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2.6.4 薬物動態試験の概要文

Bayer Yakuhin, Ltd. Page 1 of 73

2.6.4 薬物動態試験の概要文の目次

2.6.4.1 まとめ........................................................... 4

2.6.4.1.1 リオシグアト及び M-1 の薬物動態学的パラメータ ............... 4

2.6.4.1.2 分布....................................................... 4

2.6.4.1.3 代謝....................................................... 5

2.6.4.1.4 排泄....................................................... 6

2.6.4.1.5 薬物相互作用............................................... 6

2.6.4.1.6 トランスポーター特性 ....................................... 7

2.6.4.2 分析法........................................................... 9

2.6.4.2.1 リオシグアト及び代謝物 M-1、M-4 の標識体合成 ................ 9

2.6.4.2.2 放射能の測定.............................................. 11

2.6.4.2.3 定量法.................................................... 12

2.6.4.2.3.1 リオシグアトの定量 ...................................... 12

2.6.4.2.3.2 M-1（BAY 60-4552）の定量 ................................ 13

2.6.4.2.4 代謝プロファイル.......................................... 14

2.6.4.2.5 薬物動態データの取り扱い .................................. 14

2.6.4.3 吸収............................................................ 15

2.6.4.3.1 単回投与後の吸収及び薬物動態 .............................. 15

2.6.4.3.2 反復投与後の薬物動態 ...................................... 19

2.6.4.4 分布............................................................ 22

2.6.4.4.1 血漿たん白結合及び血球移行 ................................ 22

2.6.4.4.2 臓器・組織分布............................................ 23

2.6.4.4.2.1 単回投与後の定性的臓器・組織分布 ........................ 24

2.6.4.4.2.2 単回投与後の定量的臓器・組織分布 ........................ 25

2.6.4.4.2.3 妊娠ラットに単回投与後の定量的臓器・組織分布（胎盤

通過性） ................................................ 27

2.6.4.4.2.4 反復投与後の定量的臓器・組織分布 ........................ 28

2.6.4.5 代謝............................................................ 32

2.6.4.5.1 In vitro における代謝 ..................................... 32

2.6.4.5.1.1 動物種の比較 ............................................ 33

2.6.4.5.1.2 代謝に関与する CYP 酵素の同定 ............................ 35

2.6.4.5.1.3 CYP 酵素に対する阻害作用................................. 36

2.6.4.5.1.4 UGT（グルクロン酸転移酵素）に対する阻害作用 ............. 38



2.6.4.5.1.5 SULT（硫酸転移酵素）に対する阻害作用 .................... 39

2.6.4.5.1.6 酵素誘導 ................................................ 40

2.6.4.5.2 In vivo 代謝 .............................................. 41

2.6.4.6 排泄............................................................ 45

2.6.4.6.1 ラット.................................................... 45

2.6.4.6.2 イヌ...................................................... 45

2.6.4.6.3 ヒト...................................................... 46

2.6.4.6.4 乳汁中分泌................................................ 46

2.6.4.7 薬物動態学的薬物相互作用........................................ 48

2.6.4.8 その他の薬物動態試験............................................ 50

2.6.4.8.1 Caco-2 細胞透過性 ......................................... 50

2.6.4.8.2 排出トランスポーターに対する基質特性 ...................... 51

2.6.4.8.3 取り込みトランスポーターに対する基質特性 .................. 52

2.6.4.8.4 P-gp 及び BCRP を介したリオシグアトの輸送に対する阻害

作用...................................................... 53

2.6.4.8.5 排出トランスポーターに対する阻害作用 ...................... 55

2.6.4.8.6 取り込みトランスポーターに対する阻害作用 .................. 56

2.6.4.8.7 リオシグアト単回投与後の M-1（BAY 60-4552）の薬物動

態........................................................ 57

2.6.4.8.8 リオシグアト反復投与後の M-1（BAY 60-4552）の薬物動

態........................................................ 58

2.6.4.8.9 M-1（BAY 60-4552）のたん白結合 ............................ 59

2.6.4.8.10 M-1（BAY 60-4552）のグルクロン酸抱合に関与するヒト

UGT 酵素の同定 ............................................ 60

2.6.4.8.11 M-1（BAY 60-4552）の CYP 阻害作用 .......................... 61

2.6.4.8.12 M-1（BAY 60-4552）の UGT に対する阻害作用 .................. 63

2.6.4.8.13 M-1（BAY 60-4552）の SULT に対する阻害作用 ................. 64

2.6.4.8.14 M-1（BAY 60-4552）の酵素誘導 .............................. 65

2.6.4.8.15 排出トランスポーターに対する M-1（BAY 60-4552）の基

質特性.................................................... 66

2.6.4.8.16 取り込みトランスポーターに対する M-1（BAY 60-4552）

の基質特性................................................ 67

2.6.4.8.17 排出トランスポーターに対する M-1（BAY 60-4552）の阻

害作用.................................................... 67

2.6.4.8.18 取り込みトランスポーターに対する M-1（BAY 60-4552）

の阻害作用................................................ 68

2.6.4.9 種間比較を含めた考察及び結論.................................... 69



2.6.4.10 引用文献一覧.................................................... 73




2.6.4.1 まとめ

リオシグアト（BAY 63-2521）の in vivo 薬物動態は CD-1 系マウス、Wistar 系ラット、ビー

グル犬及びヒト（放射性標識体を用いたマスバランス試験）を用いて検討した。更に、ヒト及び

動物において in vitro の試験を行い、血漿たん白結合率、血球移行性、薬物相互作用、薬物代

謝及び薬物トランスポーターの輸送特性（相互作用の可能性を含む）について検討した。実施し

た薬物動態試験の一覧を 2.6.5.1 に記載した。

2.6.4.1.1 リオシグアト及び M-1 の薬物動態学的パラメータ

リオシグアトを単回静脈内投与後、全身血漿クリアランスは、ラット〔1.3L/(kg∙h)〕及びイ

ヌ〔0.3L/(kg∙h)〕において中等度であった。分布容積は中等度で、それぞれ 1.2L/kg（ラット）

及び 0.7L/kg（イヌ）であった。

[14C]リオシグアトを経口投与後、放射能の吸収率は、ラットで約 60％、イヌで約 78％であっ

た。バイオアベイラビリティは、ラットで中等度（35～65％）、イヌではラットよりわずかに高

かった（50～80％）。イヌに 0.03～0.6mg/kg の用量で経口投与したとき、AUC はおおむね用量

比例的に増加した。ラットでは、0.3～3mg/kg の用量で、AUC は用量比例性をわずかに上回って

増加した。

単回経口投与及び静脈内投与後の血漿中リオシグアトの消失半減期は、ラット（0.7～1.5 時

間）及びイヌ（1.5～3.1 時間）において短かった。

毒性試験において、リオシグアトを反復投与したときの曝露量は、ラットでは初回投与と比較

して中等度に増加したが、イヌでは増加しなかった。両動物種において曝露量に明らかな性差は

認められなかった。

M-1（BAY 60-4552）はリオシグアトの活性代謝物である。リオシグアト投与後の M-1 の薬物動

態を Wistar 系ラット及びビーグル犬を用いて in vivo で検討した。毒性試験において、リオシ

グアトを反復投与したときの M-1 の曝露量は、イヌでは未変化体と同程度であったが、ラットで

は未変化体の約 10％に過ぎなかった。

2.6.4.1.2 分布

リオシグアトのたん白結合率は、低～中等度で、種差が認められた。血漿中非結合型分率は、

ラットで 16％、イヌで 17％であり、ヒトでは約 5％であった。リオシグアトは、ヒト血漿にお

いて、主に血清アルブミン及びα1-酸性糖たん白と結合した。M-1（BAY 60-4552）のたん白結合

率はリオシグアトと同程度であった。M-1 の血漿中非結合型分率はラットで 11％、イヌで 17％

であり、ヒトでは約 4％であった。

[14C]リオシグアトをラットに投与したとき、放射能は臓器・組織にほぼ均一に分布した。放射

能の血液脳関門及び血液精巣関門の通過性は低かった。放射能の AUC が最も高かったのは甲状腺、

肝臓および腎髄質外側部であった。Long Evans ラットを用いた試験において、有色組織に対す

る放射能の親和性が認められた。ラットに 14 日間反復投与した場合、臓器・組織中においてわ



ずかに蓄積傾向が認められた。蓄積比が最も高かったのは血液（2.6 倍）及び血流量の多い臓

器・組織であった。終末相では全般的に放射能濃度が低く、消失半減期は比較的長かった。妊娠

ラットにおいて、放射能の胎盤関門通過性は中等度であった。

2.6.4.1.3 代謝

ヒトを含むすべての動物の肝ミクロソームにおいて、リオシグアトの主代謝経路は、M-1 を生

成する N-脱メチル化であった。ラットの肝ミクロソームでは、M-1 の生成に加えて、M-9、M-10

及び M-11 を生成するフルオロベンジル基の水酸化が主代謝経路であった。ラット、イヌ及びヒ

トの肝細胞における反応は、ミクロソームの一次酸化代謝経路を反映していた。更に、割合は少

ないが、M-8 及び M-4 を生成する未変化体及び M-1 のグルクロン酸抱合並びに M-3 を生成する脱

ベンジル化が認められた。フルオロベンジル基の水酸化（M-9、M-10 及び M-11 を生成）及びそ

れに続く第Ⅱ相抱合反応（M-12、M-18、M-20 及び M-21 を生成）は、ラットにおいて主代謝経路

であったが、イヌでは寄与が小さく、ヒトでは認められなかった。M-6 及び M-7 を生成する中間

代謝物のアセチル化はラット及びマウスでのみ、M-8 を生成するリオシグアトのグルクロン酸抱

合はラットでのみ認められた。グルタチオン抱合体 M-14/M-15 及びその分解物である M-13、M-

16、M-17 及び M-19 はラットでのみ認められた。

M-1 を生成する N-脱メチル化はヒト及びイヌにおいて主要な一次代謝経路である。In vitro

において、ヒト特異的な代謝経路及び大きな種差は認められなかった。

ヒト肝ミクロソーム及びリコンビナント CYP を用いた in vitro 試験において、複数の CYP 分

子種（CYP1A1、2C8、2J2 及び 3A4/5）に M-1 生成能が認められた。検討した CYP 分子種のうち、

M-1 生成の触媒効率が最も高かったのは CYP1A1 であった。M-1 の生成は肝、肺及び小腸ミクロ

ソームにおいて認められた。ヒトの肝臓、小腸及び肺において、M-1 生成に関与する CYP 分子種

を同定したところ、肝臓では CYP2C8、2J2 及び 3A4/5 が M-1 生成に同程度寄与すること、小腸で

は CYP3A4/5 及び CYP2J2 が同程度寄与することが明らかとなった。また、CYP1A1 は M-1 生成に

大きく寄与していた。このことは、ヒト肝及び肺ミクロソームとのインキュベーションにおいて、

CYP1A 阻害剤であるα-ナフトフラボンが、M-1 生成を顕著に抑制した（肝ミクロソームにおいて

対照群の 60％、肺ミクロソームでは 10％にまで抑制）ことから確認された。更に、喫煙者の肺

ミクロソームにおいて、リオシグアトの代謝の亢進がみられた。これは、恐らくタバコ煙によっ

て CYP1A1 活性が誘導されたためと考えられる。CYP1A1 は、肝臓及び肺におけるリオシグアトの

代謝に重要な酵素である。被験者の喫煙状況に由来する CYP1A1 発現の相違が、喫煙者と非喫煙

者の間でリオシグアトのクリアランスに 2～3倍の差が生じた原因であると考えられる。

M-4（BAY 1077251）を生成する M-1 の N-グルクロン酸抱合は、ヒト UGT1A1 及び UGT1A9 に

よって触媒された。グルクロン酸抱合は、腎臓では主に UGT1A9 によって、小腸では主に UGT1A1

によって触媒された。肝臓におけるグルクロン酸抱合は、UGT1A1 及び UGT1A9 の両分子種によっ

て触媒された。

In vivo の所見は in vitro 試験の結果をよく反映していた。リオシグアトを単回経口投与後、

ヒトを含むすべての動物において、血漿中の主成分は未変化体であった。代謝物 M-1 はヒト、イ

ヌ、マウス及びラットの血漿中において主代謝物であった。M-1 の N-グルクロン酸抱合体である

M-4 は、ヒト血漿中の主成分（放射能 AUC の 6～26％）であったが、他の動物の血漿中では検出

されなかった。

ヒトにおいてリオシグアト及び M-1 の血漿中濃度の個体間変動が大きかった原因として、リオ

シグアトの総クリアランスに対して寄与の大きい CYP1A1 が誘導を受けやすいことが考えられる。



2.6.4.1.4 排泄

ラット及びイヌに[14C]リオシグアトを単回経口投与した後、放射能は主に胆汁／糞を介して排

泄された（投与量の＞80％）。ラットにおいて、相当量（投与量の 24％）の胆汁外排泄（消化

管分泌）が認められた。ヒトに[14C]リオシグアトを単回経口投与した後、放射能は尿及び糞中へ

ほぼ同様に排泄された（腎排泄：投与量の 33～45％、糞中排泄：投与量の 48～59％）。

ヒトに[14C]リオシグアトを単回投与した試験で、4 例中 1 例の被験者（被験者 4）における M-

1 生成は、他の 3 例と比較して顕著に低かった。血漿中総放射能 AUC に占めるリオシグアトの割

合は、被験者 1～3 において 26～40％であったのに対して、被験者 4 では 74％であった。また、

血漿中総放射能 AUC に占める M-1 の割合は、被験者 1～3 において 42～59％であったのに対して、

被験者 4では 11％であった。

血漿中における代謝物の存在比を反映して、被験者 4 では未変化体として排泄される割合が他

の被験者より高く、投与量の 63％が未変化体として排泄されたが、被験者 1～3 では、排泄物中

の未変化体は投与量の 14～22％であった。排泄された放射能のうち、M-1 を生成する代謝経路

（M-1 及びそのグルクロン酸抱合体 M-4 の合計）が寄与する割合は、被験者 1～3 においては 67

～71％であったが、被験者 4 では 27％に過ぎなかった。このような個体間差は、上記の被験者

間において、リオシグアトのクリアランスに対する CYP1A1 の寄与が異なるためと考えられる。

ラット（排泄物中の未変化体は投与量の 41～48％、経口投与）及びイヌ（投与量の 9％、経口

投与）では、代謝がリオシグアトのクリアランスにおける主な消失経路であった。ラットの糞中

では、未変化体（投与量の 37～41％）とともに水酸化代謝物 M-9（投与量の 19～20％）が主成

分であった。ラットの尿中では、未変化体（投与量の 4～8％）、M-1（投与量の 2％）及び M-

6/M-7（投与量の 2～3％）が尿中に排泄された放射能の大部分を占めた。

イヌの糞中には未変化体が投与量の 8％排泄されたが、M-1 及びそのグルクロン酸抱合体 M-4

の排泄量は合わせて投与量の 42％であった。イヌの尿中には投与量の 1％に相当する未変化体が

排泄された。M-1 は、イヌの尿中に排泄された放射能の大部分（投与量の 6％）を占めた。

2.6.4.1.5 薬物相互作用

リオシグアト及びヒトにおける主代謝物 M-1（BAY 60-4552）は、治療域の血漿中濃度におい

て CYP1A2、2B6、2C19 及び 3A4 の誘導作用を示さず、主要な CYP 分子種（CYP1A2、2A6、2B6、

2C8、2C9、2D6、2E1、2J2 及び 3A4）に対する阻害作用も示さなかったが、CYP1A1 に対して阻害

作用を示し、Ki 値は 0.6～0.7μM であった。主に CYP1A1 を介した代謝によって消失する併用薬

との間に臨床的に問題となる薬物相互作用が起こる可能性は否定できない。

リオシグアト及び主代謝物 M-1 は、主要なヒト UGT 分子種及び SULT 分子種に対して阻害作用

を示さなかったが、M-1 は UGT1A9 に対して中等度の阻害を示した。しかし、リオシグアトの臨

床用量における M-1 の血漿中濃度を考慮すると、臨床的に問題となる薬物相互作用は起こらない

と考えられる。

複数の薬剤（抗癌剤、鎮痛薬、抗ウイルス薬、抗生物質、アゾール系抗真菌剤など）を用いて、

リオシグアトの N-脱メチル化（M-1 生成）に対する阻害作用を in vitro で評価した。ヒト肝ミ

クロソームにおける M-1 の生成は、HIV プロテアーゼ阻害剤（リトナビル、アタザナビル＞イン

ジナビル＞サキナビル）及びアゾール系抗真菌剤（ケトコナゾール＞クロトリマゾール＞ミコナ

ゾール）によって顕著に阻害された。更に、カルベジロール、エチニルエストラジオール、ケル

セチン及びテルフェナジンなどの化合物並びにエルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ及びソ



ラフェニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤もヒト肝ミクロソームにおける M-1 の生成を 20μM 以

下の IC50値で阻害した。

リコンビナント CYP1A1 を用いた検討において、アミオダロン、エチニルエストラジオール、

フェノフィブラート、ナリンゲニン、ロシグリタゾン、シンバスタチン及びテルフェナジンなど

の化合物は、20μM 以下の IC50値で M-1 生成の阻害作用を示した。アゾール系抗真菌剤であるケ

トコナゾール1)、クロトリマゾール及びミコナゾールは、CYP1A1 を顕著に阻害した。同様の

CYP1A1 阻害作用は、カルベジロール、エバスチン及びケルセチン並びにエルロチニブ、ゲフィ

チニブ、イマチニブ、ソラフェニブ及びスニチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤でも認められ

た。ゲフィチニブ及びエルロチニブは、M-1 の生成を強く阻害したが、恐らく CYP1A1 の時間依

存的阻害によるものと考えられる2)。

リオシグアトの肝代謝及び肝外代謝の両方に対する阻害を考慮すると、ケトコナゾ－ル（IC50値：0.3 及び 0.6μM）は、in vitro において M-1 生成に対する最も強力な阻害剤の一つであっ

た。リオシグアトとケトコナゾールを併用投与した臨床相互作用試験では、リオシグアトの曝露

量は中等度に増加した（平均 Cmaxは 46％、平均 AUC は 150％増加した）。In vitro で最も強力な

阻害剤であるケトコナゾールの併用投与において、リオシグアトの曝露量増加は中等度であった

ことから、in vitro で検討した他の薬剤によって、より顕著な臨床薬物相互作用が起こる可能

性は低いと考えられる。

2.6.4.1.6 トランスポーター特性

リオシグアト及び M-1（BAY 60-4552）は in vitro において P-gp 及び BCRP の基質に分類され

た。これらのトランスポーターは、能動的な腎分泌に関与している可能性が考えられたが、リオ

シグアトでは能動的腎分泌が認められなかったことから、P-gp 及び BCRP は主にリオシグアトの

胆汁中及び／又は胆汁外排泄を介した糞中排泄に関与していると考えられる。リオシグアトとは

対照的に、M-1 では能動的腎分泌が認められたことから、胆汁中及び／又は胆汁外排泄だけでな

く、能動的腎分泌にも P-gp 及び BCRP が関与している可能性が考えられる。したがって、BCRP

及び P-gp の強い阻害剤がリオシグアト及び M-1 の排泄を阻害し、血漿中濃度を増加させる可能

性は否定できない。

リオシグアトは、取り込みトランスポーターである OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT2、OCT1 及

び OCT3 に対して基質特性を示さなかったが、腎臓に発現している OCT2 の基質であった。能動的

な腎分泌はリオシグアトの主要な消失経路ではないことから、OCT2 の阻害によって薬物相互作

用は起こらないと考えられる。

M-1 は OCT1、OCT2 及び OCT3 の基質ではないことから、これらのトランスポーターの阻害によ

る薬物相互作用は起こらないと考えられる。

トランスポーターが関わる薬物相互作用について、併用薬によってリオシグアトの能動輸送が

影響を受ける可能性について in vitro で検討した。複数の薬物がリオシグアトの P-gp 及び

BCRP を介した輸送を顕著に阻害した。したがって、強力な P-gp 及び BCRP の阻害剤が、リオシ

グアトの血漿中濃度を増加させる可能性は否定できない。リオシグアトは、ヒトにおいて高い経

口バイオアベイラビリティを示すことから、消化管の P-gp 及び BCRP の阻害によって、臨床的に

問題となるバイオアベイラビリティの増加は起こらないと考えられる。臨床薬物相互作用試験に

おいて、P-gp 及び BCRP の阻害剤で、かつ強い CYP 阻害剤であるケトコナゾールは、in vivo に

おけるリオシグアトの曝露量を中等度に増加させたが、ケトコナゾールは in vitro における最



も強力な阻害剤であることから、in vitro で検討した他の薬剤によって、リオシグアトの曝露

量がより顕著に増加する可能性は低いと考えられる。

リオシグアト及び M-1 は、治療域の血漿中濃度において、P-gp、BCRP 及び OCT を阻害しな

かった。更に、リオシグアトは OATP1B1、OATP1B3、OAT1 及び OAT3 も阻害しなかった。したがっ

て、リオシグアト及び M-1 は、トランスポーターを阻害することによって、臨床的に問題となる

薬物相互作用を引き起こす可能性は低いと考えられる。



2.6.4.2 分析法

2.6.4.2.1 リオシグアト及び代謝物 M-1、M-4 の標識体合成

参照項目：4.2.2.1.1 PH-32963

4.2.2.5.1 PH-33933

4.2.2.1.2 PH-34710

4.2.2.1.5 PH-34995

4.2.2.1.3 PH-34709

4.2.2.1.6 PH-34020

4.2.2.1.4 A49928

薬物動態試験に用いた放射性標識体及び LC-MS/MS による生体試料分析法バリデーションに用

いた安定同位元素標識体は常法に従い合成した。

[14C]リオシグアト：リオシグアトのピリミジン環を 14C で標識した。精製後、非標識リオシグ

アトを添加し、比放射能を MBq/mg に調整した（4.2.2.1.1 PH-32963 参照）。

N

N

NF

C14

NN

NH2

NH2

N

O

O

[14C]BAY 63-2521

14C 標識は代謝的に安定であることが示された。すなわち、ラットに[14C]リオシグアトを経口

投与後 24 時間までに 14CO2として呼気中に排出された放射能は、投与量の 0.0137％に過ぎなかっ

た（4.2.2.5.1 PH-33933 参照）。

[2H3]リオシグアト：BAY 60-4552 をですることにより、リオシグア

トのメチルカルバメート基を重水素で標識した。標識率（[2H3]リオシグアト）は＞％であった

（4.2.2.1.1 PH-32963 参照）。

N

N

NF

NN

NH2

NH2

N

O

O

H2

H2

H2

[2H3]BAY 63-2521



[2H3]リオシグアト：リオシグアトのエステル基を重水素で標識した。標識率（[2H3]BAY 63-

2521）は＞％であった（4.2.2.1.2 PH-34710 参照）。

N

N

NF

NN

NH2

NH2

N

O

O

H2

H2

H2

[2H3]BAY 63-2521

[14C]BAY 60-4552（代謝物 M-1）：BAY 60-4552 のピリミジン環を 14C で標識した。比放射能は

MBq/mg であった（4.2.2.1.5 PH-34995 参照）。

N

N

NF

C14

NN

NH2

NH2

NH

O

O

[14C]BAY 60-4552



[2H3]BAY 60-4552（代謝物 M-1）：BAY 60-4552 のエステル基を重水素で標識した。標識率

（[2H3]BAY 60-4552）は＞％であった（4.2.2.1.3 PH-34709、4.2.2.1.2 PH-34710、4.2.2.1.6

PH-34020 参照）。

N

N

NF

NN

NH2

NH2

NH

O

O

H2

H2

H2

[2H3]BAY 60-4552

[2H3]BAY 1077251（M-1 の N-グルクロン酸抱合体、代謝物 M-4）：[2H3]BAY 60-4552 をグルク

ロン酸と反応させ、N-グルクロン酸抱合体を合成した。標識率（[2H3]BAY 1077251）は＞％で

あった（4.2.2.1.4 A49928 参照）。

N

N

NF

NN

NH

NH2

NH

O

O

H2

H2

H2

OOH

OHOH

OHO

[2H3]BAY 1077251

2.6.4.2.2 放射能の測定

[14C]リオシグアト投与後の体液、臓器・組織、排泄物中の総放射能濃度を直接又は燃焼後、常

法に従って液体シンチレーション（LSC）法により測定した。ここで用いた LSC 法では、未変化

体と代謝物を識別することはできない。血漿、胆汁及び尿などの液体試料については、さらなる

試料調製は行わなかった。



2.6.4.2.3 定量法

参照項目：4.2.2.1.7 A62548

4.2.2.1.8 PH-36889 Version 2

2.6.4.2.3.1 リオシグアトの定量

非臨床試験及び臨床試験においては、血漿中のリオシグアト及び代謝物 M-1（BAY 60-4552）

を同時に測定するため、必要に応じて種々の LC-MS/MS 法を開発し、バリデーションを行った

（4.2.2.1.7 A62548、4.2.2.1.8 PH-36889 Version 2 参照）。

血漿中のリオシグアトは、除たん白及び HPLC による分離後、同位体標識した内部標準ととも

に MS/MS 法により測定した。いずれの場合も、HPLC システムには TurboIonspray®インター

フェースを通してオンラインでタンデム型質量分析計に接続した。分析法バリデーションは、社

内 SOP 及び生体試料分析法バリデーションに関する FDA ガイドライン3)に従って実施した。

精度及び真度は、品質管理試料から算出した。結果を表 2.6.4.2- 1に示す。

表 2.6.4.2- 1 ヒト、ラット、イヌ、マウス及びウサギ血漿中におけるリオシグアト定量法の

バリデーション

Species Working range [µg/L] Precision [%] Accuracy [%]

Human 0.1 – 500 1.28 to 16.3 89.6 to 113

Rat 0.5 – 1000 2.23 to 17.0 90.6 to 118

Dog 0.5 – 1000 1.78 to 10.9 89.0 to 114

Mouse 1.0 – 500 3.03 to 11.3 91.9 to 105

Rabbit 0.5 – 1000 1.61 to 14.1 92.6 to 113

ヒト、ラット、イヌ、ウサギ及びマウス血漿中のリオシグアトは、－15℃以下で少なくとも

6 ヵ月間は安定であった。更に、他のマトリックス（保存用標準液、検量線作成用標準液など）

での安定性、定量操作中の安定性、実試料の保存期間及び保存条件（温度、遮光など）での安定

性についても検討した。



表 2.6.4.2- 2 リオシグアトの安定性

Stability type Species Temperature Period Stable

Autosampler Rat, dog, human, mice, rabbit

8°C ≥ 72 h Yes

Freeze / thaw Rat, dog, human, mice, rabbit

-15°C 3 cycles Yes

Freezer Rat, dog, mice -15°C ≥ 16 months Yes

Human -15°C ≥ 47 months Yes

Rabbit -15°C ≥ 6 months Yes

Physiological incubation Rat, dog, mice. rabbit, human

37°C ≥ 2 hours Yes

要約すると、リオシグアトは、試料を扱う際の種々条件下において安定であることが確認され

た（表 2.6.4.2- 2）。

2.6.4.2.3.2 M-1（BAY 60-4552）の定量

血漿中の M-1（BAY 60-4552）は、除たん白及び HPLC による分離後、同位体標識した内部標準

とともに MS/MS 法により測定した。いずれの場合も、HPLC システムには TurboIonspray®イン

ターフェースを通してオンラインでタンデム型質量分析計に接続した。（4.2.2.1.7 A62548、

4.2.2.1.8 PH-36889 Version 2 参照）。

精度及び真度は、品質管理用試料から算出した。結果を表 2.6.4.2- 3 に示す。

表 2.6.4.2- 3 ヒト、ラット、イヌ、マウス及びウサギ血漿中における M-1 定量法のバリデー

ション

Species Working range [µg/L] Precision [%] Accuracy [%]

Human 0.2-500 0.85 to 12.0 93.5 to 112

Rat 0.5 -1000 1.47 to 17.2 89.3 to 106

Dog 0.5-1000 2.52 to 9.29 90.2 to 115

Mouse 1.0-500 4.76 to 13.7 95.2 to 102

Rabbit 0.5-1000 3.49 to 11.2 95.4 to 101

ヒト、ラット、イヌ、ウサギ及びマウス血漿中の M-1 は－15℃以下で少なくとも 17 ヵ月間安

定であった。更に、他のマトリックス（保存用標準液、検量線作成用標準液など）での安定性、

定量操作中の安定性、実試料の保存期間及び保存条件（温度、遮光など）での安定性についても

検討した。



表 2.6.4.2- 4 M-1 の安定性

Stability type Species Temperature Period Stable

Autosampler Rat, dog, human, mice, rabbit

8°C ≥ 96 h Yes

Freeze / thaw Rat, dog, human, mice, rabbit,

-15°C 3 cycles Yes

Freezer Rat, dog, mice, rabbit

-15°C ≥ 17 months Yes

Human -15°C ≥ 47 months Yes

Physiological incubation Rat, dog, human, mice, rabbit

37°C ≥ 2 hours Yes

要約すると、M-1（BAY 60-4552）は、試料を扱う際の種々条件下において安定であることが確

認された（表 2.6.4.2- 4）。

2.6.4.2.4 代謝プロファイル

代謝プロファイルの検討では、逆相系カラム HPLC を使用した。酢酸アンモニウム緩衝液

（20mM、pH6.6）／アセトニトリルによるグラジエント溶出を行い、オフラインで放射能を検出

した。構造解明には、HPLC-MS/MS 及び NMR などの分析機器を用いた。未変化体、M-1 及び M-4 の

化学構造は、化学合成品により同定した。

2.6.4.2.5 薬物動態データの取り扱い

リオシグアト又は代謝物 M-1（BAY 60-4552）の標識体又は非標識体を用いて、in vivo 及び

in vitro 試験を実施した。放射能濃度を測定した試験では、未変化体及び代謝物は、[14C]リオ

シグアト当量として示した。

薬物動態学的評価は、ノンコンパートメント（モーメント）解析で行った。この方法で得られ

た薬物動態学的パラメータは、非臨床薬物動態の評価及びヒトとの比較に適したものであった。

代謝物の薬物動態学的パラメータ（AUC、Cmax など）を用量にて補正する場合には、代謝物の分

子量を考慮して行った。

薬物動態学的パラメータ及び濃度は、幾何平均及び標準偏差で示し、血漿たん白結合データ、

排泄率及び回収率は、算術平均及び標準偏差で示した。ラット及びイヌにおけるバイオアベイラ

ビリティは、それぞれ個体間及び個体内の曝露データ（AUCnorm）に基づいて算出した。



2.6.4.3 吸収

2.6.4.3.1 単回投与後の吸収及び薬物動態

参照項目：4.2.2.2.1 PH-33998

4.2.2.5.1 PH-33933

4.2.2.2.2 PH-33934

4.2.2.2.3 PH-34490

雄性 Wistar 系ラットに、14C 標識又は非標識リオシグアトを種々の用量で単回静脈内又は経口

投与して、未変化体及び放射能（未変化体及び／又は代謝物）の薬物動態を検討した。更に、胆

管カニュレーション（BDC）ラットを用いて、[14C]リオシグアトの経口及び静脈内投与試験を実

施した。また、雌性ビーグル犬に、14C 標識又は非標識リオシグアトを単回静脈内持続投与（T＝

1 時間）及び種々の用量で経口投与したときの未変化体及び M-1（BAY 60-4552）（2.6.4.8.7 参

照）の薬物動態を検討した。

表 2.6.4.3- 1 ラット単回投与薬物動態試験の概要

Study type Single dose pharmacokinetics, in vivo study

Bayer reference 4.2.2.2.1 PH-33998, 4.2.2.5.1 PH-33933

Test system Intact and bile duct-cannulated (BDC) rat, 3-5 males/dose group, strain: Wistar

Dosage [14C]riociguata : 1b mg/kg i.v. and 3b mg/kg p.o.

Riociguatc : 0.3 mg/kg i.v. and 0.3, 1 mg/kg p.o.

Vehicle/s i.v. administration : 10% ethanol, 30% PEG 400, 60% aqua demin. (v/v/v)

5 mL/kg, bolus injectionp.o. administration : 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. (v/v/v)

5 mL/kg, gavage

Assay, matrix LSC, HPLC-MS/MS, plasma samples, urine, bile, feces

a = specific activity: MBq/mg; SXD 1494-1-01A, SXD 1494-1-01B, SXD 1494-1-01C, SXD 1494-1-01D

b = Intact and BDC rat

c = batch no.



表 2.6.4.3- 2 イヌ単回投与薬物動態試験の概要

Study type Single dose pharmacokinetics, in vivo study


Test system Dog, 3 females/dose group, strain: Beagle

Dosage [14C]riociguata : 0.3 mg/kg i.v. 0.6 mg/kg p.o.

Riociguatb : 0.03, i.v. and 0.03 and 0.3 mg/kg p.o.

Vehicle/s i.v. administration : 15% Ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. (v/v/v)0.5 mL/kg, infusion (T = 1 h)

p.o. administration : 15% Ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. (v/v/v)1.5 mL/kg, gavage

Assay, matrix LSC, HPLC-MS/MS, plasma samples, urine, feces

a = specific activity: MBq/mg, SXD 1494-1-04A, SXD 1494-1-01D

b = batch no. ,

表 2.6.4.3- 3 [14C]リオシグアト単回投与後の放射能の薬物動態学的パラメータ a

Species Rat Rat Dog Dog

Dose [mg/kg] 1 3 0.3 0.6

Route Intravenous Oral Intravenous Oral

AUC [µg-eq·h/L] 1291 2572 3293 5120

AUCnorm [kg·h/L] 1.29 0.857 11.0 8.53

Ceqmax [µg-eq/L] n.c. c 736 484 358

Ceqmax,norm [kg/L] n.c. c 0.245 1.61 0.596

tmax [h] n.c. c 1.50 1.00 2.88

t1/2 app [h] 1.27 1.19 n.c.c n.c.c

Intervalb [h] 2-8 3-8

t1/2 [h] 8.63 17.1 91.2 85.7

Intervalb [h] 8-30 24-48 48-168 72-168

a = radioactivity concentrations consist of sum of unchanged substance and metabolites

b = used for regression to determine half-life

c = not calculated

Source: 4.2.2.2.1 PH-33998, 4.2.2.2.3 PH-34490



表 2.6.4.3- 4 [14C]リオシグアト又はリオシグアトを静脈内投与した後の未変化体の薬物動態

学的パラメータ

Species Rat Rat Dog Dog

Dose [mg/kg] 0.3 1b 0.03 0.3 b

AUC [µg·h/L] 228 820 95.0 1203

AUCnorm [kg·h/L] 0.760 0.820 3.17 4.01

AUC(0-9) [µg·h/L] n.d.d n.d.d 92.8 n.d.d

AUC(0-9)norm [kg·h/L] n.d.d n.d.d 3.09 n.d.d

CL [L/(h·kg)] 1.32 1.22 0.316 0.249

Vss [L/kg] 1.16 1.23 0.610 0.732

t1/2 app [h] 0.748 0.992 1.66 2.42

Intervala [h] 1-4 1-8 3-9 1-24

MRc n.d.d n.d.d n.d.d 79.6

a = used for regression to determine half-life

b = [14C]riociguat administered

c = metabolic ratio AUCnorm M-1 / AUCnorm riociguat

d = not determined

Source: 4.2.2.2.1 PH-33998, 4.2.2.2.3 PH-34490, 4.2.2.2.2 PH-33934



表 2.6.4.3- 5 [14C]リオシグアト又はリオシグアトを経口投与した後の未変化体の薬物動態学

的パラメータ

Species Rat Rat Rat Dog Dog Dog

Dose [mg/kg] 0.3 1 3d 0.03 0.3 0.6d

AUC [µg·h/L] 79.6 363 1524 55.9 876 1163

AUCnorm [kg·h/L] 0.265 0.363 0.508 1.86 2.92 1.94

AUC(0-8) [µg·h/L] n.d.f n.d.f n.d.f 53.8 734 n.d.f

AUC(0-8)norm [kg·h/L] n.d.f n.d.f n.d.f 1.79 2.45 n.d.f

Cmax [µg/L] 26.7 146 420 16.1 211 205

Cmax,norm [kg/L] 0.0891 0.146 0.140 0.538 0.705 0.342

tmax [h] 1.00 0.500 1.50 1.00 1.44 0.909

t1/2 app [h] 1.42 1.17 1.15 1.50 1.88 3.04

Intervala [h] 2-8 2-8 2-8 3-8 3-8 1.5-8

Fb [%] 34.9g 44.2 62.0 58.0c 79.1c 48.3

MRe [%] n.d.f n.d.f n.d.f n.d.f n.d.f 140


b = calculated with AUCnorm iv of the 1 mg/kg dose (rat) and 0.3 mg/kg dose (dog)

c = bioavailability, calculated with the AUC(0-9)norm value of 0.03 mg/kg i.v. and AUC(0-8)norm

of oral administration

d = [14C]riociguat administered

e = metabolic ratio AUCnorm M-1 / AUCnorm riociguat

f = not determined

g = bioavailability, calculated with the i.v. AUCnorm value of 0.3 mg/kg b.w.

