非选择性阳离子通道在根系钾离子

跨膜转移中的调控机制探索

王玉倩导师 : 封克

1 、立题依据 2 、研究内容 3 、研究目标 4 、拟采取的研究方案及可行性分析

1 、立题依据

植物根细胞与环境之间的物质交换通过位于细胞质膜上的转运系统进行。转运系统主要包括各类离子泵、共运转体和离子通道。由于离子通道可快速转运营养物质以及控制水、离子和其它小分子溶质进出细胞，从而决定着许多关键的细胞功能。

离子通道简介

离子通道：细胞膜上的特殊蛋白质大分子，在脂质双层膜上构成具有高度选择性的亲水孔道，从而允许适当大小和适当电荷的离子通过。

功能： 1）在短期内渗透调节重要的离子流； 2 ）沿细胞膜或跨细胞膜传递信号； 3 ）控制细胞跨膜电势差即膜电位。

概念与功能

分类

根据它们对所转移离子的专一性程度可分为： 选择性离子通道 非选择性离子通道

选择性离子通道是生物在进化过程中的产物，它的存在使生物与外界的物质与能量交换效率大大提高。因此在过去的研究中，人们对选择性离子通道更为关注。

选择性钾离子通道

选择性钾离子通道是离子通道中的一个主要种类，它对钾离子具有相对于其它离子的高度选择性，已在多种植物细胞中被发现。现已证实，钾离子的跨细胞膜运输主要通过两种途径：由 K+ 载体蛋白组成的高亲和转运系统（载体运输）由 K+ 通道蛋白组成的低亲和转运系统（通道运输） 其中载体运输系统仅在外界钾离子浓度很低时起作用（ 0.001 ～ 0.2mmol.L-1 ），在一般的钾供应条件下，主要由钾 通道负责钾的吸收。

非选择性离子通道

然而，实验室已有研究发现，添加钾载体和钾通道的专性抑制剂后，植物并未象原先预想的那样停止对溶液中钾离子的吸收。与未加抑制剂的对照相比，仍有高达 60％以上的钾在相同时间内进入植物体内。 因此我们推断：钾离子通过其它阳离子通道进行了转移

非选择性阳离子通道(nonselective cation channels －NSCCs ）

作为离子通道的一类， NSCCs在许多性质上截然不同于已知的钾选择性通道， NSCCs参与了植物体内多种生理过程，包括营养元素的吸收、膨压控制、胞间转运、信号转导以及毒害离子如重金属离子等的吸收。

NSCCs 具有高选择性阳离子通道所不具备的优点。

1. 它们能够在同一个离子通道内进行两个不同方向的离子跨膜转移，使得单个离子通道仍然具有维持膜电位（ Em）的功能。例如，由 Na+ 通过 NSCCs进入细胞所引起的膜电位的去极化可以通过同一离子通道的 K+ 的外流而抵消。

2. NSCCs本身很少与被转运的阳离子之间发生相互作用，因此可以在环境中存在对选择性通道具有抑制作用的阳离子时，仍然保持对目标阳离子的吸收，这对植物根系吸收来说是一个很实用的特点。

3. NSCCs也为那些不存在高选择性通道途径的阳离子，如 NH4

+ 、 Mg2+ 等 ) 的跨膜转移提供了一个被动吸收的途径。

NSCCs 的缺点

另一方面， NSCCs对阳离子的低选择性也意味着植物通过它们可以吸收有毒的阳离子（如一些重金属离子）和钠离子，这在植物营养与环境的关系方面开辟了一个新的研究领域。植物的抗盐特性与膜电位、非选择性离子通道和钙离子等调控因子密切相关。这提示人们，在细胞水平上深入研究 NSCCs的调控机制对理解植物在逆境条件下的反应机制和采取合适的调控措施具有及其重要的实际意义。

由于 NSCCs对植物钾离子的吸收具有重要作用，因此对 NSCCs的研究一方面可以更加客观、全面地了解植物在不同情况下吸收钾离子所采取的策略，完善植物营养吸收的理论。另一方面，在了解 NSCCs的作用机制后，可以从遗传学和分子生物学的角度探讨采用生物技术的方法改造目的基因的途径，从而为植物营养吸收的调节、对逆境环境的适应性等方面的改造提供可能性。从这个角度来看，对 NSCCs的研究无论在理论和实践上都是一项很有意义的工作。

1 ）通过 NSCCs途径的 K+、 Na+ 、 Ca2+ 平衡机制

植物的抗盐能力与植物体内的钾、钠平衡有关，而钙离子可以对此加以调节。 Na+、 Ca2+ 的转移不能通过钾离子选择性通道，因此钾钠的平衡和 Ca2+ 的调节过程必然通过 NSCCs转运系统进行。不同抗盐能力的植物是否在 NSCCs的钾、钠平衡过程中有自己的特点，还未见报道。该部分研究内容主要包括：

K+、 Na+ 对不同植物根系 NSCCs的竞争作用； Ca2+ 通过 NSCCs 对 K+、 Na+ 平衡 的调控作用。

2 、研究内容

（ 2）无机阳离子对 NSCCs途径吸钾的调控机理 目前已发现一些无机离子（如 La3+, Gd3+ 等）可以影响

NSCCs 的开闭，但其调节究竟是通过影响 H+-ATPase 的活性从而影响膜电位（电控）变化还是与 NSCCs的某个部位发生化学反应进而控制其开闭（化控）还无系统研究。本部分研究内容主要包括：

