血清血清 γγ －球蛋白的分离、纯化及－球蛋白的分离、纯化及鉴定鉴定

分工合作分工合作 专人、固定专人、固定锥形瓶，放开，不断滴加锥形瓶，放开，不断滴加 pH6.pH6.

33 醋酸盐醋酸盐缓冲液，防止气泡。缓冲液，防止气泡。 盐析混匀时需要盐析混匀时需要两个人合作两个人合作。。 两次操作是一样的，都有动手的机会。两次操作是一样的，都有动手的机会。 改错！改错！（（ P46P46 页错误）页错误）

操作操作 一、盐析 一、盐析 <1><1> 取取 1ml1ml 血清血清 1ml1ml ，，<2><2> 取取 1ml1ml 饱和饱和 (NH(NH ４４ )) ２２ SOSO ４４溶液缓慢滴溶液缓慢滴

入，边加边摇。入，边加边摇。 <3><3> 混匀后于室温中混匀后于室温中放置放置 1010 分钟分钟。。

目的要求目的要求 (( 一一 )) 掌握分离纯化蛋白质的基本原理。掌握分离纯化蛋白质的基本原理。 (( 二二 )) 了解柱层析技术。了解柱层析技术。

实验原理实验原理 蛋白质的蛋白质的分离和纯化分离和纯化是研究蛋白质化学及是研究蛋白质化学及

其生物学功能的其生物学功能的重要手段重要手段。。 不同蛋白质的不同蛋白质的分子量分子量、、溶解度溶解度及在一定条及在一定条

件下，件下，带电的情况带电的情况等都有所不同。利用这等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。

一、粗提（盐析法）一、粗提（盐析法）

盐析的定义。常用的中性盐有：盐析的定义。常用的中性盐有：硫酸铵硫酸铵、、硫酸钠硫酸钠等，由于各种蛋白质分子的等，由于各种蛋白质分子的颗粒大颗粒大小小和和亲水程度亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。也不一样。

因此，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉因此，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。淀从而达到分离的目的。

血清中含有血清中含有清蛋白清蛋白和和球蛋白球蛋白。用。用半饱和半饱和的的(NH(NH ４４ )) ２２ SOSO ４４盐析可盐析可使球蛋白沉淀使球蛋白沉淀，而清，而清蛋白仍留在溶液中，经离心而分离。蛋白仍留在溶液中，经离心而分离。

原因：一、清蛋白等电点是原因：一、清蛋白等电点是 4.04.0 。。 αα22 球蛋球蛋白等电点是白等电点是 5.065.06 ，， ββ 球蛋白等电点是球蛋白等电点是 5.15.1 ，，γγ 球蛋白等电点是球蛋白等电点是 7.17.1 。 。

二、清蛋白的分子量二、清蛋白的分子量远小于远小于球蛋白球蛋白

二、脱盐（凝胶层析法）二、脱盐（凝胶层析法） 盐析分离的蛋白质溶液中含有盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐大量无机盐，，

必须先脱盐后才能进一步纯化。脱盐有多必须先脱盐后才能进一步纯化。脱盐有多种方法，本实验采用种方法，本实验采用凝胶层析法凝胶层析法。。

凝胶层析法主要根据混合物中分子凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同大小不同的各的各种物质，随种物质，随流动相流动相流经作为流经作为固定相固定相的凝胶层析柱的凝胶层析柱时，各分子的时，各分子的扩散移动速度不同扩散移动速度不同，使混合物质得，使混合物质得到分离的技术。到分离的技术。

凝胶有多种，凝胶有多种，葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是最常用的一种人工合是最常用的一种人工合成凝胶。成凝胶。

混合物中各种物质同时进行着混合物中各种物质同时进行着两种不同的运动两种不同的运动，，垂垂直向下直向下移动和移动和无定向的扩散无定向的扩散运动。运动。

大分子物质大分子物质 (( 蛋白质蛋白质 )) 直径大不能入凝胶颗粒的网孔，直径大不能入凝胶颗粒的网孔，垂直向下的速度较快。垂直向下的速度较快。小分子物质小分子物质 (( 无机盐无机盐 )) 可扩散可扩散入凝胶颗粒网孔之中， 入凝胶颗粒网孔之中，

