ˇ 0 - BD · 2017. 5. 15. · community-acquired pneumonia (CAP) cases that require hospitalization. The case fatality rate for patients with legionellosis is 5 Œ 30%, with elderly

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INTENDED USEThe BD ProbeTec� ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay, for use with the BD ProbeTec ET System,employs Strand Displacement Amplification (SDA) technology for the direct qualitative detection of Legionellapneumophila DNA (serogroups 1 � 14) in sputum specimens from patients with a clinical suspicion of pneumonia. It isintended to aid in the presumptive diagnosis of Legionnaires' disease in conjunction with culture and other methods.

SUMMARY AND EXPLANATIONLegionnaires� disease can be acquired by the inhalation of aerosols containing Legionella or by microaspiration ofcontaminated water. In studies from Europe and North America, Legionella has been reported to cause 2 � 15% ofcommunity-acquired pneumonia (CAP) cases that require hospitalization. The case fatality rate for patients withlegionellosis is 5 � 30%, with elderly and immunocompromised patients at greater risk of death.1 Forty differentLegionella species have been identified, half of which are linked with human disease. Legionella pneumophilacauses 90% of diagnosed cases of legionellosis. Although fourteen serogroups of L. pneumophila are known, 80%of L. pneumophila infections are caused by serogroup 1.2

The importance of establishing a diagnosis of pneumonia and its etiology is heightened by the increasing concernabout overuse of antibiotics. Diagnostic test results for L. pneumophila should be made available to the clinician rapidlybecause it has been shown that mortality increases if administration of appropriate therapy is delayed. Traditionalculture methods take a minimum of two days to grow Legionella organisms from positive sputum specimens and atotal of seven to ten days to finalize a negative result. As an adjunct to culture, enzyme immunoassay kits arecommercially available for the detection of antigen from L. pneumophila serogroup 1 in urine specimens.3 However,diagnostic tests for Legionella infections that provide rapid results with good sensitivity and specificity remain limited.

PRINCIPLES OF THE PROCEDUREThe BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay is based on the simultaneous amplification anddetection of target DNA using amplification primers and a fluorescently-labeled detector probe. The SDA reagents aredried in two separate disposable microwells. Processed sample is added to the Priming Microwell, which contains theamplification primers, fluorescently-labeled detector probe and other reagents necessary for amplification. The primersamplify a 68-base-pair region of the L. pneumophila macrophage infectivity potentiator (mip) gene that is conservedacross all serogroups of the species. After incubation, the reaction mixture is transferred to the Amplification Microwell,which contains two enzymes (a DNA polymerase and a restriction endonuclease) necessary for SDA. The AmplificationMicrowells are sealed to prevent contamination and then incubated in a thermally controlled fluorescent reader, whichmonitors each reaction for the generation of amplified products. Each reaction co-amplifies and detects an InternalAmplification Control (IAC), the purpose of which is to verify that the proper conditions exist for amplification and toreduce the possibility of reporting a false-negative result due to the presence of assay inhibitors. The presence or absenceof L. pneumophila DNA is determined by calculating the PAT scores (Passes After Threshold) for the specimen based onpredetermined threshold values. The instrument automatically reports the results as positive, negative, or indeterminate.

REAGENTS AND MATERIALSEach BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay reagent pack contains:Legionella pneumophila (LP) Priming Microwells, (1x24) 6 Oligonucleotides ≥ 7.5pmol, dNTP's ≥ 15.2nmol, 2 Detector Probes ≥ 22.5pmol, Synthetic Oligonucleotide ≥ 1500 copiesLegionella pneumophila (LP) Amplification Microwells, (1x24)Restriction Enzyme: ≥ 33 Units, DNA Polymerase ≥ 14 Units10 Priming Covers, 16 Amplification Sealers (1/2), 8 Disposal BagsBD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF*/LP/MP**):Contents: Respiratory and Media Diluent: Bicine, Potassium Phosphate, Potassium Hydroxide, DMSO and Proclin�;10 (CF/LP/MP) Positive Controls: ≥ 1050 ng Salmon Sperm DNA, ≥ 47.3 µg Tris, ≥ 9.0 µg EDTA, ≥ 3600 Copies CFPlasmid, ≥ 4800 Copies LP Plasmid, ≥ 5400 Copies MP Plasmid; 10 (CF/LP/MP) Negative Controls: ≥ 1050 ng SalmonSperm DNA, ≥ 47.3 µg Tris, ≥ 9.0 µg EDTA; 100 2-mL Snap-Cap Tubes* Refers to the BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay

** Refers to the BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay

Instruments, equipment and supplies: BD ProbeTec ET Instrument and Instrument Plate, BD ProbeTec ET LysingHeater, BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, BD ProbeTec ET Pipettor, stand and Power Supply, 2 mLSample Tube Rack, BD ProbeTec ET Accessories Kit, BD ProbeTec ET Pipette Tips.

