Многоцветный анализ – основные Многоцветный анализ – основные принципы и подходыпринципы и подходы

Кудрявцев Игорь ВладимировичКудрявцев Игорь Владимирович**igorek1981@yandex.ruigorek1981@yandex.ru

Савицкий Валерий Павлович**Савицкий Валерий Павлович**vsavitski@beckman.com vsavitski@beckman.com

* отдел иммунологии, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, * отдел иммунологии, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург;

кафедра цитологии и гистологии, Санкт-Петербургский государственный кафедра цитологии и гистологии, Санкт-Петербургский государственный университет; университет;

школа биомедицины, Дальневосточный федеральный университет, Владивостокшкола биомедицины, Дальневосточный федеральный университет, Владивосток

** ООО "Бекмен Культер", Москва** ООО "Бекмен Культер", Москва

Пушкинские годы, 27 января – 2 февраля 2013 г.Пушкинские годы, 27 января – 2 февраля 2013 г.

Для чего нужен многоцветный анализ?• Оптимален и необходим для онкогематологии – типирование лейкозов и лимфом

• Повышает информативности иммунологических исследований:

– большее число комбинаций– большее число Ag определяется на одной

клетке– детальная характеристика фенотипа

отдельных клеточных популяций– анализ как основных, так и малых

популяций по широкому спектру маркеров

•Увеличивает информативность научных исследований

•Меньше пробирок в панели – экономия времени, трудозатрат и сопутствующих реагентов!

•Большая пропускная способность проточного цитометра, экономия «ресурса» прибора

Флуорохромы для многоцветного анализа

В настоящее время – более 40 различных флуорохромов; однако одновременно можно использовать не более 18 флуорохромов даже на

самых «продвинутых» приборах.

Beckman Coulter

BD Bioscience ebioscience biolegend Dako Life Technologies

Pacific Blue Pacific Blue, V450, BV421

efluor450 BV421 Pacific Blue Pacific Blue

Krome Orange AmCyan, V500 - BV570 Cascade Yellow Pacific Orange

FITC, Alexa488 FITC, Alexa488 FITC, Alexa488 FITC, Alexa488 FITC FITC, Alexa488

PE, RD1 PE PE PE R-PE PE

ECD PECF594 - - - PE-TR, PE-A610

PC5.5 PerCP, PerCPcy5.5

PerCP, (PerCPcy5.5),

PerCP-efluor710

PerCP, PerCPcy5.5 PerCP, PeCy5 PerCP, Tricolor, PeCy5.5, PEA700

PC7 PeCy7 PeCy7 PeCy7 - PeCy7

APC / Alexa647 APC, Alexa647 APC, Alexa647,efluor660

APC, Alexa647 APC APC, Alexa647

APCA700 A700 A700 A700 - APCCy5.5

APCA750 APCCy7, APCH7 APCefluor780 APCCy7 - APCA750

(самый яркий флуорохром по данному каналу)

Флуорохромы разных фирм-производителей моноклональных антител

Новые флуорохромы - новые требования к подготовке образцов

- работа с антителами должно проводиться в отсутствие прямого солнечного света;- инкубация образцов с антителами темноте;- хранение готовых проб в защищенном от света месте и на холоду (+4°С); Инкубация в темноте

Инкубация на свету, 15 минут

Одноцветные реагенты

Пятицветные панели

533

142

600

400

200

0

Новые флуорохромы - новые требования к подготовке образцов

- использование готовых смесей антител;- самостоятельная подготовка «коктейлей» антител перед окраской образцов;- тандемные красители следует вносить в смесь последними, чтобы минимизировать их облучение светом;

Все это позволяет:

- упростить работу с реагентами;- сократить время подготовки проб;- снизить вероятность ошибок при внесении антител!!!

Подготовка для анализа 5 пробирок, в каждой – 5 антител, конъюгированных с 5 различными флуорохромами

405nmPacific BluePacific Blue Krome OrangeKrome Orange

488nm

FITCFITC PEPE ECDECD PECy7PECy7PECy5.5PECy5.5

635nmAPC or AF647APC or AF647 APC-AF700APC-AF700 APCCy7 or APC-AF750APCCy7 or APC-AF750

400 500 600 700 800

Итак, 3 лазера и 10 каналов для детекции 10 флуорохромов одновременно…

… КОМПЕНСАЦИЯ!!!

PacBlue

KrOrange

FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APCAF700

APCAF750

CD25 CD3 CD8 - - CD4 CD3 CD45 - -

Вариант №1.Минимизировать компенсацию - использовать антитела с флуорохромами, спектры которых слабо перекрываются

Вариант №2.Настроить компенсацию…

405nm

638nm

488nm

„Внутрилазерная“компенсация

Многоцветная компенсация – общие положения

638nm

„Межлазерная“компенсация

Многоцветная компенсация – общие положения

Расположение маркеров по каналам: - для пан-лейкоцитарных, линейных и «ярких» маркеров используйте фиолетовый лазер; - для маркеров «популяций интереса» - красный лазер;- маркеры активации и «маркеры интереса» ставьте на голубой лазер.