结果小分子物质流出所经的路程较大分子为长，结果小分子物质流出所经的路程较大分子为长，从而使混合物中各组分按分子大小不同的顺序流出，从而使混合物中各组分按分子大小不同的顺序流出，得到除去盐的蛋白质溶液。得到除去盐的蛋白质溶液。

三、纯化（离子交换法）三、纯化（离子交换法） 离子交换离子交换是指溶液中的离子和交换剂上的是指溶液中的离子和交换剂上的

离子进行可逆的交换过程。带正电荷的交离子进行可逆的交换过程。带正电荷的交换剂称为换剂称为阴离子交换剂阴离子交换剂；带负电荷的交换；带负电荷的交换剂称剂称阳离子交换剂阳离子交换剂。。

DEAEDEAE 纤维素是一种阴离子交换剂。纤维素是一种阴离子交换剂。

因球蛋白中因球蛋白中 αα 及及 ββ 球蛋白的球蛋白的 pIpI ＜＜ 6.36.3 而而 γγ 球蛋白的球蛋白的 pIpI ＞＞ 6.3(pI7.36.3(pI7.3) ) 故经故经 DEAEDEAE 纤维素阴离子交换层析流出的第纤维素阴离子交换层析流出的第

一部分蛋白质为纯化的一部分蛋白质为纯化的 γγ 球蛋白。球蛋白。 纯化前后的纯化前后的 γγ 球蛋白用电泳法进行鉴定。球蛋白用电泳法进行鉴定。

操作操作 一、盐析 一、盐析 <1><1> 取取 1ml1ml 血清血清 1ml1ml ，，<2><2> 取取 1ml1ml 饱和饱和 (NH(NH ４４ )) ２２ SOSO ４４溶液缓慢滴溶液缓慢滴

入，边加边摇。入，边加边摇。 <3><3> 混匀后于室温中混匀后于室温中放置放置 1010 分钟分钟。。

<4><4> 然后每分然后每分 35003500 转转离心离心 1010 分钟分钟，并小心，并小心吸去吸去上清液，用上清液，用滤纸条滤纸条吸除上清夜。吸除上清夜。

<5><5> 沉淀加沉淀加 pH6.5pH6.5 醋酸氨缓冲液醋酸氨缓冲液 0.5ml0.5ml ，，使之溶解，作为纯化使之溶解，作为纯化 γγ 球蛋白用。球蛋白用。

二、二、 GG－－ 2525 凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐

（一）葡聚糖凝胶（一）葡聚糖凝胶 GG －－ 2525 层析柱的制备：层析柱的制备： 11 、取层析柱，关紧下端出口、取层析柱，关紧下端出口加蒸馏水少许加蒸馏水少许。。 22 、缓慢加入膨胀处理过的、缓慢加入膨胀处理过的凝胶悬液凝胶悬液，预先，预先

经经 pH6.5pH6.5 醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液流洗平衡。流洗平衡。

33 、待胶下沉至、待胶下沉至 1010 ～～ 15cm15cm 高高 (( 防止凝胶防止凝胶分层和柱内混有气泡，使表面整平并盖一分层和柱内混有气泡，使表面整平并盖一滤纸片，即可使用。滤纸片，即可使用。

（二）上样与洗脱：（二）上样与洗脱： 11 、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚好下降到凝胶床表面刚好下降到凝胶床表面 ((注意不要使液面低于凝注意不要使液面低于凝胶床表面以致空气进行凝胶床胶床表面以致空气进行凝胶床 )) 。。

22 、、关紧下端出口关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，，用滴管吸取盐析球蛋白液，小心缓慢的小心缓慢的加到凝胶床表面上加到凝胶床表面上 ((注意不要将凝胶注意不要将凝胶粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整粒中冲起或破坏凝胶床表面的平整 )) 。。