!ProbeTec� ET Legionella pneumophila(LP) Amplified DNA Assay

English: pages 1 � 11 Italiano: pagine 37 � 48 8010960Français : pages 12 � 24 Español: páginas 49 � 60 ! 2006/04Deutsch: Seiten 24 � 36U.S. Patent Nos. 5,270,184; 5,547,861; 5,648,211; 5,712,124; 5,744,311; 5,846,726; 5,851,767; 5,866,336; 5,919,630;

5,928,869; 5,958,700; 6,054,279; 6,090,552; 6,117,635; 6,251,609; 6,316,200; 6,656,680; 6,743,582.

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Materials Required But Not Provided: Class II Biological Safety Cabinet (BSC), vortex mixer, -20ºC and/or -70ºC(or colder) non-temperature cycling freezer, microcentrifuge capable of 16,000 x g, water baths, digital thermometer,water bath rack with screw-down lid, other appropriate sample tube racks, QIAGEN QIAamp� DNA Stool Mini Kits,96 � 100% Ethanol, BBL� CultureSwab� EZ Swabs, BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tubes and Caps, disposablegloves, alcohol-resistant markers, micropipettes capable of delivering volumes of 25 � 1000 µL, aerosol resistantpipette tips, distilled water, L. pneumophila ATCC� 33152 (Philadelphia-1), Bovine albumin (Fraction V) 0.2% (w/v)in 0.85% (w/v) saline, 1% (v/v) sodium hypochlorite with Alconox.�*

* Dissolve 7.5 g Alconox with 1 L of a 1% (v/v) sodium hypochlorite solution and mix. Prepare fresh daily.

Storage and Handling Requirements: The BD ProbeTec ET LP Reagent Packs may be stored at 2 � 33ºC. Do notuse unopened reagent packs after the expiration date. Once a pouch has been opened, the microwells are stablefor 12 weeks if properly resealed or until the expiration date, whichever comes first. Do not freeze.

The BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP/MP) may be stored at 2 � 33ºC. Do notuse reagents after the expiration date. Do not freeze.

Warnings and PrecautionsFor in vitro Diagnostic Use.

1. Pathogenic microorganisms, including hepatitis viruses and Human Immunodeficiency Virus, may be present inclinical specimens. �Standard Precautions�4-7 and institutional guidelines should be followed in handling allitems contaminated with blood and other body fluids.

2. Lower respiratory specimen handling and processing prior to the 70ºC incubation step should be performed ina Class II Biological Safety Cabinet (BSC).

3. During the 70ºC incubation step, use a water bath rack with a screw-down lid to provide added containmentfor potentially biohazardous lower respiratory specimens.

4. The BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent contain dimethyl sulfoxide (DMSO). DMSO is harmfulthrough inhalation, contact with skin or if swallowed. Avoid contact with eyes and always wear gloves whenhandling. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. Aftercontact with skin, wash immediately with plenty of water.

5. Refer to the QIAamp DNA Stool Mini Kit Handbook for safety information on QIAGEN reagents used in thisprocedure. Do not dispose of QIAGEN reagents into bleach solutions. Do not expose QIAGEN reagents to bleach.

6. There have been reports that suggest QIAGEN DNA extraction kits are not suitable for Legionella PCR (PolymeraseChain Reaction), due to the potential for the reagents to be contaminated with Legionella DNA.8,9 Although thelikelihood for this is low, and Legionella species other than L. pneumophila were identified in these studies, theuser should verify the performance of each new lot of QIAGEN reagents prior to use with patient specimens.

7. Although dedicated work areas are not required because the BD ProbeTec ET design reduces the possibility ofamplicon contamination in the testing environment, other precautions for controlling contamination,particularly to avoid contamination of specimens during processing, are necessary.

8. Reagent pouches containing unused Priming Microwells and Amplification Microwells MUST be carefullyresealed after opening. Verify that a desiccant is present prior to resealing the reagent pouches.

9. The plate containing the Amplification Microwells MUST be properly sealed with the Amplification Sealer priorto moving the plate from the BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater to the BD ProbeTec ET instrument.Sealing ensures a closed reaction for amplification and detection and is necessary to avoid contamination of theinstrument and work area with amplification products. Do not remove sealing material from microwellsat any time.

