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第第 11 章 章 DNADNA 重组克隆的单元操重组克隆的单元操作作

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作为一个理想的载体，应具备以下条件：作为一个理想的载体，应具备以下条件： （ 1 ）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；

（ 2 ）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源 DNA片段插入其中；

（ 3 ）具有容易检测的筛选标记；

（ 4 ）载体 DNA的分子量适当，可容纳较大的外源 DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；

（ 5 ）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。

第一节 第一节 DNADNA 重组的载体 重组的载体

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载体的种类：载体的种类：

1.克隆载体（ cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立 DNA文库和 cDNA文库，其上有复制子即可；

2.表达载体（ expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；

3.穿梭载体（ shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。

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一、质粒一、质粒 (( 一一 ) ) 质粒的分布、大小、数目质粒的分布、大小、数目 质粒广泛地质粒广泛地分布分布于于原核原核生物细胞中，也存在于某生物细胞中，也存在于某些真核细胞些真核细胞（酵母的（酵母的 2μ2μ 环状质粒）。环状质粒）。

质粒质粒 DNADNA 分子量范围分子量范围为为 1—200×106Da1—200×106Da 。。 一个细胞内的质粒一个细胞内的质粒数量数量变化也很大，有变化也很大，有 11 至几个至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。的，也有几十个的，甚至有数百个。

（这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个（这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有细胞只有 11 个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有胞中质粒有 10-20010-200 拷贝数。）拷贝数。）

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(( 二二 )) 质粒质粒 DNADNA 的的构型构型 三种不同的构型：三种不同的构型： 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为

共价闭合环形共价闭合环形 DNA(cccDNA)DNA(cccDNA) ，这样的，这样的 DNADNA 通常呈现超通常呈现超螺旋的螺旋的 SCSC 构型；构型；

如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环开环DNA(ocDNA)DNA(ocDNA) 。。

若质粒若质粒 DNADNA 的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为为 LL 构型构型。 。

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(( 三三 )) 质粒质粒 DNADNA 的理化性质的理化性质

质数质数 DNADNA 具有一般核酸分子的理化特性。具有一般核酸分子的理化特性。 能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂，能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定在一定 pHpH 下可解离而带电荷下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。比较能抗切割和抗变性。

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(( 四四 )) 质粒质粒 DNADNA 的生物学特的生物学特性性 (1)(1) 寄生性：寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)(2) 稳定性：稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)(3) 同源性：同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)(4) 重组性：重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质

粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。色体之间的重组。

(5)(5) 不相容性：不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。间的相互干扰造成的。

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(6)(6) 传递性传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。的质粒带有一套与传递有关的基因。

(7)(7)消除性消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。将其去除。

(8)(8) 复制类型复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 质合成的严格控制。

(9)(9) 表现型表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗性等。抗性等。

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(( 五五 )) 质粒的命名原则质粒的命名原则

19761976 年提出一种质粒命名的原则，用小写字母年提出一种质粒命名的原则，用小写字母pp 代表质粒，在代表质粒，在 pp 字母后面用两个大写字母代表字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如发现这一质粒的作者或实验室名称。如 pUC118, pUC118, 字母字母 pp 代表质粒，代表质粒， UCUC 是构建该质粒的研究人员是构建该质粒的研究人员的姓名，的姓名， 118118 代表构建的一系列质粒的编号。代表构建的一系列质粒的编号。

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（六）组建理想质粒载体必须具备的条件（六）组建理想质粒载体必须具备的条件

(1)(1) 质粒拷贝数较高质粒拷贝数较高 质粒拷贝数质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌

细胞中所含有的质粒细胞中所含有的质粒 DNADNA 分子的数目。分子的数目。 严紧型：低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有严紧型：低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有 1-31-3份的拷贝，份的拷贝，

称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒 (stringent (stringent plasmid)plasmid) ；；

松弛型：高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达松弛型：高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达 10-6010-60份拷贝，份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒 (relaxed (relaxed plasmid)plasmid) 。。