33 、、开下端出口开下端出口，使样品进入凝胶床，关闭出，使样品进入凝胶床，关闭出口，小心加入适量口，小心加入适量 pH6.3pH6.3磷酸缓冲液。磷酸缓冲液。

44 、、放开，放开，流速约流速约 2020 滴滴 // 分钟，立即分钟，立即检测（方检测（方法见后）法见后），检测到蛋白后收集三管，，检测到蛋白后收集三管， 2020 滴滴 //管。 颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。管。 颜色最深而且无浑浊的管用于下一步操作。

洗脱液中蛋白质的检查洗脱液中蛋白质的检查

取取小试管小试管 33 个个，分别加，分别加 2020 ％磺基水杨酸％磺基水杨酸 1100 滴，从下端管口取滴，从下端管口取 11 滴，滴于试管中，出滴，滴于试管中，出现现白色混浊或沉淀白色混浊或沉淀即有蛋白质析出。即有蛋白质析出。

对比法：对比法：与未加液体的管对比，出现浑浊与未加液体的管对比，出现浑浊即开始收集。即开始收集。

三、阴离子交换层析三、阴离子交换层析 经处理经处理再生再生后的后的 DEAEDEAE －纤维素，将脱盐－纤维素，将脱盐

后含球蛋白的溶液加于后含球蛋白的溶液加于 DEAEDEAE 纤维阴离子纤维阴离子交换交换柱上，用同一缓冲液洗脱，柱上，用同一缓冲液洗脱，

分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集分管收集洗脱液。检测到蛋白后立即收集三管，三管， 2020 滴滴 //管，编号。管，编号。

五、注意事项五、注意事项 11 、盐析：边加边混（、盐析：边加边混（为什么？）。为什么？）。 22 、滴速：、滴速： 2020 滴滴 // 分。分。 33 、、避免污染避免污染磺基水杨酸。磺基水杨酸。

下午下午

浓缩浓缩 刷一个干净的刷一个干净的小试管小试管，滤纸上控干。，滤纸上控干。 找一张找一张干净的纸条干净的纸条，折叠，倒入一包葡聚，折叠，倒入一包葡聚

糖干粉，小心的送入试管底部。糖干粉，小心的送入试管底部。 加入加入 11号管的样品号管的样品，小心的震荡混匀，取，小心的震荡混匀，取

上层液体一滴上样。上层液体一滴上样。

如果液体太少，小心的如果液体太少，小心的滴加滴加 22号试管的液号试管的液体，混匀，取上清夜点样。体，混匀，取上清夜点样。

回收！回收！

四、醋酸纤维素薄膜电泳检查四、醋酸纤维素薄膜电泳检查样品：样品： (1)(1) 血清。血清。 (2) (2) 纯化的纯化的 γγ －球蛋白液－球蛋白液 (( 由于此溶液浓度由于此溶液浓度

较低，较低，应多次点样于同一位置（应多次点样于同一位置（ 1010 次），次），每次点样时每次点样时待干后再点待干后再点。。

注意事项注意事项 11 、不要调电泳仪、不要调电泳仪！！！！！！ 22 、、血清接触血清接触过的点样器、玻片用完后过的点样器、玻片用完后抛入抛入 8484消毒液消毒液 3030 分钟后清洗分钟后清洗

33 、多次点样在、多次点样在同一位置！同一位置！

11 、、所用缓冲液所用缓冲液为醋酸铵缓冲液，还是硫为醋酸铵缓冲液，还是硫酸铵？酸铵？

22 、、完全饱和的硫酸铵完全饱和的硫酸铵中清蛋白、球蛋白中清蛋白、球蛋白是否均发生沉淀？是否均发生沉淀？

33 、、层析的原理层析的原理是什么？是什么？

思考题思考题

再生再生 醋酸根离子醋酸根离子 ClCl 离子离子 蛋白质离子蛋白质离子