10. Priming Microwells with residual fluid (after transfer of fluid from the Priming Microwells to the AmplificationMicrowells) represent a source of target contamination. Carefully seal Priming Microwells with a plate sealerprior to disposal.

11. To prevent contamination of the work environment with amplification products, use the disposal bags providedin the Reagent Packs to dispose of tested Amplification Microwells. Make sure the bags are properly closedbefore disposal.

12. CHANGE GLOVES at specified steps during sample processing and assay procedure to avoid cross-contaminationof specimens. If gloves come in contact with specimen, immediately change gloves to avoid contaminatingother specimens.

13. In the event of contamination of the work area or equipment with samples or controls, thoroughly clean thecontaminated area with 1% (v/v) sodium hypochlorite with Alconox and rinse thoroughly with water. Allowsurface to dry completely before proceeding with additional testing. Prior to cleaning up any QIAGEN sampleprocessing reagents, wipe down affected areas with water before using the 1% (v/v) sodium hypochloritesolution containing Alconox.

14. Use only the BD ProbeTec ET Pipettor and BD ProbeTec ET Pipette Tips for the transfer of processed samples tothe Priming Microwells and the transfer of samples from the Priming Microwells to the Amplification Microwells.

15. Use established laboratory practices when disposing of used pipette tips, sample tubes, Priming Microwells andother disposables. Discard disposables carefully. Seal and dispose of waste containers when they are ¾ full ordaily (whichever comes first).

16. Do not interchange or mix Microwells, Controls or processing reagents from kits with different lot numbers.

17. Contact Technical Services in the event of an unusual situation, such as a spill into the BD ProbeTec ET instrumentor DNA contamination that cannot be removed by cleaning.

SPECIMEN COLLECTION AND TRANSPORT1. Specimen Collection

Specimens should be collected as recommended by the Clinical Microbiology Procedures Handbook10 or yourlaboratory procedure manual.

2. Specimen Storage and Transport

� Specimens may be stored/transported at 18 � 33ºC for no longer than 6 h.

� Specimens may be refrigerated at 2 � 8ºC for no longer than 3 days.

� Specimens may be stored at or below -20ºC for no longer than 14 weeks.

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TEST PROCEDURERefer to the BD ProbeTec ET System User�s Manual for specific instructions for operating and maintaining thecomponents of the system.

A. Instrument Preparation:1. Instrument power must be on and instruments allowed to warm up prior to beginning the assay.

a. The Priming and Warming Heater requires approximately 90 min for warm-up and stabilization.The Set point for the Priming component of the Priming and Warming Heater is 72.5ºC.The Set point for the Warming component of the Priming and Warming Heater is 54ºC.

b. The BD ProbeTec ET instrument is under software control and requires approximately 30 min to warm up.2. Heater temperatures must be checked prior to beginning the assay. Record temperatures on the BD ProbeTec ET

System Maintenance Log.a. Priming and Warming Heater

The Priming Heater thermometer must read between 72 � 73ºC.The Warming Heater thermometer must read between 53.5 � 54.5ºC.

3. Check the temperature displayed on the BD ProbeTec ET screen. The temperature must read between 47.5 � 55.0 ºC.Record temperatures on the BD ProbeTec ET System Maintenance Log.

B. Pipettor:Refer to the BD ProbeTec ET System User�s Manual for detailed explanation of the BD ProbeTec ET Pipettor keypadfunctions. Additionally, the BD ProbeTec ET Pipettor needs to be cleaned after each use. Refer to your TechnicalService representative for guidance on the proper cleaning and maintenance of the BD ProbeTec ET Pipettor.The following programs are required for performing the BD ProbeTec ET LP assay. Program 1 transfers liquid fromthe processed samples to the LP Priming Microwells. Program 5 transfers liquid from the LP Priming Microwells tothe LP Amplification Microwells. Program the pipettor as follows:

Program 1: 1. Turn the pipettor ON. The pipettor will beep once, flash �ZERO,� flash Software Version # and beep once more.2. Press the blue �Prog� (Program) Key. Press the �Vol� (Volume) Key until �1� is displayed to select Program 1.

