第 15 章 色谱法引论(An Introduction to Chromatography)

色谱法的产生和发展• 19031906年，俄国植物学家 Tswett提出利用吸附原理分离植物色素 经典的液相色谱• 40年代 纸色谱 • 50年代 薄层色谱• 1941年 Martin和 Synge提出色谱塔板理论• 40年代 Martin和 Synge研究液液分配色谱理论• 1952年 Martin和 Synge发明了气相色谱• 20世纪 60年代末 70年代初发展高效液相色谱• GC-MS、 GC-FTIR、 LC-MS、 LC-NMR

经典的液相色谱

纸 色 谱

比移值

色谱法特点具有两个相：固定相和流动相分离混合物并进行分析

色谱过程色谱过程示意图

色谱法分类• 按固定相的外形分类

柱色谱

平板色谱薄层色谱

纸色谱

一般分类 分离方法 固定相 所用平衡液相色谱 LC      

液液分配 

涂在载体表面的液体 

不同溶液之间分配平衡化学键合相 

有机物被键合在载体表面 

在液体与固定相表面的分配液固吸附 固体吸附剂 吸附离子交换 离子交换树脂 离子交换尺寸排阻 凝胶 筛分

气 相 色 谱 GC（ 流 动 相 为 气体）  

气、液 涂在载体表面的液体 分析物与固定气 - 键相 有机物被键合在载体表面气 - 固 固体吸附剂 吸附

超 临 界 流 体 色谱 SFC （流动相 超 临 界 流体）  

     

固体表面键合的有机物    

超临界流体与键合表面的分配  

相间的相互作用

色谱流出曲线检测器输出信号随时间的变化曲线

色谱基本术语

2 2

1 1

2,1R R

R R

t Vrt V

保留值 定性的依据 死时间 tm 保留时间 tR 调整保留时间 t R

死体积 Vm 保留体积 VR 调整保留体积 V R

相对保留值

选择因子

区域宽度峰底宽度 W

半峰宽 W1/2

标准差

衡量柱效率和反映色谱操作条件的动力学因素

峰高峰面积 定量分析的基础

4W

1/ 2 2.354W

色谱法基本理论分离依据 混合物各组分在两相中的吸附能力、溶解度、蒸气压、离子交换能力或其它亲和作用性能的差异导致在两相间平衡分配的差异平衡分配的表征：分配系数或分配比分配系数 K s

m

cKc

s s s

m m m

m c Vk

m c V

m

s

VV

分配比 k ( 容量因子）

K k 相比

( ) ( ) ( )( ) ( ) ( )r

r

t B k B K Bt A k A K A

越大，越容易分离， =1 ，分离不能实现

0

0 0 0

r r rt t t Vkt t V

塔板理论

22

1654.521

Wt

Wtn rr

eff

12

2 2

5.54 16r rt tnW W

nLH

H 理论塔板高度理论塔板数n 由于理论塔板数 n 不能真实地反映色谱柱的分离效能，故提出用扣除了死时间影响的有效理论塔板数 neff 和有效塔板高度 Heff

effeff n

LH

色谱柱长度

2

1effkn nk

1. 用热力学的观点阐明了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程2. 解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置3. 提出了计算和评价柱效的参数

一种半经验性的平衡理论塔板理论

贡献

缺点 1.不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各 种因素2.不能说明同一溶质为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数

速率理论BH A Cuu

范迪姆特（ Van Deemter) 方程流动相平均线速度

1. 涡流扩散项 A A=2dp填充物的平均直径填充不规则因子

2. 分子扩散项 B/u( 纵向扩散项）

3. 传质阻力项 Cu

2 mB D 组分在流动相中的扩散系数弯曲因子

m sC C C 固定相传质阻力系数流动相传质阻力系数

在 GC 中 在 LC 中 2

11

2 1 sm

m

DB D kD

系数 1和 2分别反映填料不均一性对溶质在流动相和固定相中扩散的影响，又称为阻滞因子和弯曲因子

液体固定相 固定相的液膜厚度组分在固定相中的扩散系数

Van Deemter 的气液色谱板高方程

2 2 2

2 22

0.01 8221 1

p fmp

m s

k d kdDH d u uu k D k D

2 2

2

0.01

1p

mm

k dC

k D

气体流动相

气液色谱

2

22

8

1f

ss

kdC

k D

液液色谱液体流动相

液体固定相

液液色谱的 Van Deemter 方程式

2 2

2

1 6 11

24 1p

mm

k k dC

k D

2 2 21 2

2 221

1 6 11 822 124 1 1

p fm sp

m m s

k k d kdD DH d k u uu D k D k D

2

22

8

1f

ss

kdC

k D

van Deemter 方程的 H-u 曲线

固定相传质阻力项流动相传质阻力项分子扩散项涡流扩散项

H-u 关系曲线

optBuC

min 2H A BC

范氏方程曲线（ H-u 曲线）

在某一流速（最佳线速度）下有 一 板 高 的 极小值 （最小板高），相应的柱效最高。LC 的最小板高比 GC 的小一个数量级以上，说明柱效 LC比 GC 高得多，由于 LC 的最佳流速很小，若使用，则分析时间太长，故实际使用的流速比最佳流速高很多。