Source: 4.2.2.2.1 PH-33998, 4.2.2.2.3 PH-34490, 4.2.2.2.2 PH-33934

ラット（0.3～1mg/kg）及びイヌ（0.03～0.3mg/kg）に単回静脈内投与したとき、リオシグア

トの薬物動態はおおむね線形性を示した。全身血漿クリアランスの平均値は、ラット

〔1.27L/(kg･h)〕及びイヌ〔0.28L/(kg･h)〕で中等度であった。分布容積の平均値は、ラット

（1.2L/kg）及びイヌ（0.67L/kg）で中等度であった。

ラットに[14C]リオシグアトを経口投与後、尿及び胆汁中に排泄された放射能〔胆汁外排泄（消

化管分泌）を除く〕を静脈内投与後と比較することによって算出した吸収率は、約 60％であっ

た（2.6.4.6.1 参照）。経口及び静脈内投与後の血漿中総放射能 AUC の比に基づき算出した場合、

吸収率はラットで約 66％、イヌで約 78％とほぼ同程度の値が得られた。バイオアベイラビリ

ティは、ラットで中等度（35～65％）であり、イヌではラットよりわずかに高かった（50～

80％）（表 2.6.4.3- 5）。

経口投与後の未変化体曝露量（AUC）は、イヌでは 0.03～0.6mg/kg において、ほぼ用量比例的

に増加したのに対し、ラットでは 0.3～3mg/kg において用量比例性をわずかに上回って増加した。

未変化体及び総放射能の AUC は、ラットと比べてイヌの方が顕著に大きかった。



ラットにおいて、リオシグアト投与後 8 時間までの血漿中消失半減期は、0.7～1.5 時間と短

かった。イヌにおいても、投与後 24 時間までの半減期は約 1.5～3.1 時間と短かった。

終末相における放射能の消失半減期は、イヌでは約 90 時間で、ラットの 9～17 時間と比べて

顕著に長かった。

2.6.4.3.2 反復投与後の薬物動態

参照項目：4.2.3.2.6 PH-34674

4.2.3.2.10 PH-34778

反復投与したときの薬物動態試験は別途実施しなかった。毒性試験の一環として、GLP 試験で

実施したラット及びイヌの曝露量の評価結果を用いて、反復投与後の薬物動態パラメータが計算

可能である（2.6.7 参照）。13 週間投与試験では、リオシグアトと活性代謝物である M-1（BAY

60-4552）の曝露量を評価した。両動物種において、反復投与後の曝露量に明らかな性差はみら

れなかった。イヌに反復投与したとき、リオシグアトの血漿中曝露量に明らかな変化はみられな

かった。一方、ラットに反復投与すると、リオシグアト及び M-1 の AUC(0-24)及び Cmax は、投与

1日目と比べて中等度に増加した。

表 2.6.4.3- 6 反復経口投与薬物動態試験の概要

Study type Toxicokinetics (13-week studies)

Bayer reference 4.2.3.2.6 PH-346744.2.3.2.10 PH-34778

Test system Wistar rat, 3 F and 3M / dose group;

Beagle dog, 4 F and 3M / dose group (4 animals/dose/sex in the recovery group)

Dosage Riociguat:

Rat : 3, 10, 30 mg/kg/dDog : 0.3, 1, 3, mg/kg/d

Vehicle/s Rat : 0.5% tylose suspension

Dog : 0.5% tylose suspension

Assay, matrix HPLC-MS/MS, plasma samples



表 2.6.4.3- 7 ラットにリオシグアトを反復経口投与したときの薬物動態学的パラメータ（91

日目、各時点雌雄各 3匹計 6匹の平均血漿中濃度から算出）

Dose [mg/kg/d] 3 10 30

AUC(0-24) [µg·h/L] 956 3699 10388

AUC(0-24)norm [kg·h/L] 0.319 0.370 0.346

Cmax [µg/L] 174 746 1817

Cmax,norm [kg/L] 0.0578 0.0746 0.0606

C(24)/Cmax [%] 2.05 2.98 2.77

tmax [h] 0.500 0.500 0.500

RA1a [%] 144 317 384

RA3b [%] 94.6 182 160

MRc [%] n.c.d 10.3 11.2

a = Cmax, Day 91 / Cmax,Day 1

b = riociguat AUC(0-24)Day 91 / AUC(0-24)Day 1

c = metabolic ratio AUC(0-24)norm M-1 / AUC(0-24)norm riociguat

d = not calculated

Source: 4.2.3.2.6 PH-34674

ラットにリオシグアトを単回投与後、曝露量はわずかに用量比例性を上回って増加したのに対

して、反復投与後の定常状態（91 日目）におけるリオシグアトの AUC(0-24)及び Cmaxは、おおむ

ね用量比例的に増加した。リオシグアトの定常状態の AUC(0-24)は、中用量及び高用量群におい

て、初回投与時と比べてわずかに高かった（182％及び 160％）。Cmax については、定常状態では

初回投与時よりも高値を示し、その程度は用量の増加に伴って大きくなった（144～384％）。



表 2.6.4.3- 8 イヌにリオシグアトを反復経口投与したときの薬物動態パラメータ（12週目、

雌雄各 4匹の血漿中濃度から算出したパラメータの平均値）

Dose [mg/kg/d] 0.3 1 3

AUC(0-24) [µg·h/L] 483 1721 3702

AUC(0-24)norm [kg·h/L] 1.61 1.72 1.23

Cmax [µg/L] 99.7 302 533

Cmax,norm [kg/L] 0.332 0.302 0.178

C(24)/Cmax [%] 2.25 1.70 4.90

tmax [h] 1.09 1.00 1.00

RA1a [%] 87.3 120 91.2

RA3b [%] 76.1 105 95.8

MRc [%] 108 80.8 70.8

a = Cmax, Week 12 / Cmax,Day 1

b = AUC(0-24)Week 12 / AUC(0-24)Day 1

c = metabolic ratio AUC(0-24)norm M-1 / AUC(0-24)norm riociguat

Source: 4.2.3.2.10 PH-34778

イヌにリオシグアトを反復投与後、定常状態（12 週目）における AUC(0-24)及び Cmax は、0.3

～1mg/kg/日の範囲ではおおむね用量比例的に増加したが、高用量群でわずかに用量比例性を下

回った。反復投与によるリオシグアトの蓄積は認められなかった。M-1 の未変化体に対する曝露

量の比率は、用量の増加に伴ってわずかに低下したが、これは恐らく M-1 の生成が用量の増加と

ともに低下したためと考えられる（表 2.6.4.3- 8 参照）。



2.6.4.4 分布

2.6.4.4.1 血漿たん白結合及び血球移行

参照項目：4.2.2.3.1 PH-33817

4.2.2.3.2 PH-35485

マウス、ラット、ウサギ、イヌ及びヒトの血漿を用いて、リオシグアト約 0.05～2.5mg/L の濃

度範囲における in vitro たん白結合率を評価した。また、[14C]リオシグアトを用いて、ラット、

イヌ及びヒトの赤血球／血漿間におけるリオシグアトの分布を in vitro で検討した（4.2.2.3.1

PH-33817 参照）。

表 2.6.4.4- 1 たん白結合試験の概要

Study type In vitro assay, - ultrafiltration


Test compound [14C]Riociguata

a = SXD 1494-1-01 C = MBq/mg, SXD 1494-1-03 A = MBq/mg,SXD 1494-1-05 A = MBq/mg

表 2.6.4.4- 2 リオシグアトの in vitro 血漿たん白結合率

Species Concentration in plasma [mg/L] fu [%]

Human male, female 0.0492 – 2.37 4.97

Wistar rat male, female 0.0476 – 2.32 15.7

Beagle dog female 0.0503 – 2.36 17.1

Rabbit female 0.0485 – 2.31 4.17

CD-1 mouse male 0.0486 – 2.31 20.1

AGP, α1-acidic glycoprotein (0.7 g/L) 0.0965 – 0.523 22.6 – 25.4

HSA, human serum albumin (40 g/L) 0.0922 – 0.507 19.8 – 21.4

MIXa 0.514 9.94

α-Globulin (12 g/L) 0.0966 63.9

γ-Globulin (10 g/L) 0.0985 84.7

LDL, low density lipoprotein (3 g/L) 0.0972 49.9

Williams Mediumb 0.0496, 0.497, 2.32 26.0, 59.0, 72.4

a = HSA concentration 40 g/L and AGP concentration 0.7 g/L

b = with 10% fetal calf serum

Source: 4.2.2.3.1 PH-33817, 4.2.2.3.2 PH-35485



表 2.6.4.4- 3 非エステル化脂肪酸（NEFA）存在下におけるリオシグアトのヒト血漿たん白結

合率

Species NEFA Concentration [mg/L] fu [%]

Human plasma oleic acid ( 2 mM ) 0.101 1.63

Human plasma palmitic acid ( 2 mM ) 0.0945 1.98

Human plasma stearic acid ( 2 mM ) 0.105 1.88

Human plasma control 0.0993 3.86

Source: 4.2.2.3.2 PH-35485

リオシグアトの血漿たん白結合率は低～中等度で、種差が認められた（4.2.2.3.1 PH-33817

参照）。血漿中非結合型分率（fu）はラット、イヌ及びマウス血漿において約 15～20％で、ヒ

ト及びウサギ血漿において 4～5％であった。リオシグアトは、ヒト血漿において血清アルブミ

ン（fu＝20～21％）及びα1-酸性糖たん白（fu＝23～25％）に結合した。LDL（fu＝50％）、γ-

グロブリン（fu＝85％）、α-グロブリン（fu＝64％）に対する結合率は低かった。NEFA（2mM）

の添加によって結合率が増加、すなわち非結合型分率が約半分に低下した。

表 2.6.4.4- 4 リオシグアトの血球移行性

Species Concentration in plasma [mg/L] Cp / Cb

Human male, female 0.0690-3.58 1.51

Wistar rat male, female 0.0533-2.64 1.10

Beagle dog female 0.0590-2.63 1.15

Source: 4.2.2.3.1 PH-33817

ヒトの血液において、リオシグアトは血漿に多く分布した。ラット及びイヌの血液では、[14C]

リオシグアトは血漿及び血球にほぼ同等に分布した（4.2.2.3.1 PH-33817 参照）。

ヒト血漿におけるリオシグアトのたん白結合に対して、イブプロフェン、ワルファリン、ニ

フェジピン、ジギトキシン、アトルバスタチン、フロセミド、シルデナフィル及びボセンタンは

影響を及ぼさず、リオシグアトの非結合型分率（fu）は変化しなかった。しかし、200mg/L（臨

床濃度）及び 1000mg/L のサリチル酸の添加によって、リオシグアトの fu はそれぞれ 1.5 及び

2.7 倍に増加した（4.2.2.3.2 PH-35485 参照）。

2.6.4.4.2 臓器・組織分布

ラットに [14C]リオシグアトを単回及び反復経口投与したときの、臓器・組織における放射能

の分布を全身オートラジオグラフィーによって検討した。



2.6.4.4.2.1 単回投与後の定性的臓器・組織分布

参照項目：4.2.2.3.3 PH-34473

[14C]リオシグアトを雄性ラット（Wistar 系）に単回経口投与（3mg/kg）又は単回静脈内投与

（1mg/kg）した。また、雌性ラット（Wistar 系）及び雄性有色ラット（Long Evans）に単回経

口投与した。静脈内投与においては投与後 2 時間まで、経口投与においては投与後 7 日まで経時

的に分布パターンを測定した。

表 2.6.4.4- 5 ラットにおける単回投与定性的臓器・組織分布試験の概要

Study type Qualitative, whole body-autoradiography

Bayer reference 4.2.2.3.3 PH-34473

Study design Rat, 1 animal/time point

Admin. route Dosage [14C]riociguata Sex / species Sacrifice time

p.o. 3 mg/kg Wistar rat, male 2, 4, 8, 24, 72, 168 h

p.o. 3 mg/kg Wistar rat, female 2, 24 h

p.o. 3 mg/kg Long Evans rat, male 24 h

i.v. 1 mg/kg Wistar rat, male 5 minutes, 2 h

Vehicles i.v. administration : 10% ethanol, 30% PEG 400, 60% aqua demin.,

5 mL/kg, bolus injection

p.o. administration : 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.,

5 mL/kg, gavage

Assay Radioluminography

a = specific activity: MBq/mg, SXD 1494-1-01B

定性的分布パターンには、投与経路又は雌雄による差は認められなかった。放射能は、脳及び

脊髄以外の臓器・組織におおむね均一に分布し、速やかに消失した。投与 7 日後には、ほぼ完全

に消失したが、大腸内容物、皮膚及び肝臓に極めて低い残留放射能が検出された。Wistar 系

ラットでは、臓器・組織における放射能の不可逆的な結合は認められなかった。有色 Long

Evans ラットでは、メラニン含有組織に対する明らかな特異的親和性が認められた（4.2.2.3.3

PH-34473 参照）。



2.6.4.4.2.2 単回投与後の定量的臓器・組織分布

参照項目：4.2.2.3.4 PH-35543

[14C]リオシグアト 3mg/kg を雄性ラット（Wistar 系）及び雄性有色ラット（Long Evans 系）に

単回経口投与し、臓器・組織における放射能の分布及び消失を全身オートラジオグラフィーによ

り定量的に評価した。

表 2.6.4.4- 6 ラットにおける単回投与定量的臓器・組織分布試験の概要

Study type Quantitative whole body-autoradiography


Study design Wistar rat, 3 animal/time point, Long Evans rat, 1 animal/time point


p.o. 3 mg/kg Wistar rat, male 0.5, 1.5, 4, 8, 24, 72, 168 h

p.o. 3 mg/kg Long Evans rat, male 24, 72, 168, 336 h

Vehicles p.o. administration : 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. (v/v/v),5 mL/kg, gavage


a = specific activity: MBq/mg, SXD 1494-1-05A



表 2.6.4.4- 7 雄性 Wistar 系ラットに[14C]リオシグアトを単回経口投与したときの臓器・組織

中放射能の薬物動態学的パラメータ

truncated evaluation

Organs / tissues Ceqmax[µg-eq/L]

tmax[h]

AUC(0-24)[µg-eq·h/L]

AUC[µg-eq·h/L]

t1/2[h]

Regression range [h]

Adipose tissue, brown 466 1.5 1646 1646 1.44 1.5-8

Adipose tissue, white 210 1.5 668 668 1.62 1.5-8

Adrenal cortex 2429 0.5 9082 9147

Adrenal medulla 889 0.5 2959 2997

Adrenals (average) 2176 0.5 7964 8024

Aorta wall 755 1.5 2822 2869

Blood (heart) 390 1.5 1710 4898 1.69 1.5-8

Bone marrow 319 0.5 1165 1165 1.58 1.5-8

Brain 7.86 0.5 n.c.a n.c.a

Cardiac muscle 542 1.5 2060 2098

Eyes (without wall) 41.6 1.5 224 224 2.28b 4-8

Eye walls 268 0.5 1236 1285

Harderian gland 889 1.5 3557 3598

Kidney cortex 1584 0.5 4959 5156 1.68 1.5-8

Kidney inner medulla 1187 0.5 3966 4028

Kidney outer medulla 2688 1.5 18626 22670 3.76 1.5-8

Kidneys (average) 1798 1.5 10532 12050 2.96 1.5-8

Liver 2829 0.5 13549 27193 2.04 1.5-8

Lungs 407 0.5 1641 3086 1.74 1.5-8

Pancreas 709 0.5 2263 2263 1.49 1.5-8

Seminal vesicles 274 4 1913 2016

Skeletal muscle, dorsal 319 1.5 1128 1128 1.55 1.5-8

Skin, dorsal 371 1.5 1993 n.c.a 2.65 1.5-8

Skin, ventral 313 1.5 2375 n.c.a 2.30b 4-8

Spleen 617 0.5 1754 1754 1.40 1.5-8

Submandibular glands 633 1.5 2319 2345

Testes 78.7 4 509 510 2.45b 4-8

Thymus 346 1.5 1226 1226 1.50 1.5-8

Thyroid 693 1.5 13252 41639 n.c.a

Urinary bladder, wall 523 1.5 2198 2198 1.09b 4-8

Blood (LSC)c 364 1.42 1614 4694 1.85 1.42-7.92

Plasma (LSC)c 423 1.42 1742 1781

a = not calculated, too few concentrations above LLQ or terminally increasing values (skin)

b = rough estimate, due to calculation with 2 time points only

c = samples drawn immediately before sacrifice and measured by liquid scintillation counting(LSC)

Source: 4.2.2.3.4 PH-35543



臓器・組織中放射能は、精嚢及び精巣を除き、経口投与後 0.5～1.5 時間に最高濃度に達した。

Ceqmaxが最も高かったのは、肝臓（血液の 7.3 倍）、副腎皮質（6.2 倍）及び腎髄質外側部（6.9

倍）であった。AUC が最も高かったのは、甲状腺（血液の 8.5 倍）、肝臓（5.6 倍）及び腎髄質

外側部（4.6 倍）であった。大部分の臓器・組織において、放射能は投与 3 日後に定量下限（約

5μg-eq/L）未満となった。放射能の終末相における消失半減期は、大部分の臓器・組織で 30～

50 時間であった。血液中放射能の終末相における消失半減期は 159 時間及び 176 時間と比較的

長かったが、濃度は極めて低かった（5～15μg/L）。眼球壁（t1/2＝114 時間）や有色皮膚（t1/2＝120 時間）などの有色組織では、放射能の顕著な蓄積と消失の遅延が認められた（4.2.2.3.4

PH-35543 参照）。

2.6.4.4.2.3 妊娠ラットに単回投与後の定量的臓器・組織分布（胎盤通過性）

参照項目：4.2.2.3.5 A47081

[14C]リオシグアトを妊娠ラット（Wistar 系、妊娠 19 日目）に 3mg/kg 単回経口投与し、母動

物及び胎児における放射能の臓器・組織分布及び消失を全身オートラジオグラフィーにより定量

的に評価した。

表 2.6.4.4- 8 妊娠ラットにおける単回投与定量的臓器・組織分布試験の概要


Bayer reference 4.2.2.3.5 A47081

Study design Wistar rat pregnant Day 19 of gestation, 1 animal/time point


p.o. 3 mg/kg Wistar rat, female 0.5, 1.5, 4, 8, 24 h

Vehicles p.o. administration: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. (v/v/v), 5 mL/kg, gavage



[14C]リオシグアト投与後、放射能は母動物及び胎児の臓器・組織に均一に分布した。母動物の

臓器・組織の中で、AUC(0-24)が最も高かったのは、肝臓、副腎、腎臓及び羊膜であった。脳の

AUC(0-24)は血液（2751μg-eq･h/L）の 5.4％程度であったが、これを除く大部分の母動物の臓

器・組織は、血液と同程度の曝露量であった。乳腺の曝露量は、母動物の血液と比べて約 3 倍高

かった。定性的に、非常に高い放射能が消化管内容物に認められた。

放射能の血液胎盤関門通過性は中等度であった。胎児の平均 AUC(0-24)は 1528μg-eq･h/L で

あり、母動物の血液の曝露量の約 56％であった。母動物とは対照的に、胎児における血液脳関

門通過性は高かった。胎児の脳における曝露量は、胎児血液の約 46％であり、母動物の脳の曝

露量よりも 4.6 倍高かった。同様に高い AUC(0-24)が、胎児の肝臓（2019μg-eq･h/L）、腎臓

（1951μg-eq･h/L）及び皮膚（1746μg-eq･h/L）で認められた。胎児の肝臓の AUC(0-24)は、母

動物の肝臓の 11.5％であった。

大部分の母動物及び胎児の臓器・組織中放射能濃度の終末相における消失半減期は、おおむね

2～6 時間の範囲と推定された。投与後 24 時間では、母動物及び胎児体内に残留した放射能（消



化管を除く）は低く、総計で投与量の 0.62％、母動物の乳腺で 0.39％、肝臓で 0.12％、胎児で

は 0.02％認められた（4.2.2.3.5 A47081 参照）。

2.6.4.4.2.4 反復投与後の定量的臓器・組織分布

参照項目：4.2.2.3.6 A50424

[14C]リオシグアトをラットに 3mg/kg 反復経口投与（1 日 1 回 14 日間）し（4.2.2.3.6 A50424

参照）、最終投与後 14 日までの臓器・組織中の放射能濃度を測定し、単回投与と比較した

（2.6.4.1.1.1 参照）。

表 2.6.4.4- 9 ラットにおける反復投与定量的臓器・組織分布試験の概要



Study design Wistar rat, 3 animal/time point


p.o. 14 x 3 mg/kg Wistar rat, male 0.5, 1.5, 4, 8, 24, 72, 168, 336 h

Vehicles p.o. administration : 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. (v/v/v),5 mL/kg, gavage



血漿中放射能濃度は少なくとも反復投与 8 日目には定常状態に到達し、血漿中放射能の増加は

単回投与の 2 倍未満で、Ceqminは 9～13μg/L であった。Ceqmaxには投与後 1.5 時間で到達し、反

復投与による明らかな蓄積は認められなかった。血漿中 AUC(0-24)の反復／単回投与の比は、14

日目で 1.7 倍であり、わずかな増加が認められた。血液中 AUC(0-24)の増加は、血漿よりもわず

かに大きく、2.9 倍（LSC）であった。



表 2.6.4.4- 10 雄性 Wistar 系ラットに[14C]リオシグアトを反復投与したとき（14 日目）の臓

器・組織中の放射能の薬物動態学的パラメータ

Organs/tissues Ceqmax[µg-eq/L]

AUC(0-24)[µg-eq·h/L]

truncated evaluation

t1/2Regression range

Adipose tissue, brown 658 2410 1.79 1.5-8

Adipose tissue, white 177 n.c.a 1.65 1.5-8

Adrenal cortex 3120 13700 4.08 4-24

Adrenal medulla 1580 7060 4.85 4-24

Adrenals (average) 2960 13100 4.13 4-24

Aorta wall 1300 5840 4.47 1.5-24

Blood (heart) 594 4490 3.36 1.5-8

Bone marrow 434 1810 2.01 1.5-8

Brain n.c.a n.c.a n.c.a -

Cardiac muscle 728 3170 5.40 4-24

Eyes (without wall) 58.9 486 3.82 1.5-8

Eye walls 404 1820 1.95 1.5-8

Harderian gland 1030 4710 5.27 4-24

Kidney cortex 2490 11700 2.10 1.5-8

Kidney, inner medulla 1670 8110 4.82 4-24

Kidney, outer medulla 3650 31900 5.71 1.5-8

Kidneys (average) 2640 18100 3.68 1.5-8

Liver 4200 28700 2.85 1.5-8

Lungs 587 3590 2.61 1.5-8

Pancreas 892 3440 1.77 1.5-8

Seminal vesicles 300 2650 6.14 4-24

Skeletal muscle, dorsal 323 n.c.a 2.06 1.5-8

Skin, dorsal 402 2510 3.31 1.5-8

Skin, ventral 315 2250 2.64b 4-8

Spleen 958 4010 1.76 1.5-8

Submandibulary gland 753 3060 4.31 4-24

Testes 98.4 n.c.a 9.35b 4-8

Thymus 403 n.c.a 1.93 1.5-8

Thyroid 751 3850 2.38 1.5-8

Urinary bladder, wall 538 2510 2.25 1.5-8

Blood (LSC)c 596 4460 3.17 1.5-8

Plasma (LSC)c 663 2850 1.97 1.5-8

a = not calculated

b = rough estimate, due to regression with only 2 time points

c = liquid scintillation counting (LSC)

Source: 4.2.2.3.6 A50424



大部分の臓器・組織中の最高放射能濃度（Ceqmax）は、血液と同程度であったが、肝臓、腎臓

（特に髄質外側部）及び副腎皮質において、血液より 5～7 倍高い放射能が認められた。全体的

にみて、分布パターンは、単回投与とほぼ同様であった。血液と比べて、14 日目の AUC(0-24)が

最も高かったのは、腎髄質外側部（7.1 倍）、肝臓（6.4 倍）、副腎皮質（3.1 倍）及び腎皮質

（2.6 倍）であった。大部分の臓器・組織の曝露量は、血液と同程度であった。脳、白色脂肪、

骨格筋、精巣及び胸腺における放射能濃度は、投与後 4～24 時間に定量下限未満となった。これ

らの所見は、放射能の血液脳関門通過性及び血液精巣関門通過性が低いことを示している。反復

／単回投与の蓄積比は、Ceqmaxで 2 倍未満、AUC(0-24)では 3 倍未満であり、すべての臓器・組織

において蓄積は低い傾向を示した。最も高い蓄積比を示したのは、血液（2.6 倍、ARG）及び血

流量の多い臓器・組織であった。見かけの半減期を投与後 1.5～24 時間の範囲で算出したが、反

復投与による見かけの消失半減期の増大は、精巣（3.8 倍）を除いて 2 倍未満であった。終末相

（投与後 24～336 時間）において、血液、大動脈壁、骨髄、心筋、腎髄質、肺、腹部の皮膚、脾

臓、精巣及び甲状腺の放射能の消失は極めて遅く、半減期は 200 時間以上で、血液では 335

（LSC）及び 584 時間（ARG）であった（血漿は 48 時間）。終末相における放射能の消失半減期

は、見かけ上、単回投与と比べて長かったが、半減期の算出に用いた時間範囲が単回投与とは異

なり、また、限られた測定時点に基づくものであることから、算出値の精度が低いことを考慮す

る必要がある。しかし、ラット血液中放射能の消失遅延は単回投与でも同様に認められており、

恐らくグルタチオン抱合体及びその分解物の血球からの消失が遅いことに起因すると考えられる4)。In vitro 及び in vivo 試験において、グルタチオン抱合体及びその分解物はラットでのみ確

認されており（4.2.2.4.8 PH-35341 Version 2 参照）、グルタチオン抱合体が生成されないヒ

トにおいては、このような血液中放射能の消失遅延は認められなかった（4.2.2.4.10 PH-35338

Version 3 参照）。

反復投与後 24 時間における放射能濃度〔Ceq(24)〕は、大部分の臓器・組織で単回投与後の約

2～4 倍、血液及び脾臓では、6～7 倍に増加した。反復投与後 336 時間において、いくつかの臓

器・組織中には、Ceqmax の約 0.5％（副腎及び心筋）～11％（血液）の濃度の放射能が認められ

た。反復投与後 336 時間において、体内に残留した放射能は、単回投与量の 0.34％と低く、主

に血液（0.15％）及び肝臓（0.11％）に認められた。

反復投与後 24 時間以内に、尿中に単回投与量の 22.5％の放射能が、糞中には明らかに最終投

与以前に投与された放射能を含む 158％が排泄された。単回投与と同様に、胆汁／糞を介した排

泄が主な排泄経路であった（2.6.4.6.1 参照）。



表 2.6.4.4- 11 雄性 Wistar 系ラットに[14C]リオシグアト（3mg/kg）を単回及び 14 回経口投与

したときの臓器・組織中放射能の蓄積比

Ratio repeated/single Ratio AUC(0-24) Ratio Ceqmax Ratio Ceq(24)

Sample

Adipose tissue, brown 1.46 1.41 n.c. a

Adipose tissue, white n.c. a 0.841 n.c. a

Adrenal cortex 1.51 1.28 2.80

Adrenal medulla 2.39 1.78 4.59

Adrenals (average) 1.65 1.36 3.03

Aorta wall 2.07 1.72 2.88

Blood (heart) 2.63 1.52 6.29

Bone marrow 1.55 1.36 n.c. a

Brain n.c. a n.c. a n.c. a

Cardiac muscle 1.54 1.34 2.89

Eyes (without wall) 2.17 1.42 n.c. a

Eye walls 1.47 1.51 1.12

Harderian gland 1.32 1.16 3.41

Kidney cortex 2.36 1.57 3.32

Kidney, inner medulla 2.04 1.41 3.62

Kidney, outer medulla 1.71 1.36 1.98

Kidneys (average) 1.72 1.47 2.03

Liver 2.12 1.48 2.86

Lungs 2.19 1.44 4.49

Pancreas 1.52 1.26 n.c.a

Seminal vesicles 1.39 1.09 1.63

Skeletal muscle, dorsal n.c. a 1.01 n.c. a

Skin, dorsal 1.26 1.08 3.22

Skin, ventral 0.947 1.01 1.33

Spleen 2.29 1.55 6.90

Submandibulary gland 1.32 1.19 2.02

Testes n.c. a 1.25 n.c.a

Thymus n.c. a 1.16 n.c.a

Thyroid 0.291 1.08 0.0879

Urinary bladder, wall 1.14 1.03 n.c.a

Blood (LSC)b 2.93 1.32 10.1

Plasma (LSC)b 1.65 1.19 2.44

a = not calculated

b = liquid scintillation counting (LSC)

Source: 4.2.2.3.6 A50424



2.6.4.5 代謝

動物及びヒトの肝ミクロソーム、肝細胞及びリコンビナント CYP 又はグルクロン酸転移酵素を

用いてリオシグアトの in vitro における代謝を検討した。また、マウス、ラット、イヌ及びヒ

トにおいて、リオシグアトの in vivo 代謝を検討した。in vivo 及び in vitro での検討に基づ

く推定代謝経路を図 2.6.4.5- 1に示す。

O

O

NH2

NNH2

N

NN

NN

F

O

O

NH2

NHNH

2

N

NN

NN

F

O

O

NH2

NNH

2

N

NN

NH

N

OO

OH

OH

OH

OH

O

O

NH

NHNH

2

N

NN

NN

F

OH

O

O

NH2

NNH2

N

NN

NN

F

OH

O

O

NH2

NNH

2

N

NN

NN

F

O

O

NH2

NNH2

N

NN

NN

FOH

NH2

NH2

NH2

N

NN

NN

F

O

RiociguatBAY 63-2521

M-1 M-3

M-11M-10M-9M-6/M-7

M-4BAY 1077251

Conjugate: M-8 (glucuronide)

Glutathione derivatives and their degradation products:M-13, M-14, M-15, M-16,M-17 and M-19

Conjugates: M-18 (glucuronide)M-21 (sulfate)

Conjugate:M-12 (glucuronide)

Conjugate:M-20 (sulfate)

BAY 60-4552

図 2.6.4.5- 1 リオシグアトの推定代謝経路

2.6.4.5.1 In vitro における代謝

リオシグアトを肝ミクロソーム及び肝細胞とインキュベーションし、ヒトと動物の代謝プロ

ファイルを比較した。また、リオシグアトのヒトの代謝に関与する酵素を同定した。HPLC-MS、

HPLC-MS/MS 及び NMR を用いて代謝物の構造を解明した。更に、リオシグアトの CYP、グルクロン

酸転移酵素（UGT）及び硫酸転移酵素（SULT）に対する阻害作用並びに CYP 誘導作用による薬物

相互作用の可能性について in vitro で検討した。リオシグアトが併用薬によって薬物相互作用

を受ける可能性を検討した in vitro 試験については、2.6.4.7に示す。



2.6.4.5.1.1 動物種の比較

参照項目：4.2.2.4.1 A50539 Version 2

表 2.6.4.5- 1 動物種の比較試験の概要

Study type In vitro assays

Bayer reference 4.2.2.4.1 A50539 Version 2

Test material Liver microsomal preparations from man (pool), Cynomolgus monkey, Beagle dog, Himalaya rabbit, Wistar rat, CD-1 mouse, NMRI mouse

Hepatocytes of Wistar rat, Beagle dog and man

Test compound [14C]Riociguat

表 2.6.4.5- 2 [14C]リオシグアト（1μM）をヒト及び動物の肝ミクロソームとインキュベー

ションしたときの代謝物組成（たん白濃度 1mg/mL、60 分）

Species Man Cynomolgus Wistar rat Beagle NMRI Himalaya CD-1

Metabolite (pool) Monkeya male female dogb mousea rabbitb mousea

M-1 8.3 30.7 4.7 0.3 9.6 10.2 16.4 11.9

M-3 traces 0.7 0.8 0.1 0.1 0.2 0.1

M-9 2.8 4.7 0.3 0.3 1.6 1.8

M-10 1.5 0.8 0.1 0.3 0.1 0.3

M-11 4.3 1.1 0.1 0.3 0.3 0.4

Riociguat 90.6 53.6 87.4 95.9 88.4 86.9 81.8 83.1

Source: 4.2.2.4.1 A50539 Version 2

a = male, b= female

[14C]リオシグアトをヒト及び動物の肝ミクロソームとともにインキュベーションしたところ、

すべての動物種において、M-1（BAY 60-4552）を生成する N-脱メチル化が主代謝経路として認

められた。雄性ラットの肝ミクロソームにおいては、M-1 の生成に加えて、M-9、M-10 及び M-11

を生成するフルオロベンジル基の水酸化が主代謝経路として認められた。N-脱ベンジル化による

代謝物 M-3 の生成は、すべての動物種において、割合の少ない代謝経路であった。



表 2.6.4.5- 3 [14C]リオシグアト（1μM）をヒト及び動物の肝細胞とインキュベーションした

ときの代謝物組成（4時間）

Speciesa

Metabolite

Man Man Rat Rat Dog

M-1 4.2 16.0 13.8 20.5 24.6

M-3 0.2 0.3 9.6 8.8 1.0

M-4 0.3 0.5 1.1 0.8

M-6/M-7 3.6 2.4

M-8 2.4 2.9 2.5

M-12/M-17 5.1 3.3 0.9 (M-12)

M-15 20.6 11.8 0.9

Riociguat 95.6 81.1 13.8 28.7 70.6

a = two different hepatocyte preparations of man and rat


[14C]リオシグアトを Wistar 系ラット、ビーグル犬及びヒトの新鮮肝細胞とともにインキュ

ベーションした。全体としてみれば、肝細胞における第Ⅰ相代謝には肝ミクロソームと同様の種

差が認められた。イヌ及びヒトの肝細胞における主代謝経路は、M-1 の生成であった。割合は少

ないが、M-8 及び M-4 を生成する未変化体及び M-1 のグルクロン酸抱合並びに M-3 を生成する N-

脱ベンジル化も認められた。

ラットの肝細胞においては、M-1 及び M-3 を生成する脱アルキル化に加えて、M-9、M-10 及び

M-11 を生成するフルオロベンジル基の水酸化が主代謝経路として認められた。続いて、これら

の代謝物から、硫酸抱合体、グルクロン酸抱合体（M-12 など）及びグルタチオン抱合体（M-15

など）が生成し、結果として、ラットでは複雑な代謝パターンを示した（4.2.2.4.1 A50539

Version 2 参照）。

[14C]リオシグアトの in vitro 代謝において、ヒト特異的な主代謝経路は認められなかった。

これらの結果は、[14C]リオシグアトを用いたラット、イヌ及びヒトの in vivo 試験における代謝

プロファイルと極めてよく一致していた（4.2.2.4.8 PH-35341 Version 2、4.2.2.4.9 A49675

Version 3、4.2.2.4.10 PH-35338 Version 3 参照）。



2.6.4.5.1.2 代謝に関与する CYP 酵素の同定

参照項目：4.2.2.4.2 A51309 Version 2

表 2.6.4.5- 4 CYP 酵素同定試験の概要

Study type In vitro assay, CYP isoforms involved


Test material Human liver microsomes (pool), human intestinal microsomes (pool), human lung microsomes (smoker, non-smoker) (pool), human kidney microsomes (pool) recombinant human isoforms: CYP1A1, 1B1, 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C18, 2C19, 2D6, 2E1, 2J2, 3A4, 3A5, 3A7, 4A11, 4F2, 4F3A, 4F3B, 4F12

Test compound Riociguat

ヒトにおいて、リオシグアトは一次酸化反応である N-脱メチル化を受けて、主代謝物 M-1 を

生成し、更にグルクロン酸抱合を受ける。全体としてみると、この酸化反応による代謝及び未変

化体としての排泄が、ヒト in vivo におけるリオシグアトのクリアランスに対して寄与が大きい

（4.2.2.4.10 PH-35338 Version 3 参照）。

M-1 を生成するリオシグアトの N-脱メチル化に関与する CYP 分子種を同定するために、CYP 分

子種の選択的阻害剤の存在下及び非存在下において、ヒト肝、小腸及び肺ミクロソームとのイン

キュベーションを行った。更に、リコンビナントヒト CYP とのインキュベーションを実施した。

なお、ヒト腎ミクロソームでは、リオシグアトの代謝物生成量は少なかった。

20 種のリコンビナント CYP 分子種のうち、CYP1A1 による M-1 生成の触媒効率が最も高かった。

CYP2C8、2J2、3A4 及び 3A5 にも少しではあるが M-1 生成能が認められた。

リコンビナント CYP1A1、2C8、2J2 及び 3A4 を用いて、M-1 生成の速度論的パラメータを算出

した。リオシグアトとの親和性は、CYP1A1 で非常に高かった。CYP1A1、2C8 及び 2J2 の Km 値は、

それぞれ 1.1μM、22.4μM 及び 11.0μM であった。CYP3A4 については、検討した濃度範囲にお

いて、最大速度を得られなかったため、Km値の算出はできなかった。

ヒト肝ミクロソームにおいて、CYP3A4/5 阻害剤アザムリン（対照群の 82％）、CYP2C8 阻害剤

モンテルカスト（78％）及び CYP2J2 阻害剤 HET0016（83％）は M-1 の生成を同程度抑制し、こ

れらの CYP 分子種の M-1 生成に対する寄与が同程度であることが示された。ケトコナゾール及び

ケルセチン（非選択的 CYP 阻害剤）は、M-1 の生成をそれぞれ対照群の 42％及び 36％に抑制し、

CYP1A1 及び 1A2 の阻害剤5)であるα-ナフトフラボンは、対照群の 61％に抑制した。CYP1A2 阻害

剤6)としてよく知られているフルボキサミンは、ヒト肝ミクロソームにおける M-1 生成に影響を

与えなかった。

ヒト小腸ミクロソームにおいて、CYP3A4/5 阻害剤アザムリン及び CYP2J2 阻害剤 HET0016 は、

M-1 の生成を同程度抑制した（対照群の 39％）ことから、両 CYP 分子種の M-1 生成に対する寄与

が同程度であることが示された。



非喫煙者と比べて、喫煙者の肺ミクロソームでは、M-1 の生成が特に顕著であった。喫煙者の

肺ミクロソームにおける M-1 生成は、CYP1A1 阻害剤であるα-ナフトフラボン及び 7-ヒドロキシ

フラボンによって顕著に抑制された（＞80％抑制）。ヒト CYP1A1 は肝臓及び小腸に加え、肺に

も発現しており、喫煙者ではタバコ煙によって肺における発現が誘導されることが知られている7),8)。

M-1 を生成するリオシグアトの N-脱メチル化は、肝臓及び小腸に存在する複数の CYP 分子種

CYP2C8、2J2 及び 3A4/5 によって触媒された。加えて、CYP1A1 によっても M-1 の生成は触媒され

た。Nakamura9)らは、ヒト肝における CYP1A1 が、グラニセトロンの代謝に寄与していることを報

告している。フルボキサミン（CYP1A2 阻害剤）を用いた in vitro 試験の結果から、M-1 の生成

に CYP1A2 が寄与しないことが明らかとなり、更にα-ナフトフラボン（CYP1A1/1A2 阻害剤）に

よって M-1 の生成が阻害されたことから、肝ミクロソームにおけるリオシグアトの代謝には、

CYP1A1 の寄与が大きいことが示された。

CYP1A1 はヒトにおいて非常に誘導されやすい酵素である。喫煙者の肺ミクロソームにおける

M-1 生成の触媒活性が非喫煙者と比べて 2～3 倍高いという in vitro の所見は、リオシグアトの

酸化代謝及び総クリアランスにおける CYP1A1 の重要性を裏付けるものである。このことは、臨

床試験で、喫煙者におけるリオシグアトの総クリアランスが、非喫煙者と比べて高かったことと

矛盾しない（4.2.2.4.2 A51309 Version 2、5.3.3.4.3 PH-35000 参照）。

2.6.4.5.1.3 CYP 酵素に対する阻害作用

参照項目：4.2.2.4.3 PH-33080 Version 4

表 2.6.4.5- 5 CYP 阻害作用試験の概要

Study type In vitro assay, CYP inhibition

Bayer reference 4.2.2.4.3 PH-33080 Version 4

Test system Human liver microsomes (pool), recombinant isoforms: CYP1A1, CYP2E1


CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2D6、2E1、2J2 及び 3A4 活性に対するリオシグアトの阻害作用

は認められず、IC50値は＞50μM であった。リオシグアトを NADPH 添加ヒト肝ミクロソームと 30

分間プレインキュベーションしても、CYP3A4 活性の低下は認められなかった（IC50 値：＞50μM、

ミダゾラムの 1’-水酸化、テストステロンの 6β-水酸化）ことから、CYP3A4 に対する時間依存的

な阻害作用はないと考えられる。CYP2C19 活性に対しては、わずかに阻害作用が認められた。リ

オシグアトは CYP1A1 活性を強く阻害し、Ki値は 0.6 及び 1.2μM（基質として、それぞれフェナ

セチン及びエトキシレゾルフィンを使用）であった（4.2.2.4.3 PH-33080 Version 4 参照）。



表 2.6.4.5- 6 リオシグアトの CYP 分子種に対する阻害作用

CYP isoform

Probe reaction Enzyme source IC50

[µM]Ki

[µM]

1A1 Ethoxyresorufin O-deethylation Recombinant 14.7 1.2

1A1 Phenacetin O-deethylation Recombinant 0.84 0.56

1A2 Phenacetin O-deethylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2A6 Coumarin 7-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2B6 Bupropion hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2C8 Amodiaquine N-deethylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2C9 Diclofenac 4’-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2C19 Mephenytoin 4’-hydroxylation Human liver microsomes 44.4 n.d.a

2D6 Dextromethorphan O-demethylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2E1 Chlorzoxazone 6-hydroxylation Recombinant > 50 n.d.a

2J2 Ebastine tert-butyl-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

3A4 Midazolam 1’-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

Midazolam (30 min preincubation) Human liver microsomes > 50 n.d.a

3A4 Testosterone 6β-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

Testosterone (30 min preincubation) Human liver microsomes > 50 n.d.a

a = not determined

Source: 4.2.2.4.3 PH-33080 Version 4

肺高血圧症患者に 1日 3回 2.5mg を反復経口投与したときの最高血漿中濃度（Cmax）である 200

μg/L（0.5μM：5.3.3.5.3 PH-36006 参照）を基準に考えると、リオシグアトは CYP1A2、2A6、

2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1、2J2 及び 3A4 に対して阻害作用を示さなかった。CYP1A1 を介

した代謝によって消失する併用薬と臨床的に問題となる薬物相互作用が起こる可能性は否定でき

ないが、主に CYP1A1 によって消失する薬物は、グラニセトロン9)又はエルロチニブ10)など、現在

のところ稀である。



2.6.4.5.1.4 UGT（グルクロン酸転移酵素）に対する阻害作用

参照項目：4.2.2.4.4 PH-35972 Version 2

表 2.6.4.5- 7 UGT 阻害作用試験の概要

Study type In vitro assay, UGT inhibition


Test system Human liver microsomes (pool)


ヒト UDP-グルクロン酸転移酵素（UGT）分子種の UGT1A1、1A4、1A6、1A9 及び 2B7 に対するリ

オシグアトの阻害作用を in vitro で検討した（表 2.6.4.5- 8）。

表 2.6.4.5- 8 リオシグアトのグルクロン酸抱合に対する阻害作用

UGT isoform Substrate IC50

[M]

Ki

[M]

Various 17β-Estradiol (analyte estradiol 17-glucuronide)

> 50 n.d.a

1A1 17β-Estradiol (analyte estradiol 3-glucuronide)

> 50 n.d.a

1A4 Trifluoperazine > 50 n.d.a

1A6 α-Naphthol > 50 n.d.a

1A9 Propofol > 50 n.d.a

2B7 3’-Azido-3’-deoxythymidine > 50 n.d.a

a = not determined


UGT1A1、1A4、1A6、1A9 及び 2B7 のグルクロン酸抱合活性は、リオシグアトによって阻害され

なかった（IC50値：＞50μM）。

要約すると、リオシグアトは、ヒト UGT 分子種に対して阻害作用を示さなかったことから、

UGT を阻害することによって、臨床的に問題となる薬物相互作用は起こらないと考えられる。



2.6.4.5.1.5 SULT（硫酸転移酵素）に対する阻害作用

参照項目：4.2.2.4.5 A56475

表 2.6.4.5- 9 SULT 阻害作用試験の概要

Study type In vitro assay, SULT inhibition


Test system Human liver cytosol (pool)


表 2.6.4.5- 10 リオシグアトの硫酸抱合に対する阻害作用

SULT isoform Substrate IC50

[µM]Ki [µM]

Various, predominantly SULT1E1 17β-Estradiol >50 n.d.a

Various, predominantly SULT1E1 17α-Ethinylestradiol >50 n.d.a

a = n.d. - not determined

Source: 4.2.2.4.5 A56475

3’-ホスホアデノシン-5’-ホスホ硫酸（PAPS）添加系ヒト肝サイトゾルにおいて、17β-エスト

ラジオール及び 17α-エチニルエストラジオールを複数濃度のリオシグアトとインキュベーショ

ンし、硫酸抱合体の生成量を測定した。リオシグアトは、SULT 分子種、特に 17β-エストラジ

オール及び 17α-エチニルエストラジオールの硫酸抱合に関与する SULT1E1 に対して、阻害作用

を示さず、IC50値は＞50μM であった。

要約すると、リオシグアトは、ヒト SULT 分子種に対して阻害作用を示さず、17β-エストラジ

オール及び 17α-エチニルエストラジオールの硫酸抱合の阻害を含む SULT の阻害によって、臨

床的に問題となる薬物相互作用は起こらないと考えられる。



2.6.4.5.1.6 酵素誘導

参照項目：4.2.2.4.6 PH-35817 Version 3

表 2.6.4.5- 11 酵素誘導作用試験の概要

Study type In vitro assay, induction of CYP1A2, 2B6, 2C19 and 3A4


Test system Cultured human hepatocytes

Test compound Riociguat (5 – 10000 ng/mL)

異なる 3 例のドナーから得られた培養ヒト肝細胞を用いて、ヒト CYP 分子種のうち CYP1A2、

2B6、2C19 及び 3A4 に対するリオシグアトの誘導作用を検討した（表 2.6.4.5- 12）。この試験

において、リオシグアトを 1111μg/L の濃度まで繰り返して曝露させても、ヒト CYP1A2、2B6、

2C19 及び 3A4 活性に対する誘導作用は認められなかった。それに対し、陽性対照のオメプラ

ゾール及びリファンピシンでは、予測された誘導剤に特異的な CYP 酵素活性の変化が認められた。

この in vitro 試験の条件下では、1000μg/L を上回るリオシグアト濃度で、3 例中 1 例のド

ナーにおいて CYP3A4 活性の亢進が、3 例中 2 例のドナーにおいて CYP2B6 活性の亢進が認められ

た。（4.2.2.4.6 PH-35817 Version 3 参照）

表 2.6.4.5- 12 リオシグアトの酵素誘導作用

CYP Result

1A2, 2C19 No induction

2B6, 3A4 No induction up to 1111 g/L


これらの結果より、リオシグアトは、CYP1A2 及び CYP2C19 を誘導しないと判断され、CYP2B6

及び CYP3A4 については、1111μg/L の濃度まで誘導しないと判断された。肝細胞培養液中の非

結合型分率（72.4％）に基づいて補正すると、1111μg/L は非結合型濃度として 800μg/L に相

当する（4.2.2.3.1 PH-33817 参照）。ヒト血漿中におけるリオシグアトの非結合型分率 5％を

用いて、肝細胞培養液中の非結合型濃度 800μg/L に相当する血漿中濃度を算出すると 16000μ

g/L となり、これは臨床試験（5.3.3.5.3 PH-36006 参照）において、リオシグアトの有効用量

である 2.5mg を 1 日 3 回反復経口投与したときの最高血漿中濃度（Cmax）より 80 倍以上高い濃度

である（Cmax 200μg/L、Cmax,u 10μg/L）。

したがって、CYP1A2、2B6、2C19 及び 3A4 の誘導によって、臨床的に問題となる薬物相互作用

が起こる可能性は低いと考えられる（4.2.2.4.6 PH-35817 Version 3 参照）。



2.6.4.5.2 In vivo 代謝

参照項目：4.2.2.4.7 PH-36012 Version 2

4.2.2.4.8 PH-35341 Version 2

4.2.2.4.9 A49675 Version 3

4.2.2.4.10 PH-35338 Version 3

雄性 CD-1 系マウス（4.2.2.4.7 PH-36012 Version 2 参照）、雄性 Wistar 系ラット

（4.2.2.4.8 PH-35341 Version 2 参照）、雌性ビーグル犬（4.2.2.4.9 A49675 Version 3 参

照）及びヒト（4.2.2.4.10 PH-35338 Version 3 参照）におけるリオシグアトの in vivo 代謝を

検討した。

マウス、ラット及びイヌに反復投与したときのリオシグアト及び M-1 の曝露量は、2.6.6.3

（表 2.6.6.3-1～2.6.6.3-12）に要約した。ラット及びイヌ血漿中代謝プロファイル試験の概要

は、2.6.4.3.1に記載した。

表 2.6.4.5- 13 マウス血漿中代謝プロファイル試験の概要

Study type In vivo


Test system Mouse, 3 male / time point, strain: CD-1

Dosage [14C]Riociguata : 3 mg/kg

Vehicle p.o. administration: 15% ethanol, 45% PEG 400 and 40% aqua demin., 5 mL/kg, gavage