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(2)(2) 分子量较小分子量较小

低分子量的质粒如下优点低分子量的质粒如下优点

•通常拷贝数较高通常拷贝数较高•克隆时所预期的基因表达产物的数量较大克隆时所预期的基因表达产物的数量较大•限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶切点，便于制作酶切图谱。酶切点，便于制作酶切图谱。•外源外源 DNADNA 容量较大，容量较大，•容易转化，当质粒大于容易转化，当质粒大于 15kb15kb 时，将成为转化效率的时，将成为转化效率的制约因素。制约因素。•遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。

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(3)(3) 带有可供选择的标记带有可供选择的标记 常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性(Ampr)(Ampr) 、卡那霉素抗性、卡那霉素抗性 (Kanr)(Kanr) 、四环素抗性、四环素抗性 (Tetr)(Tetr) 等，而等，而且希望各抗性基因内有且希望各抗性基因内有若干单一的限制酶切点。若干单一的限制酶切点。

在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗性基因失活、抗性基因失活、宿宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。

(4)(4) 带有尽可能多的单一限制性酶切位点带有尽可能多的单一限制性酶切位点(5)(5) 具有复制起始点具有复制起始点 (origin, ori)(origin, ori)

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（七）常用的质粒载体（七）常用的质粒载体

pSC101pSC101 质粒载体是第一个成功用于克隆真核质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNADNA 的大肠杆菌质粒载体。的大肠杆菌质粒载体。

pBR322pBR322 是用人工方法构建的符合理想质粒载体是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。

(1)(1) 克隆载体克隆载体

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重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体

松弛型复制 松弛型复制

pBR322

4363 bp

Origin of Replication

ROP

ROI

Sal I

BamH I

Tcr

Pvu I

Pst I

Pst I

EcoR ICla IHind III

Hind II

Bal I

Apr

pBR322： pBR322：

氯霉素可扩增氯霉素可扩增

拷贝数 50 - 100 / cell拷贝数 50 - 100 / cell

用于基因克隆 用于基因克隆

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pUC质粒载体 (1)来自 pBR322质粒的复制起点 (ori)； (2)氨卞青霉素抗性基因 (Ampr)，但它的 DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点；

(3)大肠杆菌 β-半乳糖苷酶 (lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端 α-肽链的DNA序列 , 此结构特称为 lacZ1基因；

(4)多克隆位点 (MCS)区段：位于 lacZ 基因中的靠近 5’端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的 DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏 lacZ 基因的功能。

pBR322

4363 bp

Origin of Replication

ROP

ROI

Sal I

BamH I

Tcr

Pvu I

Pst I

Pst I

EcoR ICla IHind III

Hind II

Bal I

Apr

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pUC18 / 19 ：

pUC18 / 19 ：

拷贝数 2000 - 3000 / cell拷贝数 2000 - 3000 / cell

用于基因克隆和测序 用于基因克隆和测序

装有多克隆位点（ MCS）装有多克隆位点（ MCS）

正选择颜色标记 lacZ’正选择颜色标记 lacZ’

Bam HI

pU C182686 bp

Ap r

lacZ'

ori

GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT

396 452

EcoRI SstI KpnI Sm aI XbaI SalI PstI SphI HindIII

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pUC18pUC18 质粒载质粒载体体

优点优点 :: (1)(1) 具有更小的分子量具有更小的分子量 (2)(2) 便于重组子的检测便于重组子的检测 pUC18pUC18 质粒结构中具有来自大肠杆菌质粒结构中具有来自大肠杆菌 laclac 操纵子的操纵子的 laclacZ’Z’ 基因，基因，所编码的所编码的 α-α-肽链可参与肽链可参与 α-α-互补作用。因此，在应用互补作用。因此，在应用 pUC18pUC18 质质粒为载体的重组实验中，可用粒为载体的重组实验中，可用 X-galX-gal显色法一步实现对重组子克显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。隆的鉴定。

(3)(3) 具有多克隆位点具有多克隆位点 (MCS)(MCS) 区段区段

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(2)表达载体

条件：一个条件：一个强启动子强启动子及其两侧的及其两侧的调控序列调控序列 ;; 有有 SDSD 序列且该序列与起始密码于序列且该序列与起始密码于 ATGATG 之间要有之间要有合适的距离合适的距离