Применяйте тандемные красители с тем расчетом, что тандемы, содержащие Cy5 / Cy5.5 / Cy7, возбуждаются голубым и красным лазерами, следовательно, помещайте маркеры со среднем уровнем экспрессии, а также маркеры малых популяций на голубой лазер.

Для субпопуляционных/взаимоисключающих маркеров можно использовать пары: ECD - PC5.5, PC5 - APC, PC5.5 – APCA700, PC7 - APCA750 или PE - ECD

Многоцветная компенсация – некоторые частные вопросы:

Некоторые рекомендации по подбору флуорохромов для минимизации многоцветной

компенсации1. Для детекции антигенов с низким уровнем экспрессии 1. Для детекции антигенов с низким уровнем экспрессии следует использовать яркие флуорохромы, антигены с следует использовать яркие флуорохромы, антигены с высоким уровнем экспрессии одинаково хорошо работают со высоким уровнем экспрессии одинаково хорошо работают со всеми красителямивсеми красителями2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ 2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ следует использовать соседние – «соприкасающиеся», следует использовать соседние – «соприкасающиеся», перекрывающиеся - каналы, на которых располагаются перекрывающиеся - каналы, на которых располагаются антигенами с высоким уровнем экспрессииантигенами с высоким уровнем экспрессии3. Разрешается, но не рекомендуется, использовать «соседние» 3. Разрешается, но не рекомендуется, использовать «соседние» каналы для ярких «неперекрывающихся» - каналы для ярких «неперекрывающихся» - взаимоисключающих антигенов взаимоисключающих антигенов 4. Не рекомендуется использовать соседние каналы для 4. Не рекомендуется использовать соседние каналы для коэкспрессирующихся антигеновкоэкспрессирующихся антигенов5. Допускается применение субпопуляционных маркеров на 5. Допускается применение субпопуляционных маркеров на каналах, сильно «засвечивающих» основные маркеры, НО не каналах, сильно «засвечивающих» основные маркеры, НО не наоборотнаоборот

1. Для детекции антигенов с низким уровнем 1. Для детекции антигенов с низким уровнем экспрессии следует использовать яркие экспрессии следует использовать яркие

флуорохромыфлуорохромы……

CD56-PE P-AKT s473 Alexa 647

CD25-PE CD25-PC7

FITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5 PECy5.5PECy5.5 PC7PC7

APCAPC Alexa 700Alexa 700 APCAlexa 700APCAlexa 700 APC-H7APC-H7 APCAlexa 750APCAlexa 750

Pacific BluePacific Blue Pacific OrangePacific Orange

CD8

… … антигены с высоким уровнем экспрессии антигены с высоким уровнем экспрессии одинаково хорошо работают со всеми одинаково хорошо работают со всеми

красителямикрасителями..

2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ 2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ следует использовать соседние – «соприкасающиеся», следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,

перекрывающиеся - каналыперекрывающиеся - каналы с антигенами с высоким уровнем с антигенами с высоким уровнем экспрессииэкспрессии

HLA-DR-PE – является ли это оптимальным выбором?

(CD45 берем по FITC)

CD45, конъюгирован с Pacific Blue.

HLA-DR-FITC разрешение гораздо лучше, чем при использовании HLA-DR-PE

2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ 2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ следует использовать соседние – «соприкасающиеся», следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,

перекрывающиеся - каналыперекрывающиеся - каналы с антигенами с высоким уровнем с антигенами с высоким уровнем экспрессииэкспрессии

3. Разрешается, но не рекомендуется, использовать 3. Разрешается, но не рекомендуется, использовать «соседние» каналы для ярких неперекрывающихся «соседние» каналы для ярких неперекрывающихся

антигенов антигенов

Mutually excluding antigens serve each other as dump channels

CD4-APCCD20-APCAF700CD8-APCAF750

CD4-PacBlueCD20-ECDCD8-APCAF700

4. Не рекомендуется использовать соседние каналы 4. Не рекомендуется использовать соседние каналы для ко-экспрессирующихся антигеновдля ко-экспрессирующихся антигенов

PC5,5 на ECD – до 45% ECD на PC5,5 – до 4%

PE/APCAF750 и APCAF750/PE –

менее 0,5%

5. Допускается применение субпопуляционных 5. Допускается применение субпопуляционных маркеров на каналах, сильно «засвечивающих» маркеров на каналах, сильно «засвечивающих»

основные маркеры, НО не наоборотосновные маркеры, НО не наоборот

Настройка прибора при многоцветном анализе

• Настройка напряжения. Для настройки напряжения используйте соответствующие изотипические контроли или образцы, окрашенные антителами по отдельности.

• Компенсация. Для настройки:– используйте CD45, конъюгированные с различными

флуорохромами для автоматической настройки компенсации;– используйте образны, окрашенные каждым из антител по

отдельности;– для проверки правильности настройки компенсации используйте

FMO-подход (fluorescence-minus-one);при переходе на другой лот антител проверяйте компенсацию!

Процедуру настройки рекомендуется проводить с использованием всех перечисленных выше подходов. После настройки и проверки – НИЧЕГО НЕ МЕНЯЙТЕ!!!!