Time points / samples 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 8, 24, 32, 48 h / plasma


表 2.6.4.5- 14 ヒト[14C]リオシグアト投与試験の概要

Study type In vivo


Test system Healthy subjects, 4 male

Dosage [14C]Riociguata: p.o.: 1.04 to 1.09 mg

Vehicle Riociguat oral solution, PEG based diluent, approximately 2 mL

Time points / samples Plasma : 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 24, 48,72, 96, and 120 h

Urine : 0-4, 4-8, 8-12, 12-24, 24-48, 48-72, and 72-96 hFeces : 0-24, 24-48, 48-72, 72-96, 96-120, and 120-144 h

a = specific activity: MBq/mg



表 2.6.4.5- 15 [14C]リオシグアトを雄性 CD-1 系マウス、雄性 Wistar 系ラット、雌性ビーグル

犬及びヒトに単回投与したときの血漿中代謝物組成

Species Mouse Rat Dog Man

Dose 3 mg/kg 3 mg/kg 0.6 mg/kg 1.04 – 1.09 mg

Analyzed interval 0 – 24 h 0 – 24 h 0 – 24 h 0 – 48 h

Subj. 1-3 Subj. 4

Component % of AUC (total radioactivity)

Riociguat 74.8 75.0 38.3 26.1-39.8 73.6

M-1 16.6 9.50 56.3 41.9-59.0 10.5

M-4 8.40-25.6 6.14

Source: 4.2.2.4.7 PH-36012 Version 2 (CD1-mouse); 4.2.2.4.8 PH-35341 Version 2 (Wistar rat);4.2.2.4.9 A49675 Version 3 (Beagle dog); 4.2.2.4.10 PH-35338 Version 3 (human)

マウス及びラットに[14C]リオシグアトを単回経口投与したときの血漿中放射能の主成分は未変

化体であった（総放射能 AUC の 75％）。また、ヒトに単回投与したとき、4 例中 1 例（被験者

4）の血漿中放射能の主成分は未変化体（74％）であったが、被験者 1～3（26～40％）及びイヌ

（38％）では、未変化体が総放射能 AUC に占める割合は低かった（表 2.6.4.5- 15）。

代謝物 M-1 は、ヒト血漿中の主代謝物であり（被験者 1～3：総放射能 AUC の 42～59％、被験

者 4：11％）、イヌ（56％）、マウス（17％）及びラット（10％）の血漿中においても同様で

あった。M-1 の N-グルクロン酸抱合体である代謝物 M-4（BAY 1077251）は、ヒト血漿中の総放

射能 AUC の 6～26％を占めたが、他の動物の血漿中では認められなった。

ヒトにおいて認められたリオシグアト及び M-1 の AUC の大きな個体間変動は、主にリオシグア

トの総クリアランスに対する寄与が大きい CYP1A1 の関与によって説明できると考えられる

（2.6.4.5.1.1 参照）。CYP1A1 は、タバコ煙、炭火焼肉及びアブラナ科の野菜などによって非

常に誘導されやすい酵素である11)。



表 2.6.4.5- 16 [14C]リオシグアトを Wistar 系ラット、ビーグル犬及びヒトに単回経口投与し

たときの排泄物中代謝物組成

Species Rat Dog Man

Dose 3 mg/kg 0.6 mg/kg 1.04 – 1.09 mg

Sampling interval 0 – 48 h 0 – 72 h 0 – 96 / 144 h

Male Female Subj. 1-3 Subj. 4

Components % of dose

Urine

Riociguat 4.39 7.82 1.37 4.49 – 7.58 19.1

M-1 1.66 2.09 6.33 18.9 – 23.1 7.36

M-3 0.590 0.275 2.10 1.53 – 1.63 0.421

M-4 7.52 – 18.9 4.42

M-6/M-7 1.82 2.54

Feces

Riociguat 36.6 40.5 7.50 9.03 – 17.5 43.8

M-1 4.07 3.93 35.4 31.2 – 42.7 14.8

M-3 0.768 2.64

M-4 7.07

M-6/M-7 5.12 4.36

M-9 20.1 19.1 3.09

M-10 5.74 5.28 4.51

M-11 1.40 1.49

M-23 2.78

M-24 6.92

Source: 4.2.2.4.8 PH-35341 Version 2 (Wistar rat); 4.2.2.4.9 A49675 Version 3 (Beagle dog); 4.2.2.4.10PH-35338 Version 3 (human)

ラット及びイヌに[14C]リオシグアトを経口投与したとき、放射能は主に胆汁／糞中に排泄され

た（いずれも投与量の 82％）（4.2.2.4.8 PH-35341 Version 2、4.2.2.4.9 A49675 Version 3、

2.6.4.6 参照）。ヒトにおいては、放射能の腎排泄（33～45％）及び胆汁／糞中排泄（48～

59％）はほぼ同程度であった（4.2.2.4.10 PH-35338 Version 3 参照）。

ヒトに[14C]リオシグアトを投与後、4 例中 1 例（被験者 4）において、M-1 の生成が他の 3 例

に比べて顕著に低かった。血漿中放射能 AUC に占めるリオシグアトの割合は、被験者 1～3 にお

いて 26～40％であったのに対して、被験者 4 では 74％であった。また、血漿中放射能 AUC に占

める M-1 の割合は、被験者 1～3 において 42～59％であったのに対し、被験者 4 では 11％であっ

た。



血漿中における所見と矛盾することなく、被験者 4 では投与量の 63％、被験者 1～3 では投与

量の 14～22％が未変化体として排泄された。M-1 を生成する経路（M-1 及びそのグルクロン酸抱

合体 M-4 の合計）が寄与する割合は、被験者 1～3 においては 68～71％であったが、被験者 4 で

は 27％に過ぎなかった。このような個体間差は、リオシグアトのクリアランスにおける CYP1A1

の寄与が異なるためと考えられる。

ラット糞中放射能の主成分は、未変化体（雄及び雌でそれぞれ投与量の 37％及び 41％、以下

同様）及び水酸化体 M-9（投与量の 20％及び 19％）であった。ラット尿中では、未変化体（投

与量の 4％及び 8％）、M-1（投与量の約 2％）及び M-6/M-7（投与量の約 2％）が、放射能の大

部分を占めた。

イヌの糞中には、未変化体が投与量の 8％排泄され、M-1 及びそのグルクロン酸抱合体 M-4 の

排泄量は、合わせて投与量の 42％であった。イヌの尿中放射能の大部分は M-1 が占め（投与量

の 6％）、未変化体は投与量の 1％であった。

リオシグアトのフルオロベンジル基の水酸化代謝物（M-9、M-10 及び M-11）には、顕著な動物

種差が認められた。雄性ラット糞中には、M-9、M-10 及び M-11 がそれぞれ投与量の 20.1％、

5.7％及び 1.4％が排泄された。イヌの糞中には、M-9 及び M-10 がそれぞれ投与量の 3.1％及び

4.5％認められたが、ヒトでは M-9、M-10 及び M-11 は検出されなかった。M-1 のフルオロベンジ

ル基が水酸化された代謝物（M-23 及び M-24）はイヌの糞中においてのみ検出され、それぞれ投

与量の 2.8％及び 6.9％であった。N-アセチル化代謝物 M-6/M-7 は、ラット糞中の微量代謝物で

あったが（雄性ラットで 5.1％）、イヌ及びヒトの糞中では検出されなかった。

以上を要約すると、M-1 を生成する N-脱メチル化は、ヒト及びイヌの主代謝経路であり、ヒト

では M-1 の N-グルクロン酸抱合体 M-4 の生成も認められた。ラットでは M-1 生成に加えて、フ

ルオロベンジル基の水酸化（M-9、M-10 及び M-11 を生成）及びそれに続く第Ⅱ相抱合反応（M-

12、M-18、M-20 及び M-21 を生成）が主代謝経路として認められたが、この経路は、イヌでは主

要な経路ではなく、ヒトでは認められなかった。アセチル化（M-6 及び M-7 を生成）はラット及

びマウスでのみ、未変化体のグルクロン酸抱合（M-8 を生成）はラットでのみ認められた。ラッ

トでのみグルタチオン抱合体 M-14/M-15（BDC ラットの胆汁中でのみ認められた）並びにその分

解物 M-13、M-16、M-17 及び M-19 の生成が認められた（4.2.2.4.8 PH-35341 Version 2 参照）。



2.6.4.6 排泄

2.6.4.6.1 ラット

参照項目：4.2.2.5.1 PH-33933

無処置及び BDC ラット（Wistar 系雄性）に [14C]リオシグアトを単回静脈内投与及び経口投与

し、放射能（未変化体及び／又は代謝物）の吸収率及び排泄率を検討した。

ラット単回投与後の排泄試験の概要は、表 2.6.4.3- 1を参照のこと（アッセイ：LSC 法）

表 2.6.4.6- 1 [14C]リオシグアトを雄性ラットに単回投与後の放射能の排泄率（投与量％）

Route / time Dose [mg/kg]

Urine Bile Feces GITc Residuesb Recovery

i.v. / 7 days 1 17.0 Not done 81.9 0.0117 0.175 99.3

p.o. / 7 days 3 14.5 Not done 82.2 0.0115 0.0993 97.1

i.v. / 1 daya 1 19.3 51.3 24.4 0.773 0.578 96.4

p.o. / 1 daya 3 11.8 31.5 47.5 5.56 0.643 97.5

p.o / 1 daya 3 6.55 34.3 28.9 23.7 1.57 95.5

a = BDC rat

b = in total body excluding gastrointestinal tract

c = gastrointestinal tract

Source: 4.2.2.5.1 PH-33933

ラットに静脈内及び経口投与した後、未変化体及び／又は代謝物は、主に胆汁／糞を介して排

泄された（投与量の＞80％が 7 日間で排泄された）。BDC ラットに静脈内投与した後、1 日以内

に投与量の 24.4％が糞中に排泄された。BDC ラットでは胆汁と糞を分けて回収したため、静脈内

投与後の糞中の放射能は、消化管粘膜を介して排泄（胆汁外排泄）された未変化体及び／又は代

謝物を表す（4.2.2.5.1 PH-33933 参照）。

7 日後の動物体内（消化管を除く）に残留した放射能は極めて低く、未変化体及び／又は代謝

物が、全般的に速やかかつ完全に排泄されることと一致している。

2.6.4.6.2 イヌ

参照項目：4.2.2.5.2 PH-34490

雌性ビーグル犬に[14C]リオシグアトを単回静脈内持続投与（T＝1 時間）及び単回経口投与し

たときの放射能の排泄率を検討した。

イヌ単回投与後の排泄試験の概要は、表 2.6.4.3- 2を参照のこと（アッセイ：LSC 法）。



表 2.6.4.6- 2 [14C]リオシグアトを雌性ビーグル犬に単回投与後の放射能の排泄率（投与

量％）

Route / time Dose [mg/kg] Urine Feces Cage rinse Recovery

i.v. / 7 days 0.3 15.6 76.3 0.762 92.7

p.o. / 7 days 0.6 12.9 81.6 1.51 96.0

Source: 4.2.2.2.2 PH-34490

ラットと同様に、イヌにおいても、未変化体及び／又は代謝物は、主に胆汁／糞を介して排泄

された。

2.6.4.6.3 ヒト

参照項目：4.2.2.4.10 PH-35338 Version 3

健康被験者に[14C]リオシグアト 1mg を単回経口投与したときの放射能の排泄率を検討した。

ヒト単回投与後のマスバランス試験の概要は、表 2.6.4.5- 14を参照のこと（アッセイ：LSC

法、燃焼処理）。

表 2.6.4.6- 3 [14C]リオシグアト 1mg をヒトに単回投与後の放射能の排泄率（投与量％）

Subject No. 1 2 3 4

Samples Urine Feces Urine Feces Urine Feces Urine Feces

Excretion (% of dose) 44.5 47.6 36.0 54.3 45.2 49.5 32.6 59.2

Total excretion 92.1 90.3 94.7 91.8


ヒトにおいて、尿及び糞中に排泄された放射能はほぼ同程度で、投与量の 33～45％が腎排泄

され、48～59％が糞中に排泄された（4.2.2.4.10 PH-35338 Version 3 参照）。

2.6.4.6.4 乳汁中分泌

参照項目：4.2.2.5.3 A49741

授乳中の Wistar 系ラットに[14C]リオシグアト 3mg/kg を単回経口投与した（分娩後 8～10 日

目）（4.2.2.5.3 A49741 参照）。投与後 32 時間まで所定の時間に採取した乳汁及び血漿中の放

射能（未変化体及び／又は代謝物）濃度を測定し、放射能の乳汁中分泌を評価した。乳汁を介し

て分泌された放射能量は、乳汁中放射能濃度と乳汁分泌量の理論値に基づき算定した12)。



表 2.6.4.6- 4 ラットにおける乳汁中分泌試験の概要

Study type Secretion into the milk

Bayer reference

4.2.2.5.3 A49741

Study design Rat, 3 animals/time-point

Admin. Route Dosage [14C]riociguata Sex / species Sample times

p.o. 3 mg/kg Wistar rat, femaleDay 8-10 post partum

1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 32 h

Vehicles p.o. administration: 15% Ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. (v/v/v), 5 mL/kg gavage

Assay LSC

a = specific activity: MBq/mg

投与後 32 時間までに乳汁中に分泌された放射能は少なく、投与量の 2.2％であった。AUC の乳

汁／血漿比は、乳腺における高い放射能濃度を反映して 4.3 であった（4.2.2.5.3 A49741 参

照）。

要約すると、ラットにおいて、放射能は全身循環血液から乳汁中に分泌されたが、その量は、

投与放射能のうちのわずかな量であった（4.2.2.5.3 A49741 参照）。



2.6.4.7 薬物動態学的薬物相互作用

参照項目：4.2.2.6.1 A50207

表 2.6.4.7- 1 代謝を介した薬物相互作用試験の概要

Study type In vitro assay


Test system Human liver microsomes (pool), recombinant isoform: CYP1A1


リオシグアトが CYP 誘導、CYP 阻害、UDP-グルクロン酸転移酵素阻害作用及び硫酸転移酵素阻

害を介して薬物相互作用を引き起こす可能性については、それぞれ2.6.4.1.1.1、2.6.4.5.1.3 、

2.6.4.1.1.1及び2.6.4.1.1.1の in vitro 試験成績を参照のこと。また、トランスポーターを介

した薬物相互作用の検討については、2.6.4.8「その他の薬物動態試験」を参照のこと。

ヒトにおいて、リオシグアトは一次酸化代謝を受け、主代謝物である M-1（BAY 60-4552）を

in vitro 及び in vivo で生成する。この M-1 を生成するリオシグアトの N-脱メチル化は、複数

の CYP 分子種 CYP1A1、2C8、2J2、3A4 及び 3A5 によって触媒される。

薬物相互作用によって、リオシグアトの代謝が影響を受ける可能性を検討するために、複数の

薬剤（抗癌剤、鎮痛薬、抗ウイルス薬、抗生物質、アゾール系抗真菌剤など）を用いて、リオシ

グアトの N-脱メチル化（M-1 生成）に対する阻害作用を in vitro で検討した（4.2.2.6.1

A50207 参照）。

ヒト肝ミクロソームにおいて、カルベジロール、エチニルエストラジオール、ケルセチン及び

テルフェナジンなどの化合物並びにチロシンキナーゼ阻害剤であるエルロチニブ、ゲフィチニブ、

イマチニブ及びソラフェニブは、20μM 以下の IC50 値で N-脱メチル化を阻害した（IC50 値：6.9

～20.1μM）。HIV プロテアーゼ阻害剤（リトナビル、アタザナビル＞インジナビル、IC50 値：

5.3～11.7μM）及びアゾール系抗真菌剤（ケトコナゾール＞クロトリマゾール、ミコナゾール、

IC50値：0.6～5.7μM）は、M-1 の生成を顕著に阻害した。

リコンビナント CYP1A1 において、アゾール系抗真菌剤であるケトコナゾール、クロトリマ

ゾール及びミコナゾール（IC50 値：0.3～0.6μM）、カルベジロール、エバスチン及びケルセチ

ン（IC50 値：0.6～2.5μM）並びにチロシンキナーゼ阻害剤であるエルロチニブ、ゲフィチニブ、

イマチニブ、ソラフェニブ及びスニチニブ（IC50値：0.2～4.2μM）は、M-1 生成を顕著に阻害し

た。アミオダロン、エチニルエストラジオール、フェノフィブラート、ナリンゲニン、ロシグリ

タゾン、シンバスタチン及びテルフェナジンなどの化合物は、M-1 生成に対して弱い阻害作用を

示し、IC50値は 4.9～15.7μM であった。

リコンビナント CYP1A1 とゲフィチニブ、イマチニブ、スニチニブ及びエルロチニブを 30 分間

プレインキュベーションしたところ、M-1 生成の顕著な阻害が認められ、これらの薬剤による

CYP1A1 に対する時間依存的な阻害作用が示唆された（IC50値の変化：ゲフィチニブ 0.27μM から

0.05μM、イマチニブ 4.2μM から 0.7μM、スニチニブ 4.2μM から 0.6μM、エルロチニブ 0.17



μM から 0.05μM）。しかし、M-1 の生成は、ヒトの肝臓において複数の CYP 分子種（CYP1A1、

2C8、2J2 及び CYP3A4/5）によって触媒されるため、ヒト肝ミクロソームを用いた場合では、こ

れらの薬剤の M-1 生成阻害作用は低かった（IC50値：7～＞15μM）。

リオシグアトの肝代謝及び肝外代謝の両方に対する阻害を考慮すると、ケトコナゾールは in

vitro において強力な阻害剤であった（IC50値：0.3 及び 0.6μM）。

リオシグアトとケトコナゾール（400mg）の併用による臨床薬物相互作用試験において、リオ

シグアトの曝露量は中等度に増加した（平均 Cmax は 46％増加、平均 AUC は 150％増加）

（5.3.3.4.3 PH-35000 参照）。

以上をまとめると、in vitro において CYP1A1、2C8 及び 3A4 の強力な阻害剤かつ排出トラン

スポーターの阻害剤であるケトコナゾールは、ヒト in vivo においてリオシグアトの曝露量を中

等度に増加させたが、in vitro で検討した他の薬剤との併用によって、ケトコナゾールを上回

る臨床薬物相互作用が認められる可能性は低いと考えられる（4.2.2.6.1 A50207 参照）。



2.6.4.8 その他の薬物動態試験

2.6.4.8.1 Caco-2 細胞透過性

参照項目：4.2.2.7.1 PH-36042 Version 3

表 2.6.4.8- 1 Caco-2 細胞透過性試験の概要

Study type In vitro assay, permeability


Test system Caco-2 cells


リオシグアト濃度 2.4μM 及び 24μM において、Caco-2 細胞の頂端膜（apical：A）側から基

底膜（basal：B）側方向への透過性を検討したところ、Papp値はそれぞれ 35±8.4nm/s 及び 36±

8.7nm/s であった。BCS（Biopharmaceutics Classification System）分類に関する FDA ガイド

ライン13)に従い、プロプラノロール、シメチジン及びアテノロールなどの標準物質との比較によ

り、リオシグアトは中等度の透過性化合物に分類された。B 側から A 側方向への透過性は顕著に

高く、排出比（efflux ratio）は、2.4μM 及び 24μM の濃度で、それぞれ 11±3.3 及び 11±3.1

であった。排出比は、P-gp の阻害剤であるイベルメクチンの存在下では 4.8 に低下した

（4.2.2.7.1 PH-36042 Version 3 参照）。

リオシグアト経口投与時のヒトにおけるバイオアベイラビリティが 94％であることを考慮す

ると（5.3.1.1.1 PH-36361 参照）、認められたトランスポーターによる排出がリオシグアトの

吸収に影響を及ぼす可能性は低いと考えられる。

Caco-2 細胞で認められたトランスポーターによる排出については、P-gp 又は BCRP のトランス

フェクト細胞を用いて更に詳細に検討した（2.6.4.8.2 参照）。



2.6.4.8.2 排出トランスポーターに対する基質特性

参照項目：4.2.2.7.2 PH-36092

4.2.2.7.3 PH-36091

表 2.6.4.8- 2 P-gp 及び BCRP の基質特性試験の概要

Study type In vitro assay, P-gp and BCRP substrate characteristics


Test system Transfected LLC-PK1 cells: P-gp;transfected MDCKII cells: BCRP


P-gp をトランスフェクトした細胞を用いて、リオシグアトの P-gp 基質特性を検討した。リオ

シグアト濃度 1μM 及び 10μM において、排出比はそれぞれ 6.3±0.3 及び 5.9±1.0 であった

（4.2.2.7.2 PH-36092 参照）。P-gp 阻害剤イベルメクチン 5μM の存在下では、排出比は 1.4±

0.3 に低下した（リオシグアト濃度 1μM）。対照群である LLC-PK1 細胞における排出比は低く、

1.5±0.4 であった。

BCRP をトランスフェクトした細胞を用いて、リオシグアトの BCRP 基質特性を検討した。リオ

シグアト濃度 0.2μM、1μM 及び 10μM において、排出比はそれぞれ 19±4.0、25±7.8 及び 30

±5.3 であった（4.2.2.7.3 PH-36091 参照）。1μM の BCRP 阻害剤 Ko143 存在下では、排出比は

3.3±0.9 に低下し（リオシグアト濃度 1μM）、対照群である MDCKⅡ細胞における排出比（3.8

±0.4）と同程度であった。

以上より、リオシグアトは P-gp 及び BCRP の基質に分類された。したがって、P-gp 及び BCRP

は、ヒトにおいてリオシグアトの排泄に関与している可能性が高いと考えられる。ヒトにおける

経口投与時のバイオアベイラビリティは高かったことから、P-gp 及び BCRP の阻害によって、消

化管における吸収率が増加し、臨床的に問題となるリオシグアトのバイオアベイラビリティ増加

は起こらないと考えられる。一方、P-gp 及び BCRP を介したリオシグアトの排泄過程が阻害され

ることによって、血漿中濃度が増加する可能性は否定できない（4.2.2.7.2 PH-36092、

4.2.2.7.3 PH-36091 参照）。



2.6.4.8.3 取り込みトランスポーターに対する基質特性

参照項目：4.2.2.7.5 A61912

4.2.2.7.6 R-8601 Version 2

4.2.2.7.7 R-8643

表 2.6.4.8- 3 取り込みトランスポーターの基質特性試験の概要

Study type In vitro assay, substrate characteristics for uptake transporters

Bayer reference 4.2.2.7.5 A61912, 4.2.2.7.6 R-8601 Version 2, 4.2.2.7.7 R-8643

Test system Transfected HEK cells: OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3; transfected CHO cells: OCT1, OCT2, OCT3

Test compound Riociguat (OATPs), [14C]Riociguat (OCTs and OATs)

ヒト尿及び糞中には、リオシグアトの未変化体が排泄された。したがって、未変化体の排泄過

程に取り込みトランスポーターが関与している可能性が考えられる。

OATP1B1、OATP1B3、OAT1 及び OAT3 をトランスフェクトした細胞において、トランスポーター

を介したリオシグアトの能動的な取り込みは認められなかった。更に、OAT 阻害剤である PAH 及

びプロベネシドの存在下で、OAT トランスフェクト細胞内のリオシグアト濃度は変化しなかった

（4.2.2.7.5 A61912、4.2.2.7.6 R-8601 Version 2 参照）。

OCT1、OCT2 及び OCT3 をトランスフェクトした細胞を用いて、トランスポーターに対するリオ

シグアトの基質特性を検討した（4.2.2.7.7 R-8643 参照）。OCT の競合阻害剤である MPP+の存

在下又は非存在下において、リオシグアトの取り込みを評価した。OCT1 及び OCT3 トランスフェ

クト細胞において、リオシグアトの取り込みに対する MPP+の阻害作用は認められなかったが、

OCT2 トランスフェクト細胞ではリオシグアトの取り込みが顕著に低下した。

以上のことから、リオシグアトは腎臓に発現している OCT2 の基質であったが、OATP1B1、

OAT1B3、OAT1、OAT3、OCT1 及び OCT3 の基質ではないことが示唆された。能動的な腎分泌は、リ

オシグアトの主要な消失経路ではない（CLrenal は CLtotal の 25％未満）（5.3.3.4.3 PH-35000 参

照）ことから、取り込みトランスポーターの阻害による薬物相互作用は起こらないと考えられる。



2.6.4.8.4 P-gp 及び BCRP を介したリオシグアトの輸送に対する阻害作用

参照項目：4.2.2.7.8 PH-36340

4.2.2.7.9 A62552

表 2.6.4.8- 4 P-gp 及び BCRP を介したリオシグアトの輸送阻害試験の概要

Study type In vitro assay, inhibition of P-gp and BCRP

Bayer reference 4.2.2.7.8 PH-36340, 4.2.2.7.9 A62552

Test system Transfected LLC-PK1 cells: P-gp, transfected MDCKII cells: BCRP


P-gp 及び BCRP をトランスフェクトした細胞を用いて、併用される可能性がある薬剤の P-gp

及び BCRP を介したリオシグアトの輸送に対する阻害作用を検討した（4.2.2.7.8 PH-36340、

4.2.2.7.9 A62552 参照）。



表 2.6.4.8- 5 P-gp 及び BCRP を介したリオシグアトの輸送に対する阻害作用

Inhibitor IC50 in P-gp-transfected cells[µM]

IC50 in BCRP-transfected cells[µM]

Amiodarone 4.3 n.d.a

Atazanavir >50 n.d.a

Atorvastatin >30 >30

Clarithromycin >50 >50

Clotrimazole >1 n.d.a

Cyclosporin A 3.9 4.4

Erythromycin >50 >50

Indinavir >50 n.d.a

Itraconazole 0.26 0.43

Ivermectin 0.65 n.d.a

Ketoconazole 4.9 7.7

Miconazole 7.9 n.d.a

Pantoprazole n.d.a 4.0

Quinidine 19.0 ≥300

Ritonavir 31.3 4.7

Saquinavir >20 >1

Verapamil 3.3 ≥100

Voriconazole n.d.a >30

a = not determined

Source: 4.2.2.7.8 PH-36340, 4.2.2.7.9 A62552

アトルバスタチン、クラリスロマイシン、クロトリマゾール、インジナビル、イベルメクチン

及びボリコナゾールは、それぞれの薬剤の定常状態における最高血漿中濃度（Cmax）をはるかに

上回る濃度においても、リオシグアトの排出比を低下させなかった（Cmax/IC50＜0.1）。アミオダ

ロン、シクロスポリン A、イトラコナゾール、ケトコナゾール、パントプラゾール、キニジン、

リトナビル及びベラパミルは、それぞれの薬剤の定常状態における Cmaxに近い IC50値でリオシグ

アトの P-gp 及び／又は BCRP 介在輸送を阻害した（Cmax/IC50≧0.1）。したがって、これらの薬剤

がリオシグアトの排泄を阻害することによって、血漿中リオシグアト濃度が増加する可能性は否

定できない。CYP3A4 の強力な阻害剤であり、かつ P-gp 及び BCRP の阻害剤であるケトコナゾー

ルは、ヒト in vivo において、リオシグアトの曝露量を中等度に増加させた（平均 Cmaxを 46％、

平均 AUC を 150％増加）（5.3.3.4.3 PH-35000 参照）。しかし、ヒトにおけるリオシグアトの

経口バイオアベイラビリティは高いことから、P-gp 及び BCRP の阻害によって、臨床的に問題と

なるバイオアベイラビリティの増加は起こらないと考えられる。



2.6.4.8.5 排出トランスポーターに対する阻害作用

参照項目：4.2.2.7.2 PH-36092

4.2.2.7.4 PH-36202

表 2.6.4.8- 6 P-gp 及び BCRP に対する阻害作用試験の概要

Study type In vitro assay, inhibitory potential towards P-gp and BCRP


Test system Transfected LLC-PK1 cells: P-gp, transfected MDCKII cell: BCRPs


リオシグアトは、P-gp 及び BCRP を介した典型基質の輸送に対して、検討した最高濃度まで、

問題となる阻害作用を示さなかった（4.2.2.7.2 PH-36092、4.2.2.7.4 PH-36202 参照）。

表 2.6.4.8- 7 P-gp 及び BCRP に対するリオシグアトの阻害作用

Transporter Probe substrate IC50

[µM]

P-gp Digoxin >100

P-gp Dipyridamole >20

BCRP Topotecan >24

BCRP 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhiP) >24

Source: 4.2.2.7.2 PH-36092, 4.2.2.7.4 PH-36202

リオシグアト経口投与時の理論的な消化管内濃度 24μM（250mL の水に 2.5mg を溶解させたと

して）及び最高血漿中濃度 0.5μM を考慮すると、リオシグアトは、有効治療用量において P-gp

及び BCRP の阻害剤にはならないと考えられる。したがって、リオシグアトが P-gp 及び BCRP を

阻害することによって、臨床的に問題となる薬物相互作用は起こらないと考えられる。



2.6.4.8.6 取り込みトランスポーターに対する阻害作用

参照項目：4.2.2.7.5 A61912

4.2.2.7.6 R-8601 Version 2

4.2.2.7.7 R-8643

表 2.6.4.8- 8 取り込みトランスポーターに対する阻害作用試験の概要

Study type In vitro assay, inhibitory potential towards uptake transporters

Bayer reference 4.2.2.7.5 A61912, 4.2.2.7.6 R-8601 Version 2, 4.2.2.7.7 R-8643

Test system Transfected HEK cells: OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT 3;transfected CHO cells: OCT1,OCT2, OCT3


表 2.6.4.8- 9 取り込みトランスポーターに対するリオシグアトの阻害作用

Transporter Probe substrate Highest concentration testet[µM]

Inhibition at highest concentration[%]

IC50

[µM]

OATP1B1 Pravastatin 10 0 >10

OATP1B3 Pravastatin 10 0 >10

OAT1 PAH 3 0 >3

OAT3 Esterone 3-sulfate 3 0 >3

OCT1 MPP+ 50 40 n.d.a

OCT2 MPP+ 50 0 >50

OCT3 MPP+ 50 70 n.d.a

a = not determined

Source: 4.2.2.7.5 A61912, 4.2.2.7.6 R-8601 Version 2, 4.2.2.7.7 R-8643

取り込みトランスポーターに対するリオシグアトの阻害作用を、トランスフェクト細胞及び典

型基質を用いて検討した（4.2.2.7.5 A61912、4.2.2.7.6 R-8601 Version 2、4.2.2.7.7 R-8643

参照）。リオシグアトは、治療域の血漿中濃度である 0.5μM（5.3.3.5.3 PH-36006 参照）まで、

OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3 及び OCT2 に対して阻害作用を示さなかった。リオシグアトは、

50μM の濃度において、OCT1 及び OCT3 を介した MPP+（OCT 基質）の細胞内取り込みをそれぞれ

40％及び 70％低下させた。ヒトにおける Cmax（0.5μM）及び血漿中非結合型分率（約 5％）を考

慮すると、有効治療用量において、リオシグアトが OCT を阻害することによって薬物相互作用は

起こらないと考えられる。以上をまとめると、リオシグアトが OATP1B1、OAT1B3、OAT1、OAT3、

OCT1、OCT2 及び OCT3 を阻害することによって、臨床的に問題となる薬物相互作用は起こらない

と考えられる。



2.6.4.8.7 リオシグアト単回投与後の M-1（BAY 60-4552）の薬物動態

参照項目：4.2.2.2.3 PH-34490

イヌ単回投与後の排泄試験の概要は、表 2.6.4.3- 2を参照のこと。

表 2.6.4.8- 10 [14C]リオシグアトをイヌに単回投与後の M-1 の薬物動態

Dose [mg/kg] 0.3 0.6

Route Intravenous (T=1 h) oral

AUC [µg·h/L] 926 1574

AUCnorm [kg·h/L] 3.19 2.71

Cmax [µg/L] 101 151

Cmax,norm [kg/L] 0.349 0.260

tmax [h] 2.62 3.30

t1/2 [h] 4.90 4.82

Intervala [h] 2-30 4-24


Source: 4.2.2.2.3 PH-34490

M-1 はリオシグアトの活性代謝物であり、ヒト血漿中の主代謝物である。イヌにリオシグアト

を静脈内及び経口投与したときの M-1 の薬物動態を表 2.6.4.8- 10に示す。パラメータ及び濃度

はリオシグアト当量として示した。



2.6.4.8.8 リオシグアト反復投与後の M-1（BAY 60-4552）の薬物動態

参照項目：4.2.3.2.6 PH-34674

4.2.3.2.10 PH-34778

ラット及びイヌの反復投与試験の概要は、表 2.6.4.3- 6を参照のこと。

表 2.6.4.8- 11 ラットにリオシグアトを反復投与したときの M-1 の薬物動態学的パラメータ

（91 日目、各時点雌雄各 3匹計 6匹の平均血漿中濃度から算出）

Dose [mg/kg/d] 3 10 30

AUC(0-24) [µg·h/L] n.c.b 369 1125

AUC(0-24)norma [kg·h/L] n.c.b 0.0382 0.0388

AUC(0-7) [µg·h/L] 40.9 206 629

Cmax [µg/L] 9.28 53.4 208

Cmax,norma [kg/L] 0.00320 0.00552 0.00716

C(24)/Cmax [%] n.c.b 4.58 4.30

tmax [h] 0.500 0.500 1.00

RA1 [%] 128 269 426

RA3 [%] 95.1 193 308

RA1 = Cmax, Day 91 / Cmax,Day 1

RA3 = AUC(0-7)Day 91 / AUC(0-7)Day 1

a = equivalent doses were used for calculation of dose-normalized parameters of BAY 60-4552 using a factor of 0.9668

b = not calculated

Source: 4.2.3.2.6 PH-34674

ラットにリオシグアトを反復投与後、定常状態における M-1 の AUC(0-24)は、リオシグアトの

約 10％であった（表 2.6.4.3- 7 参照）。M-1 の AUC は、おおむね用量比例的に増加したが、

Cmaxは用量比例性を上回って増加した。M-1 の蓄積比（RA1及び RA3）は中等度で、用量増加にした

がって 3～4倍にまで増加した。



表 2.6.4.8- 12 イヌにリオシグアトを反復投与したときの M-1 の薬物動態学的パラメータ（12

週目、雌雄各 4匹の血漿中濃度から算出した平均値）

Dose [mg/kg/d] 0.3 1 3

AUC(0-24) [µg·h/L] 506 1345 2533

AUC(0-24)norma [kg·h/L] 1.74 1.39 0.874

Cmax [µg/L] 47.0 128 222

Cmax,norma [kg/L] 0.162 0.133 0.0764

C(24)/Cmax [%] 19.3 11.4 18.3

tmax [h] 3.08 3.61 3.36

RA1 [%] 112 135 121

RA3 [%] 117 129 110

RA1 = Cmax, Week 12 / Cmax,Day 1

RA3 = AUC(0-24)Week 12 / AUC(0-24)Day 1

a = equivalent doses were used for calculation of dose-normalized parameters of BAY 60-4552 using a factor of 0.9668

Source: 4.2.3.2.10 PH-34778

イヌにリオシグアトを反復投与したとき、定常状態における M-1 の AUC は、リオシグアトと同

程度であった（未変化体の AUC に対して 70～110％、表 2.6.4.3- 8 参照）。M-1 の曝露量は用

量比例性を下回って増加した。反復投与による明らかな M-1 の蓄積は認められなかった（RA1 及

び RA3）。

2.6.4.8.9 M-1（BAY 60-4552）のたん白結合

参照項目：4.2.2.7.10 PH-35330

マウス、ラット、イヌ及びヒトの血漿を用いて、M-1 の濃度範囲約 0.05～3mg/L における in

vitro 血漿たん白結合率を、限外ろ過法を用いて検討した（4.2.2.7.10 PH-35330 参照）。

表 2.6.4.8- 13 [14C]BAY 60-4552（M-1）のたん白結合試験の概要

Study type In vitro assay, ultrafiltration


Test compound [14C]BAY 60-4552a

a = MBq/mg, SXD 1493-3-01C



表 2.6.4.8- 14 M-1 の in vitro 血漿たん白結合率

Species Concentration in undiluted plasma [mg/L] fu [%]

Human 0.0507 – 2.14 3.6

Wistar rat, male 0.0511 – 2.57 10.7

Beagle dog, female 0.0517 – 1.63 16.5

CD-1 mouse, male 0.0521 – 3.05 17.1

α1-Acidic glycoprotein (0.7 g/L) 0.554 53.0

Human serum albumin (40 g/L) 0.556 16.1

Fetal calf serum (10%) in

Williams Medium 0.0564 – 2.08 58.2

Source: 4.2.2.7.10 PH-35330

M-1 の血漿たん白結合率は、ヒトを含むすべての動物において、低～中等度であった。濃度依

存性はほとんど認められなかった。M-1 の非結合型分率は、ヒトを含むすべての動物において、

リオシグアトの非結合型分率と同程度であった。

ヒト血漿における主な結合たん白は血清アルブミンであり、非結合型分率は 16％であった。

α1-酸性糖たん白との結合性は低く、非結合型分率は 53％であった。

2.6.4.8.10 M-1（BAY 60-4552）のグルクロン酸抱合に関与するヒト UGT 酵素の同定

参照項目：4.2.2.7.11 PH-36003

表 2.6.4.8- 15 M-1 の UGT 酵素同定試験の概要

Study type In vitro assay, UGT isoformes involved


Test material Human liver, kidney, intestine and lung microsomes (pool)recombinant human UGT 1A1, 1A3, 1A4, 1A6, 1A7, 1A8, 1A9, 1A10, 2B4, 2B7, 2B15, 2B17

Test compound BAY 60-4552

12 種のヒトリコンビナント UGT 分子種のうち、UGT1A1 及び UGT1A9 並びにわずかであるが

UGT1A3 に、M-1（10μM）から M-4（BAY 1077251）を生成するグルクロン酸抱合反応の触媒作用

が認められた。M-1 濃度が 1μM の条件では、UGT1A9 のみが相当量の N-グルクロン酸抱合体 M-4

を生成した。

ヒトにおける M-1 のグルクロン酸抱合に関与している臓器・組織を同定するために、肝、小腸、

腎及び肺ミクロソームを 1μM 及び 10μM の M-1 とインキュベーションした。肝及び腎ミクロ



ソームは、いずれの基質濃度においても M-1 のグルクロン酸抱合を触媒したが、小腸ミクロソー

ムでは、10μM においてのみ少量の反応が認められた。喫煙者及び非喫煙者によらず、肺ミクロ

ソームは、M-1 のグルクロン酸抱合を触媒しなかった。

UGT1A1 選択的阻害剤アタザナビル及び UGT1A9 選択的阻害剤ニフルム酸を用いたヒト肝、腎及

び小腸ミクロソームにおける阻害試験では、アタザナビルは肝（対照群の 32％）及び小腸（対

照群の 58％）ミクロソームにおいて M-4 の生成を顕著に抑制したのに対し、ニフルム酸は肝

（対照群の 72％）及び腎（対照群の 25％）ミクロソームにおいて M-4 の生成を抑制した。以上

をまとめると、M-1 の N-グルクロン酸抱合は UGT1A1 及び UGT1A9 によって触媒された。グルクロ

ン酸抱合は、腎臓では主に UGT1A9 によって触媒されたが、小腸では UGT1A1 によって選択的に触

媒された。肝臓においては、UGT1A1 及び UGT1A9 の両分子種によって M-1 のグルクロン酸抱合が

触媒された（4.2.2.7.11 PH-36003 参照）。

2.6.4.8.11 M-1（BAY 60-4552）の CYP 阻害作用

参照項目：4.2.2.7.12 A49419 Version 2

表 2.6.4.8- 16 M-1 の CYP 阻害作用試験の概要

Study type In vitro assay, CYP inhibition


Test system Human liver microsomes (pool), recombinant isoforms: CYP1A1, 2A6, 2C19, 2E1




表 2.6.4.8- 17 M-1 の CYP 分子種に対する阻害作用

CYP isoform

Probe reaction Enzyme source IC50

[µM]Ki

[µM]

1A1 Phenacetin O-deethylation Recombinant 0.74 0.65

1A2 Phenacetin O-deethylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2A6 Coumarin 7-hydroxylation Recombinant > 50 n.d.a

2B6 Bupropion hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2C8 Amodiaquine N-deethylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2C9 Diclofenac 4’-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2C19 Mephenytoin 4’-hydroxylation Recombinant > 50 n.d.a

2D6 Dextromethorphan O-demethylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

2E1 Chlorzoxazone 6-hydroxylation Recombinant > 50 n.d.a

2J2 Ebastine tert-butyl-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

3A4 Midazolam 1’-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.a

Midazolam (30 min preincubation) Human liver microsomes > 50 n.d.a

3A4 Testosterone 6β-hydroxylationb Human liver microsomes > 50 n.d.a

Testosterone (30 min preincubation)b Human liver microsomes > 50 n.d.a

a = not determined

b = single incubation


CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1、2J2 及び 3A4 活性に対する M-1 の阻害作用は

認められず、IC50 値は＞50μM であった。M-1 を NADPH 添加ヒト肝ミクロソームとプレインキュ

ベーションしても、CYP3A4 活性の低下は認めらなかった（IC50＞50μM、ミダゾラムの 1’-水酸化、

テストステロンの 6β-水酸化）ことから、CYP3A4 に対する時間依存的な阻害作用はないと考え

られた。M-1 は CYP1A1 に対して阻害作用を示し、IC50値は 0.74μM であった。更なる検討の結果、

M-1 の CYP1A1 に対する阻害の Ki値は 0.65μM であった。

リオシグアトの臨床用量における M-1 の血漿中濃度（約 0.3μM）を考慮すると、主に CYP1A1

によって消失する併用薬と臨床的に問題となる薬物相互作用が起こる可能性は否定できない。



2.6.4.8.12 M-1（BAY 60-4552）の UGT に対する阻害作用

参照項目：4.2.2.7.13 PH-35951 Version 2

表 2.6.4.8- 18 M-1 の UGT 阻害作用試験の概要

Study type In vitro assay, UGT inhibition


Test system Human liver microsomes (pool)


表 2.6.4.8- 19 M-1 のグルクロン酸抱合に対する阻害作用

UGT isoform Substrate IC50

[M]

Ki

[M]

Various 17β-Estradiol (analyte estradiol 17-glucuronide)

> 50 n.d.a

1A1 17β-Estradiol (analyte estradiol 3-glucuronide)

> 50 n.d.a

1A4 Trifluoperazine > 50 n.d.a

1A6 α-Naphthol > 50 n.d.a

1A9 Propofol 18.3 11.3

2B7 3’-Azido-3’-deoxythymidine > 50 n.d.a

a = not determined


M-1 はヒト UGT1A1、1A4、1A6 及び 2B7 に対して阻害作用を示さなかった（IC50値は＞50μM）。

M-1 は、UGT1A9 に対して中等度の阻害を示し、Ki値は 11.3μM であった。

リオシグアトの臨床用量における M-1 の血漿中濃度（約 0.3μM）を考慮すると、主に UGT1A9

が触媒する抱合反応によって消失する併用薬と臨床的に問題となる薬物相互作用は起こらないと

考えられる。



2.6.4.8.13 M-1（BAY 60-4552）の SULT に対する阻害作用

参照項目：4.2.2.7.14 A56806

表 2.6.4.8- 20 M-1 の SULT 阻害作用試験の概要

Study type In vitro assay, SULT inhibition


Test system Human liver cytosol (pool)