Press �Enter.�3. To enter the programming mode, press and hold the �Prog� Key. While depressing the �Prog� Key, simultaneously

press the Special Function Key with a pipette tip or the end of a paper clip.4. Press �Fill.� Press the up arrow until 200 is displayed. Press �Enter.�5. Press �Disp� (Dispense). Press the up arrow key until 150 is displayed. Press �Enter.�6. Press �Enter� a second time to save the program and exit. You should hear a �beep� to indicate that programming

is complete.7. Verify your program by pressing the trigger to advance through each step. As you go through each step, set

the speed of aspiration/dispense using the �Vol� key. At each step, the Speed indicator appears. Use the �Vol�key to adjust the speed indicator to show 2 squares for the �Fill� and �Disp� steps.

Program 51. Press the �Prog� Key. Press the �Vol� Key until �5� is displayed to select Program 5. Press �Enter.�2. To enter the programming mode, Press and hold the �Prog� Key. While depressing the �Prog� Key, simultaneously

press the Special Function Key with a pipette tip or the end of a paper clip.3. Press �Fill.� Press the up arrow until 100 is displayed. Press �Enter.�4. Press �Disp.� Press the up arrow key until 100 is displayed. Press �Enter.�5. Press �Mix.� Press the up arrow key until 50 is displayed. Press �Enter.�6. Press �Enter� a second time to save the program and exit. You should hear a �beep� to indicate that programming

is complete. 7. Verify your program by pressing the trigger to advance through each step. As you go through each step, set

the speed of aspiration/dispense/mix using the �Vol� key. At each step, the Speed indicator appears. Use the�Vol� key to adjust the speed indicator to show 2 squares for the aspiration and dispense functions. Use the�Vol� key to adjust the speed for the mix so that it shows 3 squares.

Program ReviewThe programs should be reviewed prior to beginning the procedure. To review the program, turn the pipettor ON.Press the blue �Prog� (Program) Key. Press the �Vol� (Volume) key until the appropriate program number (1 or 5)is displayed. Press the �Enter� key. Use the pipetting trigger to advance step by step through the program.

Program 1: This program aspirates 200 µL; dispenses 150 µL into the LP microwell. The pipettor display should readas follows:Fill 200 µL � SIIDispense 150 µL � SII

Program 5: This program aspirates 100 µL; dispenses 100 µL; and mixes 50 µL three times. The pipettor displayshould read as follows:Fill 100 µL � SIIDispense 100 µL � SIIMix 50 µL � SIIIZero (flashes on and off)

C. Plate Layout:The Plate Layout Report is generated from the BD ProbeTec ET instrument after the assay type, specimen identification,control lot numbers, and kit lot numbers are logged into the system. The Plate Layout Report shows the physical layoutof specimens and controls for each plate to be tested. This orientation is used for both the Priming Microwell plate andthe Amplification Microwell plate. For the LP assay, the Priming Microwells are solid gray microwell strips. TheAmplification Microwells are gray striped microwell strips.

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D: Lower Respiratory Specimen Processing:

Procedural Notes: � Review the QIAGEN QIAamp DNA Stool Mini Kit Handbook for important procedural notes and precautions

before starting.

� Fill a water bath with distilled water and heat to 70°C (± 5°C) prior to starting specimen processing.

� Use alcohol-resistant markers to label containers and tubes.

� Change pipette tips between all liquid transfers. The use of aerosol-barrier tips is recommended.

� Allow the BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent (CF/LP/MP) to come to room temperature and mixby gentle inversion prior to use.

� Aliquot the required quantity of BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent (CF/LP/MP) into a cleancontainer. To estimate the quantity needed, use 0.4 mL for each specimen and add another 1 � 2 mL for pipettingease. To avoid contamination of the Diluent � Do Not Pour leftover Diluent back into the bottle.

1. Prepare QIAGEN reagents (refer to �Preparation of Reagents� in the QIAamp DNA Stool Mini Kit Handbook).

2. Allow specimens to come to room temperature.

3. Label a 2 mL snap-cap tube for each specimen to be tested.

The following steps should be performed in a Biological Safety Cabinet (BSC):4. Pulse vortex specimens for 5 � 15 s to mix thoroughly.

5. Pipette 350 µL of specimen into the labeled tube.

NOTE: Sputum samples may be difficult to accurately pipette. If this happens, use the graduations on the side of thetube to assist in assuring that proper volume is delivered to the tube. Alternatively, use a tube into which 350 µLwater has been dispensed as a guide.

6. CHANGE GLOVES after the addition of specimens.

7. Pipette 150 µL of QIAGEN ASL buffer into each sample tube.

8. Pipette 25 µL of QIAGEN Proteinase K into each sample tube.

9. Pipette 500 µL of QIAGEN AL lysis buffer into each sample tube.

10. Cap each tube and pulse vortex for 5 s. Place tubes in a water bath rack with a screw-down lid.

The following steps can be performed outside a Biological Safety Cabinet (BSC):11. Incubate the tubes in the 70°C (± 5ºC) water bath for 15 min.