Проверка корректности настройки компенсации - «FMO-подход» (fluorescence-minus-one)

Для корректного сбора данных необходимы следующие гистограммы:

-FS vs. SS – выделение популяций лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов (гистограмма “Ungated” - отображены все популяции лейкоцитов)

-CD45 vs. SS – выделение популяции лимфоцитов(гистограмма “Ungated” – отображены все популяции лейкоцитов)

Для корректного сбора данных необходимы следующие гистограммы:

- двухпараметрические гистограммы «флуоресценция vs. SS» – контроль корректности выставленного напряжения по каждому из каналов флуоресценции (все гистограммы “Ungated” – все популяции лейкоцитов)

Для корректного сбора данных необходимы следующие гистограммы:

-CD45 vs. SS и FS vs. SS – выделение популяции лимфоцитов;удаление из зоны анализа разрушенных и слипшихся клеток

При анализе «редких» популяций клеток также рекомендуется удалять из зоны анализа дуплеты клеток (соотношение пикового и интегрального сигналов, например) и использовать по одному из каналов флуоресценции какой-либо краситель для определения жизнеспособности клеток (например, кальцин по FL1 или 7-AAD по FL4)

Для корректного сбора данных необходимы следующие гистограммы:

- двухпараметрические гистограммы «флуоресценция-против- флуоресценции» - контроль корректности настройки компенсации (на всех гистограммах отображены ТОЛЬКО клетки интереса!!!)

FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC-A700 APC-A750

488 Excitation 633 Excitation

HLA-DR CD4 CD3 CD56 CD25 CD8 CD19 CD45IM1638U A07751 A07748 A79388 A52882 IM2469 A78837 A79392

T/B/NK, маркеры «ранней» и «поздней» активации 8-цветная комбинация

Цель исследования: Выделить популяции B-лимфоцитов, NK- и NKT-клетки, а также CD4+ and CD8+ Т-клетки Оценить уровень экспрессии активационных маркеров на примере CD25 и HLA-DRРасположение антител по каналам:

Материал: - периферическая кровьПробоподготовка: - лизис эритроцитов при помощи VersaLyse (A09777) + IOTest 3 Fixative (A07799), без отмывки, внесение по завершении лизиса эритроцитов чаcтиц Flow-Count (7547053) для абсолютного счета.Сбор данных – NaviosTM (2 лазера, 8 цветов), обработка данных - KaluzaTM

Настройки напряжения по каналам флуоресценции

Настройки цветовой компенсации

MNC SS lowCD45++

CD3+

CD8+CD4+

CD25 и HLA-DR

CD19+ CD56+

NKT

Выделение целевых популяций клеток

Контрольная сумма:

В-клетки – 7,89%Т-клетки – 85,13%НК-клетки – 5,75%

Σ = 7,89%+85,13%+5,75%= 98,77%

Определение числа Т-хелперов, Т-киллеров и

DP-Т-клеток,а также общего числа Т-клеток, несущих CD25 и

HLA-DR

Определение числа Т-хелперов, Т-киллеров и НКТ-клеток, несущих CD25 или HLA-DR

HLA-DR

CD25

FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC-A700 APC-A750

488 Excitation 633 Excitation

CD38 CD62L CD45R0 CD56 CD3 CD4 CD19 CD8A07778 IM2214U IM2712U A79388 737657 IM2468 A78837 A94683

T/B/NK, популяции наивных клеток и клеток памяти, уровень экспрессии CD38 (8-цветная комбинация)

Цель исследования: Выделить популяции B-лимфоцитов, NK- и NKT-клетки, а также CD4+ and CD8+ Т-клетки Среди популяций Т-хелперов и цитотоксический Т-клеток выделить популяции наивных клеток, центральных и эффекторных клеток памяти, а также «терминально-дифференцированных» эффекторных клеток.Определить уровень экспрессии активационного маркера CD38 на всех перечисленных выше популяциях клетокРасположение антител по каналам:

Материал: - периферическая кровьПробоподготовка: - лизис эритроцитов при помощи VersaLyse (A09777) + IOTest 3 Fixative (A07799), без отмывки, внесение по завершении лизиса эритроцитов чаcтиц Flow-Count (7547053) для абсолютного счета.Сбор данных – NaviosTM (2 лазера, 8 цветов), обработка данных - KaluzaTM

Настройки напряжения по каналам флуоресценции

Настройки цветовой компенсации

MNC

CD3+CD19+ CD56+

NKT

Выделение целевых популяций клеток

Контрольная сумма:

В-клетки – 15.10%Т-клетки – 71.59%

НК-клетки – 10.64%

Σ = 15.10%+71.59%++10.64%== 97,33%

CD3+

CD3+CD8+CD62L-vs-CD45R0

CD3+CD4+

CD62L-vs-CD45R0

Первая многоцветная панель для клинических иммунологических исследований

Насколько часто применяется

многоцветный анализ в клинической практике?

И что же считать «многоцветным»

анализом?

Bendall et al., 2012

Успехов в многоцветном анализе!Успехов в многоцветном анализе!

Благодарю за внимание!Благодарю за внимание!