表 2.6.4.8- 21 M-1 の硫酸抱合に対する阻害作用

SULT isoform Substrate IC50

[µM]Ki

[µM]

Various, predominantly SULT1E1 17β-Estradiol >25 n.d.a

Various, predominantly SULT1E1 17α-Ethinylestradiol >25 n.d.a

a = not determined

Source: 4.2.2.7.14 A56806

複数の M-1 濃度において、ヒト肝サイトゾルと 17β-エストラジオール及び 17α-エチニルエ

ストラジオールをインキュベーションし、硫酸抱合体の生成量を測定した。M-1 は、17β-エス

トラジオール及び 17α-エチニルエストラジオールの硫酸抱合に関与する SULT、特に SULT1E1 に

対して阻害作用を示さず、IC50値は＞25μMであった。

要約すると、M-1 はヒト SULT に対して阻害作用を示さなかったことから、17β-エストラジ

オール及び 17α-エチニルエストラジオールの硫酸抱合阻害を含む SULT の阻害によって、臨床

的に問題となる薬物相互作用は起こらないと考えられる。



2.6.4.8.14 M-1（BAY 60-4552）の酵素誘導

参照項目：4.2.2.7.15 PH-35806 Version 3

表 2.6.4.8- 22 M-1 の酵素誘導作用試験の概要

Study type In vitro assay, induction of CYP1A2, 2B6, 2C19 and 3A4


Test system Cultured human hepatocytes

Test compound BAY 60-4552 (5-10000µg/L)

ヒト肝細胞を用いた試験において、M-1 をくり返し曝露させても、ヒト CYP1A2、2B6、2C19 及

び 3A4 に対する誘導作用は認められなかった。それに対し、陽性対照のオメプラゾール及びリ

ファンピシンでは、誘導剤に特異的な CYP 酵素活性の変化が認められた。

表 2.6.4.8- 23 M-1 の酵素誘導作用

CYP Result

1A2, 2B6, 2C19 and 3A4 No induction up to 10000 µg/L

酵素誘導試験の結果をたん白結合率で補正した。M-1 の肝細胞培養液中の非結合型分率 58.2％

（4.2.2.7.10 PH-35330 参照）を用いると、in vitro 試験における最高濃度 10000μg/L は非結

合濃度として 5820μg/L に相当する。ヒト血漿中における M-1 の非結合型分率 3.6％を用いて、

肝細胞培養液中の非結合型濃度 5820μg/L に相当する血漿中濃度を算出すると 162mg/L となる。

この濃度は、ヒトにリオシグアトの有効用量である 2.5mg を 1 日 3 回反復経口投与したときの

M-1 の最高血漿中濃度 110μg/L の 1500 倍高い値である（5.3.3.5.3 PH-36006 参照）。

以上をまとめると、M-1 が CYP1A2、2B6、2C19 及び 3A4 を誘導することによって、臨床薬物相

互作用は起こらないと考えられる（4.2.2.7.15 PH-35806 Version 3 参照）。



2.6.4.8.15 排出トランスポーターに対する M-1（BAY 60-4552）の基質特性

参照項目：4.2.2.7.16 PH-36158

4.2.2.7.17 PH-36267

表 2.6.4.8- 24 P-gp 及び BCRP に対する M-1 の基質特性試験の概要

Study type In vitro assay, P-gp and BCRP substrate characteristics


Test system Transfected LLC-PK1 cells: P-gptransfected MDCKII cells: BCRP


P-gp をトランスフェクトした細胞を用いて、M-1 の P-gp 基質特性を検討した。トランスフェ

クト細胞である L-MDR1 細胞において、M-1 濃度が 1μM のときの排出比は 10.4±2.7 であった

（4.2.2.7.16 PH-36158 参照）。P-gp 阻害剤イベルメクチンの存在下では、排出比は 2.2±0.3

に低下した。対照群である LLC-PK1 細胞では、排出傾向は認められなかった（排出比 0.7±

0.2）。BCRP をトランスフェクトした細胞を用いて、M-1 の BCRP 基質特性を検討した。M-1 濃度

が 1μM 及び 10μM のときの排出比は、それぞれ 27±1.4 及び 36±6.3 であった（4.2.2.7.17

PH-36267 参照）。BCRP 阻害剤 Ko143 の存在下では、M-1 濃度が 1μM のとき、排出比は 2.6±

0.3 に低下した。

これらの結果により、M-1 は P-gp 及び BCRP の基質に分類された。したがって、P-gp 及び

BCRP が、ヒトにおいて M-1 の腎分泌に関与している可能性が高いと考えられる。また、P-gp 及

び BCRP を介した排泄過程を阻害することによって、M-1 の血漿中濃度が増加することは否定で

きない。臨床薬物相互作用試験において、強力な CYP 阻害剤であり、かつ P-gp 及び BCRP 阻害剤

であるケトコナゾールは、in vivo における M-1 の曝露量をわずかに減少させたに過ぎなかった

（5.3.3.4.3 PH-35000 参照）。M-1 の曝露量の減少が予測されるよりも小さかった原因として、

二つの相反する作用である M-1 生成の阻害と M-1 排泄の阻害が起こったことが考えられ、その結

果として M-1 の曝露量がほとんど変化しなかったと考えられる。



2.6.4.8.16 取り込みトランスポーターに対する M-1（BAY 60-4552）の基質特性

参照項目：4.2.2.7.7 R-8643

表 2.6.4.8- 25 OCT1、OCT2 及び OCT3 に対する M-1 の基質特性試験の概要


Bayer reference 4.2.2.7.7 R-8643

Test system Transfected CHO cells: OCT1, OCT2, OCT3

Test compound [14C]-BAY 60-4552

M-1 は、ヒト糞中に排泄され、能動的に腎分泌もされる（5.3.3.4.3 PH-35000 参照）。した

がって、これらの M-1 の排泄過程に取り込みトランスポーターが関与している可能性が考えられ

る。

OCT1、OCT2 又は OCT3 のトランスフェクト細胞を用いて、OCT 競合阻害剤 MPP+の存在下又は非

存在下において、M-1 の取り込みを測定した。これらのトランスフェクト細胞において、M-1 の

取り込みに対する MPP+の阻害作用は認められなかったことから、M-1 は OCT の基質ではないと考

えられる（4.2.2.7.7 R-8643 参照）。

2.6.4.8.17 排出トランスポーターに対する M-1（BAY 60-4552）の阻害作用

参照項目：4.2.2.7.16 PH-36158

4.2.2.7.17 PH-36267

表 2.6.4.8- 26 P-gp 及び BCRP に対する M-1 の阻害作用試験



Test system Transfected LLC-PK1 cells: P-gp, transfected MDCKII cells: BCRP


検討した最高濃度まで、M-1 は P-gp 及び BCRP を介した輸送に対して有意な阻害作用を示さな

かった（4.2.2.7.16 PH-36158、4.2.2.7.17 PH-36267 参照）。



表 2.6.4.8- 27 P-gp 及び BCRP を介した輸送に対する M-1 の阻害作用

Transporter Probe substrate IC50

[µM]

P-gp Digoxin >100

P-gp Dipyridamole >10

BCRP Topotecan >10

BCRP 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhiP) >10

Source: 4.2.2.7.16 PH-36158, 4.2.2.7.17 PH-36267

臨床試験（5.3.3.5.3 PH-36006 参照）において、リオシグアトの有効用量 2.5mg を 1 日 3 回

反復経口投与したときの M-1 の最高血漿中濃度（0.3μM）を考慮すると、M-1 は P-gp 及び BCRP

を阻害する可能性は低いと考えられる。したがって、M-1 が P-gp 及び BCRP を阻害することに

よって、臨床的に問題となる薬物相互作用は起こらないと考えられる。

2.6.4.8.18 取り込みトランスポーターに対する M-1（BAY 60-4552）の阻害作用

参照項目：4.2.2.7.7 R-8643

表 2.6.4.8- 28 OCT1、OCT2 及び OCT3 に対する M-1 の阻害作用試験の概要

Study type In vitro assay, inhibitory potential towards uptake transporters

Bayer reference 4.2.2.7.7 R-8643

Test system Transfected CHO cells: OCT1, OCT2, OCT3


OCT の典型基質である MPP+ を用いて、OCT1、OCT2 及び OCT3 を介した取り込みに対する M-1 の

阻害作用を評価した（4.2.2.7.7 R-8643 参照）。M-1 は 50μM の濃度において、OCT1 トランス

フェクト細胞における MPP+の取り込みを 20％低下させたが、OCT2 及び OCT3 に対しては有意な阻

害を示さなかった。臨床用量における最高血漿中濃度（0.3μM）及びヒト血漿中非結合型分率

（3.6％）を考慮すると、M-1 が OCT を阻害することによって、臨床における相互作用は起こら

ないと考えられる。



2.6.4.9 種間比較を含めた考察及び結論

CD-1 系マウス、Wistar 系ラット、ビーグル犬及びヒトの in vivo におけるリオシグアト（BAY

63-2521）の薬物動態及び代謝を検討した。肝ミクロソーム及び肝細胞を用いた in vitro 試験に

おいて、代謝プロファイルを動物種間で比較した。ヒトにおいてリオシグアトの代謝に関わる酵

素を同定した。更に、リオシグアト及びその活性代謝物 M-1（BAY 60-4552）について、酵素阻

害及び誘導、トランスポーターが引き起こす薬物相互作用の可能性を in vitro で検討した。こ

れらの試験の概要については、薬物動態の概要表にも記載した。

[14C]リオシグアトを経口投与したときの放射能の吸収率は、ラット及びイヌにおいて、それ

ぞれ約 60％及び 78％であった。バイオアベイラビリティは、ラットにおいて中等度（35～

65％）であったが、イヌではラットよりわずかに高かった（50～80％）。イヌに経口投与したと

きの AUC は、0.03～0.6mg/kg においておおむね用量比例的に増加した。ラットでは、0.3～

3mg/kg において、用量比例性をわずかに上回って増加した。

単回静脈内投与後の血漿クリアランスは、ラット〔1.3L/(kg･h)〕及びイヌ〔0.3L/(kg･h)〕に

おいて中等度であった。分布容積はラット及びイヌにおいて中等度であり、それぞれ 1.2L/kg 及

び 0.7L/kg であった。血漿中の消失半減期はラット（0.7～1.5 時間）及びイヌ（1.5～3.1 時

間）において短かった。

反復投与試験では、ラットにおけるリオシグアトの曝露量は初回投与時に比べて中等度の増加

を示したが、イヌにおいて曝露量の増加は認められなかった。ラット及びイヌの曝露量に明らか

な性差は認められなった。リオシグアトを反復投与したときの M-1 の曝露量は、イヌでは未変化

体と同程度であったが、ラットでは未変化体の約 10％に過ぎなかった。

リオシグアトのたん白結合率は低～中等度で、種差が認められた。血漿中非結合型分率は、

ラット及びイヌにおいてそれぞれ 16％及び 17％であり、ヒトでは約 5％であった。リオシグア

トは、ヒト血漿中において、主に血清アルブミン及びα1-酸性糖たん白に結合した。リオシグア

トをたん白結合率の高い 9 種の薬物とインキュベーションした場合、非結合型のリオシグアトを

最大 2.7 倍まで増加させたサリチル酸（200 及び 1000mg/L）を除いて、リオシグアトのたん白結

合の置換は起こらなった。M-1（BAY 60-4552）のたん白結合率はリオシグアトと同程度であった。

M-1 の血漿中非結合型分率は、ラット及びイヌにおいてそれぞれ 11％及び 17％であり、ヒトで

は約 4％であった。

ラットにおける[14C]リオシグアト及び／又は代謝物の臓器・組織への分布はおおむね均一で

あった。放射能の血液脳関門及び血液精巣関門通過性は低かった。甲状腺、肝臓及び腎髄質外側

部において最も放射能 AUC が高かった。Long Evans 系ラットを用いた試験において、有色組織

への親和性が認められた。経口及び静脈内投与後 7 日目において、ラットにおける残留放射能

（消化管内を除く）は低く、投与量の約 0.1～0.2％であった。

ラットに 14 日間反復経口投与したときの蓄積比（反復投与／単回投与）を検討したところ、

臓器・組織の蓄積性は低かった。蓄積比が最も高かったのは血液（2.6 倍）及び血液量の多い臓

器・組織であった。終末相における放射能の消失半減期は非常に長く、特に血液で長かった。血

球に対する親和性は、ラットに特異的であり、グルタチオン抱合体及びその分解物が血球から消

失するのが遅いことに起因すると考えられる（後述のラットにおけるリオシグアトの代謝経路を

参照のこと）。これはヒトの排泄試験において、血液からの放射能の消失に関して、ラットでみ

られたような長い終末相の消失半減期は認められなかったことによって支持される。妊娠ラット

において、放射能の胎盤関門通過性は中等度であった。



ラット、イヌ及びヒトにおけるリオシグアトの主代謝経路は、M-1 を生成する N-脱メチル化で

あり、ヒトでは続いて N-グルクロン酸抱合体 M-4 が生成された。リオシグアトの N-脱ベンジル

化（M-3 を生成）は、いずれの動物種においても主代謝経路ではなかった。ラットでは、M-1 の

生成に加えて、フルオロベンジル基の水酸化（M-9、M-10 及び M-11 を生成）及びそれに続く第

Ⅱ相抱合反応（M-12、M-18、M-20 及び M-21 を生成）が主代謝経路として認められた。これらの

代謝経路は、イヌでは寄与の少ない代謝経路であり、ヒトでは認められなった。ラットでのみ認

められたグルタチオン抱合体及びその分解物が、血液中放射能の消失がラットで遅かった原因で

あると考えられる。

複数の CYP 分子種（CYP1A1、2C8、2J2、CYP3A4/5）が、一次酸化代謝によって M-1（in vitro

及び in vivo におけるリオシグアトの主代謝物）を生成することが in vitro 試験で明らかと

なった。このリオシグアトの N-脱メチル化による M-1 生成は、肝臓、肺及び小腸で起こる。リ

オシグアトの代謝には複数の CYP 分子種が関与し、そのまま未変化体としても排泄されることか

ら、リオシグアトは薬物相互作用を受けにくい化合物であると考えられる。

ヒト肝及び肺ミクロソームにおいて、CYP1A 阻害剤α-ナフトフラボンの存在下で、M-1 の生成

が顕著に抑制されたことから、M-1 の生成に CYP1A1 が関与していることが示された。更に、喫

煙者の肺ミクロソームにおいて、リオシグアトの代謝の亢進が認められた。これはタバコ煙によ

り CYP1A1 が誘導されたためと考えられる。CYP1A1 は、肝臓及び肺におけるリオシグアトの代謝

に重要な CYP 分子種であると考えられる。

代謝に関する in vitro 試験の結果は in vivo 試験の所見を良く反映していた。リオシグアト

を単回経口投与したとき、ヒトを含むすべての動物において、未変化体と M-1 は血漿中の主成分

であった。更に、M-1 の N-グルクロン酸抱合体である代謝物 M-4（BAY 1077251）は、ヒト血漿

中の主成分であったが、他の動物の血漿中では検出されなかった。ヒトにおいてリオシグアト及

び M-1 の血漿中濃度に大きな個体間差が認められた原因として、リオシグアトの総クリアランス

に対して寄与の大きい CYP1A1 が非常に誘導されやすいことが考えられる。

ヒト[14C]リオシグアト投与試験で、4 例中 1 例の被験者（被験者 4）における M-1 生成は、他

の 3 例と比較して顕著に低かった。血漿中総放射能 AUC に占めるリオシグアトの割合は、被験者

1～3 において 26～40％であったのに対して、被験者 4 では 74％であった。また、血漿中総放射

能 AUC に占める M-1 の割合は、被験者 1～3 において 42～59％であったのに対して、被験者 4 で

は 11％であった。

血漿中の存在比を反映して、被験者 4 では未変化体の排泄される割合が高く、投与量の 63％

が未変化体として排泄されたが、被験者 1～3 では、排泄物中の未変化体は投与量の 14～22％で

あった。排泄された放射能のうち、M-1 を生成する代謝経路（M-1 とそのグルクロン酸抱合体 M-

4 の合計）が寄与する割合は、被験者 1～3 においては 67～71％であったが、被験者 4 では 27％

に過ぎなかった。このような個体間差は、上記の被験者間において、リオシグアトのクリアラン

スにおける CYP1A1 の寄与が異なるためと考えられる。

代謝は、ラットにおけるリオシグアトの主な消失経路であった（未変化体の排泄率は投与量の

50％未満）。ラット糞中では、未変化体（投与量の 37～41％）とともに水酸化代謝物 M-9（投与

量の 19～20％）が主成分であった。ラットの尿中では、未変化体（投与量の 4％）、M-1（投与

量の 2％）及び M-6/M-7（投与量の 2～3％）が排泄された放射能の大部分を占めた。

イヌにおいては、リオシグアトの代謝による消失がより顕著であった（未変化体の排泄率は投

与量の 10％未満）。イヌの糞中には、未変化体が投与量の 8％排泄されたが、M-1 及びそのグル



クロン酸抱合体 M-4 の排泄量は合わせて投与量の 42％であった。イヌの尿中では、M-1 が排泄さ

れた放射能の大部分を占めた（投与量の 6％）。未変化体は、投与量の 1％が尿中に排泄された。

ヒトにおける消失は、腎排泄（33～45％）と胆汁／糞中排泄（48～59％）がほぼ同程度であっ

た。

ラットにおいて、放射能は主に胆汁／糞を介して排泄され、尿中には投与量の約 15％が排泄

された。投与量の 24％が胆汁外に排泄、すなわち消化管粘膜を介して消化管内に分泌され、恐

らく P-gp 及び BCRP を介した能動輸送の関与が示唆される。授乳中のラットにおいて、少量の放

射能の乳汁中移行が認められた。

イヌにおいて、放射能は主に胆汁／糞を介して排泄され、尿中には経口投与量の約 13％が排

泄された。

リオシグアト及び M-1 は P-gp 及び BCRP の基質に分類され、これらのトランスポーターは恐ら

くリオシグアト及び M-1 の排泄に関与していると考えられる。能動的な腎分泌は、リオシグアト

の主消失経路ではなかったことから（5.3.3.4.3 PH-35000 参照）、P-gp 及び BCRP が主に関与

しているのは、胆汁中排泄及びラットに認められたような消化管への胆汁外排泄（消化管分泌）

であると考えられ、また、リオシグアトの OCT2 基質特性に臨床的な意義はないと考えられる。

リオシグアト及び M-1 は、CYP、UGT 及び SULT の主要な分子種に対して阻害作用を示さず、主

要な CYP 分子種に対する誘導作用も示さなかった。しかし、リオシグアト及び M-1 は、CYP1A1

に対して阻害作用を示した（Ki値 0.6～0.7μM）。したがって、CYP1A1 によって大部分が代謝さ

れる併用薬と臨床的に問題となる薬物相互作用が起こる可能性は否定できないが、総クリアラン

スに対する CYP1A1 の寄与が大きい薬剤は、現在までにグラニセトロンやエルロチニブなどわず

かに知られているのみである。また、M-1 は UGT1A9 に対して中等度の阻害を示したが、リオシ

グアトの臨床用量における M-1 の血漿中濃度を考慮すると、臨床的に問題となる薬物相互作用は

起こらないと考えられる。

リオシグアトは、治療域の血漿中濃度において、検討したすべてのトランスポーター（P-gp、

BCRP、OCT、OAT 及び OATP）対して阻害作用を示さなかった。したがって、リオシグアトがこれ

らのトランスポーターを阻害することによって、臨床的に問題となる薬物相互作用が起こる可能

性は極めて低いと考えられる。M-1 は、OCT の基質ではなく、リオシグアトの治療域の濃度にお

いて、P-gp、BCRP 及び OCT の阻害剤にもならない。したがって、M-1 がこれらのトランスポー

ターを阻害することによって、薬物相互作用が起こる可能性は極めて低いと考えられる。

ヒト肝ミクロソ－ムにおける M-1 の生成は、HIV プロテアーゼ阻害剤（リトナビル、アタザナ

ビル＞インジナビル＞サキナビル）及びアゾール系抗真菌剤（ケトコナゾール＞クロトリマゾー

ル、ミコナゾール）によって顕著に阻害された。更に、カルベジロール、エチニルエストラジ

オール、ケルセチン及びテルフェナジン並びにチロシンキナーゼ阻害剤エルロチニブ、ゲフィチ

ニブ、イマチニブ及びソラフェニブなどの化合物は、ヒト肝ミクロソームにおける M-1 の生成を

阻害し、IC50 値は 20μM 以下であった。アゾール系抗真菌薬ケトコナゾール、クロトリマゾール

及びミコナゾールは CYP1A1 を顕著に阻害した。同様の CYP1A1 に対する阻害は、カルベジロール、

エバスチン、ケルセチン並びにチロシンキナーゼ阻害剤エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニ

ブ、ソラフェニブ及びスニチニブでも認められた。ゲフィチニブ及びエルロチニブは、恐らく時

間依存的な CYP1A1 の阻害によって M-1 生成を顕著に阻害したと考えられる。

アゾール系抗真菌剤ケトコナゾール及びイトラコナゾール並びに免疫抑制剤シクロスポリン A

は、リオシグアトの P-gp 及び BCRP を介した輸送を in vitro において顕著に阻害した。した



がって、P-gp 及び BCRP の強い阻害剤が、リオシグアトの排泄を阻害することによって血漿中濃

度を増加させる可能性は否定できない。しかし、リオシグアトの細胞膜透過性は中等度であり、

ヒトにおける経口バイオアベイラビリティは高いことから、臨床的に問題となるバイオアベイラ

ビリティの増加は起こらないと考えられる。

ケトコナゾールは in vitro において、M-1 生成の最も強力な阻害剤、かつ排出トランスポー

ターP-gp 及び BCRP の阻害剤である。リオシグアトとケトコナゾールを併用した臨床相互作用試

験において、リオシグアトの曝露量は中等度に増加した（平均 Cmaxは 46％、平均 AUC は 150％増

加した）。ケトコナゾールは in vitro において最も強力な阻害剤の 1 つであることから、in

vitro 試験で検討した他の化合物との併用によって、より顕著な臨床薬物相互作用が起こる可能

性は低いと考えられる。



2.6.4.10 引用文献一覧

1) Westerink WMA et al., Arch Toxicol 2008:82:909-921（4.3.1 添付）

2) EMEA (EMA) Scientific Discussion on Tarceva (Erlotinib) 2005:1-44（4.3.2 添付）

3) FDA, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration,

Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM),

Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 2001:1-25（4.3.3 添付）

4) Awasthi YC et al., Blood 1981:58:733-738（4.3.4 添付）

5) Tassaneeyakul W et al., J Pharmacol Exp Ther 1993:265:401-407（4.3.5 添付）

6) Olesen OV et al., J Clin Psychopharmacol 2000:20:35-42（4.3.6 添付）

7) Anttila S et al., Int J Cancer 1991:47:681-685（4.3.7 添付）

8) Anttila S et al., Pharmacogenetics 2001:11:501-509（4.3.8 添付）

9) Nakamura H et al., Curr Drug Metab 2005:6:469-480（4.3.9 添付）

10) Li J et al., Clin Cancer Res 2007:13:3731-3737（4.3.10 添付）

11) Conney AH et al., J Pharmacol Exp Ther 2012:342:9-14（4.3.11 添付）

12) Grigor MR et al., J Nutr 1987:117:1247-1258（4.3.12 添付）

13) FDA, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration,

Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Guidance for Industry: Waiver of In

vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate-Release Solid Oral

Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System 2000:1-16（4.3.13 添

付）

2.6.5 薬物動態試験概要表Bayer Yakuhin, Ltd. Page 1 of 181

2.6.5.1 薬物動態試験：一覧表

Test article: Riociguat

2.6.5.1-1: Overview on pharmacokinetic studies

Type of study Test system / Species / strain

Route of administr. / method

Admin. compound Testing facility

Report no. Location

Analytical methodsSynthesis [14C]Riociguat

[2H3]RiociguatBayer HealthCare AG

PH-32963 4.2.2.1.1

Synthesis [2H3]Riociguat[2H3]BAY 60-4552

BayerHealthCare AG

PH-34710 4.2.2.1.2

Synthesis [2H3]BAY 60-4552 BayerHealthCare AG

PH-34709 4.2.2.1.3

Synthesis [2H3]BAY 1077251 Bayer HealthCare AG

A49928 4.2.2.1.4

Synthesis [14C]BAY 60-4552 BayerHealth Care AG

PH-34995 4.2.2.1.5

Synthesis [2H3]BAY 60-4552 BayerHealthCare AG

PH-34020 4.2.2.1.6

Bioanalytical method validation

n.a.a / HPLC-MS/MS RiociguatBAY 60-4552

BayerHealthCare AG

A62548 4.2.2.1.7

Bioanalytical method validation

n.a.a / HPLC-MS/MS RiociguatBAY 60-4552

Bayer HealthCare AG

PH-36889Version 2

4.2.2.1.8


2.6.5.1 薬物動態試験：一覧表（続き）


2.6.5.1-1: Overview on pharmacokinetic studies (continued)




Report no. Location

AbsorptionAbsorption Rat / Wistar p.o. + i.v. /

LSC + HPLC-MS/MS[14C]Riociguat / Riociguat

Bayer HealthCare AG

PH-33998 4.2.2.2.1

Absorption Dog / Beagle p.o. + i.v. / HPLC-MS/MS Riociguat Bayer HealthCare AG

PH-33934 4.2.2.2.2

Absorption Dog / Beagle p.o. + i.v. / LSC + HPLC-MS/MS

[14C]Riociguat / Riociguat

Bayer HealthCare AG

PH-34490 4.2.2.2.3

DistributionPlasma protein binding Mouse / CD-1

Rat / WistarRabbit / CHBB Dog / BeagleHuman / Caucasian

in vitro / LSC [14C]Riociguat Bayer HealthCare AG

PH-33817 4.2.2.3.1

Extended plasma protein binding

Human / Caucasian in vitro interaction / LSC [14C]Riociguat Bayer HealthCare AG

PH-35485 4.2.2.3.2

Single dose tissue distribution

Rat / WistarRat / Long Evans

i.v. + p.o. / WBA(qualitatively)

[14C]Riociguat Bayer HealthCare AG

PH-34473 4.2.2.3.3

Single dose tissue distribution

Rat / WistarRat / Long Evans

p.o. / WBA(quantitatively)


PH-35543 4.2.2.3.4

Placental transfer Rat / Wistar p.o. / WBA(quantitatively / qualitatively)


A47081 4.2.2.3.5








Report no. Location

Distribution (continued)Repeated dose tissue distribution

Rat / Wistar p.o. / WBA (qualitatively) + LSC (quantitatively)


A50424 4.2.2.3.6

MetabolismMetabolism in vitro Mouse / CD-1,

NMRIRat / WistarRabbit / HimalayaDog / BeagleMonkey / Cynomol-gusHuman / n.a.a

in vitro / hepatocytesliver microsomes


A50539 Version 2

4.2.2.4.1

CYP isoforms involved Human / n.a.a in vitro / liver, kidney, lung and intestinal microsomes recombinant enzymes

Riociguat Bayer HealthCare AG

A51309 Version 2

4.2.2.4.2

Enzyme inhibition CYP Human / n.a.a in vitro / liver microsomesrecombinant enzymes


PH-33080 Version 4

4.2.2.4.3

Enzyme inhibition UGT Human / n.a.a in vitro / liver microsomesrecombinant enzymes


PH-35972 Version 2

4.2.2.4.4

Enzyme inhibition SULT Human / n.a.a in vitro / liver cytosol Riociguat Bayer HealthCare AG

A56475 4.2.2.4.5








Report no. Location

Metabolism (continued)Enzyme induction CYP Human / n.a.a in vitro /

hepatocytesRiociguat Bayer

HealthCare AG

PH-35817 Version 3

4.2.2.4.6

Metabolism in vivo Mouse / CD-1 p.o. [14C]Riociguat Bayer HealthCare AG

PH-36012 Version 2

4.2.2.4.7

Metabolism in vivo Rat / Wistar p.o. + i.v. [14C]Riociguat Bayer HealthCare AG

PH-35341 Version 2

4.2.2.4.8

Metabolism in vivo Dog / Beagle p.o. + i.v. [14C]Riociguat Bayer HealthCare AG

A49675 Version 3

4.2.2.4.9

Metabolism in vivo Human / Caucasian p.o. [14C]Riociguat Bayer HealthCare AG

PH-35338 Version 3

4.2.2.4.10

ExcretionAbsorption and excretion Rat / Wistar p.o. + i.v. /

LSC [14C]Riociguat Bayer

HealthCare AG

PH-33933 4.2.2.5.1

Absorption and excretion Dog / Beagle p.o. + i.v. / LSC


PH-34490 4.2.2.5.2

Milk secretion Rat / Wistar p.o. / LSC [14C]Riociguat Bayer HealthCare AG

A49741 4.2.2.5.3








Report no. Location

Pharmacokinetic drug interactionsb

Drug effects on biotransformation

Human / n.a.a in vitro / liver microsomesrecombinant CYP1A1


A50207 4.2.2.6.1

Other PK studiesBCS classification Human / n.a.a in vitro Riociguat Bayer

HealthCare AG

PH-36042 Version 3

4.2.2.7.1

P-gp – substrate characteristics / P-gp – inhibition

Recombinant cell line

in vitro Riociguat Bayer HealthCare AG

PH-36092 4.2.2.7.2

BCRP – substrate characteristics



PH-36091 4.2.2.7.3

BCRP – inhibition Recombinant cell line


PH-36202 4.2.2.7.4

OATP1B1 and OATP1B3 substrate characteristics / OATP1B1 and OATP1B3 inhibition



A61912 4.2.2.7.5

OAT1 and OAT3 substrate characteristics / OAT1 and OAT3 inhibition


in vitro Riociguat R-8601Version 2

4.2.2.7.6








Report no. Location

Other PK studies (continued)OCT1, OCT2, OCT3 substrate characteristics / OCT1, OCT2, OCT3 inhibition


in vitro [14C]Riociguat[14C]BAY 60-4552

R-8643 4.2.2.7.7

P-gp – mediated transport – influence of various drugs


In vitro Riociguat Bayer HealthCare AG

PH-36340 4.2.2.7.8

BCRP – mediated transport – influence of various drugs


In vitro Riociguat BayerHealthCare AG

A62552 4.2.2.7.9

Plasma protein binding Mouse / CD-1Rat / WistarDog -/ BeagleHuman / Caucasian

in vitro / LSC [14C]BAY 60-4552 Bayer HealthCare AG

PH-35330 4.2.2.7.10

UGT isoforms involved Human / n.a.a in vitro / liver, kidney, lung and intestinal microsones recombinant enzymes

BAY 60-4552 Bayer HealthCare AG

PH-36003 4.2.2.7.11

Enzyme inhibition CYP Human / n.a.a in vitro / liver microsomesrecombinant enzymes


A49419 Version 2

4.2.2.7.12

Enzyme inhibition UGT Human / n.a.a in vitro / recombinant enzymes


PH-35951 Version 2

4.2.2.7.13

Enzyme inhibition SULT Human / n.a.a in vitro / liver cytosol


A56806 4.2.2.7.14








Report no. Location

Other PK studies (continued)Enzyme induction CYP Human / n.a.a in vitro /

hepatocytesBAY 60-4552 Bayer

HealthCare AG

PH-35806 Version 3

4.2.2.7.15

P-gp – substrate characteristics / P-gp – inhibition


in vitro BAY 60-4552 Bayer HealthCare AG

PH-36158 4.2.2.7.16

BCRP – substrate characteristics / BCRP – inhibition


in vitro BAY 60-4552 Bayer HealthCare AG

PH-36267 4.2.2.7.17

a = not applicableb = for preclinical PK drug interaction studies see “extended protein binding and enzyme inhibition / enzyme induction”. For in vitro PK

interaction see also “clinical pharmacology overview”.


2.6.5.2 分析方法及びバリデーション試験


2.6.5.2-1: Pharmacokinetics: Syntheses of carbon-14 - labeled compound

Location: 4.2.2.1.1Report no.: PH-32963

Report title: BAY 63-2521: Labeling syntheses of BAY 63-2521 with carbon-14 and deuterium

Chemical structure / labeling position, see reaction scheme:

N

N

NF

C14

NN

NH2

NH2

N

O

O

[14C]BAY 63-2521

°C, h

%

SXD 1181

SXD 1268

1) 2)

1) h; 2) h

SXD 1188

SXD 1494

MAI 9591

°C, h; , h

%

h

°C, h

%

°C, h

% over steps

SXD 1493

SXD 1492


2.6.5.2 分析方法及びバリデーション試験（続き）


2.6.5.2-2: Pharmacokinetics: Syntheses of stable isotope - labeled compound


Report title: BAY 63-2521: Syntheses of [2H3]BAY 63-2521 and its Metabolite M-1 BAY 60-4552


NN

N

N

NF

NH2

NH2

N

O

O

H2

H2

H2

,MAI 9594-10

,

PLS 0747

[2H3]BAY 63-2521,

PLS 0748






Report title: Synthesis of [2H3]BAY 60-4552


NN

N

N

NF

NH2

NH2

NH

O

O

H2

H2

H2

MAI 9594-10

[2H3]BAY 60-4552,

PLS 0747




2.6.5.2-4: Pharmacokinetics: Syntheses of carbon-14 - labeled compound


Report title: Radiosynthesis of [14C]BAY 60-4552


N

N

NF

C14

NN

NH2

NH2

NH

O

O

[14C]BAY 60-4552

SXD 1493

°C,

%

SXD 1181

SXD 1268

1) 2)

1) , h; 2) h

yield

SXD 1188

MAI 9591

h

% over steps

°C, h

°C, h

% over steps

SXD 1492

°C, h





Location: 4.2.2.1.4Report no.: A49928

Report title: BAY 60-4552: Labeling Synthesis of [2H3]BAY 1077251, the N-Glucuronide of BAY 60-4552


O

OHO

OH

NH

OH

OH

N

N

NF

NN

NH

NH2

O

H2

H2

H2

O

[2H3]BAY 1077251,

N-Glucuronide of BAY 60-4552,

SXD 2009 PLS 0747

pH °C,

%






Report title: BAY 63-2521: Labeling Synthesis of BAY 60-4552, the Metabolite M-1 of BAY 63-2521, with Deuterium


N

N

NF

NN

NH2

NH2

NH

O

O

H2

H2

H2

[2H3]BAY 60-4552

SXD 1677

h

SXD 1676




2.6.5.2-7: Pharmacokinetics: Analytical methods and validation Location: 4.2.2.1.7Report no.: A62548

Report title: BAY 63-2521: Bioanalytical Methods and Validation for Preclinical and Toxicokinetic StudiesMethod-No, Version

Sample preparation,assay type

MS Type Species Analyte(s) ISTD(s) EffectiveDate

Applied to studies(Study No.)

M1181 Version 1

Protein Precipitation,HPLC-MS/MS

API 3000 Rat, Dog Riociguat [2H3]Riociguat 07 AUG 2003 T0073280, T1072750, T2072968, T4072528, T2074605, I 0001685,

I 8001692M1185 Version 1


API 3000 Mouse Riociguat [2H3]Riociguat 16 FEB 2004 T6073899

M1193 Version 1


API 3000 Rabbit Riociguat [2H3]Riociguat 10 DEC 2004 T1073920

M1212 Version 1


API 3000 Rat, Dog RiociguatM-1 (BAY 60-4552)

[2H3]Riociguat 29 APR 2005 T2074605

M1212 Version 2



[2H3]Riociguat 16 JUL 2005 I 4574-0

M1212 Version 3



[2H3]Riociguat 16 JUL 2005

M1220 Version 1


API 3000 Rat, Dog, Mouse, Rabbit

RiociguatM-1 (BAY 60-4552)

[2H3]Riociguat[2H3]BAY 60-4552

08 NOV 2005 T1076323, T3076325, T4076731, T6076319, T9075089, T1073920,

T4072528, I4574-0M1220 Version 2





21 SEP 2006 T0077024, T2076973, T5076778, T9076321, T1077502, T9078248

M1220 Version 3





30 AUG 2007 T0078366, T9078248, T0080192, T1079546, T0081434 T9078248,

MW1220 Version 4





29 SEP 2010T6081458




2.6.5.2-7: Pharmacokinetics: Analytical methods and validation (continued) Location: 4.2.2.1.7Report no.: A62548

Report title: BAY 63-2521: Bioanalytical Methods and Validation for Preclinical and Toxicokinetic Studies

Method-No, Version, SpeciesBAY 63-2521Precision (P)Accuracy (A)

[%]

BAY 60-4552 (M-1)Precision (P)Accuracy (A)

[%]M1181, Version 1, Rat P: 2.23 – 9.35

A: 90.7 -109n.a.a

M1181, Version 1, Dog P: 1.86 – 4.69A: 89.3 -110

n.a.a

M1185, Version 1, Mouse P: 3.82 – 8.88A: 91.9 -105

n.a.a

M1193, Version 1, Rabbit P: 1.61 – 3.08A: 92.6 -113

n.a.a

M1212, Version 1, Rat n.d.b n.d.b

M1212, Version 1, Dog P: 1.78 – 3.17A: 99.2 - 103

P: 2.52 – 3.84A: 103 - 107

M1212, Version 2, Dog P: 2.72 – 6.66A: 90.9 - 103

P: 3.76 – 7.22A: 90.2 - 103

M1212, Version 2, Rat n.d.a n.d.a

M1212, Version 3, Dog P: 2.72 – 6.66A: 90.9 - 103

P: 3.76 – 7.22A: 90.2 - 103

M1212, Version 3, Rat P: 2.40 – 7.62A: 91.3 - 109

P: 1.47 – 8.59A: 92.6 - 106

M1220, Version 1-4, Dog P: 3.43 – 6.96A: 96.8 - 114

P: 4.83 – 7.58c

A: 98.2 - 112c

P: 4.31 – 7.59A: 96.8 - 103

P: 3.84 – 7.21c

A: 97.5 – 103c




2.6.5.2-7: Pharmacokinetics: Analytical methods and validation (continued)


Report title: BAY 63-2521: Bioanalytical Methods and Validation for Preclinical and Toxicokinetic Studies

Method-No, Version, SpeciesRiociguat

Precision (P)Accuracy (A)

[%]


[%]M1220, Version 1-4, Rat P: 2.87 – 6.69

A: 90.6 – 101P: 3.26 – 9.20c

A: 86.1 – 103c

P: 2.80 – 12.0A: 92.0 - 104

P: 3.56 – 7.48c

A: 99.3 – 103c

M1220, Version 1-4, Mouse P: 3.03 – 7.01A: 96.0 – 98.5

P: 4.76 – 10.1A: 95.2 - 101

M1220, Version 1-4, Rabbit P: 3.37 - 11.0A: 95.2 – 97.6

P: 3.49 – 9.14A: 95.4 - 100

a = not applicableb = not determinedc = For the evaluation of 14C studies the ISTDs were exchanged



Test article: Riociguat2.6.5.2-8: Pharmacokinetics: Analytical methods and validation Location: 4.2.2.1.8

Report no.: PH-36889 V2Report title: BAY 63-2521: Bioanalytical Methods and Validation for Clinical Studies

Method-No, Version RiociguatPrecision (P)Accuracy (A)

[%]


[%]BAY 63-2521/P/Version 1.01 P: 2.80 - 8.40

A: 89.6 - 104n.a.

M1213 Version 1, automated work-up P: 2.98 - 7.31A: 97.7 - 105

P: 2.98 - 9.26A: 98.7 - 107

M1213 Version 1, manual work-up in HPLC glass vials

P: 2.38 - 6.13A: 94.7 - 105

P: 2.48 - 8.24A: 94.6 - 105

M1213 Version 2 and 3 P: 2.45 - 3.58A: 99.8 - 109

P: 1.87 - 4.03A: 98.0 - 105

M1286 Version 1 P: 4.06 - 9.89A: 92.7 - 111

P: 2.65 - 7.19A: 97.0 - 102

MW1286 Version 2 P: 3.22 - 4.19A: 97.4 - 103

P: 2.72 - 5.73A: 101 - 105

MW1286 Version 2, Triton X100 procedure for infectious samples

P: 3.14 - 5.36A: 108 - 113

P: 3.57 - 4.52A: 103 - 108

MW1370 Version 1 to 5 P: 1.65 - 3.22A: 98.7 - 103

P: 1.93 - 3.71A: 99.2 - 101

MW1425 Version 1 and 2 P: 1.74 - 2.43A: 100 - 102

P: 1.56 - 4.79A: 98.0 - 103

MW1472 Version 1 P: 1.28 - 5.45A: 92.7 - 113

P: 1.85 - 6.87A: 95.1 - 112




2.6.5.2-8: Pharmacokinetics: Analytical methods and validation (continued)

Location: 4.2.2.1.8Report no.: PH-36889 V2

Report title: BAY 63-2521: Bioanalytical Methods and Validation for Clinical Studies

Method-No, Version RiociguatPrecision (P)Accuracy (A)

[%]


[%]MW1498 Version 1 P: 1.72 - 3.22

A: 92.5 - 93.9P: 1.78 - 4.18A: 93.5 - 95.1

MW1506 Version 1 P: 1.54 - 5.61A: 97.9 - 100

P: 1.97 - 3.94A: 96.8 - 104

MW1507 Version 1 P: 2.38 - 4.61A: 100 - 105

P: 0.85 - 6.92A: 103 - 104

n.a = not applicable


2.6.5.3 薬物動態試験：単回投与後の吸収


2.6.5.3-1: Pharmacokinetics: Absorption / basic PK after a single dose, rodent


Species / strain: Rat / Wistar Rat / Wistar Rat / Wistar Rat / WistarAdmin. compound: Riociguat [14C]Riociguat Riociguat RiociguatAnalyte: Riociguat Riociguat Riociguat RiociguatDose: [ mg/kg] 0.3 1 0.3 1Route: i.v. i.v. p.o. p.o.Gender / No. of animals: M / 3 M / 3 M / 3 M / 3Feeding condition: Fasted Fasted Fasted FastedFormulation: 10% ethanol,

30% PEG 400, 60% aqua demin.

10% ethanol, 30% PEG 400,

60% aqua demin.

15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua

demin.