在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有源基因下游有转录终止子转录终止子等。等。

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pKKpKK 表达质粒载体表达质粒载体 pKKpKK启动子为启动子为 PtacPtac ，由大肠杆菌强启动子，由大肠杆菌强启动子 PtrpPtrp和和PlacPlac杂合组成。杂合组成。

pKK233-3pKK233-3 表达载体含有表达载体含有 tactac 启动子、启动子、 lacElacE的的RBSRBS、、 pUC18pUC18 的多克隆位点，在远端还有一个的多克隆位点，在远端还有一个 rrnBrrnB 的的转录终止信号。转录终止信号。

pKK233—2pKK233—2 ，它的特点是，它的特点是 RBSRBS 的下游的下游 88 个核苷酸处有一个核苷酸处有一个个 ATGATG序列，该序列，该 ATGATG 和它的前后核苷酸和它的前后核苷酸 (CCATGG)(CCATGG) 一一起又组成了起又组成了 Nco INco I位点，其后又有可供插入用的位点，其后又有可供插入用的 Pst Pst II 及及 HindIIIHindIII位点，最后接上位点，最后接上 rrn Brrn B 的转录终止信号。的转录终止信号。

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外源外源 DNADNA 可有可有 33 种插人法种插人法①①将将 Nco INco I位点切开补齐后与外源位点切开补齐后与外源 DNADNA平端连接；平端连接；②②如外源如外源 DNADNA亦含翻译起始亦含翻译起始 ATGATG，， Nco INco I位点则可直接位点则可直接连接，如为其他位点可加入连接，如为其他位点可加入 Nco INco I接头后连接接头后连接 (( 使用使用 88 ，，1010或或 1212 个核苷酸的个核苷酸的 NcoINcoI接头以获得正确的读码框接头以获得正确的读码框架架 )) ；；③③使用使用 Pst IPst I或或 HindHind皿位点，但此时会在表达蛋白的皿位点，但此时会在表达蛋白的N-N-末端增加末端增加 2-52-5 个氨基酸。较新的表达载体是个氨基酸。较新的表达载体是pKK388-IpKK388-I ，它亦含有，它亦含有 tactac 启动子及启动子及 rrnBrrnB 抗终止序列、抗终止序列、RBSRBS 以及下游以及下游 88 个核苷酸处的个核苷酸处的 Nco INco I位点，紧接着是位点，紧接着是来自来自 pUCl8pUCl8 的多位接头，最后是的多位接头，最后是 rrnBrrnB 的转录终止信号。的转录终止信号。

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融合表达载体系统融合表达载体系统 组成成分：组成成分： 含有启动子含有启动子 (tac)(tac)及及 laclac 操纵基因、操纵基因、 SDSD 序列序列 谷胱苷肽巯基转移酶谷胱苷肽巯基转移酶 (GST)(GST) 基因，而克隆的外基因，而克隆的外源基因则与源基因则与 GSTGST 基因相连。当基因表达时，表达基因相连。当基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因的融合体。产物为谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因的融合体。

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该载体具有以下优点：

①可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。 IPTG可诱导 tac启动子进行高效表达。②融合蛋白极易纯化。谷胱苷肽巯基转移酶谷胱苷肽巯基转移酶 GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法 (G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。③可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。

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QIAexpress 6×His表达系统

该系统为 Ni-NTA基质对带 6 个组氨酸残基的重组蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统，

优点：① 6×His比其它标记更小，可用于任何表达系统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白酶把 6×His切除。②生理 pH条件下 6×His不带电荷，所以不影响蛋白质的分泌。③因5×His免疫原性差，所以无需去除 6×His, 重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。

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二、二、 λλ 噬菌体噬菌体 λλ 噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。