12. After 15 min, remove tubes from water bath, and centrifuge (16,000 x g) for approximately 5 s.

13. Remove tubes from centrifuge. Open each tube, and add 500 µL of 96 � 100% ethanol.

14. Recap each tube and pulse vortex for 5 s.

15. Centrifuge specimens (16,000 x g) for approximately 5 s.

16. Label a QIAGEN spin column and collection tube for each specimen.

17. Transfer 700 µL of specimen to the appropriately labeled QIAGEN spin column.

18. Centrifuge tubes (16,000 x g) for 1 min.

19. Transfer the columns to new QIAamp collection tubes. Discard the tubes containing the filtrate.

20. Carefully transfer 700 µL more of the specimen to the appropriate column.


22. Transfer the columns to clean QIAamp collection tubes. Discard the tubes containing the filtrate.

23. Open the QIAamp columns and add 500 µL of QIAGEN AW1 wash buffer to each.


25. Transfer the columns to new QIAamp collection tubes. Discard the tubes containing the filtrate.

26. Open the QIAamp columns and add 500 µL of QIAGEN AW2 wash buffer to each.


28. Transfer columns to final labeled QIAamp collection tubes. Discard the tubes containing the filtrate.

NOTE: The collection tube should be labeled at this point.

NOTE: Use caution to assure that no liquid remains clinging to the bottom of the column. Transfer of residual washinto the collection tube may affect results.

29. Open the columns and add 225 µL QIAGEN AE elution buffer to each.

30. Incubate at room temperature 1 min.


32. Discard the columns.

33. Label a 2 mL screw-cap tube for each specimen.

34. Transfer 400 µL of Respiratory and Media Diluent (CF/LP/MP) to each screw-cap tube.

NOTE: Fill a water bath with distilled water and bring the bath to a boil for use in step 38.

35. Transfer 200 µL of eluate to the appropriately labeled tube containing 400 µL of Respiratory and Media Diluent(CF/LP/MP).

36. Cap tube and pulse vortex 5 s.

37. Prepare the controls. See Lower Respiratory Control Preparation (Section E).38. Transfer specimens and controls to a water bath rack.

39. Place the water bath rack into the boiling water bath for 5 min.

40. At the end of 5 min, remove the water bath rack and allow tubes to cool at room temperature for 15 min.

WARNING: Use care to avoid burns from the boiling water, the water bath rack, or surfaces of the water bath thatmay be hot.

41. After cooling, centrifuge (16,000 x g) for approximately 5 s.

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NOTE: After boiling samples:

a. They may be stored at 18 � 33ºC for up to 6 h and may be tested without re-boiling.

b. They may be stored up to 3 days at 2 � 8ºC. Samples must be vortexed and re-boiled prior to testing.

c. They may be stored up to 14 weeks at ≤ -20ºC. Samples must be thawed at room temperature, vortexed andre-boiled prior to testing.

42. Specimens are ready for the Testing Procedure for the BD ProbeTec ET LP Assay (Section F).

E. Lower Respiratory Control Preparation:1. For each run (plate) to be tested, prepare one Negative Control (CF/LP/MP) tube and one Positive Control (CF/LP/MP)

tube. If a plate contains more than one Reagent Pack lot number, controls must be tested with each lot.

2. Gently invert the QIAGEN buffer AE and the Respiratory and Media Diluent prior to use.

3. Remove the cap from the Negative Control (CF/LP/MP) tube.

4. Using a new pipette tip for each control tube, add 200 µL of QIAGEN buffer AE.

5. Using a new pipette tip for each control tube, add 400 µL of Respiratory and Media Diluent.

6. Tightly recap the tube.

7. Remove the cap from the Positive Control (CF/LP/MP) tube.

8. Using a new pipette tip for each control tube, add 200 µL of QIAGEN buffer AE.

9. Using a new pipette tip for each control tube, add 400 µL of Respiratory and Media Diluent.

10. Tightly recap the tube.

11. Vortex the control tubes for 5 s.

12. Controls are ready to be boiled. See Lower Respiratory Specimen Processing (Section D).

F. Testing Procedure for the BD ProbeTec ET LP Assay:NOTE: Prior to performing the testing procedure, arrange the processed specimens and processed controls into arack capable of handling 2 mL sample tubes, such as the BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tube Rack, compatible withthe BD ProbeTec ET Pipettor.1. Remove and discard the caps from the cooled specimens and controls.2. CHANGE GLOVES before proceeding to avoid contamination.3. Using the Plate Layout Report, prepare the Priming Microwell plate � see Plate Layout (Section C).4. Re-seal the microwell pouches as follows:

a. Place pouch on flat surface. Hold the open end flat with one hand.b. While applying pressure, slide finger across outside of seal moving from one edge of pouch to other.c. Inspect to ensure pouch is sealed.