15% ethanol, 45% PEG 400,

40% aqua demin.Duration: [h] 24 168 24 24Assay: HPLC-MS/MS HPLC-MS/MS HPLC-MS/MS HPLC-MS/MS

Parameter Unit Pharmacokinetic parameters were calculated from the geometric means of the concentrationsAUC [µg·h/L] 228 820 79.6 363AUCnorm [kg·h/L] 0.760 0.820 0.265 0.363AUC(0-tn) [µg·h/L] 224 818 77.7 358tn [h] 4 8 8 8Cmax [µg/L] n.c.a n.c.a 26.7 146Cmax,norm [kg/L] n.c.a n.c.a 0.0891 0.146tmax [h] n.c.a n.c.a 1.00 0.500t1/2 [h] 0.748 0.992 1.42 1.17Interval [h] 1-4 1-8 2-8 2-8CL [L/(kg·h)] 1.32 1.22 n.a.b n.a.b

Vss [L/kg] 1.16 1.23 n.a.b n.a.b

Fc [%] - (100) 34.9d 44.2

a = not calculated b = not applicablec = absolute bioavailability using intravenous administration of 1 mg/kg b.w. as reference d = absolute bioavailability using intravenous administration of 0.3 mg/kg b.w. as reference


2.6.5.3 薬物動態試験：単回投与後の吸収（続き）

Test article: Riociguat2.6.5.3-1: Pharmacokinetics: Absorption / basic PK after a single dose, rodent (continued) Location: 4.2.2.2.1

Report no.: PH-33998Species / strain: Rat / Wistar Rat / Wistar Rat / Wistar

Admin. compound: [14C]Riociguat [14C]Riociguat [14C]Riociguat

Analyte: Riociguat Radioactivity Radioactivity

Dose: [ mg/kg] 3 1 3

Route: p.o. i.v. p.o.

Gender / No. of animals: M / 3 M / 3 M / 3

Feeding condition: Fasted Fasted Fasted

Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.

10% ethanol, 30% PEG 400, 60% aqua demin.

15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.

Duration: [h] 168 168 168

Assay: HPLC-MS/MS LSC LSC

Parameter Unit Pharmacokinetic parameters were calculated from the geometric means of the concentrationsAUC [µg·h/L] 1524 1291d 2572 d

AUCnorm [kg·h/L] 0.508 1.29 0.857AUC(0-tn) [µg·h/L] 1456 1278 d 2545 d

tn [h] 24 30 48Cmax [µg/L] 420 n.c.a 736 d

Cmax,norm [kg/L] 0.140 n.c.a 0.245tmax [h] 1.50 n.c.a 1.50t1/2 apparent [h] 1.15 1.27 1.19Interval [h] 2-8 2-8 3-8t1/2 [h] 12.4 8.63 17.1Interval [h] 8-24 8-30 24-48CL [L/(kg·h)] n.a.a n.a.a n.a.a

Vss [L/kg] n.a.a n.a.a n.a.a

Fb [%] 62.0 n.a.a n.a.a

fc [%] n.a.a (100) 66.4

a = not applicableb = absolute bioavailability using intravenous administration of 1 mg/kg b.w. as referencec = extent of absorption calculated with AUCnorm after i.v. administrationd = shown as µg equivalent to riociguat



Test article: Riociguat2.6.5.3-2: Pharmacokinetics: Absorption / basic PK after a single dose, non-rodent Location: 4.2.2.2.2

Report no.: PH-33934Species / strain: Dog / Beagle Dog / Beagle Dog / BeagleAdmin. compound: Riociguat Riociguat RiociguatAnalyte: Riociguat Riociguat RiociguatDose: [ mg/kg] 0.03 0.03 0.3Route: i.v. infusion (T = 1 h) p.o. p.o.Gender / No. of animals: F / 3 F / 3 F / 3Feeding condition: Fasted Fasted FastedFormulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.Duration: [h] 168 24 24Assay: HPLC-MS/MS HPLC-MS/MS HPLC-MS/MS

Geometric Geometric GeometricParameter Unit Mean S.D. Mean S.D. Mean S.D.

AUC [µg·h/L] 95.0 1.14 55.9 1.16 876 1.22AUCnorm [kg·h/L] 3.17 1.14 1.86 1.16 2.92 1.22AUC(0-8) [µg·h/L] 92.8c 1.13 53.8 1.16 734 1.38AUC(0-8)norm [kg·h/L] 3.09c 1.13 1.79 1.16 2.45 1.38tn [h] 9 8 24Cmax [µg/L] 42.2 1.21 16.1 1.39 211 1.74Cmax,norm [kg/L] 1.41 1.21 0.538 1.39 0.705 1.74tmax [h] 1.00 1.00 1.00 2.00 1.44 1.42t1/2 apparent [h] n.c.b n.c.b n.c.b n.c.b 1.88 1.27Interval [h] n.c.b n.c.b n.c.b n.c.b 3-8t1/2 [h] 1.66 1.12 1.50 1.13 4.26 1.46Interval [h] 3-9 3-8 8-24CL [L/(kg·h)] 0.316 1.14 n.a.d n.a.d n.a.d n.a.d

Vss [L/kg] 0.610 1.16 n.a.d n.a.d n.a.d n.a.d

Fa [%] n.c.b n.c.b 58.0 1.15 79.1 1.38

a = bioavailability, calculated with the AUC(0-9)norm value of 0.03 mg/kg i.v. and AUC(0-8)norm of oral administrationb = not calculatedc = AUC(0-9)d = not applicable



Test article: Riociguat2.6.5.3-3: Pharmacokinetics: Absorption / basic PK after a single dose, non-rodent Location: 4.2.2.2.3

Report no.: PH-34490Species / strain: Dog / Beagle Dog / Beagle Dog / BeagleAdmin. compound: [14C]Riociguat [14C]Riociguat [14C]RiociguatAnalyte: Radioactivity Radioactivity RiociguatDose: [ mg/kg] 0.3 0.6 0.3

Route: i.v. infusion (T = 1 h) oral i.v. infusion (T = 1 h)Gender / No. of animals: F / 3 F / 3 F / 3Feeding condition: Fasted Fasted FastedFormulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.Duration: [h] 168 168 168Assay: LSC LSC HPLC-MS/MS


AUC [µg·h/L] 3293d 1.27 5120d 1.10 1203 1.17AUCnorm [kg·h/L] 11.0 1.27 8.53 1.10 4.01 1.17AUC(0-tn) [µg·h/L] 3099d 1.24 4680d 1.07 1188 1.18tn [h] 144 168 24Cmax [µg/L] 484d 1.13 358d 1.28 395 1.04Cmax,norm [kg/L] 1.61 1.13 0.596 1.28 1.32 1.04tmax [h] 1.00 1.00 2.88 1.42 1.00 1.00t1/2 [h] 91.2 1.47 85.7 1.20 2.42 1.34Interval [h] 48-168 72-168 1.05-24CL [L/(kg·h)] n.a.b n.a.b n.a.b n.a.b 0.249 1.17Vss [L/kg] n.a.b n.a.b n.a.b n.a.b 0.732 1.03Fa [%] n.a.b n.a.b n.a.b n.a.b n.a.b n.a.b

fc [%] n.a.b n.a.b 77.7 1.21 n.a.b n.a.b

a = absolute bioavailability calculated with the AUCnorm after i.v. administrationb = not applicablec = extent of absorption calculated with AUCnorm after i.v. administrationd = shown as equivalent to riociguat




2.6.5.3-3: Pharmacokinetics: Absorption / basic PK after a single dose, non-rodent (continued)


Species / strain: Dog / Beagle Dog / Beagle Dog / BeagleAdmin. compound: [14C]Riociguat [14C]Riociguat [14C]RiociguatAnalyte: Riociguat BAY 60-4552 BAY 60-4552Dose: [ mg/kg] 0.6 0.3 0.6Route: p.o. i.v. infusion (T = 1 h) p.o.Gender / No. of animals: F / 3 F / 3 F / 3Feeding condition: Fasted Fasted FastedFormulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% demineralized waterDuration: [h] 48 30 48Assay: HPLC-MS/MS HPLC-MS/MS HPLC-MS/MS


AUC [µg·h/L] 1163 1.25 926 1.18 1574 1.05AUCnorm

b [kg·h/L] 1.94 1.25 3.19 1.18 2.71 1.05AUC(0-tn) [µg·h/L] 894 1.23 909 1.17 1508 1.05tn [h] 8 30 24Cmax [µg/L] 205 1.32 101 1.18 151 1.07Cmax,norm

b [kg/L] 0.342 1.32 0.349 1.18 0.260 1.07tmax [h] 0.909 2.81 2.62 1.26 3.30 1.18t1/2 [h] 3.04 2.09 4.90 1.06 4.82 1.11Interval [h] 1.5-8 2-30 4-24CL [L/(kg·h)] n.a.c n.a.c n.a.c n.a.c n.a.c n.a.c

Vss [L/kg] n.a.c n.a.c n.a.c n.a.c n.a.c n.a.c

Fa [%] 48.3 1.40 n.a.c n.a.c n.a.c n.a.c

fd [%] n.a.c n.a.c n.a.c n.a.c n.a.c n.a.c

Rme [%] n.a.c n.a.c 79.6 1.11 140 1.29

a = absolute bioavailability calculated with the AUCnorm after i.v. administration b = in case of M-1 as analyte - dose-normalization with respect to the molecular weight of M-1c = not applicabled = extent of absorption calculated with AUCnorm after i.v. administratione = metabolic ratio AUCnorm M-1 / AUCnorm riociguat


2.6.5.4 薬物動態試験：反復投与後の吸収

反復投与後のトキシコキネティクス試験における薬物動態パラメータは 2.6.7.3.1 リオシグアトのトキシコキネティクス成績を参照のこと。


2.6.5.5 薬物動態試験：分布、組織分布


2.6.5.5-1: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, qualitative, single dose


Report title: BAY 63-2521: Whole-body Autoradiography in Rats after Single Intravenous and Oral Administration of [14C]BAY 63-2521. Study No.: I 6001690

Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Assay: WBA RadioluminographyAdmin. compound: [14C]Riociguat Gender / no.: M / 1Analyte: Radioactivity Feeding conditions: FastedDose: 3 mg/kg Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 50% aqua demin.Tissue distribution of radioactivity in male albino rats; 2 - 8 h post-orally (selected organs)Highest exposure Moderate exposure Low exposureGIT contents, contents of bile ducts, GIT mucosa, kidney medullary rays, bladder, urine, hair follicles

Liver, adrenal cortex, kidney outer medulla > adrenal medulla, aorta wall, elastic fibers, lacrimal glands, kidney inner medulla and cortex, pancreas, cowperian gland, skin > (moderate to low) blood, skeletal muscles, lungs, heart, prostate, epididymides, salilvary gland, thyroid

White adipose tissue, testes, eye wall, vitreous body > (limit of detection) brain, spinal cord, eyelens, spinal nerves, bone

Additional information: The qualitative distribution pattern of radioactivity proved to be independent of the route of administration.The qualitative distribution pattern of radioactivity proved to be independent of the sex.No penetration of the blood/brain barrier was detected.Significant affinity of the drug and/or its metabolites for melanin - bearing tissues, particularly the eye wall (uveal tract).Virtually complete elimination after 7 days post-orally. Low residual radioactivity in large intestinal contents and mucosa, bile ducts contents and liver, skin and hair follicles.Apart from the enrichments found in the pigmented eye wall and skin, there was no evidence on irreversible binding or retention of radioactivity in organs and tissues of rats.


2.6.5.5 薬物動態試験：分布、組織分布（続き）


2.6.5.5-2: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative, single dose Location: 4.2.2.3.4Report no.: PH-35543

Report title: BAY 63-2521: Quantitative Whole-body Autoradiography. Distribution of Radioactivity and Elimination from Blood, Organs and Tissues after Single Oral Administration to Male Wistar Rats and Pigmented Long Evans Rats of [14C]BAY 63-2521. Study No.: I 4705-6

Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Assay: RadioluminographyAdmin. compound: [14C]Riociguat Gender / no.: M / 3Analyte: Radioactivity Feeding conditions: FastedDose: 3 mg/kg Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% distilled water

AUC(0-24) AUC Ceqmax Ceqmax RatioOrgan / tissue [µg-eq·h/L] [µg-eq·h/L] [µg-eq/L] Organ / blood

Adipose tissue, brown 1646 1646 466 1.19Adipose tissue, white 668 668 210 0.540Adrenal cortex 9082 9147 2429 6.23Adrenal medulla 2959 2997 889 2.28Adrenals (average) 7964 8024 2176 5.58Aorta wall 2822 2869 755 1.94Blood (heart) 1710 4898 390 1.00Bone marrow 1165 1165 319 0.819Brain n.c.a n.c.a 7.86 0.0202Cardiac muscle 2060 2098 542 1.39Eyes (without wall) 224 224 41.6 0.107Eye wall 1236 1285 268 0.688Harderian gland 3557 3598 889 2.28Kidney cortex 4959 5156 1584 4.06Kidney inner medulla 3966 4028 1187 3.04Kidney outer medulla 18626 22670 2688 6.90Kidneys (average) 10532 12050 1798 4.61Liver 13549 27193 2829 7.26Lungs 1641 3086 407 1.04Pancreas 2263 2263 709 1.82




2.6.5.5-2: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative, single dose (continued)



Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Assay: RadioluminographyAdmin. compound: [14C]Riociguat Gender / no.: M / 3Analyte: Radioactivity Feeding conditions: FastedDose: 3 mg/kg Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.

AUC(0-24) AUC Ceqmax Ceqmax RatioOrgan / tissue [µg-eq·h/L] [µg-eq·h/L] [µg-eq/L] Organ / bloodSeminal vesicles 1913 2016 274 0.703Skeletal muscle, dorsal 1128 1128 319 0.819Skin, dorsal 1993 n.c.a 371 0.952Skin, ventral 2375 n.c.a 313 0.802Spleen 1754 1754 617 1.58Submandibulary glands 2319 2345 633 1.62Testes 509 510 78.7 0.202Thymus 1226 1226 346 0.888Thyroid 13252 41639 693 1.78Urinary bladder, wall 2198 2198 523 1.34Blood (LSC)b 1614 4694 364 0.934Plasma (LSC)b 1742 1781 423 1.08

a = not calculatedb = rough estimate, due to calculation of t1/2 with 2 points



Test article: Riociguat2.6.5.5-3: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative, single dose Location: 4.2.2.3.4

Report no.: PH-35543Report title: BAY 63-2521: Quantitative Whole-body Autoradiography. Distribution of Radioactivity and Elimination from Blood, Organs and

Tissues after Single Oral Administration to Male Wistar Rats and Pigmented Long Evans Rats of [14C]BAY 63-2521. Study No.: I 4705-6


tmax t1/2 Regression range truncated evaluationOrgan / tissue [h] [h] [h] t1/2 [h] Regression range [h]Adipose tissue, brown 1.5 1.44 1.5-8 1.44 1.5-8Adipose tissue, white 1.5 1.62 1.5-8 1.62 1.5-8Adrenal cortex 0.5 3.68 4-24Adrenal medulla 0.5 4.46 4-24Adrenals (average) 0.5 3.75 4-24Aorta wall 1.5 4.08 1.5-24Blood (heart) 1.5 159 24-168 1.69 1.5-8Bone marrow 0.5 1.58 1.5-8 1.58 1.5-8Brain 0.5 n.c.a

Cardiac muscle 1.5 4.75 4-24Eyes (without wall) 1.5 2.28b 4-8 2.28b 4-8Eye wall 0.5 5.57 4-24Harderian gland 1.5 4.01 4-24Kidney cortex 0.5 6.19 8-72 1.68 1.5-8Kidney inner medulla 0.5 4.46 4-24Kidney outer medulla 1.5 30.9 24-168 3.76 1.5-8Kidneys (average) 1.5 12.5 8-72 2.96 1.5-8Liver 0.5 49.9 8-168 2.04 1.5-8Lungs 0.5 93.5 24-168 1.74 1.5-8Pancreas 0.5 1.49 1.5-8 1.49 1.5-8

a = not calculated




2.6.5.5-3: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative, single dose (continued) Location: 4.2.2.3.4Report no.: PH-35543



truncated evaluationtmax t1/2 Regression range t1/2 Regression range

Organ / tissue [h] [h] [h] [h] [h]

Seminal vesicles 4 5.27 4-24

Skeletal muscle, dorsal 1.5 1.55 1.5-8 1.55 1.5-8

Skin, dorsal 1.5 n.c.a n.c.a 2.65 1.5-8

Skin, ventral 1.5 n.c.a n.c.a 2.30b 4-8

Spleen 0.5 1.40 1.5-8 1.40 1.5-8

Submandibulary glands 1.5 4.19 4-24

Testes 4 2.45b 4-8 2.45b 4-8

Thymus 1.5 1.50 1.5-8 1.50 1.5-8

Thyroid 1.5 51.0 8-168

Urinary bladder, wall 1.5 1.09b 4-8 1.09b 4-8

Blood (LSC)c 1.42 176 23.9-168 1.85 1.42-7.92

Plasma (LSC)c 1.42 4.70 3.92-23.9

a = not calculatedb = rough estimate, due to calculation of t1/2 with 2 points c = samples drawn immediatly before sacrifice, measurement by liquid scintillation counting (LSC)




2.6.5.5-4: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative, single dose, pigmented rats Location: 4.2.2.3.4Report no.: PH-35543


Species / strain: Rat / Long Evans Route: Oral Assay: RadioluminographyAdmin. compound: [14C]Riociguat Gender / no.: M / 1Analyte: Radioactivity Feeding conditions: FastedDose: 3 mg/kg Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.

AUC(t1-tn) AUC(tn-∞) t1/2 Points used for RegressionOrgan / tissue [µg-eq·h/L] [µg-eq·h/L] [h] regression range [h]Adipose tissue, white n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a

Adrenal glands (average) n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a

Blood (heart) n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a

Bone marrow n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a

Brain n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a

Eyes (without wall) 1607 55.1 206 2 72-168Eye wall, pigmented 230007 13.7 114 3 72-336Harderian gland n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a

Kidney cortex 463 31.9 35.7 2 24-72Kidney inner medulla n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a

Kidney outer medulla 1862 7.96 15.8 2 24-72Kidneys (average) 1018 10.8 18.0 2 24-72Liver 17732 14.5 118 3 72-336Skeletal muscle, dorsal n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a

Skin highly pigmented, dorsal 33074 16.3 120 3 72-336Skin less pigmented, dorsal n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a

Thyroid 46925 7.24 82.8 3 72-336

a = not calculated




2.6.5.5-5: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative and qualitative, single dose, pregnant rats


Report title: BAY 63-2521: Quantitative Whole-body Autoradiography. Distribution of Radioactivity and Elimination from Blood, Organs, Tissues, and Fetuses after Single Oral Administration of [14C]BAY 63-2521 to Pregnant Rats. Study No.: I 5078-0

Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Assay: RadioluminographyAdmin. compound: [14C]Riociguat Gender / no.: F / 1Analyte: Radioactivity Gestation day: 19th Feeding conditions: FastedDose: 3 mg/kg Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.

AUC (0-24) AUC(0-tn) Ceqmax Ceqmax RatioOrgan / tissue [µg-eq·h/L] [µg-eq·h/L] [µg-eq/L] Organ/BloodAdipose tissue, brown 2565 1067 208 0.776Adipose tissue, white n.c.a 558 113 0.423Adrenal glands 17220 17220 2367 8.84Amnion 8176 8176 826 3.08Amniotic fluid 400 143 25.6 0.0956Blood (heart) 2751 2751 268 1.00Brain 147 10.8 8.77 0.0327Cardiac muscle n.c.a 2591 437 1.63Kidney, cortex 7124 7124 1052 3.93Kidney, inner medulla 5693 5693 627 2.34Kidney, outer medulla 16634 16634 1437 5.36Kidneys (average) 10732 10732 949 3.54Liver 17613 17613 2178 8.13Lungs 3342 3342 386 1.44Mammary glands 7127 7127 376 1.40Ovaries 1505 1505 204 0.762Placentae 2462 2462 239 0.891Skeletal muscle (dorsal) n.c.a 1105 178 0.666Skin (dorsal) n.c.a 1083 185 0.691Skin (ventral) 2031 2031 182 0.679




2.6.5.5-5: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative and qualitative, single dose, pregnant rats (continued)




AUC (0-24) AUC(0-tn) Ceqmax Ceqmax RatioOrgan / tissue [µg-eq·h/L] [µg-eq·h/L] [µg-eq/L] Organ/BloodSpleen 3701 3701 434 1.62Submandibulary gland 4440 4440 500 1.87Thyroid 5753 5753 519 1.94Uterus n.c.a 1751 293 1.09Fetal blood 1473 1473 140 0.522Fetal brain 671 671 73.0 0.273Fetal kidneys 1951 1951 176 0.657Fetal liver 2019 2019 186 0.695Fetal skeletal muscles 1577 1577 162 0.605Fetal skin 1746 1746 138 0.516Fetus (average) 1528 1528 154 0.573

a = not calculated




2.6.5.5-6: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative and qualitative, single dose, pregnant rats




tmax t1/2 Regression rangeOrgan / tissue [h] [h] [h]Adipose tissue, brown 0.500 n.c.a -Adipose tissue, white 1.50 n.c.a -Adrenal glands 0.500 2.70b 8-24Amnion 8.00 5.53b 8-24Amniotic fluid 4.00 18.1b 4-8Blood (heart) 0.500 3.49b 8-24Brain 0.500 21.8b 0.5-1.5Cardiac muscle 0.500 n.c.a -Kidney, cortex 0.500 2.93b 8-24Kidney, inner medulla 0.500 2.69b 8-24Kidney, outer medulla 8.00 3.21b 8-24Kidneys (average) 0.500 3.39b 8-24Liver 0.500 4.06b 8-24Lungs 0.500 2.81b 8-24Mammary glands 8.00 32.5b 8-24Ovaries 1.50 4.26 4-24Placentae 8.00 3.38b 8-24Skeletal muscle (dorsal) 8.00 n.c.a -Skin (dorsal) 8.00 n.c.a -Skin (ventral) 8.00 3.55b 8-24




2.6.5.5-6: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative and qualitative, single dose, pregnant rats (continued)



Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Assay: RadioluminographyAdmin. compound: [14C]Riociguat Gender / no.: F / 1Analyte: Radioactivity Gestation day: 19th Feeding conditions: fastedDose: 3 mg/kg Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.

tmax t1/2 Regression rangeOrgan / tissue [h] [h] [h]Spleen 1.50 2.95b 8-24Submandibulary gland 0.500 2.62b 8-24Thyroid 8.00 3.84b 8-24Uterus 0.500 n.c.a -Fetal blood 8.00 4.09b 8-24Fetal brain 0.500 4.74b 8-24Fetal kidneys 8.00 4.95b 8-24Fetal liver 8.00 4.45b 8-24Fetal skeletal muscles 8.00 3.80b 8-24Fetal skin 8.00 5.49b 8-24Fetus (average) 8.00 3.95b 8-24

a = not calculatedb = rough estimate, due to calculation of t1/2 with 2 points




2.6.5.5-7: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative, repeated dose Location: 4.2.2.3.6Report no.: A50424

Report title: BAY 63-2521: Quantitative Whole-body Autoradiography. Distribution of Radioactivity and Elimination from Blood, Plasma, Organs and Tissues after Repeated Oral Administration of [14C]BAY 63-2521 to Male Wistar Rats. Study No.: I 5174-7

Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Assay: RadioluminographyAdmin. compound: [14C]Riociguat Gender / no.: M / 3Analyte: Radioactivity Feeding conditions: FastedDose: 14 x 3 mg/kg Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.

AUC(0-24) AUC Ceqmax Ceqmax RatioOrgan / tissue [µg-eq·h/L] [µg-eq·h/L] [µg-eq/L] Organ / bloodAdipose tissue, brown 2410 2510 658 1.11Adipose tissue, white n.c.a 560 177 0.298Adrenal cortex 13700 25200 3120 5.25Adrenal medulla 7060 16300 1580 2.66Adrenals (average) 13100 24900 2960 4.98Aorta wall 5840 44900b 1300 2.19Blood (heart) 4490 83500b 594 1.00Bone marrow 1810 15300b 434 0.731Brain n.c.a n.c.a n.c.a n.c.a

Cardiac muscle 3170 12000b 728 1.23Eyes (without wall) 486 624 58.9 0.0992Eye wall 1820 1960 404 0.680Harderian gland 4710 7790 1030 1.73Kidney cortex 11700 29500 2490 4.19Kidney, inner medulla 8110 20500 1670 2.81Kidney, outer medulla 31900 57900 3650 6.14Kidneys (average) 18100 34900 2640 4.44Liver 28700 112000 4200 7.07Lungs 3590 34800b 587 0.988Pancreas 3440 3540 892 1.50




2.6.5.5-7: Pharmacokinetics: Organ and tissue distribution, quantitative, repeated dose (continued)




AUC(0-24) AUC Ceqmax Ceqmax RatioOrgan / tissue [µg-eq·h/L] [µg-eq·h/L] [µg-eq/L] Organ / bloodSeminal vesicles 2650 2860 300 0.505Skeletal muscle, dorsal n.c.a 1240 323 0.544Skin, dorsal 2510 3620 402 0.677Skin, ventral 2250 13000b 315 0.530Spleen 4010 34300b 958 1.61Submandibulary gland 3060 3110 753 1.27Testes n.c.a 1600b 98.4 0.166Thymus n.c.a 1530 403 0.678Thyroid 3850 22100b 751 1.26Urinary bladder, wall 2510 2620 538 0.906

a = not calculatedb = rough estimate, due to large extraporated part (>30%)








Organ / tissue [h] [h] [h] [h] [h]Adipose tissue, brown 1.50 n.c.a - 1.79 1.5-8Adipose tissue, white 1.50 n.c.a - 1.65 1.5-8Adrenal cortex 1.50 240 24-336 4.08 4-24Adrenal medulla 1.50 221 24-336 4.85 4-24Adrenals (average) 1.50 248 24-336 4.13 4-24Aorta wall 1.50 993 24-336 4.47 1.5-24Blood (heart) 1.50 584 24-336 3.36 1.5-8Bone marrow 1.50 871 24-168 2.01 1.5-8Brain n.c.a n.c.a - n.c.a -Cardiac muscle 1.50 339 24-336 5.40 4-24Eyes (without wall) 1.50 n.c.a - 3.82 1.5-8Eye wall 1.50 n.c.a - 1.95 1.5-8Harderian gland 1.50 81.8 24-168 5.27 4-24Kidney cortex 1.50 190 24-336 2.10 1.5-8Kidney, inner medulla 1.50 271 24-336 4.82 4-24Kidney, outer medulla 1.50 101 24-336 5.71 1.5-8Kidneys (average) 1.50 135 24-336 3.68 1.5-8Liver 1.50 112 24-336 2.85 1.5-8Lungs 1.50 386 24-336 2.61 1.5-8Pancreas 1.50 n.c.a - 1.77 1.5-8









Organ / tissue [h] [h] [h] [h] [h]Seminal vesicles 1.50 n.c.a - 6.14 4-24Skeletal muscle, dorsal 1.50 n.c.a - 2.06 1.5-8Skin, dorsal 1.50 47.4c 24-72 3.31 1.5-8Skin, ventral 1.50 285 24-336 2.64c 4-8Spleen 1.50 721 24-336 1.76 1.5-8Submandibulary gland 1.50 n.c.a - 4.31 4-24Testes 4.00 n.c.a - 9.35c 4-8Thymus 1.50 n.c.a - 1.93 1.5-8Thyroid 1.50 372 24-336 2.38 1.5-8Urinary bladder, wall 1.50 n.c.a - 2.25 1.5-8

a = not calculatedb = rough estimate, due to large extrapolated part (>30%)c = rough estimate, due to calculation of t1/2 with 2 points







Organ / tissue Ratio AUC(0-24) Ratio Ceqmax Ratio Ceq(24)Adipose tissue, brown 1.46 1.41 n.c. a

Adipose tissue, white n.c. a 0.841 n.c. a

Adrenal cortex 1.51 1.28 2.80Adrenal medulla 2.39 1.78 4.59Adrenals (average) 1.65 1.36 3.03Aorta wall 2.07 1.72 2.88Blood (heart) 2.63 1.52 6.29Bone marrow 1.55 1.36 n.c. a

Brain n.c. a n.c. a n.c. a

Cardiac muscle 1.54 1.34 2.89Eyes (without wall) 2.17 1.42 n.c. a

Eye wall 1.47 1.51 1.12Harderian gland 1.32 1.16 3.41Kidney cortex 2.36 1.57 3.32Kidney, inner medulla 2.04 1.41 3.62Kidney, outer medulla 1.71 1.36 1.98Kidneys (average) 1.72 1.47 2.03Liver 2.12 1.48 2.86Lungs 2.19 1.44 4.49Pancreas 1.52 1.26 n.c.a






Report title: BAY 63-2521: Quantitative Whole-body Autoradiography. Distribution of Radioactivity and Elimination from Blood, Organs and Tissues after Multiple Oral Administration to Male Wistar Rats of [14C]BAY 63-2521. Study No.: I 5174-7


Organ / tissue Ratio AUC(0-24) Ratio Ceqmax Ratio Ceq(24)Seminal vesicles 1.39 1.09 1.63Skeletal muscle, dorsal n.c. a 1.01 n.c. a

Skin, dorsal 1.26 1.08 3.22Skin, ventral 0.947 1.01 1.33Spleen 2.29 1.55 6.90Submandibulary gland 1.32 1.19 2.02Testes n.c. a 1.25 n.c.a

Thymus n.c. a 1.16 n.c.a

Thyroid 0.291 1.08 0.0879Urinary bladder, wall 1.14 1.03 n.c.a

Blood (LSC)b 2.93 1.32 10.1Plasma (LSC)b 1.65 1.19 2.44

a = not calculatedb = liquid scintillation counting (LSC)


2.6.5.6 薬物動態試験：分布、たん白結合


2.6.5.6-1: Pharmacokinetics: Plasma protein binding in vitro


Report title: BAY 63-2521: Investigation of the Stability in Plasma, Binding to Plasma Proteins, Reversibility of Binding, and Erythrocyte/Plasma Partitioning of [14C]BAY 63-2521 in Vitro. Study Nos.: B4-63-2521-55, B5-63-2521-57, B6-63-2521-58

Test compound: [14C]Riociguat Method: UltrafiltrationAnalyte: Radioactivity Assay: LSCSpecies / strain / Test system

Gender / no. Matrix Concentration[mg/L]

Fraction bound [%]

Fraction unbound[%]

Rat / Wistar Male + female / 3 Plasma 0.0476 – 2.32 84.3 15.7Human / Caucasian Male + female / 3 Plasma 0.0492 – 2.37 95.0 4.97Dog / Beagle Female / 3 Plasma 0.0503 – 2.36 82.9 17.1Mouse / CD-1 Male / 3 Plasma 0.0486 – 2.31 79.9 20.1Rabbit / CHBB Female / 3 Plasma 0.0485 – 2.31 95.8 4.17Human / Caucasian n.a.b / 3 AGP (0.7 g/L) 0.511 74.6 25.4Human / Caucasian n.a.b / 3 HSA (40 g/L) 0.504 78.6 21.4Human / Causcasian n.a.b / 3 MIXa 0.514 90.1 9.94Fetal calf n.a.b / 3 Williams

Medium0.0496 74.0 26.0

Fetal calf n.a.b / 3 Williams Medium

0.497 41.0 59.0

Fetal calf n.a.b / 3 Williams Medium

2.32 27.6 72.4

a =HSA concentration 40 g/L and AGP concentration 0.7 g/Lb =not applicable


2.6.5.6 薬物動態試験：分布、たん白結合（続き）


2.6.5.6-2: Pharmacokinetics: Blood to plasma concentration ratio in vitro


Report title: BAY 63-2521: Investigation of the Stability in Plasma, Binding to Plasma Proteins, Reversibility of Binding, and Erythrocyte/Plasma Partitioning of [14C]BAY 63-2521 in Vitro. Study Nos.: B4-63-2521-55, B5-63-2521-57, B6-63-2521-58

Test compound: [14C]RiociguatAnalyte: RadioactivitySpecies / strain Gender / no. Conc. in blood (Cb)

[mg/L]Conc. in plasma (Cp)

[mg/L]Cp / Cb

Rat / Wistar Male + female / 3 0.0489 - 2.39 0.0533 - 2.64 1.10Human / Caucasian Male + female / 3 0.0462 - 2.34 0.0690 - 3.58 1.51Dog / Beagle Female / 3 0.0499 - 2.35 0.0590 - 2.63 1.15




2.6.5.6-3: Pharmacokinetics: Binding of riociguat to various plasma proteins


Report title: BAY 63-2521: Extended Investigations on the Binding to Plasma Proteins and Displacement Studies of [14C]BAY 63-2521 in Vitro in Human Plasma . Study No.: I 4733-7, I 4735-9, I 4736-0, I 4737-1

Test compound: [14C]Riociguat Method: UltrafiltrationAnalyte: Radioactivity Assay: LSCSpecies / strain Gender / no. Plasma Protein Subfraction Concentration

[mg/L]Fraction bound

[%]Fraction unbound

[%]Human / Caucasian n.a.a Human Serum albumin (40 g/L) 0.0922 80.2 19.8Human / Caucasian n.a.a α1-acidic glycoprotein (0.7 g/L) 0.0965 77.4 22.6Human / Caucasian n.a.a α –globulin (12 g/L) 0.0966 36.1 63.9Human / Caucasian n.a.a γ-globulin (10 g/L) 0.0985 15.3 84.7Human / Caucasian n.a.a LDL low density lipoprotein (3 g/L) 0.0972 50.1 49.9Human / Caucasian n.a.a Native plasma (control) 0.100 96.0 4.04

a = not applicable




2.6.5.6-4: Pharmacokinetics: Dependence of protein binding of riociguat in human plasma on free fatty acids


Report title: BAY 63-2521: Extended Investigations on the Binding to Plasma Proteins and Displacement Studies of [14C]BAY 63-2521 in Vitro in Human Plasma. Study No.: I 4733-7, I 4735-9, I 4736-0, I 4737-1

Test compound: [14C]Riociguat Method: UltrafiltrationAnalyte: Radioactivity Assay: LSCSpecies / strain Gender / no. Free fatty acid Concentration


[%]Fraction unbound

[%]Human / Caucasian M / 3 Oleic acid (2 mM) 0.101 98.4 1.63Human / Caucasian M / 3 Palmitic acid (2 mM) 0.0945 98.0 1.98Human / Caucasian M / 3 Stearic acid (2 mM) 0.105 98.1 1.88Human / Caucasian M / 3 0.0993 96.1 3.86




2.6.5.6-5: Pharmacokinetics: Dependence of protein binding on pH



Test compound: [14C]Riociguat Method: UltrafiltrationAnalyte: Radioacticvity Assay: LSCSpecies / strain Gender / no. Matrix Concentration pH Fraction bound Fraction unbound

[mg/L] [%] [%]Human / Caucasian M / 3 Plasma 0.0964 7.13 95.8 4.20Human / Caucasian M / 3 Plasma 0.108 7.42 96.1 3.94Human / Caucasian M / 3 Plasma 0.100 7.59 96.4 3.56Human / Caucasian M / 3 Plasma 0.105 7.79 96.7 3.35




2.6.5.6-6: Pharmacokinetics: Displacement studies with highly bound drugs



Test compound: [14C]Riociguat Method: UltrafiltrationAnalyte: Radioactivity Assay: LSCSpecies / strain Gender / no. Interacting drug Concentration


[%]Fraction unbound

[%]Human / Caucasian M / 3 Ibuprofen (50 mg/L) 0.0965 96.72 3.28Human / Caucasian M / 3 Ibuprofen (250 mg/L) 0.0976 96.18 3.82Human / Caucasian M / 3 Warfarin (3 mg/L) 0.0972 95.90 4.10Human / Caucasian M / 3 Warfarin (15 mg/L) 0.0973 94.96 5.04Human / Caucasian M / 3 Nifedipin (1 mg/L) 0.104 95.34 4.66Human / Caucasian M / 3 Nifedipin (5 mg/L) 0.0964 93.65 6.35Human / Caucasian M / 3 Digitoxin (0.1 mg/L) 0.103 96.01 3.99Human / Caucasian M / 3 Digitoxin (0.5 mg/L) 0.105 95.37 4.63Human / Caucasian M / 3 Salicylic acid (200 mg/L) 0.102 93.71 6.29Human / Caucasian M / 3 Salicylic acid (1000 mg/L) 0.100 88.80 11.2Human / Caucasian M / 3 Atorvastatin (0.065 mg/L) 0.102 95.71 4.29Human / Caucasian M / 3 Atorvastatin (0.325 mg/L) 0.102 93.97 6.03Human / Caucasian M / 3 Furosemide (0.5 mg/L) 0.0961 96.09 3.91Human / Caucasian M / 3 Furosemide (2.5 mg/L) 0.0978 94.51 5.49Human / Caucasian M / 3 Sildenafil (1 mg/L) 0.0964 96.31 3.69Human / Caucasian M / 3 Sildenafil (5 mg/L) 0.0985 94.71 5.29Human / Caucasian M / 3 Bosentan (1 mg/L) 0.0999 96.05 3.95Human / Caucasian M / 3 Bosentan (5 mg/L) 0.104 94.41 5.59




2.6.5.6-6: Pharmacokinetics: Displacement studies with highly bound drugs (continued)



Test compound: [14C]Riociguat Method: Equilibrium dialysisAnalyte: Radioactivity Assay: LSCSpecies / strain Gender / no. Interacting drug Concentration


[%]Fraction unbound

[%]Human / Caucasian M / 3 Control (solvent) 0.100 95.01 4.99Human / Caucasian M / 3 Control (solvent) 0.0976 93.27 6.73Human / Caucasian M / 3 Control (solvent) 0.101 95.92 4.08Human / Caucasian M / 3 Control 1 (native) 0.0973 96.02 3.98Human / Caucasian M / 3 Control 2 (native) 0.0999 96.42 3.58Human / Caucasian M / 3 Control 3 (native) 0.102 96.55 3.45Human / Caucasian M / 3 Control 4 (native) 0.104 95.85 4.15


2.6.5.7 薬物動態試験：妊娠または授乳動物における試験（胎盤移行性）

妊娠動物を用いた胎盤移行性の試験成績は 2.6.5.5-5 に記載した。


2.6.5.7 薬物動態試験：妊娠または授乳動物における試験（乳汁分泌）


2.6.5.7-1: Pharmacokinetics: Secretion into the milk, rodent


Report title: BAY 63-2521 (Riociguat): Secretion of Radioactivity into Milk of Lactating Wistar Rats after Single Peroral Administration of [14C]BAY 63-2521. Study No.: I 4647-1

Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Feeding conditions: Ad libitumAdmin. compound: [14C]Riociguat Gender / no.: F / 3 Assay: LSCAnalyte: Radioacitivity Lactating day: 8Dose: 3 mg/kg Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.

Time 1 h 2 h 4 h 8 h 24 h 32 hConcentration Milk a [µg-eq/L] 756 576 1045 795 9.15 3.53Concentration Plasma a [µg-eq/L] 314 235 196 145 2.59 1.37Ratio Milk / Plasmaa 2.41 2.45 5.33 5.47 3.54 2.58Parameter AUC

[µg-eq·h/L]AUC(0-24)[µg-eq·h/L]

Ceqmax

[µg-eq/L]tmax

[h]t1/2

[h] interval

Value Milk a 9190 9132 1045 4.00 2.97 8-32Value Plasma a 2124 2103 314 1.00 3.67 2-32Ratio Milk/ Plasma 4.33 4.34 3.33 4.00 0.810 -

a = geometric mean of n = 3Additional information: Equivalent amount of [14C]riociguat excreted into milk were calculated using the means of the equivalent concentrations of [14C]riociguat in the milk in the respective time interval and the estimated milk flow. The milk flow was estimated on the base of an average body weight of 308 g and a daily milk production of 20% of the body weight. Thus a milk flow of 2.57 mL per hour was assumed [see 2.6.4.6.4]. On this basis calculated, 2.21% of the dose was secreted into the milk within the first 32 h.