基因组长度：约为基因组长度：约为 50kb50kb 的双链的双链 DNADNA 分子，实际分子，实际大小为大小为 48502bp48502bp 。。

DNADNA 是线状双链分子带有单链的互补末端，末端是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长长 1212 个核苷酸，称为粘性末端，简写个核苷酸，称为粘性末端，简写 coscos，， 1212个碱基的序列为个碱基的序列为 5'-GGGCGGCGACCT-3'5'-GGGCGGCGACCT-3' 。当噬。当噬菌体感染宿主细胞后，双链菌体感染宿主细胞后，双链 DNADNA 分子通过分子通过 coscos而成环状。而成环状。

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GGGCGGCGACCT

CCCGCCGCTGGA

T

A C

G

环化作用

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基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成： （（ 11 ）左臂，）左臂， 19.6kb19.6kb ，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因， AA ～～ JJ 的的 1212 基因都基因都

是构成外壳蛋白的基因，其中是构成外壳蛋白的基因，其中 AA ～～ E5E5 个基因与头部形成有关，个基因与头部形成有关， GG ～～ J5J5 个基因与个基因与尾部形成有关。尾部形成有关。

噬菌体左右两臂包含了噬菌体左右两臂包含了 λλ 复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区中央片段为非必需区，，即位于即位于 JJ 基因和基因和 NN 基因之间的片段可被其他大肠杆菌基因之间的片段可被其他大肠杆菌 DNADNA 片段所替换。片段所替换。

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（（ 22 ）中央片段，）中央片段， 12kb12kb～～ 24kb24kb，含，含 PLPL控制控制 redred和和 gamgam基因。基因。

非必需区非必需区

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（（ 33 ）右臂，）右臂， 9kb9kb～～ 11kb11kb ，含，含 λDNAλDNA 复制和溶菌有关的蛋白复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的编码基因。与裂解有关的 SS 和和 RR 基因、与基因、与 DNADNA 复制有关的复制有关的 OO 基基因和因和 PP 基因等也都分别聚集在一起。基因等也都分别聚集在一起。

非必需区非必需区

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调节元件或调节基因 产物及功能PL,OL, PR,OR 左右向转录的启动子和操纵子tR (1,2,3,4,5) 右向转录的终止子tL(1,2) 左向转录的终止子PRE  CⅠ蛋白建立启动子，受 CⅡ蛋白调控PI int基因启动子，受 CⅡ蛋白调控PaQ Q蛋白反义 RNA启动子，受 CⅡ蛋白调控PRM CⅠ蛋白基因维持启动子，受 CⅠ浓度调控PR′ 晚期转录的启动子nutL, nutR N蛋白左右两个反终止结合位点qut Q蛋白反终止结合位点cro PL和 PR的阻遏蛋白，并可阻遏 PE ，抑制 CI  表达cI PL 和 PR 的主要的阻遏物，并可自主调控 PRM

cⅡ 可以启动 PRE 、 PI 和 PAQ，使 λ进入溶原化途径

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cⅢ 和 CⅡ组成复合物，启动 PE产生 cⅠ及 cro的反义 RNA

N tR1, tR2及 tL1的反终止蛋白Q tR4的反终止蛋白 . 

O, P DNA复制所需的蛋白S, R, R2 裂解宿主所需的裂解酶int 整合酶，使 λ整合到宿主的染色体中xis 切除酶，帮助 λ在 att位点和宿主连接bet, exo 重组蛋白，帮助 λ和宿主进行重组W, B, N u3, C, D, E, FⅠ, FⅡ,Z

头部蛋白基因

U, V, G, T, H, M, L, K, I, J 尾部蛋白基因

cos (cohesive) 12bp的回文序列，由线状连接成环状的连接点， A 蛋白切割位点

A 末端酶，识别 cos位点，包装时将环连体切成单个的基因组

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λλ 噬菌体的缺陷与改造噬菌体的缺陷与改造

λλ 噬菌体的改造噬菌体的改造

⑴ 基因组太大（ 49kb ）；

⑵ 酶切点太多，它有 5个 BamH1 位点（ G↓GATCC ）， 6个 BgⅠ位点（ A↓GATCT ）， 5个 EcoRⅠ 位点（ G↓AATTC ）。

⑶ 野生型只能接纳一定长度的 DNA 。若相当于 λ 噬菌体的 75-

105% ，那么只能接纳 49kb×5%=2.45kb的 DNA 。

⑴ 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（ 2.5kb 或更大）；

⑵ 去处太多的酶位点，每种酶只留 1-2 个切口；

⑶ 增加标记基因（ remarke gene ）。

(4) 引入无义突变．

λ 噬菌体的缺陷：

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野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改造才野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改造才能用作载体：能用作载体：