对于一定长度的柱子，理论塔板数越大，板高越小，柱效越高。

固定相粒度大小对板高的影响固定相粒度大小对板高的影响

粒度越细，板高越小，受线速度影响亦小

• 反映柱效和选择性总分离效能指标分 离 度

2 1 2 1

1 21 2

2( )1 ( )2

R R R Rt t t tRW WW W

R=0.75 时 A 、 B 峰不能分离

R=1.0 时 A 、 B 峰中互含 4%

R=1.5 时 A 、 B 峰中互含 0.3%

分离度公式2

1 1164

R

R

t nnW W t

14 1n kR

k

2

1

kknneff

假设 k1k2=k, W1 W2=W

1( )4effnR

分离度与柱效的关系2

1 1 1

2 2 2

R n LR n L

分离度与 n 有关

增加柱长，可提高分离度，但延长了分析时间，因此降低板高，提高柱效，才是提高分离度的好方法。

分离度与选择因子的关系当 =1 时， R=0 ，无法分离两组分增大，是改善分离度的有效手段气相色谱主要通过选择合适的固定相和降低柱温来增大。液相色谱通过改变固定相和流动相的性质和组成，可有效增大。对一个复杂混合物的分离条件的选择，主要是提高最难分离物质对的值。

分离度与容量因子 k 的关系

对于 GC ，增加固定液的用量或降低柱温，可增大 k 值。对于 LC ，改变流动相的组成，有效的控制 k 值。

R正比于 1kk

考虑分离度和分析时间，容量因子一般控制在 1~5 为宜，不超过 10。

样品量的影响• 每一色谱柱的固定相，都有一定的样品线性容量范围，在该范围内，进样量增加，色谱峰高增加，色谱峰区域宽度和保留时间不变。若样品量超过线性容量范围，进样量增加，容量因子 k 下降。• 对于分析分离，为获得必需的分离度，一般进样量保持在线性容量范围以下。• 色谱柱固定相的样品容量，决定于固定相的性质和用量。

复杂样品的分离，改善总体分离效果• GC 中采用程序升温方法或程序升压的方法• HPLC 中采用梯度洗脱的方法

色谱定性分析• 利用已知纯物质对照定性• 根据相对保留值定性• 根据保留指数定性 Kováts指数

• 用双柱或多柱定性• 与其他方法结合定性GC-MS , GC-AES, GC-FTIR, LC-MS

1

lg ( ) lg100

lg lgR R n

x

R n R n

t x t CI n

t C t C

正构烷烃碳原子数

色谱峰面积的测量对称形峰面积的测量峰高乘半峰宽法

12

1.065A h W

不对称峰面积的测量峰高乘平均峰宽法

峰高 0.15倍处的峰宽 峰高 0.85倍处的峰宽0.15 0.85

1 ( )2

A h W W

自动积分仪法剪纸称重法

定量校正因子绝对校正因子 i

ii

wfA

'

'

( )( )( )i s i

is i s

f m A mf mf m A m

相对校正因子

定量分析• 归一化法 要求全部组分都出峰

• 外标法 分析条件和进样量必须重现• 内标法 内标物是样品中不存在的组分，其保留时间和定量校正因子应该与待测物尽可能接近，且完全分离

1 1 2 2

% 100%i ii

n n

A fxA f A f A f

% 100%i s ii

s i s

f m Ax

f m A

各种定量方法的比较项 目 归一化法 内标法 外标法计算公式 由工作曲线直接查得称重配样 不需要 需要 不需要进样量 不需准确 不需准确 需准确操作条件稳定性 一次分析过程中条件需稳定 一次分析过程中条件需稳定 全部过程中条件需严格不变对组分出峰的要求 全部组分 内标物及所测组分 所测组分校正因子 需全部组分的校正因子 需内标及所测组分的校正因子 不需要使用检测器 通用型检测器 选择性检测器有时不适用 选择性检测器适用范围 多组分试样中各组分含量的分析 微量组分的精确定量 日常控制分析和大量同类样品的分析

1 1 2 2

% 100%i ii

n n

A fxA f A f A f

方 法% 100%i s ii

s i s

f m Axf m A

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作业 P304-30518. 19. 20. 21