5. Select Program 1 on the BD ProbeTec ET Pipettor.6. Pick up the pipette tips. Expand the BD ProbeTec ET Pipettor by pulling the spacing knob all the way out.

NOTE: Make sure tips are fitted securely on the pipettor to prevent leakage.7. Aspirate 200 µL from the 1st column of samples. 8. Gently collapse the pipettor, touch pipette tips to sides of wells and dispense 150 µL into the corresponding

column of Priming Microwells (1 A � H).NOTE: Do not collapse the pipettor over samples or microwells as this may cause contamination. Abruptmovements may cause droplets or aerosols.

9. Discard the tips. Depress the pipetting trigger to reset the pipettor.NOTE: Discard the tips carefully to avoid droplets or aerosols, which may contaminate the work area.

10. Pick up new tips, expand the pipettor and aspirate 200 µL from the 2nd column of samples.11. Gently collapse the pipettor, touch pipette tips to sides of wells and dispense 150 µL into the corresponding

column of Priming Microwells (2 A � H).12. Discard tips.13. Continue transferring the remaining samples for the run.14. Cover the Priming Microwell plate with the Priming Cover and let the plate incubate at room temperature for

at least 20 min. (May sit up to 6 h). NOTE: Recap the processed samples with new caps. CHANGE GLOVES.15. At the end of the Priming incubation prepare the Amplification Microwell Plate. Configure the Amplification

Microwells in a plate to match the Plate Layout Report (same as priming plate). Reseal the microwell pouch asdescribed in step 4.

16. Remove the cover from the Priming Microwell plate and transfer the plate to the Priming Heater. IMMEDIATELYplace the Amplification Microwell plate in the Warming Heater to pre-warm.

17. Set timer for 10 min. (NOTE: This is a time critical step).18. At the end of the 10 min (± 1 min) incubation, select Program 5 on the pipettor.19. Pick up pipette tips and transfer 100 µL from column 1 of Priming Microwell plate to column 1 of Amplification

Microwell plate. Allow pipette tips to touch sides of wells and dispense the liquid. After dispensing allowpipettor to automatically mix the liquid in the wells. Carefully lift the pipettor away from the plate. Avoidtouching other wells.

20. Discard tips. Pick up new tips and continue to transfer the reaction mixture from Priming Microwells to theAmplification Microwells, column by column, using new tips for each column.

21. When the last column has been transferred, remove the backing from an Amplification sealer (One AmplificationSealer (1/2) will cover up to 6 columns. If the plate exceeds 6 columns, a full sealer sheet MUST be used). Holdthe sealer by the edges and apply over the microwells. Use the guides on the Warming Heater to assist you inapplying the sealer. Press downward on sealer to ensure that all microwells are completely sealed.

22. At the BD ProbeTec ET user interface, move the carrier out and open the door and lift the plate cover.IMMEDIATELY (within 30 s) transfer the sealed Amplification Microwell plate to the BD ProbeTec ET instrumentand initiate the run. (Refer to the BD ProbeTec ET System User�s Manual for detailed instructions.)

23. After initiating the run, proceed with the following portion of the clean-up procedure:a. Seal the Priming Microwells with the Amplification sealer and remove the plate from the Priming and Warming

Heater. WARNING: Temperature is in excess of 70ºC. Use the heat resistant glove to remove plate.

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b. Allow the plate to cool on the bench for 5 min.

c. Remove the sealed Priming Microwells from the plate by holding the sealer on both sides and lifting thewells straight up as a unit. Place the sealed microwells into a disposal bag and seal.

d. Clean the metal plate:

Rinse the plate with 1% (v/v) sodium hypochlorite - Alconox solution.

Rinse the plate with water.

Wrap the plate in clean paper towel and allow to completely dry prior to re-use.

24. When the run is complete, a printout of test results will be generated.

25. Move the plate carrier out of the stage, open the door and remove the plate. Close the door and return theplate stage to the inside of the instrument.