2.6.5.8 薬物動態試験：その他の分布試験

該当なし


2.6.5.9 薬物動態試験： In Vivo における代謝


2.6.5.9-1: Pharmacokinetics: Metabolism in vivo, Mouse


Report title: [14C]BAY 63-2521: Biotransformation in Male Mouse

Species / strain: Mouse / CD-1 Route: Oral Gender / no.: Male / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: ad libitumAnalyte: Radioactivity Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. Table: Plasma concentrations [µg-eq/L] and pharmacokinetic parameters of riociguat and metabolite M-1 (BAY 60-4552) after oral

administration of 3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male CD-1 miceTime [h] Total radioactivity Riociguat M-1 (BAY 60-4552)a

0.25 369 333 18.80.5 500 439 35.00.75 487 408 39.11 510 391 89.22 276 191 58.44 221 155 47.08 81.5 59.8 12.024 1.18 1.07 0.107AUC [µg·h/L] 2146 1605 355% AUC(0-tn) 74.8 16.6AUC(0-tn) [µg·h/L] 2142 1601 355AUC(0-24) [µg·h/L] 2142 1601 355Cmax [µg/L] 510 439 89.2C(24)/Cmax [%] 0.231 0.244 0.119t1/2 [h] 2.64 2.78 2.36Points 3 3 5Interval [h] 4-24 4-24 1-24

a dose normalized with respect to the molecular weight


2.6.5.9 薬物動態試験： In Vivo における代謝（続き）


2.6.5.9-2: Pharmacokinetics: Metabolism in vivo, Rat


Report title: [14C]BAY 63-2521: Biotransformation in Male and Female Rats

Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Gender / no.: Male / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MSMSCompound: [14C]Riociguat Dose 3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. Table: Plasma concentrations [µg-eq/L] and pharmacokinetic parameters of riociguat and metabolite M-1 (BAY 60-4552) after oral

administration of 3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male Wistar ratsTime [h] Total radioactivity Riociguat M-1 (BAY 60-4552)0.25 406 365 14.30.5 611 505 34.51 661 535 45.41.5 736 562 64.42 565 414 55.83 373 285 40.94 269 176 33.68 22.0 14.7 4.8824 3.23 2.47 n.s.a

AUC [µg·h/L] 2527 1894 240% AUC 75.0 9.50AUC(0-24) [µg·h/L] 2500 1872 240AUC(tn-) [%] 1.07 1.17 4.21Cmax [µg/L] 736 562 64.4C(24)/Cmax [%] 0.439 0.440 n.c.b

t1/2 [h] 5.78 6.22 1.44Points 2 2 2Interval [h] 8-24 8-24 4-8

a = no sample b = not calculated







Species / strain: Rat / Wistar Route: Intravenous Gender / no.: Male / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 10% ethanol, 30% PEG 400, 60% aqua demin.Table: Plasma concentrations [µg-eq/L] and pharmacokinetic parameters of riociguat and metabolite M-1 (BAY 60-4552) after intravenous

administration of 1 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male Wistar ratsTime [h] Total radioactivity Riociguat M-1 (BAY 60-4552)0.05 946 946 n.s.a

0.1 906 879 14.90.25 789 727 26.60.5 666 547 37.71 433 314 44.82 190 124 25.94 34.4 16.6 7.578 6.31 3.79 0.910AUC [µg·h/L] 1226 933 112% AUC 76.1 9.10AUC(0-8) [µg·h/L] 1217 928 110Cmax [µg/L] 946 946 44.8C(24)/Cmax [%] n.c.b n.c.b n.c.b

t1/2 [h] 1.16 1.11 1.24Points 4 4 4Interval [h] 1-8 1-8 1-8

a = no sample b = not calculated







Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Gender / no.: Male / 5 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 45% PEG 400, 15% ethanol, 40% aqua demin.Table: Metabolic pattern in pooled rat urine following oral administration of 3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male intact Wistar ratsAnimal No. (pool) 163 - 167Data file [.wal] 3204D03 3204D04 3204D05Time period [h] 0 - 8 8 - 24 24 - 48 0 - 48Excretion (% of dose) 7.42 2.92 0.332 10.7Retention time Identification % of % of % of % of % of % of % of % of[min] radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose

calculated16.83 - 18.17 Unknown 0.48 0.0356 0.67 0.0196 0.52 0.055226.33 M-3 5.18 0.384 6.39 0.187 5.79 0.0192 5.51 0.59031.50 - 34.83 Unknown 3.59 0.266 0.79 0.00262 2.51 0.26935.33 Unknown 3.05 0.226 1.14 0.0333 2.42 0.25936.67 Unknown 2.67 0.198 0.60 0.0175 2.02 0.21637.67 - 42.00 Unknown 1.87 0.139 4.82 0.141 2.93 0.00973 2.71 0.29043.00 - 65.33 Unknown 0.70 0.0519 1.92 0.0561 1.01 0.10868.50 Unknown 0.61 0.0453 0.42 0.045374.67 M-6 / M-7 16.18 1.20 18.92 0.552 20.49 0.0680 17.01 1.8278.67 M-10 1.66 0.123 2.03 0.0593 0.94 0.00312 1.73 0.18579.83 M-9 1.56 0.116 1.89 0.0552 1.31 0.00435 1.64 0.17680.83 M-1 14.00 1.04 18.54 0.541 22.39 0.0743 15.51 1.6681.50 - 83.33 Unknown 1.17 0.0868 0.45 0.0131 0.93 0.10086.50 Unknown 4.42 0.328 4.09 0.119 3.03 0.0101 4.27 0.45787.00 - 87.33 Unknown 0.56 0.0416 0.39 0.041688.67 BAY 63-2521 42.14 3.13 38.40 1.12 42.34 0.141 41.03 4.39Metabolites balanced 99.84 7.41 99.86 2.91 100.01 0.332 99.63 10.7Metabolites identified 80.72 5.99 86.17 2.51 93.26 0.310 82.43 8.82




2.6.5.9-5: Pharmacokinetics: Metabolism in vivo, Rat Location: 4.2.2.4.8Report no.: PH-35341 V2


Species / strain: Rat / Wistar Route: Intravenous Gender / no.: Male / 5 Assay: HPLC+LSC, HRMS, MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 10% ethanol, 30% PEG 400, 60% aqua demin. Table: Metabolic pattern in pooled rat urine following intravenous administration of 1 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male intact Wistar ratsAnimal No. (pool) 246 - 250Data file [.wal] 3202D12 3202D14Time period [h] 0-8 8-24 0-24Excretion (% of dose) 13.4 2.80 16.2Retention time Identification % of % of % of % of % of radioactivity % of[min] radioactivity dose radioactivity dose calculated dose15.83 Unknown 0.57 0.0764 0.53 0.0148 0.56 0.091218.00 Unknown 2.41 0.323 2.01 0.0563 2.34 0.37918.50 - 23.33 Unknown 1.27 0.170 1.11 0.0311 1.24 0.20125.00 M-3 12.74 1.71 12.16 0.340 12.65 2.0526.17 - 36.17 Unknown 4.56 0.611 8.51 0.238 5.24 0.84939.17 Unknown 2.96 0.397 1.65 0.0462 2.73 0.44340.50 Unknown 3.14 0.421 2.84 0.0795 3.09 0.50141.50 - 72.33 Unknown 4.13 0.553 2.85 0.0798 3.91 0.63374.17 M-6 / M-7 13.43 1.80 16.22 0.454 13.89 2.2576.00 Unknown 0.89 0.119 0.21 0.00588 0.77 0.12578.83 M-10 2.30 0.308 2.05 0.0574 2.25 0.36579.50 M-9 1.93 0.259 1.40 0.0392 1.84 0.29880.50 M-1 16.25 2.18 24.14 0.676 17.65 2.8682.17 Unknown 0.29 0.0389 0.24 0.038983.67 Unknown 2.42 0.324 1.66 0.0465 2.29 0.37184.33 Unknown 1.96 0.263 1.95 0.0546 1.96 0.31888.33 BAY 63-2521 28.58 3.83 23.42 0.656 27.72 4.49Metabolites balanced 99.83 13.4 102.71 2.88 100.62 16.3Metabolites identified 75.23 10.1 79.39 2.22 75.93 12.3







Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Gender / no.: Female / 3 Assay: HPLC+LSC, HRMS, MSMSCompound: [14C]Riociguat Dose 3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 45% PEG 400, 15% ethanol, 40% aqua demin.Table: Metabolic pattern in pooled rat urine following oral administration of 3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to female intact Wistar ratsAnimal No. (pool) 093/1 - 095/1 093/2 - 095/2 093/3 - 095/3 093 - 095Data file [.wal] 3212H09 3212H10 3212H11Time period [h] 0 - 8 8 - 24 24 - 48 0 - 48Excretion (% of dose) 10.1 4.60 0.528 15.2Retention time Identification % % of % % of % % of % % of[min] radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose

calculated6.50 Unknown 0.17 0.0172 0.11 0.017223.83 M-3 1.72 0.174 1.97 0.0906 1.97 0.0104 1.81 0.27525.00 - 28.33 Unknown 0.45 0.0207 0.14 0.020731.67 Unknown 0.70 0.0707 0.66 0.0304 0.76 0.00401 0.69 0.10532.83 Unknown 0.58 0.0586 0.41 0.0189 0.50 0.00264 0.53 0.080135.83 Unknown 5.78 0.584 4.16 0.191 3.45 0.0182 5.22 0.79336.50 Unknown 4.65 0.470 3.64 0.167 4.13 0.0218 4.34 0.65937.50 - 59.00 Unknown 0.60 0.0606 0.56 0.0258 0.57 0.086468.50 M-6 / M-7 16.58 1.67 17.03 0.783 15.99 0.0844 16.71 2.5476.33 M-11 0.48 0.0485 0.18 0.00828 1.67 0.00882 0.43 0.065677.17 M-10 1.65 0.167 1.10 0.16777.83 M-9 1.41 0.142 1.92 0.0883 2.27 0.0120 1.59 0.24278.50 M-1 11.68 1.18 17.74 0.816 18.17 0.0959 13.75 2.0981.00 Unknown 0.86 0.0869 0.45 0.00238 0.59 0.089384.83 Unknown 0.88 0.0889 1.24 0.0570 0.30 0.00158 0.97 0.14787.17 BAY 63-2521 52.27 5.28 49.43 2.27 50.34 0.266 51.45 7.8296.50 Unknown 0.61 0.0281 0.18 0.0281Metabolites balanced 100.01 10.1 100.00 4.60 100.00 0.528 100.00 15.2Metabolites identified 85.79 8.66 88.27 4.06 90.41 0.478 86.84 13.2







Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Gender / no.: Male / 4 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 45% PEG 400, 15% ethanol, 40% aqua demin.Table: Metabolic pattern in pooled rat urine following oral administration of 3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male bile duct-cannulated ratsAnimal No. (pool) 171, 172, 173, 175Data file [.wal] 3204D06 3204D07Time period [h] 0 - 8 8 - 24 0 - 24Excretion (% of dose) 7.36 4.42 11.8Retention time Identification % of % of % of % of % of % of[min] radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose

calculated16.83 - 18.17 Unknown 0.32 0.0236 0.32 0.0141 0.32 0.037726.33 M-3 4.66 0.343 5.68 0.251 5.03 0.59433.17 - 37.67 Unknown 2.78 0.205 2.73 0.121 2.76 0.32638.17 Unknown 2.91 0.214 1.81 0.21439.83 Unknown 3.40 0.250 2.12 0.25040.83 Unknown 2.90 0.128 1.08 0.12842.00 Unknown 0.32 0.0236 2.97 0.131 1.31 0.15543.00 - 47.33 Unknown 1.44 0.106 0.89 0.0393 1.23 0.14561.00 - 70.00 Unknown 0.52 0.0383 0.27 0.0119 0.43 0.050274.67 M-6 / M-7 15.40 1.13 17.18 0.760 16.02 1.8977.83 Unknown 0.34 0.0250 0.21 0.025078.67 M-10 2.46 0.181 2.17 0.0959 2.35 0.27779.83 M-9 1.38 0.102 1.75 0.0774 1.52 0.17980.83 M-1 14.12 1.04 16.69 0.738 15.08 1.7881.50 - 83.33 Unknown 1.34 0.0986 0.52 0.0230 1.03 0.12286.50 - 87.33 Unknown 2.58 0.190 3.54 0.156 2.93 0.34688.67 BAY 63-2521 45.58 3.35 42.39 1.87 44.24 5.22Metabolites balanced 99.55 7.32 100.00 4.42 99.48 11.7Metabolites identified 83.60 6.15 85.86 3.79 84.24 9.94







Species / strain: Rat / Wistar Route: Intravenous Gender / no.: Male / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 10% ethanol, 30% PEG 400, 60% aqua demin. Table: Metabolic pattern in pooled rat urine following intravenous administration of 1 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male bile duct-

cannulated ratsAnimal No. (pool) 176, 177, 179Data file [.wal] 3204D08 3204D09Time period [h] 0 - 8 8 - 24 0 - 24Excretion (% of dose) 16.0 3.32 19.3Retention time Identification % of % of % of % of % of % of[min] radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose

calculated18.17 Unknown 0.71 0.0236 0.12 0.023626.33 M-3 8.43 1.35 8.43 0.280 8.45 1.6326.83 - 37.67 Unknown 1.96 0.314 2.97 0.0986 2.14 0.41340.83 Unknown 2.86 0.458 1.40 0.0465 2.62 0.50541.33 Unknown 3.27 0.523 2.71 0.52342.00 - 73.50 Unknown 2.73 0.437 4.62 0.153 3.06 0.59074.67 M-6 / M-7 14.48 2.32 16.64 0.552 14.87 2.8775.50 Unknown 0.39 0.0624 0.32 0.062478.67 M-10 2.77 0.443 2.99 0.0993 2.81 0.54279.83 M-9 1.57 0.251 1.40 0.0465 1.54 0.29880.83 M-1 16.40 2.62 19.89 0.660 16.99 3.2881.50 - 83.33 Unknown 1.06 0.170 0.16 0.00531 0.91 0.17586.50 Unknown 2.71 0.434 2.57 0.0853 2.69 0.51988.67 BAY 63-2521 41.36 6.62 38.24 1.27 40.88 7.89Metabolites balanced 99.99 16.0 100.02 3.32 100.00 19.3Metabolites identified 85.01 13.6 87.59 2.91 85.49 16.5



Test article: Riociguat Location: 4.2.2.4.82.6.5.9-9: Pharmacokinetics: Metabolism in vivo, Rat Report no.: PH-35341 V2Report title: [14C]BAY 63-2521: Biotransformation in Male and Female Rats

Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Gender / no.: Male / 5 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. Table: Metabolic pattern in pooled feces extracts after 48 h following oral administration of 3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male intact

Wistar ratsAnimal No. (pool) 163 - 167KNM extracts 3204C08-4 - C12-4 3204C12-4 - C17-4Data file [.wal] 3204G05 - 09 3204G10,11, 13 - 15Time period [h] 0 - 24 24 - 48 0 - 48Excretion (% of dose) 71.7 12.1 83.8Retention time Identification % of radioactivity % of % of radioactivity % of % of radioactivity % of[min] calculated dose calculated dose calculated dose

2.33 - 25.67 Unknown 0.01 0.00820 0.31 0.0372 0.05 0.045426.00 M-3 0.98 0.700 0.56 0.0681 0.92 0.76826.83 - 37.00 Unknown 1.45 1.04 0.17 0.0210 1.27 1.0638.17 - 40.83 Unknown 0.83 0.596 0.01 0.00140 0.71 0.59741.33 Unknown 0.41 0.292 0.00 0.35 0.29242.33 - 63.00 Unknown 0.64 0.457 0.11 0.0135 0.56 0.47163.50 Unknown 0.44 0.316 0.07 0.00810 0.39 0.32464.33 - 73.33 Unknown 0.45 0.326 0.90 0.109 0.52 0.43574.00 M-6 / M-7 5.73 4.11 8.35 1.01 6.11 5.1274.83 Unknown 2.62 1.88 0.14 0.0165 2.27 1.9075.17 - 77.33 Unknown 0.68 0.485 1.33 0.161 0.77 0.64678.00 M-11 1.63 1.17 1.91 0.231 1.67 1.4079.17 M-10 6.67 4.78 7.93 0.959 6.85 5.7480.00 M-9 23.85 17.1 24.71 2.99 23.99 20.180.67 M-1 4.78 3.43 5.31 0.642 4.86 4.0781.50 - 86.00 Unknown 2.68 1.92 3.34 0.404 2.77 2.3286.50 Unknown 0.74 0.529 1.38 0.167 0.83 0.69687.33 Unknown 0.21 0.153 0.16 0.0192 0.21 0.17288.50 BAY 63-2521 44.21 31.7 40.25 4.87 43.68 36.691.33 - 95.33 Unknown 1.09 0.785 2.81 0.340 1.35 1.13Metabolites balanced 100.10 71.8 99.75 12.1 100.13 83.9Metabolites identified 87.85 63.0 89.02 10.8 88.08 73.8







Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Gender / no.: Female / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 45% PEG 400, 15% ethanol, 40% aqua demin.Table: Metabolic pattern in pooled feces extracts after 48 h following oral administration of 3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to female intact

Wistar ratsAnimal No. 093 - 095Time period [h] 0 - 24 24 - 48 0 - 48Excretion (% of dose) 67.7 11.4 79.1Retention time Identification % radioactivity % of % radioactivity % of % radioactivity % of[min] calculated dose calculated dose calculated dose24.33 - 59.00 Unknown 0.174 0.118 0.300 0.0342 0.19 0.15268.17 M-6 / M-7 4.93 3.34 8.95 1.02 5.51 4.3671.83 - 75.67 Unknown 0.487 0.330 0.42 0.33076.50 Unknown 2.88 1.95 2.47 1.9577.50 Unknown 0.0406 0.0275 0.03 0.027578.33 M-11 1.88 1.27 1.90 0.217 1.88 1.4979.17 M-10 6.51 4.41 7.61 0.867 6.68 5.2880.17 M-9 23.9 16.2 25.5 2.91 24.10 19.181.17 M-1 4.99 3.38 4.85 0.553 4.97 3.9382.00 Unknown 0.787 0.533 1.82 0.208 0.94 0.74183.17 Unknown 0.479 0.324 0.41 0.32486.50 Unknown 0.369 0.250 0.877 0.100 0.44 0.35088.50 BAY 63-2521 51.8 35.1 47.2 5.38 51.20 40.594.17 Unknown 0.775 0.525 1.35 0.154 0.86 0.679Metabolites balanced 100 67.8 100 11.4 100.00 79.2Metabolites identified 94.0 63.7 96.0 10.9 94.30 74.6







Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Gender / no.: Male / 4 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 45% PEG 400, 15% ethanol, 40% aqua demin.Table: Metabolic pattern in pooled feces extracts after 24 h following oral administration of 3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male bile duct-

cannulated ratsAnimal No. (pool) 171, 172, 173, 175KNM extract 3204C01 - C04Data file [.wal] 3204D21Time period [h] 0 - 24Excretion (% of dose) 47.5Retention time Identification % of % of[min] radioactivity dose26.17 M-3 2.04 0.96936.33 Unknown 0.92 0.43737.50 Unknown 0.19 0.090374.00 M-6 / M-7 5.21 2.4774.67 - 77.83 Unknown 1.28 0.60877.83 M-11 0.88 0.41878.67 M-10 5.17 2.4680.00 M-9 28.16 13.480.67 M-1 5.00 2.3881.17 Unknown 0.17 0.080885.17 Unknown 0.85 0.40486.00 Unknown 0.29 0.13888.50 BAY 63-2521 49.85 23.7Metabolites balanced 100.01 47.6Metabolites identified 96.31 45.8




2.6.5.9-12: Pharmacokinetics: Metabolism in vivo, Rat Location: 4.2.2.4.8Report no.: PH-35341 V2


Species / strain: Rat / Wistar Route: Intravenous Gender / no.: Male / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 10% ethanol, 30% PEG 400, 60% aqua demin.Table: Metabolic pattern in pooled feces extracts after 24 h following intravenous administration of 1 mg/kg b.w. [14C]riociguat to

male bile duct-cannulated ratsAnimal No. (pool) 176, 177, 179KNM extract 3204C05 - C07Data file [.wal] 3204D22Time period [h] 0 - 24Excretion (% of dose) 24.4Retention time Identification % of % of[min] radioactivity dose26.33 M-3 2.21 0.53936.50 Unknown 0.22 0.053767.00 - 67.50 Unknown 0.48 0.11774.33 M-6 / M-7 7.85 1.9276.00 - 76.83 Unknown 1.13 0.27678.00 M-11 0.91 0.22279.00 M-10 4.82 1.1880.00 M-9 18.57 4.5380.83 M-1 8.39 2.0583.17 Unknown 0.58 0.14284.67 Unknown 0.40 0.097686.00 - 87.33 Unknown 1.56 0.38188.50 BAY 63-2521 51.71 12.691.33 - 94.33 Unknown 1.18 0.288Metabolites balanced 100.01 24.4Metabolites identified 94.46 23.0




Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Gender / no.: Male / 4 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 45% PEG 400, 15% ethanol, 40% aqua demin.Table: Metabolic pattern in pooled bile following oral administration of 3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male bile duct-cannulated ratsAnimal No. (pool) 171, 172, 173, 175Data file [.wal] 3204D14 3204D15 3204D16Time period [h] 0 - 4 4 - 8 8 - 24 0 - 24Excretion (% of dose) 13.5 9.39 8.55 31.5Retention time Identification % of % of % of % of % of % of % of % of[min] radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose

calculated16.67 - 17.33 Unknown 2.81 0.379 1.48 0.139 4.96 0.424 3.00 0.94224.17 Unknown 1.03 0.139 1.38 0.130 1.27 0.109 1.20 0.37825.17 - 26.17 Unknown 0.61 0.0573 0.92 0.0787 0.43 0.13626.50 Unknown 0.84 0.113 0.74 0.0695 1.09 0.0932 0.88 0.27627.50 Unknown 0.39 0.0366 0.71 0.0607 0.31 0.097328.17 Unknown 2.35 0.317 1.89 0.177 1.55 0.133 2.00 0.62728.67 Unknown 0.45 0.0608 0.49 0.0460 1.09 0.0932 0.64 0.20029.33 M-13 5.01 0.676 4.39 0.375 3.34 1.0530.33 M-14 / M-15 18.32 2.47 14.16 1.33 10.06 0.860 14.84 4.6632.00 Unknown 0.15 0.0203 0.15 0.0141 0.35 0.0299 0.20 0.064332.83 M-4 1.35 0.182 1.21 0.114 1.68 0.144 1.40 0.44034.00 Unknown 0.59 0.0797 0.93 0.0873 1.36 0.116 0.90 0.28335.17 M-12 4.47 0.603 5.78 0.543 5.69 0.486 5.19 1.6335.67 Unknown 1.03 0.139 0.71 0.0667 0.66 0.20636.83 M-16 / M-17 11.18 1.51 10.94 1.03 17.36 1.48 12.80 4.0237.67 M-18 6.51 0.879 7.43 0.698 1.90 0.162 5.54 1.7438.67 Unknown 1.17 0.158 0.76 0.0714 0.69 0.0590 0.92 0.28840.33 M-19 9.47 1.28 8.58 0.806 8.44 0.722 8.95 2.8142.00 Unknown 2.71 0.366 2.86 0.269 2.70 0.231 2.76 0.866




2.6.5.9-13: Pharmacokinetics: Metabolism in vivo, Rat (continued) Location: 4.2.2.4.8Report no.: PH-35341 V2


Species / strain: Rat / Wistar Route: Oral Gender / no.: Male / 4 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 45% PEG 400, 15% ethanol, 40% aqua demin.Table: Metabolic pattern in pooled bile following oral administration of 3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male bile duct-cannulated ratsAnimal No. (pool) 171, 172, 173, 175Data file [.wal] 3204D14 3204D15 3204D16Time period [h] 0 - 4 4 - 8 8 - 24 0 - 24Excretion (% of dose) 13.5 9.39 8.55 31.5Retention time Identification % of % of % of % of % of % of % of % of[min] radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose

calculated43.00 M-8 5.44 0.734 4.12 0.387 4.66 0.398 4.84 1.5245.00 Unknown 1.67 0.225 1.65 0.155 0.98 0.0838 1.48 0.46459.33 M-20 2.66 0.359 2.80 0.263 2.60 0.222 2.69 0.84461.67 Unknown 3.62 0.310 0.99 0.31062.67 M-21 2.18 0.294 4.10 0.385 0.61 0.0522 2.33 0.73164.83 Unknown 0.55 0.0516 0.64 0.0547 0.34 0.10666.83 Unknown 2.47 0.333 2.22 0.208 2.28 0.195 2.34 0.73670.33 - 71.50 Unknown 0.73 0.0986 0.71 0.0667 0.95 0.0812 0.79 0.24774.50 M-6 / M-7 6.18 0.834 6.23 0.585 6.07 0.519 6.18 1.9478.67 M-10 2.94 0.397 1.20 0.113 2.51 0.215 2.31 0.72579.00 Unknown 2.10 0.197 0.33 0.0282 0.72 0.22580.67 M-1 0.24 0.0324 0.91 0.0854 0.87 0.0744 0.61 0.19283.33 Unknown 1.36 0.184 1.66 0.156 1.65 0.141 1.53 0.48186.33 Unknown 1.16 0.157 1.19 0.112 0.94 0.0804 1.11 0.34988.50 BAY 63-2521 3.51 0.474 5.46 0.513 4.95 0.423 4.49 1.41Metabolites balanced 99.98 13.5 95.39 8.96 99.98 8.54 98.74 31.0Metabolites identified 79.46 10.7 72.92 6.85 71.79 6.13 75.48 23.7




Species / strain: Rat / Wistar Route: Intravenous Gender / no.: Male / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 10% ethanol, 30% PEG 400, 60% aqua demin.Table: Metabolic pattern in pooled bile following intravenous administration of 1 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male bile duct-cannulated

ratsAnimal No. (pool) 176, 177, 179Data file [.wal] 3304D17 3304D18 3304D38Time period [h] 0 - 4 4 - 8 8 - 24 0 - 24Excretion (% of dose) 45.4 4.98 0.937 51.3Retention time Identification % of % of % of % of % of % of % of % of[min] radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose

calculated14.50 - 20.83 Unknown 1.78 0.808 3.48 0.173 3.50 0.0328 1.98 1.0121.33 Unknown 1.24 0.563 1.08 0.0538 1.20 0.61722.33 - 23.00 Unknown 0.19 0.0863 0.53 0.0264 0.22 0.11324.17 Unknown 1.34 0.608 2.42 0.121 1.42 0.72924.83 - 25.83 Unknown 0.21 0.0953 0.87 0.0433 0.27 0.13926.50 Unknown 0.98 0.445 1.39 0.0692 1.00 0.51427.33 Unknown 0.16 0.0726 0.48 0.0239 0.19 0.096528.50 Unknown 2.94 1.33 2.53 0.126 2.85 1.4629.50 M-13 4.82 2.19 3.44 0.171 4.60 2.3630.50 M-14 / M-15 17.02 7.73 10.02 0.499 16.04 8.2333.00 Unknown 1.37 0.622 1.58 0.0787 1.37 0.70133.50 M-4 0.91 0.0453 17.19 0.161 0.40 0.20634.17 M-12 1.20 0.545 7.22 0.360 1.76 0.90535.33 Unknown 7.12 3.23 1.53 0.0762 6.45 3.3136.83 M-16 / M-17 12.52 5.68 16.67 0.830 46.72 0.438 13.55 6.9537.50 M-18 2.63 1.19 2.22 0.111 2.53 1.3038.00 Unknown 2.01 0.913 4.31 0.0404 1.86 0.95338.50 Unknown 0.71 0.322 1.00 0.0498 3.36 0.0315 0.79 0.40339.00 Unknown 0.73 0.331 0.65 0.331


2.6.5.9 薬物動態試験： In Vivo における代謝（続き）Test article: Riociguat2.6.5.9-14: Pharmacokinetics: Metabolism in vivo, Rat (continued) Location: 4.2.2.4.8

Report no.: PH-35341 V2Report title: [14C]BAY 63-2521: Biotransformation in Male and Female Rats

Species / strain: Rat / Wistar Route: Intravenous Gender / no.: Male / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 10% ethanol, 30% PEG 400, 60% aqua demin.Table: Metabolic pattern in pooled bile following intravenous administration of 1 mg/kg b.w. [14C]riociguat to male bile duct-cannulated ratsAnimal No. (pool) 176, 177, 179Data file [.wal] 3304D17 3304D18 3304D38Time period [h] 0 - 4 4 - 8 8 - 24 0 - 24Excretion (% of dose) 45.4 4.98 0.937 51.3Retention time Identification % of % of % of % of % of % of % of % of[min] radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose radioactivity dose

calculated40.33 M-19 9.41 4.27 7.00 0.349 8.08 0.0757 9.14 4.6941.17 Unknown 3.00 0.149 0.29 0.14942.00 Unknown 3.21 1.46 4.09 0.204 3.24 1.6643.00 M-8 7.06 3.21 0.26 0.0129 6.28 3.2244.33 Unknown 1.06 0.0528 0.10 0.052845.17 Unknown 1.96 0.890 1.73 0.89046.17 - 58.67 Unknown 2.71 0.135 3.63 0.0340 0.33 0.16959.50 M-20 3.35 1.52 1.06 0.0528 9.17 0.0859 3.24 1.6662.67 M-21 3.22 1.46 5.26 0.262 4.04 0.0379 3.43 1.7664.50 Unknown 1.09 0.0543 0.11 0.054367.00 Unknown 3.51 1.59 2.16 0.108 3.31 1.7070.17 Unknown 1.69 0.0842 0.16 0.084271.33 Unknown 0.97 0.440 0.86 0.44074.50 M-6 / M-7 1.95 0.885 3.75 0.187 2.09 1.0775.17 Unknown 0.32 0.145 0.28 0.14578.33 M-10 0.94 0.427 0.83 0.42778.83 Unknown 0.86 0.390 3.25 0.162 1.08 0.55280.67 M-1 0.26 0.118 1.11 0.0553 0.34 0.17386.17 Unknown 1.16 0.527 1.03 0.52786.67 Unknown 0.18 0.0817 0.70 0.0349 0.23 0.11788.50 BAY 63-2521 2.66 1.21 3.68 0.183 2.71 1.39Metabolites balanced 99.99 45.4 99.86 4.94 100.00 0.937 99.99 51.3Metabolites identified 67.04 30.4 62.60 3.12 85.20 0.799 66.86 34.3




2.6.5.9-15: Pharmacokinetics: Metabolism in vivo, Dog

Location: 4.2.2.4.9Report no.: A49675 V3

Report title: [14C]BAY 63-2521: Biotransformation in Female Beagle Dogs

Species / strain: Dog / Beagle Route: Oral Gender / no.: Female / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 0.6 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.Table: Plasma concentrations [µg-eq/L] and pharmacokinetic parameters of riociguat and metabolite M-1 (BAY 60-4552), after oral

administration of 0.6 mg/kg b.w. [14C]riociguat to female Beagle dogsTime [h] Total radioactivity Riociguat M-1 (BAY 60-4552)0.5 252 206 44.61 278 194 81.12 311 178 1244 349 165 1688 173 54.1 11524 28.4 1.57 24.4AUC [µg·h/L] 3661 1322 2184% AUC(0-24) 38.3 56.3AUC(0-tn) [µg·h/L] 3434 1315 1931AUC(0-24) [µg·h/L] 3434 1315 1931AUC(tn-) [%] 6.22 0.506 11.6Cmax [µg/L] 349 206 168t1/2 [h] 5.69 3.02 7.18







Species / strain: Dog / Beagle Route: Intravenous Gender / no.: Female / 3 Assay: HPLC+LSC, MSMSCompound: [14C]Riociguat Dose 0.3 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: Ad libitumAnalyte: Radioactivity Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin. Table: Plasma concentrations [µg-eq/L] and pharmacokinetic parameters of riociguat and metabolite M-1 (BAY 60-4552), after intravenous

administration of 0.3 mg/kg b.w. [14C]riociguat to female Beagle dogsTime [h] Total radioactivity Riociguat M-1 (BAY 60-4552)1 484 429 53.41.25 413 337 73.81.5 389 279 75.82 358 252 1013 302 181 1165 210 93.2 1129 79.9 20.3 56.924 16.0 1.43 13.7AUC [µg·h/L] 2718 1302 1351% AUC(0-24) 49.6 46.8AUC(0-tn) [µg·h/L] 2611 1296 1223AUC(0-24) [µg·h/L] 2611 1296 1223AUC(tn-) [%] 3.95 0.426 9.49Cmax [µg/L] 484 429 116t1/2 [h] 5.10 3.11 6.63







Species / strain: Dog / Beagle Route: Oral Gender / no.: Female / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 0.6 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.Table: Main components in urine of Beagle dog following single oral administration of [14C]riociguatSampling interval 0 – 72 hComponents % of dose

Riociguat 1.37M-1 6.33M-3 2.10







Species / strain: Dog / Beagle Route: Oral Gender / no.: Female / 3 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 0.6 mg/kg Nuclide: 14C Feeding condition: FastedAnalyte: Radioactivity Formulation: 15% ethanol, 45% PEG 400, 40% aqua demin.Table: Main components in feces of Beagle dog following single oral administration of [14C]riociguatSampling interval 0 – 72 hComponents % of dose

Riociguat 7.50M-1 35.4M-3 2.64M-4 7.07M-9 3.09M-10 4.51M-23 2.78M-24 6.92




2.6.5.9-19: Pharmacokinetics: Metabolism in vivo, Man


Report title: [14C]BAY 63-2521: Biotransformation in Man

Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 1 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MSMSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.09 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Plasma concentrations [µg-eq/L] of riociguat and metabolites M-1 (BAY 60-4552) and M-4 after oral administration of 1.09

mg/volunteer [14C]riociguat to male human volunteer No.1Time [h] Total radioactivity

[µg-eq/L]Riociguat

[µg/L]M-1 (BAY 60-4552)

[µg/L]M-4

[µg/L]

0.25 10.4 10.3 0.0814 <LLOQa

0.5 33.6 31.8 1.78 <LLOQa

0.75 41.8 37.0 4.68 <LLOQa

1 32.9 28.2 4.54 <LLOQa

1.5 32.4 25.3 6.62 <LLOQa

2 31.6 23.9 7.48 <LLOQa

2.5 30.7 21.8 7.99 0.8663 28.6 18.3 9.18 0.9214 28.9 16.6 10.7 1.176 20.8 10.7 8.30 2.148 17.4 7.66 8.00 2.0210 13.7 4.93 6.77 2.4512 13.4 4.81 6.57 2.2915 10.1 2.64 6.08 1.6224 6.66 1.21 4.22 1.5048 1.63 <LLOQa 1.04 0.75872 <LLOQa <LLOQa <LLOQa <LLOQa

96 <LLOQa <LLOQa <LLOQa <LLOQa

a = lower limit of quantitation







Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 1 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.09 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Pharmacokinetic parameters of riociguat and metabolites M-1 (BAY 60-4552) and M-4 after oral administration of 1.09

mg/volunteer [14C]riociguat to male human volunteer No.1Time [h] Total radioactivity Riociguat M-1 (BAY 60-4552) M-4

AUC [µg·h/L] 486 189 231 n.c.AUCnorm [kg·h/L] 33.5 13.0 15.9 n.c.AUC(0-tn) [µg·h/L] 457 182 209 64.3AUC(0-tn)norm [kg·h/L] 31.5 12.6 14.4 4.43AUC(0-24) [µg·h/L] 372 182 155 38.2AUC(0-24)norm [kg·h/L] 25.6 12.6 10.7 2.63AUC(tn-) [%] 5.82 3.37 9.55 n.c.a

Cmax [µg/L] 41.8 37.0 10.7 2.45Cmax,norm [kg/L] 2.88 2.55 0.739 0.169C(24)/Cmax [%] 15.9 3.28 39.3 61.2tmax [h] 0.750 0.750 4.00 10.0t1/2 [h] 12.0 4.87 13.9 n.c.a

Points 6 11 8 n.c.a

Interval [h] 8-48 1.5-24 4-48% of radioactivityb) 39.8 45.7 14.1

a = not calculatedb = calculated using AUC(0-tn)







Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 1 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.05 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Plasma concentrations [µg-eq/L] of riociguat and metabolites M-1 (BAY 60-4552) and M-4 after oral administration of 1.05

mg/volunteer [14C]riociguat to male human volunteer No.2Time [h] Total radioactivity

[µg-eq/L]Riociguat

[µg/L]M-1 (BAY 60-4552)

[µg/L]M-4

[µg/L]

0.25 6.38 6.07 0.297 <LLOQa

0.5 30.6 26.2 4.22 <LLOQa

0.75 47.1 36.7 10.1 <LLOQa

1 47.0 32.3 13.9 <LLOQa

1.5 41.7 24.1 17.0 <LLOQa

2 34.6 19.0 14.9 0.2102.5 37.7 20.4 15.9 0.6153 35.6 18.4 16.1 0.7584 37.4 15.4 18.8 1.386 26.8 9.99 15.2 1.558 23.7 7.34 14.8 1.5210 22.0 5.01 15.1 1.9512 18.1 3.65 12.7 1.8515 13.8 2.33 9.47 2.3324 11.1 1.09 8.36 1.8848 3.02 0.161 2.63 0.19972 0.904 <LLOQa <LLOQa <LLOQa









Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 1 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.05 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Pharmacokinetic parameters of riociguat and metabolites M-1 (BAY 60-4552) and M-4 after oral administration of 1.05 mg/volunteer

[14C]riociguat to male human volunteer No.2Time [h] Total radioactivity Riociguat M-1 (BAY 60-4552) M-4

AUC [µg·h/L] 709 183 470 n.c.a

AUCnorm [kg·h/L] 48.7 12.6 32.3 n.c. a

AUC(0-tn) [µg·h/L] 691 181 407 58.0AUC(0-tn)norm [kg·h/L] 47.5 12.4 28.0 3.99AUC(0-24) [µg·h/L] 500 169 289 40.1AUC(0-24)norm [kg·h/L] 34.4 11.6 19.8 2.76AUC(tn-) [%] 2.50 1.09 13.2 4.50Cmax [µg/L] 47.1 36.7 18.8 2.33Cmax,norm [kg/L] 3.24 2.52 1.29 0.160C(24)/Cmax [%] 23.6 2.97 44.5 80.8tmax [h] 0.750 0.750 4.00 15.0t1/2 [h] 13.7 8.60 16.1 n.c. a

Points 8 3 8 n.c. a

Interval [h] 6-72 15-48 4-48% of radioactivityb 26.1 59.0 8.40








Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 1 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.04 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Plasma concentrations [µg-eq/L] of riociguat and metabolites M-1 (BAY 60-4552) and M-4 after oral administration of

1.04 mg/volunteer [14C]riociguat to male human volunteer No.3

Time [h] Total radioactivity [µg-eq/L]

Riociguat [µg/L]

M-1 (BAY 60-4552)[µg/L]

M-4 [µg/L]

0.25 20.2 19.3 0.619 <LLOQa

0.5 28.8 26.3 2.42 <LLOQa

0.75 29.3 25.1 4.04 <LLOQa

1 31.4 26.1 5.16 <LLOQa

1.5 34.3 26.3 7.71 <LLOQa

2 32.1 23.1 8.73 <LLOQa

2.5 31.1 22.1 8.57 0.2063 32.2 20.4 10.9 0.6864 36.2 19.7 14.6 1.956 22.9 10.9 10.1 2.238 21.7 8.55 10.6 3.0810 15.4 4.62 8.01 3.4412 15.3 3.98 7.78 4.5315 12.8 2.36 6.85 4.6424 10.2 1.08 5.60 4.6148 3.12 <LLOQa 1.43 2.2772 0.980 <LLOQa <LLOQa <LLOQa


a = lower limit of quantitationAdditional information:







Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 1 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.04 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Pharmacokinetic parameters of riociguat and metabolites M-1 (BAY 60-4552) and M-4 after oral administration of

1.04 mg/volunteer [14C]riociguat to male human volunteer No.3Time [h] Total radioactivity Riociguat M-1 (BAY 60-4552) M-4

AUC [µg·h/L] 648 193 293 n.c.a

AUCnorm [kg·h/L] 46.6 13.9 21.1 n.c.a

AUC(0-tn) [µg·h/L] 625 183 262 160AUC(0-tn)norm [kg·h/L] 45.0 13.1 18.8 11.5AUC(0-24) [µg·h/L] 438 183 189 80.9AUC(0-24)norm [kg·h/L] 31.5 13.1 13.6 5.82AUC(tn-∞) [%] 3.52 5.15 10.5 n.c.a

Cmax [µg/L] 36.2 26.3 14.6 4.64Cmax,norm [kg/L] 2.60 1.89 1.051 0.333C(24)/Cmax [%] 28.2 4.11 38.3 99.3tmax [h] 4.00 1.50 4.00 15.0t1/2 [h] 15.4 6.60 14.4 n.c.a

Points* 6 4 8 n.c.a

Interval* [h] 10-72 10-24 4-48% of radioactivityb 29.2 41.9 25.6








Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 1 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.06 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Plasma concentrations [µg-eq/L] of riociguat and metabolites M-1 (BAY 60-4552) and M-4 after oral administration of

1.06 mg/volunteer [14C]riociguat to male human volunteer No.4Time [h] Total radioactivity

[µg-eq/L]Riociguat

[µg/L]M-1 (BAY 60-4552)

[µg/L]M-4

[µg/L]

0.25 13.0 13.0 <LLOQ <LLOQ0.5 35.5 34.5 0.408 <LLOQ0.75 33.5 32.6 0.768 <LLOQ1 31.2 30.7 0.443 <LLOQ1.5 29.5 28.6 0.850 <LLOQ2 32.4 31.3 1.11 <LLOQ2.5 31.0 29.5 1.45 <LLOQ3 26.3 24.8 1.46 <LLOQ4 33.3 31.7 1.52 <LLOQ6 21.6 20.3 1.22 <LLOQ8 20.4 18.7 1.50 <LLOQ10 18.2 15.7 1.96 0.42012 16.2 13.3 2.22 0.83115 12.1 9.60 1.40 0.82524 12.6 8.77 2.54 1.3048 4.24 2.83 0.604 1.0872 1.73 <LLOQ <LLOQ <LLOQ96 <LLOQ <LLOQ <LLOQ <LLOQ








Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 1 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.06 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Pharmacokinetic parameters of riociguat and metabolites M-1 (BAY 60-4552) and M-4 after oral administration of

1.06 mg/volunteer [14C]riociguat to male human volunteer No.4Time [h] Total radioactivity Riociguat M-1 (BAY 60-4552) M-4

AUC [µg·h/L] 735 568 82.6 n.c.a

AUCnorm [kg·h/L] 69.2 53.4 7.78 n.c. a

AUC(0-tn) [µg·h/L] 689 507 72.5 42.3AUC(0-tn)norm [kg·h/L] 64.8 47.7 6.83 3.98AUC(0-24) [µg·h/L] 437 381 40.2 13.7AUC(0-24)norm [kg·h/L] 41.2 35.8 3.78 1.29AUC(tn-) [%] 6.29 10.7 12.2 n.c. a

Cmax [µg/L] 35.5 34.5 2.54 1.30Cmax,norm [kg/L] 3.34 3.25 0.239 0.123C(24)/Cmax [%] 35.5 25.4 100 100tmax [h] 0.500 0.500 24.0 24.0t1/2 [h] 18.4 15.3 11.6 n.c. a

Points 8 7 2 n.c. a

Interval [h] 6-72 6-48 24-48% of radioactivityb 73.6 10.5 6.14








Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 4 Assay: HPLC+LSC, MSMSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.04 to 1.09 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Excretion of radioactivity in man [% of dose] following single oral administration of 1 mg [14C]riociguat.Subject No. 1 2 3 4Samples Urine Feces Urine Feces Urine Feces Urine Feces

Excretion (% of dose) 44.5 47.6 36.0 54.3 45.2 49.5 32.6 59.2Total excretion 92.1 90.3 94.7 91.8







Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 4 Assay: HPLC+LSC, MSMSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.04 to 1.09 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Main components in urine of man following single oral administration of [14C]riociguatSampling interval 0 – 96 h

Subj. 1-3 Subj. 4Components % of dose

Riociguat 4.49 – 7.58 19.1M-1 18.9 – 23.1 7.36M-3 1.53 – 1.63 0.421M-4 7.52 – 18.9 4.42







Species / strain: Male / Caucasian Route: Oral Gender / no.: Male / 4 Assay: HPLC+LSC, HPLC-MS/MSCompound: [14C]Riociguat Dose 1.04 to 1.09 mg Nuclide: 14CAnalyte: Radioactivity Formulation: PEG-based Diluent SOL 30 ML 001 ORALTable: Main components in feces of man following single oral administration of [14C]riociguatSampling interval 0 – 144 h

Subj. 1-3 Subj. 4Components % of dose

Riociguat 9.03 – 17.5 43.8M-1 31.2 －42.7 14.8


2.6.5.10 薬物動態試験： In Vitro における代謝


2.6.5.10-1: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, species comparison: liver microsomes (metabolic pattern)


Report title: [14C]BAY 63-2521: In Vitro Metabolic Profiling and Species Comparison in Liver Microsomes and Hepatocytes

Species / strain: Various Route: In vitroMaterial Liver microsomes Assay: HPLC + LSC, HPLC-MS, HPLC-MSMSCompound: [14C]riociguat Nuclide: 14CTable: Mass balance of 1 h incubations (1 μM) with liver microsomes of different species

Components in % of radioactivity

Species/strain Man / (pool)Rat /

Wistara Rat / Wistarb Dog / Beagleb

Monkey / Cynomolgusa

Mouse / CD-1a

Mouse / NMRIa

Rabbit / Himalayab

Parent 90.6 87.4 95.9 88.4 53.6 83.1 86.9 81.8M-1 (BAY 60-4552) 8.3 4.7 0.3 9.6 30.7 11.9 10.2 16.4M-3 traces 0.8 0.1 0.1 0.7 0.1 0.2M-9 4.7 0.3 0.3 2.8 1.8 1.6M-10 0.8 0.1 1.5 0.3 0.3 0.1M-11 1.1 0.1 4.3 0.4 0.3 0.3M-26 0.6 0.1 1.5 0.6 1.8 0.7 traces 0.9M-27 0.1 0.5 1.9 0.3 2.8 0.7 0.2

a = maleb = female


2.6.5.10 薬物動態試験： In Vitro における代謝（続き）


2.6.5.10-2: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, species comparison: hepatocytes (metabolic pattern)


Report title: [14C]BAY 63-2521: In Vitro Metabolic Profiling and Species Comparison in Liver Microsomes and Hepatocytes

Species / strain: Various Route: In vitroMaterial: Hepatocytes Assay: HPLC + LSC, HPLC-MS, HPLC-MSMSCompound: [14C]Riociguat Nuclide: 14CTable: Mass balance of 4 h incubations (1 μM) with hepatocytes of different species