①① 现在用的现在用的 λλ 载体大都载体大都减少或增加某些限制性内切酶减少或增加某些限制性内切酶的的酶切位点酶切位点：野生型有：野生型有 6565 种限制酶酶切点，除种限制酶酶切点，除ApaⅠApaⅠ、、 NaeⅠNaeⅠ、、 NarⅠNarⅠ、、 NheⅠNheⅠ、、 Sna Sna BⅠBⅠ、、 XbaⅠXbaⅠ和和 XhoⅠXhoⅠ等等 77 种限制酶各有一个切点外，种限制酶各有一个切点外，其余都多于其余都多于 22 个。有些酶切点在个。有些酶切点在 λλ 增殖所必需的基因区增殖所必需的基因区域内。域内。

②②将将 λλ 噬菌体的噬菌体的非必需区做部分切除非必需区做部分切除 ③③ 插入了某种插入了某种报告基因报告基因

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1.λ噬菌体载体的类型

两种类型：两种类型： ① ① 置换型置换型

② ② 插入型插入型

置换型载体：可被外源 DNA置换的 λ噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。

插入型载体：有一类只含一个限制性位点可供插入外源 DNA 的载体，这类 λ噬菌体载体称插入型载体。

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注意： λ 噬菌载体作为载体，其重组噬菌体 DNA大小只能： 38kb ~ 52kb。

体外包装： λ 噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白

λλ 噬菌体载体是主要用于噬菌体载体是主要用于 cDNAcDNA 文库构建，文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。也经常用于外源目的基因的克隆。

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三、柯斯质粒三、柯斯质粒

19781978年年 CollinsCollins和和 HohnHohn 构建一种新型的大肠构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为杆菌克隆载体，命名为 cosmid(cosmid( 柯斯质粒柯斯质粒 )) ，，又叫粘粒。又叫粘粒。

柯斯质粒（柯斯质粒（ cosmidcosmid）） = cos= cos 序列序列 ++ 质粒。质粒。 实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同 λλ噬菌体的噬菌体的 coscos 位点构成。 位点构成。

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1.粘粒的组成及性质：

它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA 克隆的最大 DNA 片段可达 45kb

①质粒复制起点（ colE1） 象质粒一样转化和增殖

②抗性标记 ampr ③ cos位点 ④有的粘粒载体含有两个 cos位点

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pHC79pHC79

6400

bp

6400

bp

Tc

r

Tc

r

l fragmentl fragmentcoscos

or

i

or

i

AprAprPst

I

Pst

I

BamHIBamHI

Sal

I

Sal

I

l-DNA cos序列和质粒复制子的l-DNA cos序列和质粒复制子的

cos site - carrying

plasmid

cos site - carrying

plasmid

1.8 kb的 l-DNA片段 + pBR322片段

1.8 kb的 l-DNA片段 + pBR322片段

装载范围为 31 - 45 kb 装载范围为 31 - 45 kb

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2. 柯斯质粒pHC79 系 由质粒由质粒 pBR322pBR322和和 λλ 噬菌体的噬菌体的 coscos位点的一段位点的一段 DNADNA 构成，全长构成，全长43kb43kb 。。

在包装时，在包装时， coscos位点打开而产生位点打开而产生 λλ 噬菌体的粘性末端。由于噬菌体的粘性末端。由于pHC79pHC79有有 pBR322DNApBR322DNA ，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。性两个标记。

凡具有凡具有 coscos位点的任何位点的任何 DNADNA 分子只要在长度相当于噬菌体基因组，分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似 λλ 噬菌体的颗粒。噬菌体的颗粒。