对 K+ 的 NSCCs转移具有抑制作用的阳离子种类； 抑制机制的探讨。

（ 3 ）有机物对 NSCCs途径吸钾的调控机理 多种有机物质可以影响 NSCCs的开闭，如 ABA、戊脉安、奎宁、

环化核苷和一些氨基酸等，但它们是通过电控还是化控来调节NSCCs的开闭或兼而有之还没有明确报道。该部分研究内容主要包括：

对钾离子通过 NSCCs转移过程具有明显调节作用的有机物质有哪些？

抑制机制的探讨。

3 、研究目标

明确不同阳离子在竞争 NSCCs时的相互关系，初步揭示不同抑制因子影响NSCCs开闭的机理，为从分子生物学角度进一步深入研究 NSCCs提供基础资料

拟解决的关键问题

正确鉴别出不同化学物质调控 NSCCs的开闭过程究竟是直接与通道的某个部位发生了反应而使通道关闭，还是该物质影响了膜电位后间接导致了有关通道的关闭。由于某些化学物质本身带有电荷，在进入细胞后也能同时造成膜电位的变化。对此，我们拟采用测定离体细胞 H+-

ATPase活性是否受化学物质影响的方法解决这个问题。因为膜电位主要是由细胞膜上的 H+-ATPase所维持的，因此如果一种抑制物质可以造成某些 NSCCs的关闭并同时伴有膜电位的改变，但只要它并不影响离体细胞 H+-ATPase的活性，这种抑制就是该物质与通道的反应产物对通道的直接抑制，而不是由于细胞膜电位变化所引起的通道关闭。

4 、拟采取的研究方案及可行性分析

本项目主要针对植物根系的 NSCCs

进行研究。由于拟南芥已作为一种模式植物，对其全部基因图谱已较清楚，因此也作为供试植物之一，以便在下一步进行分子生物学和基因研究时有所参比。

内容（ 1 ）实验方案：（通过 NSCCs 途径的K+ 、 Na+ 、 Ca2+ 平衡机制）

1. 水培供试植物（选择具不同抗盐能力的基因型）；

2. 设立高、低钠盐浓度的吸收液处理；

3. 添加钾选择性通道抑制剂；

4. 将植物根系置于显微操作台上的营养液槽中，采用离子选择性微电极测定根细胞内 K+ 、 Na+ 离子浓度；

5. 在营养液槽中添加 Ca2+ 观测细胞内 K+ 、 Na+ 离子浓度变化；

6. 根据所得结果分析盐胁迫下的 K+ 、 Na+ 离子通过 NSCCs转移的特征；

7. 根据加 Ca2+ 前后 K+ 、 Na+ 离子通过 NSCCs转移的变化，了解 Ca2+ 调节 K+ 、 Na+ 离子通过 NSCCs转移过程中的作用。

内容（ 2 ）实验方案：（无机阳离子对 NSCCs 途径吸钾的调控机理）

1. 水培供试植物；

2. 吸收液中加入 K+ 离子和钾选择性通道抑制剂；

3. 分别加入可能对 NSCCs有抑制作用的无机阳离子；

4. 植物吸收；

5. 测定溶液中 K+ 离子浓度，确定对 NSCCs有抑制作用的无机阳离子种类；

6. 将供试植物根固定于膜电位测定系统的液槽中，加入已确定有抑制作用的阳离子；

7. 采用微电极测定加入抑制离子前后的细胞膜电位变化；

8. 对产生较大膜电位变化的植物，测定其离体根细胞膜 H+-ATPase活性是否受这种有抑制作用的阳离子的影响。

内容（ 3 ）实验方案：（有机物质对 NSCCs 途径吸钾的调控机理）

1. 水培供试植物；

2. 吸收液中加入 K+ 离子和钾选择性通道抑制剂；

3. 分别加入可能对 NSCCs有抑制作用的有机物质（按氨基酸类、呼吸抑制剂类、环化核苷类、激素类）；

4. 植物吸收；

5. 测定溶液中 K+ 离子浓度，选出对 NSCCs有抑制作用的物质；

6. 将供试植物根固定于膜电位测定系统的液槽中，加入已确定有抑制作用的抑制物；

7. 采用微电极测定加入抑制物前后的细胞膜电位变化；

8. 对产生较大膜电位变化的植物，测定其离体根细胞膜 H+-ATPase活性是否受该抑制物质的影响。

可行性分析 人们已认识到植物体内存在选择性离子通道和非选择

性离子通道，但过去对钾离子吸收的研究多集中在钾离子的选择性通道方面，而对钾离子通过非选择性通道进入植物根细胞的研究很少，因为难以将这两者加以分开研究。近年来，钾离子的选择性通道抑制物质已被发现，它们可专性性地抑制钾选择性通道，但并不影响非选择性离子通道对钾离子的运输，这就为研究非选择性通道对钾离子的转移以及钾离子和其它阳离子对非选择性离子通道的竞争提供了理论上的可行性。

在前期试验中已发现，一旦钾选择性通道被抑制，钾离子可以通过非选择性离子通道进入植物体内，而且转移的量很大，完全可以通过一般的化学测定加以证实，这为得到准确的试验数据提供了保证。