Components in % of radioactivitySpecies/strain Man Man Rat / Wistara Rat / Wistara Dog / Beagleb

Riociguat 95.6 81.1 13.8 28.7 70.6M-1 (BAY 60-4552) 4.2 16.0 13.8 20.5 24.6M-3 0.2 0.3 9.6 8.8 1.0M-4 0.3 0.5 1.1 0.8M-6/7 3.6 2.4M-8 2.4 2.9 2.5M-10 0.7 1.1 0.5M-12, M-17 5.1 3.3 0.9 (M-12)M-15 20.6 11.8 0.9M-29 4.3 2.4

a = maleb = female



Test article: Riociguat2.6.5.10-3: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, CYP isoforms involved Location: 4.2.2.4.2

Report no.: A51309 V2Report title: Identification of Human CYP Isoforms Involved in the In Vitro Metabolism of BAY 63-2521

Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Liver microsomes Assay: HPLC-MS/MSTest compound: RiociguatTable: Influence of different CYP inhibitors on M-1 (BAY 60-4552) formation from riociguat (1 µM) catalyzed by human liver microsomesInhibitor c[Inhibitor]

[µM]Mean M-1 [ng/mL]

% of control

Controlb - 6.15 -1-Amino-1H-benzotriazoleb 1000 2.94 47.8Furaphyllineb 20 5.18 84.2CH3CN/water 1+1b - 0.13 2.2CH3CN/water 1+1b - 0.12 2.0Control - 12.63 -α-Naphthoflavone 1 7.65 60.6Fluvoxamine 3 14.48 114.6Azamulin 10 9.81 77.7Azamulin 1 10.36 82.0Ketoconazole 10 2.04 16.1Ketoconazole 1 5.36 42.44-Methylpyrazole 200 15.58 123.4HET0016 10 10.50 83.1Quinidine 5 9.07 71.8Benzylphenobarbital 5 11.63 92.1Sulfaphenazole 10 12.65 100.1Quercetin 10 4.50 35.6Montelukast 1 9.84 77.9CH3CN/water 1+1 - 0.14 1.1CH3CN/water 1+1 - 0.11 0.9

a = not applicable b = preincubation 20 min (RMA 1491V07-V10 / V43-46 without NADPH)




2.6.5.10-4: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, CYP isoforms involved


Report title: Identification of Human CYP Isoforms Involved in the In Vitro Metabolism of BAY 63-2521

Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Pulmonary microsomes Assay: HPLC-MS/MSTest compound: RiociguatTable: Influence of different CYP inhibitors on M-1(BAY 60-4552) formation from riociguat (1 µM) catalyzed by human pulmonary

microsomes (smoker)Inhibitor c[Inhibitor]

[µM]Mean M-1[ng/mL]

% of control

Control - 4.29 -Azamulin 5 4.15 96.7HET0016 10 2.32 54.0α-Naphthoflavone 1 0.47 10.87-Hxdroxyflavone 1 0.90 20.9Control - 3.89 -Ketoconazole 1 1.33 34.1Fluvoxamine 3 3.44 88.5

a = not applicable







Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Recombinant CYPs Assay: HPLC+LSC, HRMS, HPLC-MSMS

Test compound: RiociguatTable: Formation of M-1 (BAY 60-4552) by screening a panel of human recombinant CYP isoforms at a concentration of 1 µM riociguatHuman CYP isozyme P450 Time M-1 mean M-1 mean V M-1

[pmol/mL] [min] [ng/mL] [pmol/mL] [pmol/pmol P450·min]

[%]

CYP1A1+OR 100 45 215.7 528.0 0.1173 52.8CYP1A1+OR 20 45 228.5 559.5 0.6217 56.0CYP1A1+OR 2 45 35.8 87.7 0.9749 8.8CYP1A2+OR 100 45 1.21 2.96 0.0007 0.30CYP2A6+OR+b5 100 45 0.03 0.06 0.0000 0.01CYP1B1+OR 100 45 1.07 2.62 0.0006 0.26CYP2B6+OR 100 45 0.35 0.87 0.0002 0.09CYP2C8+OR+b5 100 45 8.31 20.34 0.0045 2.03CYP2C9-Arg+OR+b5 100 45 0.01 0.02 0.0000 0.00CYP2C18+OR 100 45 0.35 0.86 0.0002 0.09CYP2C19+OR+b5 100 45 0.20 0.48 0.0001 0.05CYP2D6-Val+OR 100 45 0.80 1.96 0.0004 0.20CYP2E1+OR+b5 100 45 0.20 0.49 0.0001 0.05CYP2J2+OR+b6 100 45 76.85 188.2 0.0418 18.8

a = not applicable







Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Recombinant CYPs Assay: HPLC-MS/MS

Tesft compound: RiociguatTable: Formation of M-1 (BAY 60-4552) by screening a panel of human recombinant CYP isoforms at a concentration of 1 µM riociguatHuman CYP isozyme P450 Time M-1 mean M-1 mean V M-1

[pmol/mL] [min] [ng/mL] [pmol/mL] [pmol/pmol P450·min]

[%]

CYP3A4+OR+b5 100 45 2.71 6.64 0.0015 0.66CYP3A5+OR+b5 100 45 14.87 36.41 0.0081 3.64CYP3A7+OR+b5 100 45 0.75 1.84 0.0004 0.18CYP4A11+OR 100 45 0.12 0.29 0.0001 0.03CYP4F2+OR+b5 100 45 0.00 0.01 0.0000 0.00CYP4F3A+OR+b5 100 45 0.21 0.52 0.0001 0.05CYP4F3B+OR+b5 100 45 0.00 0.00 0.0000 0.00CYP4A12+OR+b5 100 45 0.00 0.00 0.0000 0.00Insect cell control - 45 0.00 0.00 - 0.00Control mics + vector - 45 0.00 0.01 - 0.00Reductase mics - 45 0.00 0.00 - 0.00Reductase mics+ b5 - 45 0.05 0.13 - 0.01

a = not applicable


2.6.5.11 薬物動態試験：推定代謝経路


2.6.5.11-1: Pharmacokinetics: Metabolism

Location: 2.6.4.5Report no.: n.a.a

Report title: n.a.a

Table: Proposed metabolic pathways of riociguat in vivo (selected metabolites)

O

O

NH2

NNH

2

N

NN

NN

F

O

O

NH2

NHNH2

N

NN

NN

F

O

O

NH2

NNH

2

N

NN

NH

N

OO

OH

OH

OH

OH

O

O

NH

NHNH2

N

NN

NN

F

OH

O

O

NH2

NNH

2

N

NN

NN

F

OH

O

O

NH2

NNH

2

N

NN

NN

F

O

O

NH2

NNH2

N

NN

NN

FOH

NH2

NH2

NH2

N

NN

NN

F

O

RiociguatBAY 63-2521

M-1 M-3

M-11M-10M-9M-6/M-7

M-4BAY 1077251

Conjugate: M-8 (glucuronide)

Glutathione derivatives and their degradation products:M-13, M-14, M-15, M-16,M-17 and M-19

Conjugates: M-18 (glucuronide)M-21 (sulfate)

Conjugate:M-12 (glucuronide)

Conjugate:M-20 (sulfate)

BAY 60-4552

a = not applicable


2.6.5.12 薬物動態試験：薬物代謝酵素の誘導／阻害


2.6.5.12-1: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, CYP inhibitory potential


Report title: BAY 63-2521 (riociguat): Determination of the Inhibitory Potency of BAY 63-2521 Towards Human CYP Isoforms In Vitro

Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Recombinant CYPs / human liver microsomes Test compound: Riociguat Assay: HPLC / fluorescence / radio detection, HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effects of BAY 63-2521 on formation of metabolites from standard probes mediated by cytochrome P450 isoforms

(duplicate incubations, mean value)CYP isoform Probe reaction Enzyme source IC50

[µM]Ki

[µM]1A1 Ethoxyresorufin O-deethylation Recombinant 14.7 1.21A1 Phenacetin O-deethylation Recombinant 0.84 0.561A2 Phenacetin O-deethylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2A6 Coumarin 7-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2B6 Bupropion hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2C8 Amodiaquine N-deethylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2C9 Diclofenac 4’-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2C19 Mephenytoin 4’-hydroxylation Human liver microsomes 44.4 n.d.b

2D6 Dextromethorphan O-demethylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2E1 Chlorzoxazone 6-hydroxylation Recombinant > 50 n.d.b

2J2 Ebastine tert-butyl-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

3A4 Midazolam 1’-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

Midazolam (30 min preincubation) Human liver microsomes > 50 n.d.b

3A4 Testosterone 6-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

Testosterone (30 min preincubation) Human liver microsomes > 50 n.d.b

a = not applicable b = not determined


2.6.5.12 薬物動態試験：薬物代謝酵素の誘導／阻害（続き）


2.6.5.12-2: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, UGT inhibitory potential


Report title: BAY 63-2521: Determination of the Inhibitory Potential of BAY 63-2521 Towards Human UDP-glucuronosyltransferases (UGTs)

Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Liver microsomes Nuclide: -Test compound: Riociguat Assay: HPLC / fluorescence / radio detection, HPLC-MSMSTable: Inhibitory effect of riociguat on glucuronidation of UGT isoform selective standard probes in human liver microsomes UGT isoform Substrate IC50

[µM]Ki

[µM]

Various Estradiol (estradiol 17-gluc) > 50 n.d.b

1A1 Estradiol (estradiol 3-gluc) > 50 n.d.b

1A4c Trifluoperazine > 50 n.d.b

1A6 α-Naphthol > 50 n.d.b

1A9 Propofol > 50 n.d.b

2B7 3’-Azido-3’-deoxythymidine > 50 n.d.b

a = not applicableb = not determinedc = Human UGT1A4 Supersomes were used instead of human liver microsomes




2.6.5.12-3: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, SULT inhibitory potential


Report title: Determination of the Inhibitory Potential of BAY 63-2521 Towards Human Sulfotransferases (SULTs)

Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Liver cytosolTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of riociguat on sulfation of SULT isoform standard probes in human liver cytosol.SULT isoform Substrate IC50

[µM]Ki

[µM]

Various, predominantly SULT1E1 17β-Estradiol >50 n.d.b

Various, predominantly SULT1E1 17α-Ethinylestradiol >50 n.d.b

a = not applicableb = not determined




2.6.5.12-4: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, CYP induction potential


Report title Evaluation of the CYP Induction Potential of BAY 63-2521 in Cultured Human Hepatocytes

Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Cultured human hepatocytesTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MS of CYP specific substrates

Table: Inductive potential of riociguat towards human CYP1A2, 2C19, 2B6 and 3A4.CYP Result1A2, 2C19 No induction2B6, 3A4 No induction up to 1111 µg/L


2.6.5.13 薬物動態試験：累積排泄


2.6.5.13-1: Pharmacokinetics: Excretion, rodent


Report title: BAY 63-2521: Absorption and Excretion of the Radioactivity in Male Wistar Rats after Single Administration of [14C]BAY 63-2521.

Species / strain: Rat / Wistar Rat / Wistar Rat / Wistar Rat / WistarAdmin. compound: [14C]Riociguat [14C]Riociguat [14C]Riociguat [14C]RiociguatAnalyte: Radioactivity Radioactivity Radioactivity RadioactivityDose: [ mg/kg] 1 3 3 3Route: Intravenous Oral Oral OralGender / No. of animals: Male / 5 Male / 5 Male / 4 BDCc Male / 4 BDCc

Feeding condition Fasted Fasted Fasted FastedFormulation: 30% PEG 400, 10% ethanol,

60% aqua demin.45% PEG 400, 15% ethanol, 40% aqua demin.

Duration: [h] 168 168 24 24Assay: LSC LSC LSC LSC

% of administered doseArithmetic Arithmetic Arithmetic Arithmetic

Matrix Interval Mean C.V. [%] Mean C.V. [%] Mean C.V. [%] Mean C.V. [%]

Urine 0-24 h 16.2 9.47 13.8 16.4 6.55 21.0 11.8 10.40-168 h 17.0 9.78 14.5 14.7 n.a.a n.a.a n.a.a n.a.a

Bile 0-24 h n.a.a n.a.a n.a.a n.a.a 34.3 17.4 31.5 6.63Feces 0-24 h 79.8 3.57 74.4 8.09 28.9 31.8 47.5 8.76

0-168 h 81.9 2.01 82.2 5.81 n.a.a n.a.a n.a.a n.a.a

Expired air 0-24 h n.a.a n.a.a 0.0137 8.20 n.a.a n.a.a n.a.a n.a.a

Body excluding GITb 24 h n.a.a n.a.a n.a.a n.a.a 1.57 45.0 0.643 33.0168 h 0.175 7.67 0.0993 4.61 n.a.a n.a.a n.a.a n.a.a

GITb 24 h n.a.a n.a.a n.a.a n.a.a 23.7 44.0 5.56 99.6168 h 0.0117 12.2 0.0115 39.7 n.a.a n.a.a n.a.a n.a.a

Recovery 99.3 2.54 97.1 3.87 95.5 1.50 97.5 1.34

a = not applicable b = gastrointestinal tractc = bile duct cannulated


2.6.5.13 薬物動態試験：累積排泄（続き）


2.6.5.13-1: Pharmacokinetics: Excretion, rodent (continued)


Report title: BAY 63-2521: Absorption and Excretion of the Radioactivity in Male Wistar Rats after Single Administration of [14C]BAY 63-2521.

Species / strain: Rat / WistarAdmin. compound: [14C]RiociguatAnalyte: RadioactivityDose [ mg/kg] 1Route Intravenous BDCc

Gender / No. of animals Male / 3Feeding condition FastedFormulation 30% PEG 400, 10% ethanol, 60% aqua demin.Duration [h] 24Assay LSC

% of administered doseMatrix Interval Arithmetic

Mean C.V. [%]

Urine 0-24 h 19.3 6.32Bile 0-24 h 51.3 3.20Feces 0-24 h 24.4 8.32Expired air 0-24 h n.a.a n.a.a

Body excl. GITb 24 h 0.578 18.7GITb 24 h 0.773 144

Recovery 96.4 2.07a = not applicableb = gastrointestinal tractc = bile duct cannulated


2.6.5.13 薬物動態試験：累積排泄（続き）


2.6.5.13-2: Pharmacokinetics: Excretion, non-rodent


Report title: BAY 63-2521: Pharmacokinetics of Total Radioactivity, Unchanged BAY 63-2521 and M-1 (BAY 60-4552) in Female Beagle Dogs after Single Administration of [14C]BAY 63-2521

Species / strain: Dog / Beagle Gender: Female No. of animals: 3 Feeding conditions: FastedAdmin. compound: [14C]RiociguatAnalyte: Radioactivity Nuclide 14C Assay: LSC

Dose [ mg/kg] 0.3 0.6Route Intravenous infusion (T=1h) oralFormulation 45% PEG 400, 15% ethanol, 40% demineralized water

% of administered doseMatrix Interval Arithmetic Arithmetic

Mean C.V. [%] Mean C.V. [%]

Urine 0-168 h 15.6 2.26 12.9 8.22Feces 0-168 h 76.3 2.85 81.6 2.14Urine rinse 168 h 0.762 28.9 1.51 80.8Recovery 92.7 2.07 96.0 0.790


2.6.5.14 薬物動態試験：胆汁中排泄

ラットにおける胆汁中排泄の試験成績は 2.6.5.13-1 に記載した。


2.6.5.15 薬物動態試験：薬物相互作用


2.6.5.15-1: Pharmacokinetics: Effects of Drugs on Biotransformation


Report title Effects of Drugs on the Biotransformation of BAY 63-2521 in Vitro

Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Human liver microsomes / recombinant CYP1A1Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Effects of various drugs on M-1 (BAY 60-4552) formation in human liver microsomes or CYP1A1 Supersomes® (with and

without preincubation) given as IC50 valuesCYP1A1 HLM

IC50

[µM]IC50

[µM]Inhibitor Without preincubation With preincubation Without preincubation With preincubationAcetylsalicylic acid > 50 > 50 > 50 > 50Acyclovir > 50 > 50 > 50 > 50Ambrisentan > 50 > 50 > 50 > 50Amiodarone 4.9 2.6 > 10 > 10Amitriptyline * HCl > 50 > 50 > 50 > 50Astemizole 19.3 24.1 35.2 30.0Atazanavir > 20 > 20 6.0 3.8Atenolol > 50 > 50 > 50 > 50Atorvastatin > 50 > 50 > 50 46.2Azamulin > 50 > 50 > 50 > 50Bosentan > 50 > 50 > 50 > 50Captopril > 50 > 50 > 50 > 50Carbamazepine > 50 > 50 > 50 > 50Carvedilol 0.68 0.49 11.2 6.6


2.6.5.15 薬物動態試験：薬物相互作用（続き）


2.6.5.15-1: Pharmacokinetics: Effects of Drugs on Biotransformation (continued)



Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Human liver microsomes / recombinant CYPTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Effects of various drugs on M-1(BAY 60-4552) formation in human liver microsomes or CYP1A1 Supersomes® (with and


IC50

[µM]IC50

[µM]Inhibitor Without preincubation With preincubation Without preincubation With preincubationCimetidine > 50 > 50 > 50 > 50Clarithromycin > 50 > 50 > 50 > 50Clopidogrel sulfate 22.6 20.4 > 50 > 50Clotrimazole 0.61 0.36 5.7 5.0Clozapine 48.0 24.2 > 50 35.1Cyclosporin A > 20 > 20 > 20 > 20Dextromethorph.* HBr > 50 > 50 > 50 > 50Diclofenac > 50 > 50 > 50 > 50Diltiazem * HCl > 50 > 50 > 50 > 50Ebastine 2.5 2.6 > 10 > 10Enalapril maleate > 50 > 50 > 50 > 50Erlotinib (Tarceva) 0.17 0.05 6.9 4.6Erythromycin > 50 > 50 > 50 > 5017α-Ethynylestradiol 13.0 7.6 15.0 11.6







Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Human liver microsomes / recombinant CYP1A1Tset compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Effects of various drugs on M-1(BAY 60-4552) formation in human liver microsomes or CYP1A1 Supersomes® (with and


IC50

[µM]IC50

[µM]Inhibitor Without preincubation With preincubation Without preincubation With preincubationFamotidine > 50 > 50 > 50 > 50Fenofibrate 6.2 2.4 > 12.5 > 12.5Fluconazole > 50 > 50 > 50 > 50Fluoxetine > 50 > 50 > 50 > 50Fluvoxamine maleate > 50 50 > 50 > 50Furosemide > 50 > 50 > 50 > 50Gefitinib (Iressa) 0.27 0.05 13.3 9.4Gemfibrozil > 50 > 50 > 50 > 50Glybenclamide > 50 37.6 47.9 > 50HET0016 2.9 2.8 33.7 24.2Hydrochlorothiazide > 50 > 50 > 50 > 50Ibuprofen > 50 > 50 > 50 > 50Imatinib (Gleevec) 4.2 0.66 9.4 5.1Imipramine * HCl > 50 > 50 > 50 > 50







Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Human liver microsomes / recombinant CYP1A1Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Effects of various drugs on M-1 (BAY 60-4552) formation in human liver microsomes or CYP1A1 Supersomes® (with and


IC50

[µM]IC50

[µM]Inhibitor Without preincubation With preincubation Without preincubation With preincubationIndinavir sulfate (Crixivan) > 50 > 50 11.7 10.8Indomethacin > 50 > 50 > 50 > 50Ketoconazole 0.30 0.31 0.57 0.55Ketoprofen > 50 > 50 > 50 > 50Lamotrigine > 50 > 50 > 50 > 50Lidocaine * HCl > 50 > 50 > 50 > 50Mefenamic acid > 50 > 50 > 50 > 50Metoprolol > 50 > 50 > 50 > 50Miconazole 0.55 0.79 3.4 3.6Midazolam > 50 14.4 36.1 23.7Mycophenolic acid > 50 29.3 > 50 > 50Naproxen > 50 > 50 > 50 > 50Naringenin 13.0 9.3 23.0 13.9Nifedipine 43.4 41.1 48.0 42.2







Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Liver microsomes / recombinant CYP1A1Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Effects of various drugs on M-1(BAY 60-4552) formation in human liver microsomes or CYP1A1 Supersomes® (with and


IC50

[µM]IC50

[µM]Inhibitor Without preincubation With preincubation Without preincubation With preincubationNiflumic acid 28.0 28.9 > 50 > 50Omeprazole 2.7 2.2 24.1 21.2Paracetamol > 50 > 50 > 50 > 50Paroxetine * HCl 44.8 22.0 > 50 > 50Phenprocoumon > 50 > 50 > 50 > 50Phenytoin > 50 > 50 > 50 > 50Pioglitazone * HCl 17.9 16.9 > 25 > 25Probenecid > 50 > 50 > 50 > 50Propofol > 50 > 50 > 50 > 50Propranolol * HCl > 50 > 50 > 50 > 50Quercetin 0.59 1.7 20.1 22.7Ranitidine * HCl > 50 > 50 > 50 > 50Ritonavir > 10 > 10 5.3 4.8Rosiglitazone 15.7 15.0 28.1 36.4







Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Human liver microsomes / recombinant CYP1A1Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Effects of various drugs on M-1(BAY 60-4552) formation in human liver microsomes or CYP1A1 Supersomes® (with and


IC50

[µM]IC50

[µM]Inhibitor Without preincubation With preincubation Without preincubation With preincubationSaquinavir > 30 > 30 22.3 22.0Sildenafil > 50 > 50 > 50 36.5Simvastatin 6.7 6.6 > 25 > 25Sitaxentan > 50 44.6 > 50 > 50Sorafenib (Nexavar) 0.49 0.49 11.0 7.4Sulfamethazine > 50 > 50 > 50 > 50Sunitinib (Sutent) 4.2 0.64 > 15 > 15Terfenadine 6.8 8.0 18.2 19.4Ticlopidine * HCL > 50 > 50 > 50 > 50Tolbutamide > 50 > 50 > 50 > 50Trimethoprim > 50 > 50 > 50 > 50Valproic acid > 50 > 50 > 50 > 50Vardenafil > 50 > 50 38.5 28.4Verapamil * HCl > 50 > 50 37.7 20.0Warfarin > 50 > 50 > 50 > 50Zidovudine > 50 > 50 > 50 > 50Zomepirac > 50 > 50 > 50 > 50

a = not applicable


2.6.5.16 薬物動態試験：その他

2.6.5.16-1: Pharmacokinetics: In vitro studies in Caco-2 cells to evaluate permeability for BCS classification

Location: 4.2.2.7.1Report no.:

PH-36042 V3

Report title: BAY 63-2521: Investigation on Cell Permeability of BAY 63-2521 in Caco-2 Cells with Regard to BCS Classification

Test system: In vitroMaterial: Caco-2 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Papp values of riociguat across Caco-2 cells after 2 h incubation at 37 °C (n = 3)Concentrationriociguat [µM]

Inhibitor Inhibitor concentration

[M]Papp A-B Papp B-A Efflux ratio

Mean [nm/s] S.D. [nm/s] Mean [nm/s] S.D. [nm/s] Mean [nm/s] S.D. [nm/s]

0.24 <LLOQa <LLOQa 356 61 n.c.b n.c.b

2.4 35 8.4 367 75 11 3.324 36 8.7 385 57 11 3.12.4 Ivermectin 1.0 68 7.2 330 16 4.8 0.562.4 Ko 143 1.0 37 5.9 395 47 11 2.2

a = lower limit of quantitationb = not calculated


2.6.5.16 薬物動態試験：その他（続き）

2.6.5.16-2: Pharmacokinetics: In vitro studies in L–MDR1 cells to evaluate the P-gp substrate characteristics


Report title: BAY 63-2521: In Vitro Studies in L-MDR1 Cells to Evaluate the P-gp Substrate Characteristics and the P-gp Inhibitory Potential

Test system: In vitroMaterial: Human L-MDR1 cells / LLC-PK1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 and LLC-PK1 cells (n = 3)

Cell typeRiociguatconcentration Papp A-B Papp B-A Efflux ratio

Ratio L-MDR1/LLC-PK1

[µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD Mean SDL-MDR1 0.2 <LLOQa 244 5.7 n.a.b

LLC-PK1 0.2 97.8 9.0 162 11.0 1.7 0.2 n.a.b

L-MDR1 1 41.2 1.3 260 9.3 6.3 0.3LLC-PK1 1 108 11.9 160 37.8 1.5 0.4 4.3 1.1L-MDR1 10 43.5 6.5 259 15.4 5.9 1.0LLC-PK1 10 93.5 4.2 171 43.0 1.8 0.5 3.3 1.0

a = lower limit of quantitationb = not applicable






Test system: In vitroMaterial: Human L-MDR1 cells / LLC-PK1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibition of the efflux of riociguat at 1 M in L-MDR1 and LLC-PK1 cells by the P-gp model inhibitor Ivermectin (n = 3).

Cell typeIvermectin concentration Papp A-B Papp B-A Efflux ratio[µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD

L-MDR1 control 41.2 1.3 260 9.3 6.3 0.3L-MDR1 5 115 24.3 156 4.8 1.4 0.3LLC-PK1 control 108 11.9 160 37.8 1.5 0.4LLC-PK1 5 113 3.1 135 33.4 1.2 0.3






Test system: In vitroMaterial: Human L-MDR1 cells / LLC-PK1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of the P-gp model substrate Dipyridamole across L-MDR1 and LLC-PK1 cells (n = 3).

Cell typeDipyridamole concentration Papp A-B Papp B-A Efflux ratio


[µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD Mean SDL-MDR1 1 20.0 3.3 532 41.4 26.6 4.9LLC-PK1 1 105 7.3 293 78.5 2.8 0.8 9.5 3.2




2.6.5.16-5: Pharmacokinetics: In vitro studies in L–MDR1 cells to evaluate the P-gp inhibitory potentials



Test system: In vitroMaterial: Human L-MDR1 cells Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Effect of riociguat at various concentrations on the efflux of 1 M Dipyridamole in L-MDR1 cells (n = 2-3).Cell type Inhibitor Papp A-B Papp B-A Efflux ratio

Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SDL-MDR1 Control 11.4 2.6 392 137 34.2 14.2L-MDR1 Riociguat (0.07 µM) 13.1 2.6 386 1.8 29.5 5.8L-MDR1 Riociguat (0.2 µM) 11.4 1.6 434 23.3 38.2 5.6L-MDR1 Riociguat (0.7 µM) 12.0 2.4 360 1.5 30.0 6.0L-MDR1 Riociguat (2 µM) 10.1 2.8 449 33.9 44.6 13.0L-MDR1 Riociguat (7 µM) 12.4 2.0 377 9.7 30.5 5.1L-MDR1 Riociguat (20 µM) 15.7 2.3 515 21.6 32.8 5.1



2.6.5.16-6: Pharmacokinetics: In vitro studies in L–MDR1 cells to evaluate the P-gp inhibitory potentials



Test system: In vitroMaterial: Human L-MDR1 cells Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Effect of riociguat at various concentrations on the efflux of 25 M Digoxin in L-MDR1 cells (n = 1-3).Cell type Inhibitor Papp A-B Papp B-A Efflux ratio

Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SDL-MDR1 Control 6.7 0.3 94.6 9.7 14.1 1.6L-MDR1 Riociguat (0.1 µM) 10.5 3.5 131 n.c.a 12.5 n.a.b

L-MDR1 Riociguat (0.3 µM) 15.2 2.5 144 9.2 9.4 1.7L-MDR1 Riociguat (1 µM) 7.0 0.2 112 13.2 16.1 1.9L-MDR1 Riociguat (3 µM) 9.9 2.7 108 6.3 10.9 3.1L-MDR1 Riociguat (10 µM) 12.4 3.0 115 20.0 9.3 2.7L-MDR1 Riociguat (30 µM) 10.6 1.0 103 5.0 9.8 1.0L-MDR1 Riociguat (100 µM) 9.0 2.2 89.5 12.2 10.0 2.8L-MDR1 Ivermectin (5 µM) 28.2 4.1 77.7 n.c.a 2.8 n.a.b

a = only one well was considered for Papp calculation because recovery of Digoxin was >120% in two wells.b = not applicable



2.6.5.16-7: Pharmacokinetics: In vitro studies in MDCKII-BCRP cells to evaluate BCRP substrate characteristics


Report title: BAY 63-2521: In Vitro Studies in MDCKII-BCRP Cells to Evaluate the Substrate Characteristics of BAY 63-2521 for Human BCRP

Test system: in vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Permeability of Topotecan across WT and BCRP overexpressing MDCKII cells after a 2 h incubation at 37°C (n of 3 per direction)

Cell typeTopotecan conc. Papp A-B Papp B-A Efflux ratio

Ratio efflux ratio

[µM] Mean [nm/s]SD

[nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD BCRP/WTMDCKII-BCRP-HUMAN 2.0 3.2 0.65 150 51 47 19 10MDCKII-WT 2.0 19 3.9 90 11 4.7 1.1



2.6.5.16-8: Pharmacokinetics: In vitro studies in MDCKII-BCRP cells to evaluate BCRP substrate characteristics


Report title: BAY 63-2521: In Vitro Studies in MDCKII-BCRP Cells to Evaluate the Substrate Characteristics of BAY 63-2521 for Human BCRP

Test system: in vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MSMSTable: Permeability of riociguat across WT and BCRP overexpressing MDCKII cells after a 2 h incubation at 37°C (n of 3 per direction)

Cell typeRiociguatconc. Inhibitor

Inhibitor conc. Papp A-B Papp B-A efflux ratio Ratio efflux ratio

[µM]Mean [nm/s]

SD[nm/s]

Mean [nm/s]

SD [nm/s] Mean SD BCRP/WT

MDCKII-BCRP-HUMAN 0.20 25 2.9 481 84 19 4.0 3.71.0 21 4.9 530 107 25 7.8 6.710 17 2.1 517 67 30 5.3 6.51.0 Ko143 1.0 77 2.3 252 67 3.3 0.87

MDCKII-WT 0.20 56 5.0 289 40 5.2 0.861.0 73 0.55 277 32 3.8 0.4410 60 16 279 84 4.6 1.91.0 Ko143 1.0 51 4.2 295 91 5.8 1.84



2.6.5.16-9: Pharmacokinetics: In vitro studies in MDCKII-BCRP cells to evaluate the inhibitory potency towards BCRP


Report title: BAY 63-2521: Determination of the Inhibitory Potential Towards Human BCRP using MDCKII-BCRP Cells

Test system: in vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of riociguat and Ko143 on the efflux of Topotecan (2 M) across MDCKII-BCRP cells after a 2 h incubation at

37°C.Topotecanconc. Inhibitor

Inhibitor conc. Papp A-B Papp B-A Efflux ratio

[µM] [µM]Mean [nm/s]

SD[nm/s]

Mean[nm/s]

SD[nm/s] Mean SD

2.0 4.0 0.038 149 29 38 0.412.0 Riociguat 0.10 4.8 0.30 171 34 35 2.22.0 Riociguat 1.0 4.2 0.49 167 25 39 4.62.0 Riociguat 24 3.9 1.1 144 23 37 112.0 Ko143 1.0 19 1.8 88 24 4.7 0.52



2.6.5.16-10: Pharmacokinetics: In vitro studies in MDCKII-BCRP cells to evaluate the inhibitory potency towards BCRP


Report title: BAY 63-2521: Determination of the Inhibitory Potential Towards Human BCRP using MDCKII-BCRP Cells

Test system: in vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of BAY 63-2521 and Ko143 on the efflux of PhiP (2 µM) across MDCKII-BCRP cells after a 2 h incubation at 37°C.

PhiPconc. Inhibitor



SD[nm/s]

Mean [nm/s]

SD[nm/s] Mean SD

2.0 25 4.5 750 83 30 5.52.0 Riociguat 1.0 31 1.7 770 156 25 1.42.0 Riociguat 24 30 3.5 730 67 24 2.82.0 Ko143 1.0 297 66 242 23 0.82 0.21



2.6.5.16-11: Pharmacokinetics: In vitro studies in HEK-OATP1B1 and HEK-OATP1B3 cells to evaluate the substrate characteristics


Report title: BAY 63-2521: In Vitro Studies in HEK-OATP1B1 and HEK-OATP1B3 Cells to Evaluate the Substrate Characteristics and the Inhibitory Potential

Test system: in vitroMaterial: HEK-OATP1B1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Uptake of riociguat or Pravastatin into HEK-OATP1B1.and control cells (n = 3)

Substrate Substrate Conc.

Uptake time HEK-OATP1B1 Transport Rate HEK-Control Transport Rate Ratio OATP1B1/Control

[µM] [min]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein] Mean SDRiociguat 0.2 1.5 2.30 0.512 2.10 0.178 1.1 0.26

2 1.5 26.5 3.54 26.8 6.16 1.0 0.2610 1.5 123 12.0 105 15.6 1.2 0.21

Pravastatin 10 1.5 53.7 5.25 6.06 4.30 8.9 6.4






Test system: in vitroMaterial: HEK-OATP1B3 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Uptake of riociguat or Pravastatin into HEK-OATP1B3 and control cells (n = 3).

Substrate Substrate Conc.

Uptake time HEK-OATP1B3 Transport Rate HEK-Control Transport Rate Ratio OATP1B3/Control

[µM] [min]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein] Mean SDRiociguat 0.2 2.5 3.56 0.203 2.59 0.282 1.4 0.17

2 2.5 32.8 1.73 22.5 1.57 1.5 0.1310 2.5 192 28.8 114 10.1 1.7 0.29

Pravastatin 10 1.5 286 35.0 76.2 6.79 3.8 0.57






Test systems: in vitroMaterial: HEK-OATP1B3 cells Nuclide: -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Uptake of riociguat into HEK-OATP1B3 and control cells (n = 2-3).

Riociguat Uptake time HEK-OATP1B3 Transport Rate HEK-Control Transport Rate Ratio OATP1B3/Control

[µM] [min]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein] Mean SD3 1.5 72.9 19.2 76.6 12.5 1.0 0.293 2.5 51.2 4.60 40.9 10.8 1.3 0.353 5 27.4 4.70 35.6 7.88 0.8 0.2210 1.5 254 13.7 222 16.9 1.1 0.1110 2.5 139 8.40 185 15.0 0.8 0.0810 5 78.2 7.92 104 14.1 0.8 0.13






Test system: in vitroMaterial: HEK-OATP1B3 cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Uptake of riociguat or Pravastatin into HEK-OATP1B3 and control cells (n = 3).

Substrate Conc. Rifamycin HEK-OATP1B3 Transport Rate HEK-Control Transport Rate Ratio OATP1B3/Control

[µM] [µM]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein] Mean SDRiociguat 3 control 51.2 4.60 40.9 10.8 1.3 0.35

3 10 57.5 11.6 46.1 5.97 1.2 0.30Pravastatin 10 control 253 27.4 41.9 11.6 6.0 1.8

10 10 50.3 9.02 45.0 17.0 1.1 0.47



2.6.5.16-15: Pharmacokinetics: In vitro studies in HEK-OATP1B1and HEK-OATP1B3 cells to evaluate the inhibitory potency



Test system: in vitroMaterial: HEK-OATP1B1 cells Nuclide: -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of riociguat towards the uptake of Pravastatin (10 µM) into HEK-OATP1B1 and control cells at 1.5 min (n = 3)

Inhibitor HEK-OATP1B1 Transport Rate HEK-Control Transport Rate Active UptakeMean

[pmol/min/mg Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein]Control 32.4 2.65 n.c.a 32.41 µM riociguat 30.2 2.12 n.c.a 30.2Control 95.6 19.6 12.1 1.25 83.5 19.610 µM riociguat 93.2 9.83 12.5 1.51 80.7 9.9

a = not calculated (samples below LLOQ)



2.6.5.16-16: Pharmacokinetics: In vitro studies in HEK-OATP1 and HEK-OATP1B3 cells to evaluate the inhibitory potency



Species / strain: in vitroMaterial: HEK-OATP1B3 cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of riociguat towards the uptake of Pravastatin (10 µM) into HEK-OATP1B3 and control cells at 1.5 min (n = 2-3)

Inhibitor HEK-OATP1B3 Transport Rate HEK-Control Transport Rate Active UptakeMean

[pmol/min/mg Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein]

Mean [pmol/min/mg

Protein]

SD [pmol/min/mg

Protein]Control 274 34.3 40.0 5.60 234 34.80.3 µM riociguat 264 17.3 38.1 9.73 226 19.83 µM riociguat 317 47.6 31.7 16.4 286 50.310 µM riociguat 374 45.4 37.7 10.6 336 46.610 µM Rifamycin 41.7 7.26 47.7 10.0 -6.0 12.3



2.6.5.16-17: Pharmacokinetics: Inhibition of [³H]PAH (1 µM) by riociguat (0.3 and 3 µM) in hOAT1-HEK and vector-HEK-cells

Location: 4.2.2.7.6Report no.: R-8601 V2

Report title: In vitro-studies to determine the substrate characteristics and inhibitory potential of BAY 63-2521 towards OAT1 and OAT3

Test system: in vitroMaterial: hOAT1-HEKTest compound: Riociguat Assay: LSC for [3H] PAHTable: Inhibition of [3H]PAH (1 µM, probe substrate) uptake (5 min incubation) by riociguat (0.3 µM and 3 µM) and by probenecid

(100 µM, reference inhibitor) in hOAT1-HEK and vector-HEK-Cells.Assay no. Inhibitor Concentration Net-uptake [pmol/mg/min] Net uptake [%]

Inhibitor [µM] Per experiment

Mean Average deviation

Per experiment


PCT_004-10-V1 0 3 3 0.1 105 100 4PCT_004-10-V2 0 3 94PCT_004-10-V3 0 3 100PCT_004-10-V1 Riociguat 0.3 4 4 0.3 143 133 6PCT_004-10-V2 Riociguat 0.3 3 125PCT_004-10-V3 Riociguat 0.3 4 133PCT_004-10-V1 Riociguat 3 5 4 0.3 163 153 6PCT_004-10-V2 Riociguat 3 4 147PCT_004-10-V3 Riociguat 3 4 150PCT_004-10-V1 Probenecid 100 0.7 1 0.1 26 19 5PCT_004-10-V2 Probenecid 100 0.3 14PCT_004-10-V3 Probenecid 100 0.5 17



2.6.5.16-18: Pharmacokinetics: Inhibition of [³H]PAH (1 µM) by riociguat (0.3 and 3 µM) in hOAT1-HEK and vector-HEK-cells



Test system: in vitroMaterial: hOAT1-HEKTest compound: Riociguat Assay: LSC for [3H] PAHTable: Inhibition of [3H]PAH (10 µM, probe substrate) uptake (5 min incubation) by riociguat (0.3 µM and 3 µM) and by probenecid

(100 µM, reference inhibitor) in hOAT1-HEK and vector-HEK-Cells.Assay no. Inhibitor Concentration Net-uptake [pmol/mg/min] Net uptake [%]



Per experiment


PCT_004-10-V1 0 59 54 4 110 100 7PCT_004-10-V2 0 54 101PCT_004-10-V3 0 49 90PCT_004-10-V1 Riociguat 0.3 59 53 4 99 98 2PCT_004-10-V2 Riociguat 0.3 54 99PCT_004-10-V3 Riociguat 0.3 46 95PCT_004-10-V1 Riociguat 3 61 58 2 103 109 6PCT_004-10-V2 Riociguat 3 56 104PCT_004-10-V3 Riociguat 3 57 118PCT_004-10-V1 Probenecid 100 4 6 1 6 10 3PCT_004-10-V2 Probenecid 100 6 11PCT_004-10-V3 Probenecid 100 7 14



2.6.5.16-19: Pharmacokinetics: Inhibition of [14C]riociguat (0.3 µM) by PAH (10 and 100 µM) in OAT1-HEK and vector-HEK-cells



Test system: in vitroMaterial: hOAT1-HEK Nuclide: 14CTest compound: [14C]Riociguat Assay: LSCTable: Uptake (5 min incubation) of [14C]riociguat (0.3 µM) and inhibition by PAH (10 and 100 µM, probe substrate) and by probenecid

(100 µM, reference inhibitor) in hOAT1-HEK and vector-HEK-Cells.Assay no. Inhibitor Concentration Net-uptake [pmol/mg/min]

Inhibitor [µM] Per experiment Mean Average deviation

PCT_004-10-V1 0 0.01 -0.02 0.05PCT_004-10-V2 0 -0.1PCT_004-10-V3 0 0.03PCT_004-10-V1 PAH 10 -0.001 0.02 0.03PCT_004-10-V2 PAH 10 0.1PCT_004-10-V3 PAH 10 -0.01PCT_004-10-V1 PAH 100 -0.01 -0.005 0.02PCT_004-10-V2 PAH 100 0.03PCT_004-10-V3 PAH 100 -0.03PCT_004-10-V1 Probenecid 100 -0.04 0.03 0.1PCT_004-10-V2 Probenecid 100 -0.1PCT_004-10-V3 Probenecid 100 0.2



2.6.5.16-20: Pharmacokinetics: Inhibition of [14C]riociguat (3 µM) by PAH (10 and 100 µM) in hOAT1-HEK and vector-HEK-cells



Test system: in vitroMaterial: hOAT1-HEK Nuclide: 14CTest compound: [14C]riociguat Assay: LSCTable: Uptake (5 min incubation) of [14C]riociguat (3 µM) and inhibition by PAH (10 and 100 µM, probe substrate) and by probenecid



PCT_004-10-V1 0 -1.1 0.03 1.1PCT_004-10-V2 0 -0.5PCT_004-10-V3 0 1.7PCT_004-10-V1 PAH 10 -1.4 -0.5 0.6PCT_004-10-V2 PAH 10 0.1PCT_004-10-V3 PAH 10 -0.3PCT_004-10-V1 PAH 100 -0.7 0.1 0.6PCT_004-10-V2 PAH 100 -0.04PCT_004-10-V3 PAH 100 0.9PCT_004-10-V1 Probenecid 100 0.6 0.5 0.7PCT_004-10-V2 Probenecid 100 -0.7PCT_004-10-V3 Probenecid 100 1.5



2.6.5.16-21: Pharmacokinetics: Inhibition of [³H]ES (10 µM) by riociguat (0.3 and 3 µM) in hOAT3-HEK and vector-HEK-cells



Test system: in vitroMaterial: hOAT3-HEKTest compound: Riociguat Assay: LSC for [3H]ESTable: Inhibition of [3H]ES (10 µM, probe substrate) uptake (5 min incubation) by riociguat (0.3 µM and 3 µM) and by probenecid (100 µM,

reference inhibitor) in hOAT3-HEK and vector-HEK-Cells.Assay no. Inhibitor Concentration Net-uptake [pmol/mg/min] Net uptake [%]



Per experiment


PCT_004-10-V1 0 29 29 1 99 100 3PCT_004-10-V2 0 28 96PCT_004-10-V3 0 31 105PCT_004-10-V1 Riociguat 0.3 28 29 2 98 98 2PCT_004-10-V2 Riociguat 0.3 26 94PCT_004-10-V3 Riociguat 0.3 31 101PCT_004-10-V1 Riociguat 3 28 29 0.3 97 98 3PCT_004-10-V2 Riociguat 3 29 103PCT_004-10-V3 Riociguat 3 29 94PCT_004-10-V1 Probenecid 100 2 2 0.6 7 7 2PCT_004-10-V2 Probenecid 100 3 10PCT_004-10-V3 Probenecid 100 1 4



2.6.5.16-22: Pharmacokinetics: Inhibition of [³H]ES (1 µM) by riociguat (0.3 and 3 µM) in hOAT3-HEK and vector-HEK-cells



Test system: in vitroMaterial: hOAT3-HEKTest compound: Riociguat Assay: LSC for [3H]ESTable: Inhibition of [3H]ES (1 µM, probe substrate) uptake (5 min incubation) by riociguat (0.3 µM and 3 µM) and by probenecid (100 µM,

reference inhibitor) in hOAT3-HEK and vector-HEK-Cells.Assay no. Inhibitor Concentration Net-uptake [pmol/mg/min] Net uptake [%]



Per experiment


PCT_004-10-V1 0 5 4 0.3 104 100 6PCT_004-10-V2 0 4 91PCT_004-10-V3 0 5 105PCT_004-10-V1 Riociguat 0.3 4 4 0.2 93 98 4PCT_004-10-V2 Riociguat 0.3 4 102PCT_004-10-V3 Riociguat 0.3 5 100PCT_004-10-V1 Riociguat 3 4 4 0.3 88 93 4PCT_004-10-V2 Riociguat 3 4 94PCT_004-10-V3 Riociguat 3 5 98PCT_004-10-V1 Probenecid 100 0.3 0.2 0.03 5 5 0PCT_004-10-V2 Probenecid 100 0.2 4PCT_004-10-V3 Probenecid 100 0.2 5



2.6.5.16-23: Pharmacokinetics: Inhibition of [14C]riociguat (0.3 µM) by ES (10 and 100 µM) in hOAT3-HEK and probenecid (100 µM) and vector-HEK-cells



Test system: in vitroMaterial: hOAT3-HEK Nuclide: 14CTest compound: [14C]riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Uptake (5 min incubation) of [14C]riociguat (0.3 µM) and inhibition by ES (10 and 100 µM, probe substrate) and by probenecid



PCT_004-10-V1 0 0.1 0.15 0.1PCT_004-10-V2 0 0.2PCT_004-10-V3 0 0.2PCT_004-10-V1 ES 10 0.01 0.05 0.03PCT_004-10-V2 ES 10 0.1PCT_004-10-V3 ES 10 0.1PCT_004-10-V1 ES 100 -0.04 0.08 0.08PCT_004-10-V2 ES 100 0.1PCT_004-10-V3 ES 100 0.1PCT_004-10-V1 Probenecid 100 0.1 0.12 0.04PCT_004-10-V2 Probenecid 100 0.1PCT_004-10-V3 Probenecid 100 0.2



2.6.5.16-24: Pharmacokinetics: Inhibition of [14C]riociguat (3 µM) by ES (10 and 100 µM) in hOAT3-HEK and vector-HEK-cells



Test system: in vitroMaterial: hOAT3-HEK Nuclide: 14CTest compound: [14C]riociguat Assay: LSCTable: Uptake (5 min incubation) of [14C]riociguat (3 µM) and inhibition by ES (10 and 100 µM, probe substrate) and by probenecid



PCT_004-10-V1 0 -1 0.7 0.9PCT_004-10-V2 0 2PCT_004-10-V3 0 1PCT_004-10-V1 ES 10 1 0.8 0.1PCT_004-10-V2 ES 10 1PCT_004-10-V3 ES 10 1PCT_004-10-V1 ES 100 0.2 1.5 1.5PCT_004-10-V2 ES 100 1PCT_004-10-V3 ES 100 4PCT_004-10-V1 Probenecid 100 1 2.4 1.8PCT_004-10-V2 Probenecid 100 1PCT_004-10-V3 Probenecid 100 5



2.6.5.16-25: Pharmacokinetics: Interaction of KO1, KO2 and KO3 with OCT1, OCT2 and OCT3

Location: 4.2.2.7.7Report no.: R-8643

Report title: Report concerning the interaction of compounds KO1, KO2 and KO3 with the human organic cation transporters OCT1, OCT2 and OCT3

Test system: in vitroMaterial: OCT1, OCT2, OCT3Test compound: [14C]riociguat

Additional Information:Riociguat is transported by hOCT2, but is not a substrate of hOCT1 and hOCT3. Riociguat at 50 µM did not inhibit hOCT2, but reduced the transport of the OCT model substrate MPP+ by 40% and 70% in hOCT1- and hOCT3-transfected cells, respectively.