26. Remove sealed Amplification Microwells from plate. CAUTION: Do Not remove sealing material from themicrowells. The sealed microwells may be easily removed as a unit by holding the sealer at the top and bottomand lifting straight up and out of the plate. Place the sealed microwells into the disposal bag. Seal the bag.

27. Clean the metal plate:

Rinse the plate with 1% (v/v) sodium hypochlorite � Alconox solution.

Rinse the plate with water.

Wrap the plate in clean paper towel and allow to completely dry prior to re-use.

28. After the last run of the day, perform the following clean-up procedures:

a. Saturate paper towels or gauze pads with the 1% (v/v) sodium hypochlorite with Alconox solution and apply tocountertops and the exterior surfaces of the Priming and Warming Heater, 2 mL sample tube rack, water baths,centrifuge and the BD ProbeTec ET Instrument. Allow the solution to remain on surfaces for 2 � 3 min. Saturatepaper towels or gauze pads with water and remove cleaning solution. Change towels or gauze frequently whenapplying cleaning solution and when rinsing with water. Dampen paper towels or gauze pads with 1% (v/v)sodium hypochlorite with Alconox and wipe the pipettor handle (ONLY THE HANDLE). After 2 � 3 min wipe thehandle with paper towels or gauze pads dampened with water.

b. Immerse the water bath rack and plates in 1% (v/v) sodium hypochlorite with Alconox for 1 � 2 min. Rinsethoroughly with water and allow to air dry.

c. Recharge the Pipettor.

d. Dispose of sealed disposal bag and biohazard waste according to established procedures for the disposal ofcontaminated waste material.

29. At least weekly perform the following procedures:

a. Discard water in the water baths.

b. Clean the water baths with 1% (v/v) sodium hypochlorite with Alconox. Rinse with water and allow to dry.

c. Refill with distilled water.

Quality ControlQuality control requirements must be performed in accordance with applicable local, state and/or federal regulationsor accreditation requirements and your laboratory�s standard Quality Control procedures. It is recommended that theuser refer to pertinent CLSI (formerly NCCLS) guidance and CLIA regulations for appropriate Quality Control practices.

Respiratory and Media Diluent and Controls are provided together in the Respiratory and Media Diluent andControl Kit (CF/LP/MP). One positive and one negative control must be included for each assay run on a plate andfor each new reagent kit lot number. Controls may be randomly positioned. The positive control monitors forsubstantial reagent failure. The negative control monitors for reagent and/or environmental contamination. Thepositive and negative control must test as positive and negative, respectively, in order to report sample results. Ifthe controls do not perform as expected, the assay run is considered invalid and patient results will not be reportedby the instrument. If the run controls do not provide the expected results, repeat the entire run using a new set ofcontrols, new microwells and the processed specimens. If inadequate processed specimen remains for a repeat test,reprocess another aliquot of the primary specimen. If the repeated controls do not provide the expected results,contact Technical Services (see �Interpretation of Test Results�).

An Internal Amplification Control (IAC) is dried into the Priming Microwell. The IAC contains nucleic acid target thatis amplified in the presence of the sample matrix. The IAC is designed to confirm the validity of the amplificationreaction and to identify potential inhibition from the processed specimen.

Specimen Processing ControlsSpecimen processing controls may be tested in accordance with the requirements of appropriate accreditingorganizations. A positive control should test the entire assay system. For this purpose, known positive specimens canserve as controls by being processed and tested in conjunction with unknown specimens. Specimens used asprocessing controls must be stored, processed and tested according to the product insert. Specimen processingcontrols, which simulate lower respiratory specimens, can also be prepared as described below:

1. Remove a vial of freeze-dried L. pneumophila ATCC 33152 (Philadelphia-1) from storage at -20ºC or below.

2. Rehydrate with 1 mL of 0.85% (w/v) saline containing 0.2% (w/v) Bovine Albumin (Fraction V).

3. Dilute rehydrated L. pneumophila stock to 1:100,000 in 0.85% (w/v) saline containing 0.2% (w/v) Bovine Albumin(Fraction V).

4. Pipet 350 µL of diluted L. pneumophila into a snap-cap tube.

5. Process as described in Lower Respiratory Specimen Processing (Section D).

Monitoring for the Presence of DNA ContaminationAt least monthly, the following test procedures should be performed to monitor the work area and equipmentsurfaces for the presence of DNA contamination. Environmental monitoring is essential to detect contaminationprior to the development of a problem.

1. For each area* to be tested, use a BBL CultureSwab EZ swab.

2. Label a 2 mL screw-cap tube for each area to be tested. Pipette 600 µL of Respiratory and Media Diluent intoeach tube and add 300 µL QIAGEN buffer AE or molecular grade distilled water. Vortex for 5 s to mix.