因此，插入柯斯质粒的外源因此，插入柯斯质粒的外源 DNADNA 可大于可大于 40kb40kb 。重组的柯斯质粒。重组的柯斯质粒可象可象 λλ 噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿主菌在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞主菌在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞DNADNA总量的总量的 50%50%左右。左右。

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3.柯斯质粒有以下优越性： ① ① 能象能象 λ-DNAλ-DNA 一样体外包装，并高效导入受体一样体外包装，并高效导入受体细胞；细胞；

②② 可以装载比质粒或可以装载比质粒或 λ-DNAλ-DNA 大得多的外源大得多的外源 DNADNA片段，如片段，如 coscos 区及附近顺序长为区及附近顺序长为 1.7 kb1.7 kb ，质粒，质粒长为长为 3.3kb3.3kb ，则该柯斯质粒最大可装载，则该柯斯质粒最大可装载 46.5kb46.5kb的外源的外源 DNADNA ；；

③ ③ 由于携带质粒的选择标记，便于筛选；由于携带质粒的选择标记，便于筛选； ④ ④ 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。

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常用的粘性粒有常用的粘性粒有 PHC79PHC79、、 PJB8PJB8、、 MUA-3MUA-3和和KOSIKOSI 等，它们大多具等，它们大多具有一种或多种限制性内切有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。酶的单一酶切位点。采用这种大容量载体不仅可采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组减少构建基因组 DNADNA 文库的重组克隆数目，减少文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。合高等真核基因的克隆工作。

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4.采用柯斯质粒作载体的困难 ①①载体载体易易自身连接自身连接。。可可用用碱性磷酸酶处理，可阻止载体碱性磷酸酶处理，可阻止载体

分子自身连接；分子自身连接； ②②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。。 ③③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制

备基因文库，则备基因文库，则筛选所需的含某一筛选所需的含某一 DNADNA 片段的菌落很费片段的菌落很费时间。时间。

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四、 M13 噬菌体载体 单链 DNA噬菌体是一类丝状的大肠杆菌噬菌体，由单链环状 DNA分子外面包裹上一层蛋白质外壳而成。

M13噬菌体是单链 DNA噬菌体中的一个典型的代表。

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1.M13噬菌体的组成和结构

M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。

27002700 个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子 27002700 个外壳蛋白分子个外壳蛋白分子

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单链 DNA，由 6407碱基组成。 90%以上的序列可编码蛋白质，共有 11个编码基因 基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和 DNA合成的元件。

2.M13噬菌体的基因组

编码 3 类蛋白质：① 复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ）② 形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ）③ 结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）

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3. M13噬菌体载体的构建 M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：①M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；

②M13噬菌体 DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将 M13噬菌体 DNA导人宿主菌中；

③M13噬菌体的包装不受 DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随 DNA的大小而改变，即使 DNA的大小比本身 DNA的大小超出6 倍，仍能进行包装。

⑤M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。

⑥外源片段插入位点在基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的 508bp间隔区 ----M13不像 λ 噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因Ⅱ /Ⅳ和基因Ⅷ /Ⅲ之间）。

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mpmp 系列载体系列载体 M13mpM13mp 载体系列是由载体系列是由 M13mp1M13mp1改造而来的，改造而来的， M13mp1M13mp1在在IRIR 区内插入了一个编码区内插入了一个编码 β-β-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 NN 端端 146146氨基酸氨基酸的基因序列的基因序列

当选用含有当选用含有 F’F’ 因子的因子的 β-β-半乳糖苷酶基因缺陷突变体作半乳糖苷酶基因缺陷突变体作为宿主菌时为宿主菌时，由于该缺陷型基因编码的多肽缺失，由于该缺陷型基因编码的多肽缺失 NN 端第端第1111－－ 4141位氨基酸，因此缺陷型的位氨基酸，因此缺陷型的 β-β-半乳糖苷酶没有半乳糖苷酶没有生物活性生物活性

未插入外源基因的未插入外源基因的 M13mp1M13mp1 与该缺陷型基因可以产生互与该缺陷型基因可以产生互补作用，常称为补作用，常称为 αα互补。 互补。

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M13mp18 和 M13mp19 这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不