2.6.5.16-26: Pharmacokinetics: Interaction of KO1, KO2 and KO3 with OCT1, OCT2 and OCT3

Location: 4.2.2.7.7Report no.: R-8643

Report title: Report concerning the interaction of compounds KO1, KO2 and KO3 with the human organic cation transporters OCT1, OCT2 and OCT3

Test system: in vitroMaterial: OCT1, OCT2, OCT3Test compound: [14C]BAY 60-4552

Additional Information:BAY 60-4552 is not transported by hOCT1, hOCT2 and hOCT3.BAY 60-4552 did not inhibit hOCT2 and hOCT3 at 50 µM, but reduced the transport of the OCT model substrate MPP+ by 20% in hOCT1-transfected cells.



2.6.5.16-27: Pharmacokinetics: In vitro studies in L-MDR1 cells to evaluate the inhibitory potency of various drugs


Report title: BAY 63-2521: In vitro studies to evaluate the inhibitory potential of various drugs on the efflux of BAY 63-2521 across L-MDR1 cells

Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 in the presence of various drugs (n = 3).

Riociguat InhibitorInhibitor conc. Papp A-B Papp B-A Efflux ratio

[µM] [µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD1.0 Control 0.00 13.1 0.400 198 3.10 15.2 0.4661.0 Clotrimazole 1.00 13.2 0.200 241 11.4 16.1 0.2491.0 Indinavir 50.00 18.7 3.80 247 31.1 13.2 2.691.0 Saquinavir 10.00 14.8 3.20 218 19.5 14.7 3.181.0 Control 0.00 12.3 2.00 166 6.60 13.5 2.191.0 Atazanavir 50.00 15.0 1.80 237 20.0 15.8 1.911.0 Clarithromycin 50.00 16.7 2.80 249 17.1 14.9 2.511.0 Erythromycin 50.00 11.9 0.600 250 20.4 21.0 1.061.0 Control 0.00 20.9 3.00 131 12.1 6.30 0.9111.0 Atorvastatin 10.00 19.5 3.10 159 26.7 8.16 1.311.0 Atorvastatin 30.00 25.5 1.20 232 19.2 9.11 0.4371.0 Saquinavir 20.00 26.4 5.20 219 14.4 8.29 1.64






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 in the presence of amiodarone (n = 3).


[µM] [µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD1.0 Control 0.00 20.8 0.600 249 26.0 12.0 0.3631.0 Amiodarone 0.30 15.3 0.800 275 16.5 17.9 0.9371.0 Amiodarone 1.00 17.6 1.40 237 23.8 13.5 1.081.0 Amiodarone 3.00 25.5 2.60 242 7.60 9.48 0.9661.0 Amiodarone 10.00 29.5 1.60 226 18.3 7.68 0.4251.0 Amiodarone 30.00 39.5 1.40 254 30.9 6.43 0.2581.0 Amiodarone 100.00 44.8 3.50 252 19.1 5.62 0.4451.0 Amiodarone 300.00 94.3 5.80 262 18.1 2.78 0.184





Report title: BAY 63-2521: In vitro studies to evaluate the inhibitory potential of various drugs on the efflux of BAY 63-2521 across L-MDR1 cells.

Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of amiodarone on the efflux of riociguat (1 µM) across L-MDR1 cells after a 2 h incubation at 37 °C (n = 3).

Additional Information:

Amiodarone conc. [µM]

0.1 1 10 100 1000

Eff

lux

ratio

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

IC50 = 4.33 ± 3.77 µM






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 in the presence of cyclosporin A (n = 3).


[µM] [µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD1.0 Control 0.00 12.0 292 35.0 23.9a 0.120 a

1.0 Cyclosporin A 0.03 22.0 3.94 407 88.1 18.5 3.321.0 Cyclosporin A 0.10 14.3 1.77 252 43.8 17.6 2.181.0 Cyclosporin A 0.30 9.41 0.731 281 52.6 29.9 a 2.33 a

1.0 Cyclosporin A 1.00 16.5 3.45 239 92.8 14.5 3.071.0 Cyclosporin A 3.00 28.5 5.49 330 93.7 11.6 2.251.0 Cyclosporin A 10.00 65.5 9.13 200 15.6 3.06 0.4341.0 Cyclosporin A 30.00 98.4 10.9 142 34.7 1.45 0.292

a = italic values were not use into IC50 calculation






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of cyclosporin A on the efflux of riociguat (1 µM) across L-MDR1 cells after a 2 h incubation at 37 °C (n = 3).

Cyclosporin A conc. [µM]

0.01 0.1 1 10 100

Eff

lux

ratio

0

5

10

15

20

25

IC50 = 3.93 ± 1.27 µM






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 in the presence of itraconazole (n = 3).


[µM] [µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD1.0 Control 0.00 14.5 2.80 274 17.5 18.9a 3.64a

1.0 Itraconazole 0.01 17.0 3.23 248 15.4 14.6 2.791.0 Itraconazole 0.03 17.0 0.995 256 43.1 15.1 0.8991.0 Itraconazole 0.10 18.3 2.33 273 32.0 14.9 1.911.0 Itraconazole 0.30 27.2 2.03 268 57.0 9.85 0.7661.0 Itraconazole 1.00 30.3 4.71 241 35.0 7.96 1.251.0 Itraconazole 3.00 33.2 5.10 243 23.7 7.33 1.131.0 Itraconazole 10.00 39.9 0.0199 223 26.6 5.59 0.119







Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of itraconazole on the efflux of riociguat (1 µM) across L-MDR1 cells after a 2 h incubation at 37 °C (n = 3).

Itraconazole conc. [µM]

0.001 0.01 0.1 1 10 100

Eff

lux

ratio

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

IC50 = 0.26 ± 0.056 µM






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 in the presence of ivermectin (n = 3).


[µM] [µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD1.0 Control 0.00 9.84 1.60 240 28.3 24.4 3.971.0 Ivermectin 0.01 11.3 0.658 284 35.6 25.2 1.481.0 Ivermectin 0.03 15.8 0.00968 357 56.7 22.7 0.1591.0 Ivermectin 0.10 14.1 1.73 279 19.2 19.7 2.411.0 Ivermectin 0.30 18.2 3.49 295 58.0 16.2 3.111.0 Ivermectin 1.00 23.2 2.82 278 60.9 12.0 1.471.0 Ivermectin 3.00 65.5 12.1 205 17.7 3.12 0.5821.0 Ivermectin 5.00 76.8 7.16 106 9.28 1.38 0.156






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of ivermectin on the efflux of riociguat (1 M) across L-MDR1 cells after a 2 h incubation at 37 °C (n = 3).

Ivermectin conc. [µM]

0.001 0.01 0.1 1 10

Eff

lux

ratio

0

5

10

15

20

25

30

IC50 = 0.65 ± 0.17 µM






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 in the presence of ketoconazole (n=3).



1.0 Ketoconazole 0.10 12.5 3.14 259 56.4 20.7 5.221.0 Ketoconazole 0.30 16.0 1.67 320 42.5 20.0 2.091.0 Ketoconazole 1.00 14.2 0.937 241 51.0 17.0 1.141.0 Ketoconazole 3.00 23.3 0.944 281 52.6 12.1 0.5241.0 Ketoconazole 10.00 28.6 4.63 261 31.6 9.14 1.491.0 Ketoconazole 30.00 58.1 9.42 187 11.6 3.21 0.5251.0 Ketoconazole 50.00 66.3 17.4 169 38.8 2.55 0.704







Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of ketoconazole on the efflux of riociguat (1 µM) across L-MDR1 cells after a 2 h incubation at 37 °C (n=3).

Ketoconazole conc. [µM]

0.01 0.1 1 10 100

Eff

lux

ratio

0

5

10

15

20

25

30

IC50 = 4.9 ± 1.38 µM






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 in the presence of miconazole (n = 3).


[µM] [µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD1.0 Control 0.00 18.1 1.50 307 55.0 16.9 1.411.0 Miconazole 0.30 13.4 0.400 254 23.8 18.9 0.5711.0 Miconazole 1.00 15.2 1.50 239 28.2 15.7 1.551.0 Miconazole 3.00 16.3 3.00 263 37.0 16.1 2.971.0 Miconazole 10.00 34.8 6.40 271 16.2 7.80 1.441.0 Miconazole 30.00 64.7 7.40 201 25.3 3.11 0.378






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of miconazole on the efflux of riociguat (1 µM) across L-MDR1 cells after a 2 h incubation at 37 °C (n = 3).

Miconazole conc. [µM]

0.1 1 10 100 1000

Eff

lux

ratio

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

IC50 = 7.86 ± 2.03 µM






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 in the presence of quindine (n = 3).


[µM] [µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD1.0 Control 0.00 14.1 0.900 191 70.3 13.5 0.9391.0 Quinidine 1.00 11.7 2.06 239 66.6 20.4a 3.61a

1.0 Quinidine 3.00 17.3 1.45 248 55.0 14.4 1.231.0 Quinidine 10.00 18.9 0.971 207 51.6 10.9 0.6141.0 Quinidine 30.00 27.7 3.26 180 20.7 6.52 0.7771.0 Quinidine 50.00 34.3 6.32 186 1.36 5.44 1.001.0 Quinidine 100.00 51.6 3.92 170 10.5 3.30 0.2581.0 Quinidine 300.00 49.9 4.77 165 16.9 3.31 0.333







Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of quindine on the efflux of riociguat (1 µM) across L-MDR1 cells after a 2 h incubation at 37 °C (n=3).






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 in the presence of ritonavir (n=3).


[µM] [µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD1.0 Control 0.00 16.9 2.20 302 20.2 17.8 2.321.0 Ritonavir 0.30 17.9 3.30 212 5.80 11.8 2.181.0 Ritonavir 1.00 16.6 3.00 225 34.0 13.6 2.461.0 Ritonavir 3.00 15.9 4.00 225 15.2 14.2 3.561.0 Ritonavir 10.00 16.7 3.20 285 31.0 17.1 3.281.0 Ritonavir 30.00 20.5 5.70 234 17.0 11.4 3.161.0 Ritonavir 100.00 48.0 10.1 203 30.8 4.22 0.9011.0 Ritonavir 300.00 44.7 3.50 167 4.20 3.73 0.293






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MSMSTable: Inhibitory effect of ritonavir on the efflux of riociguat (1 µM) across L-MDR1 cells after a 2 h incubation at 37 °C (n = 3).






Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cells Nuclide: -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat across L-MDR1 in the presence of verapamil (n = 3).



1.0 Verapamil 0.10 17.5 1.46 301 77.3 17.2 1.471.0 Verapamil 0.30 19.2 0.173 340 32.9 17.7 0.1871.0 Verapamil 1.00 19.4 0.541 237 11.5 12.2 0.3451.0 Verapamil 3.00 23.1 0.809 270 13.9 11.7 0.4131.0 Verapamil 10.00 32.4 0.335 287 20.5 8.86 0.1161.0 Verapamil 30.00 44.2 3.79 258 46.5 5.84 0.5311.0 Verapamil 100.00 55.1 6.05 243 23.8 4.41 0.495







Test system: in vitroMaterial: L-MDR1 cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of verapamil on the efflux of riociguat (1 µM) across L-MDR1 cells after a 2 h incubation at 37 °C (n = 3).

Verapamil conc. [µM]

0.01 0.1 1 10 100 1000

Eff

lux

ratio

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

IC50 = 3.27 ± 3.94 µM



2.6.5.16-46: Pharmacokinetics: In vitro studies in MDCKII-BCRP cells to evaluate the inhibitory potency of various drugs


Report title: BAY 63-2521: In vitro studies to evaluate the inhibitory potential of various drugs on the efflux of BAY 63-2521 in MDCKII-BCRP cells

Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MSMSTable: Calculated [I1]/IC50 and [I2]/IC50 ratios of the investigated drugs.

[I1]:Plasma Cmax

[I2]:Gastrointestinal concentration IC50 [I1]/IC50 [I2]/IC50

[µM] (dose/250 mL) [µM]Atorvastatin 0.0123 80 mg dose: 0.6 mM > 30 < 0.0004 ≤ 20Clarithromycin 3.2 500 mg dose: 2.7 mM > 50 < 0.06 < 54Cyclosporine 1.1 350 mg dose: 1.2 mM 4.4 0.25 273Erythromycin 4.7 500 mg dose: 2.7 mM > 50 < 0.06 < 54Ketoconazole 13.6 400 mg dose: 3 mM 7.7 1.8 195Itraconazole 0.9 200 mg dose: 1.1 mM 0.43 2.1 2560Pantoprazole 6 40 mg dose: 0.4 mM 4 1.5 100Quinidine 4 400 mg dose: 4.9 mM ≥ 300 0.01 16Ritonavir 15 600 mg dose: 3.3 mM 4.7 3.2 702Saquinavir 1.4 800 mg dose: 4.8 mM ~ 10 0.14 480Verapamil 0.5 240 mg dose: 2.1 mM ≥ 100 ≤ 0.005 ≤ 21Voriconazole 6.7 240 mg dose: 2.3 mM > 30 < 0.2 < 80






Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells in the presence of voriconazole (n = 3).

InhibitorInhibitor conc. Papp A-B Papp B-A Efflux ratio[µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD

Control 0 19.0 3.79 400 17.1 21.1 4.31Voriconazole 0.03 22.6 1.48 472 30.1 20.9 1.91Voriconazole 0.1 24.6 1.11 452 27.8 18.4 1.41Voriconazole 0.3 23.6 1.71 385 16.3 16.3 1.37Voriconazole 1.0 24.4 1.53 439 13.1 18.0 1.25Voriconazole 3.0 26.6 2.03 464 35.9 17.4 1.90Voriconazole 10 25.2 0.36 456 13.6 18.1 0.60Voriconazole 30 28.6 3.70 459 23.7 16.0 2.23






Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MSMSTable: Transport of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells in the presence of ketoconazole (n = 2 - 3).


Control 0 18.0 5.84 410 53.0 22.8 7.93Ketoconazole 0.1 16.0 0.714 420 45.7 26.3 3.10Ketoconazole 0.3 14.7 0.943 385 34.3 26.2 2.88Ketoconazole 1.0 16.0 0.714 394 61.9 24.7 4.03Ketoconazole 3.0 22.3 3.31 497 4.87 22.3 3.32Ketoconazole 10 42.0 4.32 421 6.32 10.0 1.04Ketoconazole 30 133 41.2 292 28.0 2.2 0.71






Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MSMSTable: Inhibitory effect of ketoconazole on the efflux of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells (n = 2-3).

Ketoconazole [µM]

0.1 1 10 100

Eff

lux

ra

tio

BA

Y 6

3-2

52

1

0

5

10

15

20

25

30

35

IC50 = 7.7 ± 0.64 µM






Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cells Nuclide: -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MSMSTable: Transport of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells in the presence of itraconazole or KO143 (reference inhibitor) (n = 1-3).


Control 0 23.8 1.12 449 24.1 18.9 1.34Itraconazole 0.03 18.6 3.94 439 17.0 23.6 5.08itraconazole 0.1 23.4 6.44 451 19.7 19.3 5.39Itraconazole 0.3 24.6 4.16 433 22.7 17.6 3.12Itraconazole 1.0 36.3 9.44 377 13.9 10.4 2.72Itraconazole 3.0 52.4 7.09 406 4.21 7.75 1.05Itraconazole 10 63.1 8.3 380 12.9 6.03 0.816KO143 1.0 124 n.c.a 138 2.48 1.12 n.c.a

a = not calculated because n = 1






Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of itraconazole on the efflux of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells (n = 2 - 3).

Itraconazole [µM]

0.01 0.1 1 10

Eff

lux

ra

tio

BA

Y 6

3-2

52

1

0

5

10

15

20

25

30

IC50 = 0.43 ± 0.17 µM






Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MSMSTable: Transport of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells in the presence of verapamil (n = 3).


Control 0 18.7 1.28 435 9.9 23.2 1.67Verapamil 0.3 22.1 1.78 421 17.2 19.1 1.73Verapamil 1.0 21.2 2.23 437 34.7 20.6 2.71Verapamil 3.0 25.7 3.90 357 55.3 13.9 3.00Verapamil 10 23.7 1.31 450 20.4 19.0 1.36Verapamil 30 24.8 1.10 449 19.7 18.1 1.13Verapamil 100 30.1 3.48 420 37.9 14.0 2.05






Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: LC-MSMSTable: Transport of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells in the presence of pantoprazole (n = 1-3).


Control 0 12.0 2.84 313 n.c.a 26.0 n.c.a

Pantoprazole 0.3 25.5 4.46 450 3.59 17.6 3.08Pantoprazole 1.0 24.9 2.27 411 22.5 16.5 1.76Pantoprazole 3.0 34.0 12.9 361 7.61 10.6 4.04Pantoprazole 10 46.2 0.99 259 20.6 5.6 0.46Pantoprazole 30 110 16.9 152 13.3 1.4 0.24Pantoprazole 100 113 16.0 127 6.38 1.1 0.17







Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of pantoprazole on the efflux of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells (n = 1-3).

Pantoprazole [µM]

0.1 1 10 100

Eff

lux

ra

tio

BA

Y 6

3-2

52

1

0

5

10

15

20

25

IC50 = 4.0 ± 0.83 µM






Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MSMSTable: Transport of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells in the presence of cyclosporin A (n = 1 - 3).


Control 0 20.0 n.c.a 423 10.4 21.2 n.c.a

Cyclosporin A 0.03 21.7 1.86 459 35.7 21.2 2.45Cyclosporin A 0.1 24.3 n.c.a 429 17.8 17.7 n.c.a

Cyclosporin A 0.3 25.8 4.28 395 15.4 15.3 2.61Cyclosporin A 1.0 23.8 2.73 444 34.8 18.7 2.59Cyclosporin A 3.0 31.2 4.30 424 37.1 13.6 2.21Cyclosporin A 10 60.6 1.58 330 19.1 5.4 0.35Cyclosporin A 30 78.2 2.51 252 19.7 3.2 0.27







Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of cyclosporin A on the efflux of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells (n = 1-3).

Cyclosporin A [µM]

0.01 0.1 1 10

Eff

lux

ra

tio

BA

Y 6

3-2

52

1

0

5

10

15

20

25

30

IC50 = 4.4 ± 2.0 µM






Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cells -Test compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells in the presence of quinidine or KO143 (reference inhibitor) (n = 3).


Control 0 19.0 4.33 388 25.9 20.5 4.87Quinidine 3.0 27.4 3.81 408 21.0 14.9 2.21Quinidine 10 28.7 5.57 405 22.6 14.1 2.84Quinidine 30 28.5 6.94 412 24.1 14.5 3.62Quinidine 50 29.2 7.99 445 24.0 15.3 4.27Quinidine 100 30.3 3.86 437 21.2 14.4 1.96Quinidine 300 37.3 3.72 431 6.52 11.6 1.17KO143 1.0 144 9.26 119 2.18 0.83 0.06






Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MSMSTable: Transport of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells in the presence of ritonavir or KO143 (reference inhibitor) (n = 1-3).


Control 0 19.9 2.72 405 32.8 20.3 3.22Ritonavir 1.0 22.6 2.89 423 24.3 18.7 2.62Ritonavir 3.0 31.8 3.06 399 n.c. 12.5 n.c.a

Ritonavir 10 35.1 3.54 338 12.9 9.6 1.04Ritonavir 30 76.6 13.6 275 29.0 3.6 0.74Ritonavir 100 139 23.8 165 11.9 1.2 0.22KO143 1.0 145 12.4 110 6.07 0.76 0.08

a = not calculated







Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of ritonavir on the efflux of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells (n = 1-3).

Ritonavir [µM]

1 10 100

Eff

lux

ra

tio

BA

Y 6

3-2

52

1

0

5

10

15

20

25

IC50 = 4.7 ± 2.8 µM





Report title: BAY 63-2521: In vitro studies to evaluate the inhibitory potential of various drugs on the efflux of BAY 63-2521 in MDCKII-BCRP cells.

Test system: In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: Riociguat Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of riociguat (1 µM) across BCRP-MDCKII cells in the presence of atorvastatin, clarithromycin, erythromycin or saquinavir

(n = 3).


Control 0 22.3 1.14 348 9.50 15.6 0.90Control 0 29.6 1.35 411 36.8 13.9 1.40Atorvastatin 30 36.3 6.83 358 13.7 9.9 1.89Clarithromycin 50 36.1 2.67 398 18.9 11.0 0.97Erythromycin 50 29.2 3.56 365 9.23 12.5 1.55Saquinavir 1.0 34.1 5.60 410 16.9 12.0 2.03Saquinavir 10 42.2 4.78 365 15.9 8.6 1.05Saquinavir 30 80.5 6.71 265 7.49 3.3 0.29




2.6.5.16-61: Pharmacokinetics: Plasma protein binding in vitro of BAY 60-4552 (M-1)


Report title: BAY 60-4552: Stability in Plasma, Binding to Plasma Proteins, and Erythrocyte/Plasma Partitioning of [14C]BAY 60-4552 in Vitro

Test compound: [14C]BAY 60-4552 Method: UltrafiltrationAnalyte: Radioactivity Assay: LSCSpecies / strain / Test system

Gender / no. Matrix Concentration [mg/L]

Fraction bound [%]

Fraction unbound[%]

Rat / Wistar Male / 3 Plasma 0.0511-2.57 89.3 10.7Human / Caucasian Male / 3 Plasma 0.0507 95.4 4.59Human / Caucasian Male / 3 Plasma 0.541 96.3 3.68Human / Caucasian Male / 3 Plasma 2.14 96.2 3.76Dog / Beagle Female / 3 Plasma 0.0517-1.63 83.5 16.5Mouse / CD-1 Male / 3 Plasma 0.0521-3.05 82.9 17.1Human / n.a. a n.a.a / 3 AGP (0.7 g/L) 0.554 47.0 53.0Human / n.a. a. n.a.a / 3 HSA (40 g/L) 0.556 83.9 16.1Fetal calf n.a.b / 3 Williams Medium 0.0564-2.08 41.8 58.2

a = not applicable




2.6.5.16-62: Pharmacokinetics: Blood to plasma concentration ratio in vitro of BAY 60-4552 (M-1)



Test compound: BAY 60-4552Analyte: RadioactivitySpecies / strain Gender / no. Conc. in blood (Cb)

[mg/L]Conc. in plasma (Cp)

[mg/L]Cp / Cb

Rat / Wistar Male / 3 0.0507-2.37 0.0571-2.77 1.16Human / Caucasian Male / 3 0.0523-2.17 0.0719-3.02 1.4Dog / Beagle Female / 3 0.056-2.17 0.0594-2.38 1.09




2.6.5.16-63: Pharmacokinetics: Blood to plasma concentration ratio in vitro of BAY 60-4552 (M-1)



Test compound: BAY 60-4552Analyte: RadioactivitySpecies Gender Concentration

[µg/L]fu

[%]Human pH 7.2 Male 0.950 4.16Human pH 7.4 Male 1.05 3.57Human pH 7.6 Male 1.10 3.34Human pH 7.8 Male 1.02 3.03




2.6.5.16-64: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, UGT isoforms involved of BAY 60-4552 (M-1)


Report title: Identification of Human UDP-glucuronosyl-transferase (UGT) Isoforms Involved in the In Vitro Metabolism of the Major Metabolite BAY 60-4552

Species / strain: Human / n.a.a Route: in vitroMaterial: liver, kidney, lung,and intestinal microsomes Test compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MSTable: Formation of glucuronide (M-4) catalyzed by various enzyme sourcesEnzyme source BAY 60-4552

[µM]Time [min]

M-4(peak area)

Liver HLM 1 60 38098Kidney HRM 1 60 61617Lung HPM (NS)c 1 60 n.d.b

Lung HPM (S)d 1 60 n.d.b

Intestine HIM 1 60 n.d.b

Liver HLM 10 60 345379Kidney HRM 10 60 487257Lung HPM (NS)c 10 60 n.d.b

Lung HPM (S)d 10 60 n.d.b

Intestine HIM 10 60 221283

a = not applicable:b = not detectedc = non smokersd = smokers







Species / strain: Human / n.a.a Route: in vitroMaterial: Recombinant UGTsTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MSTable: Formation of glucuronide (M-4) by human UGT isozymesHuman UGTs BAY 60-4552

[µM]Time [min]

M-4(peak area)

UGT1A1 1 60 n.d.b

UGT1A3 1 60 n.d.b

UGT1A4 1 60 n.d.b

UGT1A6 1 60 n.d.b

UGT1A7 1 60 n.d.b

UGT1A8 1 60 n.d.b

UGT1A9 1 60 52328UGT1A10 1 60 n.d.b

UGT2B4 1 60 n.d.b

UGT2B7 1 60 n.d.b

UGT2B15 1 60 n.d.b

UGT2B17 1 60 n.d.b

UGT insect contr. 1 60 n.d.b

UGT1A1 10 60 239097UGT1A3 10 60 33255UGT1A4 10 60 n.d.b

UGT1A6 10 60 n.d.b

UGT1A7 10 60 n.d.b

UGT1A8 10 60 n.d.b




2.6.5.16-65: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, UGT isoforms involved of BAY 60-4552 (M-1) (continued)



Species / strain: Human / n.a.a Route: in vitroMaterial: Recombinant UGTsTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MSTable: Formation of glucuronide (M-4) by human UGT isozymesHuman UGTs BAY 60-4552

[µM]Time [min]

M-4(peak area)

UGT1A9 10 60 169606UGT1A10 10 60 n.d.b

UGT2B4 10 60 n.d.b

UGT2B7 10 60 n.d.b

UGT2B15 10 60 n.d.b

UGT2B17 10 60 n.d.b

UGT insect contr. 10 60 n.d.b

a = not applicable b = not detected







Species / strain: Human / n.a.a Route: in vitroMaterial: Liver, kidney and intestinal microsomesTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibition of glucuronide formation in the presence of UGT isoform-selective inhibitors in human liver (HLM), renal (HRM), and

intestinal microsomes (HIM)Mics Predominantly

inhibited UGTInhibitor c [Inhibitor]

[µM]Mean %

M-4% of control

Liver HLM - Control (no UDPGA) -Liver HLM - Control (ACN:Water 3:1) - 245400 -

Liver HLM 1A1 Atazanavir 5 78523 32.0

Liver HLM - Control (no UDPGA) -

Liver HLM - Control (ACN:20 mM NaOH 1:1) - 296148 -.

Liver HLM 1A9 Niflumic Acid 5 212654 71.8

Kidney HRM - Control (no UDPGA) -

Kidney HRM - Control (ACN:Water 3:1) - 311418 -

Kidney HRM 1A1 Atazanavir 5 309416 99.4

Kidney HRM - Control (no UDPGA) -

Kidney HRM - Control (ACN:20 mM NaOH 1:1) - 352974 -

Kidney HRM 1A9 Niflumic acid 5 88622 25.1




2.6.5.16-66 Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, UGT isoforms involved of BAY 60-4552 (M-1) (continued)



Species / strain: Human / n.a.a Route: in vitroMaterial: Liver, kidney and intestines microsomesTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibition of glucuronide formation in the presence of UGT isoform-selective inhibitors in human liver (HLM), renal (HRM), and

intestinal microsomes (HIM)Mics Predominantly

inhibited UGTInhibitor c [Inhibitor]

[µM]Mean %

M-4% of control

Intestine HLM - Control (no UDPGA) -Intestine HLM - Control (ACN:Water 3:1) - 174025 -Intestine HLM 1A1 Atazanavir 5 101071 58.1Intestine HLM - Control (no UDPGA) -Intestine HLM - Control (ACN:20 mM NaOH 1:1) - 234912 -Intestine HLM 1A9 Niflumic Acid 5 219114 93.3

a = not applicable:




2.6.5.16-67: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, CYP inhibitory potential of BAY 60-4552 (M-1)


Report title: Determination of the Inhibitory Potency of BAY 60-4552 Towards Human CYP Isoforms In Vitro

Species / strain: Human / n.a.a Route: in vitroMaterial: Recombinant CYPs, liver microsomesTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC / fluorescence / radio detection, HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effects of BAY 60-4552 on formation of metabolites from standard probes mediated by cytochrome P450 isoforms

(duplicate incubations, mean value)CYP isoform Probe reaction Enzyme source IC50

[µM]Ki

[µM]1A1 Phenacetin O-deethylation Recombinant 0.74 0.651A2 Phenacetin O-deethylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2A6 Coumarin 7-hydroxylation Recombinant > 50 n.d.b

2B6 Bupropion hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2C8 Amodiaquine N-deethylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2C9 Diclofenac 4’-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2C19 Mephenytoin 4’-hydroxylation Recombinant > 50 n.d.b

2D6 Dextromethorphan O-demethylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

2E1 Chlorzoxazone 6-hydroxylation Recombinant > 50 n.d.b

2J2 Ebastine tert-butyl-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

3A4 Midazolam 1’-hydroxylation Human liver microsomes > 50 n.d.b

Midazolam (30 min preincubation) Human liver microsomes > 50 n.d.b

3A4 Testosterone 6-hydroxyltion c Human liver microsomes > 50 n.d.b

Testosterone (30 min preincubation) c Human liver microsomes > 50 n.d.b

a = not applicable b = not determinedc = single incubation




2.6.5.16-68: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, UGT inhibitory potential of BAY 60-4552 (M-1)


Report title: Determination of the Inhibitory Potential of BAY 60-4552 Towards Human UDP-glucuronosyltransferases (UGTs)

Species / strain: Human / n.a.a Route: in vitroMaterial: Liver microsomesTest compound: BAY 60-4552 Assay: LC-MS/MSTable: Inhibitory effect of BAY 60-4552 on glucuronidation of UGT isoform-selective standard probes.UGT isoform Substrate IC50

[µM]Ki

[µM]Various Estradiol (estradiol 17-gluc) > 50 n.d.b

1A1 Estradiol (estradiol 3-gluc) > 50 n.d.b

1A4 Trifluoperazine > 50 n.d.b

1A6 α-Naphthol > 50 n.d.b

1A9 Propofol 18.3 11.32B7 3’-Azido-3’-deoxythymidine > 50 n.d.b





2.6.5.16-69: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, SULT inhibitory potential of BAY 60-4552 (M-1)


Report title: Determination of the Inhibitory Potential of BAY 60-4552 Towards Human Sulfotransferases (SULTs)

Species / strain: Human / n.a.a Route: in vitroMaterial: Liver cytosolTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MSTable: Inhibitory effect of BAY60-4552 on sulfation of SULT isoform standard probes in human liver cytosol.SULT isoform Substrate IC50 [µM] Ki[µM]

Various, predominantly SULT1E1 17β-Estradiol >25 n.d.b

Various, predominantly SULT1E1 17α-Ethinylestradiol >25 n.d.b





2.6.5-16-70: Pharmacokinetics: Metabolism in vitro, CYP induction potential of BAY 60-4552 (M-1)


Report title BAY 63-2521. Evaluation of the CYP Induction Potential of BAY 60-4552 in Cultured Human Hepatocytes

Species / strain: Human / n.a.a Route: In vitroMaterial: Cultured human hepatocytesCompound: BAY 60-4552 Assay: LC-MSMS of CYP specific substratesTable: Inductive potential of BAY 60-4552 towards human CYP1A2, 2B6, 2C19 and 3A4CYP Result1A2, 2B6, 2C19 and 3A4 No induction up to 10000 µg/L




2.6.5.16-71: Pharmacokinetics: In vitro studies in L–MDR1 cells to evaluate the P-gp substrate characteristics of BAY 60-4552 (M-1)


Report title: BAY 60-4552: In Vitro Studies in L-MDR1 Cells to Evaluate the P-gp Substrate Characteristics and the P-gp Inhibition Potential

Test system: In vitroMaterial: Human L-MDR1 cells / LLC-PK1 cellsTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of BAY 60-4552 at 1 µM across L-MDR1 and LLC-PK1 cells (n = 2-3)

Cell typeIvermectinconcentration Papp A-B Papp B-A Efflux ratio


[µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD Mean SDL-MDR1 control 12.5 2.6 129 19.9 10.4 2.7LLC-PK1 control 56.3 3.9 37.9 8.4 0.7 0.2 15.4 5.3L-MDR1 5 38.8 3.8 83.9 9.8 2.2 0.3LLC-PK1 5 64.9 4.5 28.7 0.4 0.4 0.03 n.a.a

a = not applicable




2.6.5.16-72: Pharmacokinetics: In vitro studies in L-MDR1 cells to evaluate the P-gp substrate characteristics of BAY 60-4552 (M-1)


Report title: BAY 60-4552: In Vitro Studies in L-MDR1 Cells to Evaluate the P-gp Substrate Characteristics and the P-gp Inhibition Potential

Test system: In vitroMaterial: Human L-MDR1 cells / LLC-PK1 cellsTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MS/MSTable: Transport of the P-gp model substrate Dipyridamole across L-MDR1 and LLC-PK1 cells (n = 2-3)

Cell typeDipyridamoleconcentration Papp A-B Papp B-A Efflux ratio[µM] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD

L-MDR1 1 21.5 0.1 718 81.6 33.3 3.8LLC-PK1 1 111 28.6 119 5.0 1.1 0.3




2.6.5.16-73: Pharmacokinetics: In vitro studies in L-MDR1 cells to evaluate the inhibitory potency towards P-gp



Test system: In vitroMaterial: Human L-MDR1 cells / LLC-PK1 cellsTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC–MS/MSTable: Effect of BAY 60-4552 at various concentrations on the efflux of 1 µM Dipyridamole in L-MDR1 cells (n = 1-3).Cell type Inhibitor Papp A-B Papp B-A Efflux ratio

Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SDL-MDR1 Control 10.8 a 415 34.1 38.4 n.a.b

L-MDR1 BAY 60-4552 (0.3 µM) 11.1 2.2 436 21.1 39.2 7.9L-MDR1 BAY 60-4552 (1 µM) 9.5 1.8 409 20.0 42.9 8.2L-MDR1 BAY 60-4552 (3 µM) 11.9 2.5 441 10.1 37.2 8.0L-MDR1 BAY 60-4552 (10 µM) 15.5 3.1 475 21.9 30.7 6.4L-MDR1 Ivermectin (5 µM) 125 7.3 353 53.2 2.8 0.5

a = 2 out of 3 wells failed the Lucifer Yellow monolayer integrity test.b = not applicable







Test system: In vitroMaterial: Human L-MDR1 cells / LLC-PK1 cellsTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC–MS/MSTable: Effect of BAY 60-4552 at various concentrations on the efflux of 25 µM Digoxin in L-MDR1 cells (n = 2-3).Cell type Inhibitor Papp A-B Papp B-A Efflux ratio

Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SDL-MDR1 Control 8.4 2.0 101 5.0 11.9 2.9L-MDR1 BAY 60-4552 (0.1 µM) 6.6 0.7 110 7.5 16.8 2.2L-MDR1 BAY 60-4552 (1 µM) 9.2 1.2 103 4.1 11.2 1.6L-MDR1 BAY 60-4552 (10 µM 10.9 1.0 108 3.3 9.9 1.0L-MDR1 BAY 60-4552 (30 µM) 14.7 4.2 102 1.7 7.0 2.0L-MDR1 BAY 60-4552 (100µM) 9.8 2.4 104 5.8 10.6 2.7L-MDR1 Ivermectin (5 µM) 43.2 6.3 80.2 6.3 1.9 0.3




2.6.5.16-75: Pharmacokinetics: In vitro studies in MDCKII cells to evaluate BCRP substrate characteristics of BAY 60-4552 (M-1)


Report title: BAY 60-4552: In Vitro Studies in MDCKII-BCRP Cells to Evaluate the Substrate Characteristics and Inhibitory Potential of BAY 60-4552 towards Human BCRP

Test system: in vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MS/MSTable: Permeability of BAY 60-4552 across BCRP overexpressing MDCKII cells after a 2 h incubation at 37°C (n of 3 per direction)

Concentration InhibitorInhibitor

conc. Papp A-B Papp B-A Efflux ratio


SD[nm/s]

Mean [nm/s]

SD [nm/s] Mean SD

Topotecan 2.0 8.1 1.4 159 55 20 3.4BAY 60-4552 0.20 <LLOQa <LLOQa 249 23 n.c.b n.c.b

BAY 60-4552 1.0 10.0 0.52 266 39 27 1.4BAY 60-4552 1.0 Ko 143 1.0 48 4.3 123 26 2.6 0.31BAY 60-4552 10 7.7 1.4 277 54 36 6.3

a = LLOQ - lower limit of quantitationb = n.c. - not calculated




2.6.5.16-76: Pharmacokinetics: In vitro studies in MDCKII-BCRP cells to evaluate the inhibitory potency towards BCRP of BAY 60-4552


Report title: BAY 60-4552: In Vitro Studies in MDCKII-BCRP Cells to Evaluate the Substrate Characteristics and Inhibitory Potential of BAY 60-4552 Towards Human BCRP

Test system In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MSMSTable: Inhibitory effect of BAY 60-4552 and Ko143 on the efflux of Topotecan (2 M) across MDCKII-BCRP cells after a 2 h incubation at

37°C.Topotecan conc. Inhibitor


[µM] [µM] Mean [nm/s]SD

[nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD2.0 4.4 0.81 108 2.9 25 4.52.0 BAY 60-4552 0.10 3.0 0.63 151 8.8 50 112.0 BAY 60-4552 1.0 5.2 0.35 149 10 28 1.92.0 BAY 60-4552 10 6.1 0.75 138 1.6 23 2.82.0 Ko143 1.0 24 1.7 29 5.5 1.2 0.21




2.6.5.16-77: Pharmacokinetics: In vitro studies in MDCKII-BCRPI cells to evaluate the inhibitory potency towards BCRP of BAY 60-4552


Report title: BAY 60-4552: In Vitro Studies in MDCKII-BCRP Cells to Evaluate the Substrate Characteristics and Inhibitory Potential of BAY 60-4552 Towards Human BCRP

Test system In vitroMaterial: MDCKII- BCRP cellsTest compound: BAY 60-4552 Assay: HPLC-MS/MSTable: Inhibitory effect of BAY 60-4552, Ko143 and Ritonavir on the efflux of PhiP (2 µM) across MDCKII-BCRP cells after a 2 h

incubation at 37°C.PhiPconc. Inhibitor


[µM] [µM] Mean [nm/s]SD

[nm/s] Mean [nm/s] SD [nm/s] Mean SD2.0 69 19 430 48 6.2 1.72.0 BAY 60-4552 0.10 59 4.7 550 29 9.3 0.742.0 BAY 60-4552 1.0 53 6.9 478 5.7 9.0 1.22.0 BAY 60-4552 10 61 6.0 504 54 8.2 0.812.0 Ko 143 1.0 349 6.4 189 34 0.54 0.182.0 Ritonavir 0.10 66 10 509 77 7.7 1.22.0 Ritonavir 1.0 72 3.4 685 78 9.5 0.472.0 Ritonavir 10.0 155 48 584 93 3.8 1.2

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