg/g Cr），这就要求所选用的MA检测方法，其检测敏感度必须<10mg/L.



尿液标准品的差异

候选的参考物质主要有3类：

› ERM-DA470及ERM-DA470K/IFCC:

将稀释的ERM470可以作为尿白蛋白的参考物质，大部分厂商均使用稀释的ERM系列对主定标品进行赋值

尿液基质与血液基质完全不同，稀释的方式是否合适直接决定了结果的互通性，但目前尚无统一的稀释方法与

稀释物质

› 纯化人血清白蛋白CRM

定值溯源至ERM-DA470，用蔗糖与磷酸缓冲液模拟尿液基质

› 15N-标记的白蛋白CRM

目前尚无商业化



尿蛋白的检测后因素

报告方式的不同

参考区间的不同


报告方式的不同

2002年ADA发布的导则中推荐

› 24小时尿白蛋白>30mg/24h,随机尿ACR>30ug/mg 为微量白蛋白尿，沿用至今

很多导则推荐使用30ug/mg作为成人ACR的单一阈值

› 然而女性肌酐排泄量相对较低，导致ACR偏高，在不同人种女性中有差异

› 尿白蛋白阈值是代表肾病风险增加的临床水平，而非健康人群参考范围

› 目前将ACR<10ug/mg(或者女性<15ug/mg)视为生理性，与疾病预后无关

› 而在CKD患者中，ACR与预后的关联性则呈U型，即使ACR水平在“正常值”以下依旧会对预后

产生影响，且更低的ACR却可能得到更高的死亡率与更快的疾病进展



迟家敏主编.实用糖尿病学.人民卫生出版社.2010年第3版,518-520中国2型糖尿病防治指南(2013年版).中华糖尿病杂志.2014;6(7):467-468

分组单一时间点样本(mg/g肌酐)

24h尿样本(mg/24h)一定时间段内的尿样本

(ug/min)

正常或轻度白蛋白尿（A1)

＜30 ＜30 ＜20

中度白蛋白尿（A2)

30-300 30-300 20-200

重度白蛋白尿（A3)

＞300 ＞300 ＞200

参考区间的不同

2012年 KDIGO 推荐的参考区间：

› ACR<30mg/g 定义为尿白蛋白排泄正常至轻度增加

› ACR 30~300mg/g 中度增加

› ACR >300mg/g 重度增加


小结

1. 由糖尿病、高血压等引起的慢性肾损伤不容小觑，需及早展开肾损伤的检查，尿蛋白检测是最好的标志物

---无创伤，经济，简便，准确性好，适合连续监测

2. 尿蛋白检测需采用适宜的检测方法，目前，散射比浊法在检测尿白蛋白时，与参考方法的偏倚度最小，灵

敏度最高，且无假阴性的报道；

3. 在尿蛋白检测时需注意样本类型选择，以及存储方式，PH值，时间，温度对尿微量蛋白的影响；

4. 按KDIGO指南，建议采用ACR（白蛋白/肌酐）比值来报告检测结果；且采用指南建议的参考区间。

5. 尿白蛋白的标准化，还需不断改善，从而达到尿白蛋白检测的一致性。

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谢谢！

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