Московская гимназия на Юго-западе № 1543 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

РАН

Генотипирование генов главного комплекса

гистосовместимости по локусу HLA.

Юртаева С., Коробко Е.

Научный руководитель: Доктор биологических наук Юрий Борисович Лебедев.

Москва 2011

Введение.

Аутоиммунные заболевания – это заболевания, нарушающие работу иммунной системы, которая начинает уничтожать собственные клетки организма.

Анкилозирующий спондилит (АС) – аутоиммунное заболевание, для которого характерно развитие воспаления суставов осевого скелета с последующим формированием участков окостенения.

Наша гипотеза:Мы предположили ассоциацию риска развития

заболевания с однонуклеотидной заменой в гене MICA, находящегося в HLA – локусе шестой

хромосомы человека

HLA–локус содержит весь кластер генов главного комплекса гистосовместимости (MHC).

MHC – это большая группа белковых молекул на поверхности большинства клеток здорового человека, которая служит для

распознавания своих и чужих пептидных цепочек.

Белки МНС включают два основных класса:

Еще одна функция МНС белков состоит во взаимодействии с NK

клетками (клетками врожденного иммунитета).

MICA – стресс-индуцируемый HLA-подобный белок. Этот белок распознается специальным(и) рецептором(ами) NKG на поверхности NK- и некоторых Т-клеток .

ПЦР

Из приблизительно 50-ти известных аллельных вариантов, отличающихся один от другого набором однонуклеотидных замен, лишь несколько замен предполагают функциональные последствия, так как приводят к замене аминокислоты. Для определения нуклеотидной замены мы использовали метод ПЦР (полимеразная цепная реакция), который позволяет добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в пробе.

Мы исследовали три возможные однонуклеотидные замены в 3-ем экзоне гена

(Met на Val в двух различных участках гена MICA, и замены His на Leu в одном случае.)

А) rs1051792(Met152Val)

Б) rs41560824(Met174Val)

Цели и задачи

Целью нашей работы было сравнение вариабильности геномов по локусу гена главного комплекса гистосовместимости (HLA-локусу) MICA в выборках здоровых доноров и больных аутоимунными заболеваниями (анкилозирующим спондилитом).

Для выполнения данной цели нами были поставлены следующие задачи:

• Определить частоты трех однонуклеотидных замен (SNP) в исследуемых выборках.

• Выяснить, существует ли разница в частоте исследуемых аллелей между группой больных и здоровых людей.

Этапы постановки ПЦР

1) промотор 2)некодирующая область 3) экзон 4)интрон 5)прямой праймер 6)обратный праймер 7)однонуклеотидные замены

Праймер Нуклеотидная последовательность (5’ – 3’)

Примечания

MICA-For1 GGAGGGCCAGGGAGGCATAC I ПЦР

MICA-Rev1 GAGGGTTTCCCTGGACACAT

MICA-For2 CTCCAGGAGATTAGGGTCTGT прямой для II ПЦР

MICA-Rev2-С(Val) GCTCTGGAGGACTGGGGAAC для маркераrs1051792

MICA-Rev2-Т(Met)

GCTCTGGAGGACTGGGGAAT

MICA-Rev2-Н TGCATGCATAGCGTGATTGT для маркера rs3819268

MICA-Rev2-L TGCATGCATAGCGTGATTGA

MICA-Rev2-M TGATAGTGTGTCTTGGTCTTGAT для маркераrs41560824

MICA-Rev2-V TGATAGTGTGTCTTGGTCTTGAC

Мы проводили генотипирование среди двух выборок: 25 здоровых людей и 20 людей больных анкилозирующим спондилитом

Результаты ПЦР-I

Результаты ПЦР-II

генотип T/T C/T C/T C/T

(маркер rs1051792)

Группа ID (№) аллели Генотип MICA

rs1051792 rs3819268 rs41560824

M V H L M V

Больные

91 + + + - + + M/V,H/H,M/V

92 + + + - + - M/V,H/H,M/M

93 + + + - + - M/V,H/H,M/M

94 + - + - + + M/M,H/H,M/V

Далее мы посчитали частоты встречаемости гомо и гетерозигот для выборки больных и здоровых доноров и частоту встречаемости

отдельного аллеля в этой выборке.

маркер генотип средне-популяционная частота

выборка p

Больные (n=25)

Здоровые (n=20)

Rs1051792 C/C 0,04(1) 0,10 (2)

C/T 0,60 (15) 0,60 (12)

T/T 0,36(9) 0,28(6)

fc 0,793 0,34 0,40 0.7126

Для проверки статистической достоверности различий в частотах встречаемости минорных аллелей между выборками больных и здоровых доноров мы использовали пакет программ для статистической обработки данных генотипирования OpenEpi.

Учитывая небольшой размер анализируемых выборок мы применяли оценку по точному критерию Фишера.

Disease

(+) (-)

(+) 17 16 33Exposure (-) 33 24 57

50 40 90

В качестве примера представлена «2х2 Таблица» интернет-ресурса OpenEpi, заполненная в соответствии с частотами аллелей по маркеру rs1051792.

Выводы

По результатам генотипирования нами установлено, что в исследованных выборках:

- отсутствует полиморфизм по маркеру Rs38(HL), т.к. частота минорного аллеля равняется нулю.

- частоты встречаемости аллелей «С» по маркерам rs1051792 и Rs415 существенно отличаются от представленности данных аллелей в усредненной популяции европеоидов, что может свидетельствовать о сцепленности маркеров с другим геном HLA-локуса – геном HLA B27

- обнаруженные отличия частот аллелей у больных и здоровых не являются статистически достоверными

Для российской популяции показано отсутствие

ассоциации стресс-индуцируемого HLA-подобного гена MICA с развитием аутоиммунных артропатий.

Благодарности.

Мы выражаем свою благодарность Институту биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и всю лабораторию сравнительной и функциональной геномики за предоставленную возможность выполнить нашу научную работу.

 

Особенно мы хотим поблагодарить нашего научного руководителя Юрия Борисовича Лебедева за чуткое руководство, отзывчивость и неоценимую помощь.

 

Также мы благодарим Сергея Менделевича Глаголева за организацию практики.