相同的限制酶切割而成的 DNA 片段，这两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。

当 RF DNA被两种不同的限制酶切割以后， M13mp18 和 M13mp19 轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链 DNA片段时，方可闭合成环。

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这一片段在 M13mp18 和 M13mp19 中将以两个互为相反的方向插入。这样一来，在 M13mp18 的正链中含有外源 DNA 双链的其中一条链，而在 M13mp19 正链中则含有外源 DNA 的另一条链，即 M13mp18 重组体的子代噬菌体内含有外源 DNA 的一条链， M13mp19重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。

故用 M13mp18 和 M13mp19 作为一对载体，就可能用一个引物（通用引物），从所插入 DNA 片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的 DNA 序列，并可制备只与外源 DNA的任意一条链互补的 DNA探针。

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M13噬菌体产生单双链 DNA的机制：

1 、以（ + ）链 DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（ RFDNA）。

2 、 RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约 200个拷贝。

3 、单链特异的 DNA结合蛋白结合在（ + ）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（ + ）链 DNA 。

4 、游离出来的（ + ）链 DNA先与基因 V 的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因 V 的蛋白质从（ + ） DNA链上脱落下来，余下的 M13（ + ）链 DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。

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病毒载体概述（ 1 ）要求： 1 、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2 、介导外源基因转移和表达 3 、对机体不致病

容量：自身基因组大小的 105%~110%

类型： 1 、重组型病毒载体

2 、无病毒基因的病毒载体 复制缺陷型

可复制型

复制缺陷型

组成： 1 、病毒复制和包装元件 2 、病毒基因 3 、插入的外源基因或元件 4 、病毒外壳 / 外膜

用途：基因转移和表达 1 、基因治疗 2 、疫苗 3 、器官移植 4 、组织工程 5 、转基因动物 6 、基因功能研究

五、病毒载体

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病毒载体概述（ 2 ）

优点： 1 、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；

2 、复杂的装配过程由细胞完成； 3 、不同的病毒载体具有不同的表达特点。

存在的问题： 1 、安全性

2 、靶向性

3 、有效性

细胞毒性染色体毒性免疫毒性转导靶向性转录靶向性转导效率靶向性基因表达水平和持续时间表达的可调控性

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病毒载体 生物学特性 适用范围

反转录病毒载体 单链 RNA病毒 8~10kb

可感染分裂细胞；整合到染色体中；表达时间较长；有致癌的危险；

Ex vivo基因治疗；肿瘤基因治疗。

腺病毒载体 双链 DNA病毒 36kb

可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；表达时间较短；免疫原性强；

In vivo基因治疗；肿瘤基因治疗；疫苗。

AAV病毒载体 单链 DNA病毒 ~5kb

可感染分裂和非分裂细胞；整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱；可长期表达外源基因；在骨骼肌、心肌、肝脏、视网膜等组织中表达较高；

In vivo 基 因 治疗；Ex vivo基因治疗；遗传病基因治疗；获得性慢性疾病的基因治疗。

HSV病毒载体 双链 DNA病毒 152kb

具有嗜神经性；可逆轴突传递；可潜伏感染；容量大；可感染分裂和非分裂细胞；

神经系统疾病的基因治疗；肿瘤的基因治疗。

常用的病毒载体的特点：

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◆ Ti 质粒是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤 (grown gall tumors) 。

致毒区

Ti质粒复制起始点

冠瘿碱代谢

酶编码基因

与 Ti质粒转移功能

有关的遗传座位

冠瘿碱合成基因

T-DNA区

右边界

生长素合成基因 细胞分裂素合成基因

左边界

◆Ti 质粒。 Ti 质粒的一部分 DNA 叫做转移 DNA（ T-DNA ），当 T-DNA 整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱 (opine), 作为土壤农杆菌的碳源和氮源 。

六、 Ti 质粒

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（ 1） T-DNA 区（ transferred-DNA regions ） T-DNA 是农杆菌侵染植物细胞时，从 Ti 质粒上导入植物细胞的一段 DNA 。 T-DNA 两端各有一段 25bp 的重复序列 (LB, RB) 。 T-DNA 携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态，形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。Ti 质粒改造后才能应用于植物的基因工程。 保留 T-DNA 两端的末端序列，然后用外源 DNA 插入或直接取代野生型 T-DNA 的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。

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（ 2） Vir 区（ virolence region ）Vir 区段上的基因与 T-DNA 从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。 Vir 区段总长度大约 35kb ，由 7 个互补群组成，分别命名为 VirA、 VirB、 VirC、 VirD、 VirE、 VirG和 VirH 。（ 3） Con区 (regions encoding conjugations) 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（ tra），调控 Ti质粒在农杆菌之间的转移。 （ 4） Ori区 (origin of replication) 该区段基因调控 Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。

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（ 1 ）双元载体系统（ binary vector ）具有两个质粒——穿梭质粒和 Ti 质粒。（ 2 ）共整合载体（ integrated vector ）共整合载体系统包括在 T-DNA 上的激素合成区经

过突变后的 Ti 质粒和中间载体两部分。

Ti 质粒的衍生载体

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　七、酵母人工染色体载体 （ yeast artificial chromosome, YAC ）

八、细菌人工染色体 （ bacterial artificial chromosome, BAC ）

动物病毒 DNA 改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）

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人基因组十分庞大，约含 4×109bp ，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（ yeast artificial chromosome,YAC ）载体应运而生。 YAC 含有酵母染色体端粒（ telesome ）、着丝点 (centromere)及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500kb 的外源 DNA ，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要

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正常酵母人工染色体含有：

* 四膜虫端粒（ tel)

* 酵母自主复制序列（ ARS)

* 酵母着丝点 (CEN)

•酵母的选择标记 (TRP1 、 URA1)

YAC 载体

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BAC 载体

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Structure of a bacterial artificial chromosome (BAC), used for cloning large fragments of donor DNA. CMR is a selectable marker for chloramphenicol resistance. oriS, repE, parA, and parB are F genes for replication and regulation of copy number. cosN is the cos site from l phage. HindIII and BamHI are cloning sites at which foreign DNA is inserted. The two promoters are for transcribing the inserted fragment. The NotI sites are used for cutting out the inserted fragment.

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PAC 载体

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质粒质粒 λλ 噬菌体噬菌体 柯斯质粒柯斯质粒 单链噬菌体单链噬菌体

克隆克隆 DNADNA 大片段大片段 ±±** ++ ++ --

构建基因组文库构建基因组文库 -- ++ ++ --

构建构建 DNADNA 文库文库 ++ -- -- --

常规的亚克隆化常规的亚克隆化 ++ -- -- --

构建新型的构建新型的 DNADNA结构结构 ++ -- -- --

序列分析序列分析 ++ -- -- ++

单链探针单链探针 ++**** -- -- ++

外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达 ++ -- -- --

四种常用载体的比较

* 外源 DNA 如超过 10kb ，则重组质粒的转化率和 DNA得率都非常低** 已有个别材料可用于此目的　　　　　　　　　　

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质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA 重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒 SV40（ Simian Virus 40 ）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等。　　

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猴病毒 40（ SV40 ）的基因组常用来作为克隆载体，把外源 DNA 转入哺乳类细胞。猴病毒 40 是球形动物病毒，直径 40nm ，呈 20面体，有一个共价闭环的双链DNA 基因组，全长 5244bp 。它在猴肾中增殖。被 SV40 感染的细胞都会出现 SV40的 T抗原。早已证明完整的小鼠染色体 β 珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序）整合在 SV40 中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠β 珠蛋白的初级转录本。

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SV40 作为克隆载体有其局限性：①SV40 基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外源 DNA 的重组和表达；②早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；③重组 DNA片段的大小受体限制。

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逆转录病毒是 RNA 病毒，它有三个基因： gag-编码病毒的核心蛋白； pol-编码逆转录酶； env-编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因（ vonc ），即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒（ defective virus ）使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。