3. Dip the first swab in the Diluent prepared in Step 2, and wipe the first area with a broad sweeping motion.

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4. Swirl the swab in the Diluent, express against the side of the tube. Recap the tube and vortex for 5 s. Discardthe swab.

5. Repeat the procedure for each area to be tested.

6. Place the tubes into a water bath rack and heat in a boiling water bath for 5 min. Remove rack from the boilingwater bath and allow the samples to cool 15 min at room temperature before continuing.

7. After cooling, centrifuge (16,000 x g) for approximately 5 s.

8. While the tubes are heating, use clean towels saturated with water to remove the buffer mixture residue fromthe tested surfaces.

9. Once samples have cooled, proceed with the Testing Procedure for the BD ProbeTec ET LP Assay (Section F).*Recommended areas to test include: Surfaces of water bath rack, microcentrifuge, Priming and Warming Heater,black microwell plates, pipettor handle, instrument touch keys, instrument keyboard, dry surfaces of water baths,surfaces of sample racks and the work benches including sample processing areas.

If an area gives a positive result, clean the area with fresh 1% (v/v) sodium hypochlorite with Alconox. Make surethe entire area is wetted by the cleaning solution and allow the cleaning solution to remain on the surface for atleast 2 min. or until dry. If necessary, remove excess cleaning solution with a clean towel. Wipe the area with a cleantowel saturated with water and allow the surface to dry. Retest the area. Repeat until negative results are obtained.If contamination does not resolve, contact Technical Services for additional information.

INTERPRETATION OF TEST RESULTS

The presence or absence of L. pneumophila DNA is determined by calculating the PAT scores (Passes After Threshold)for the specimen based on predetermined threshold values. The PAT score is a metric used to assess the magnitude ofsignal generated as a result of the reaction. For this metric, larger numbers indicate the threshold was achieved in theearly phases of amplification, while smaller numbers mean that the threshold was reached later in the course of thereaction. The magnitude of the PAT score is not indicative of the level of L. pneumophila DNA in the specimen.

If assay control results are not as expected, patient results should not be reported. See Quality Control section forexpected control values. Reported results are determined as follows:

a Repeat BD ProbeTec ET LP Assay from the processed sample tube. If insufficient volume remains from theprocessed sample, repeat from the original specimen. If the repeat result is positive or negative, interpret asdescribed above. If result repeats as indeterminate, a new specimen should be requested.

Determination of LP and IAC Threshold:

The threshold values for the L. pneumophila target DNA and the IAC were initially established using ReceiverOperator Characteristic curve analyses of data obtained from positive and negative controls. These threshold valueswere verified in clinical studies and with retrospective L. pneumophila-positive and -negative lower respiratoryspecimens. The threshold values were then validated in additional clinical studies.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE1. The BD ProbeTec ET LP Assay is specific for L. pneumophila serogroups 1-14 only. Other L. pneumophila serogroups

have not been tested.

2. The BD ProbeTec ET LP Assay will not detect infections caused by other Legionella species.

3. Performance characteristics for the BD ProbeTec ET LP Assay have only been established with sputum specimens.Performance with other specimen types has not been determined.

4. The BD ProbeTec ET LP Assay has only been evaluated with patients 13 years of age and older.

PAT ScoreLP Target IAC Target Result Interpretation Report

> 0 > or = 0 Positive L. pneumophila DNAdetected by SDA.

Positive for organismsbelonging to L. pneumophila serogroups1-14 suggesting currentinfection. Additional testingneeded to identify theserogroup, if required forepidemiological purposes.

= 0 > 0 Negative L. pneumophila DNA notdetected by SDA.

Presumed negative for L. pneumophila serogroups1-14, suggesting no recent orcurrent infection. Infectiondue to Legionella cannot beruled out because: 1) serogroups other than 1-14 and other Legionellaspecies may cause diseaseand, 2) the level of DNApresent may be below thedetection limit of the test.

= 0 = 0 Indeterminate Amplification controlinhibited. Additional testingrequired for resultinterpretation.a

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5. As with many diagnostic tests, results from the BD ProbeTec ET LP Assay should be interpreted in conjunctionwith other laboratory and clinical data available to the physician.

6. A negative test result does not exclude the possibility of infection because test results may be affected by improperspecimen collection, technical error, specimen mix-up, concurrent antibiotic therapy or the presence of a quantityof L. pneumophila DNA in the specimen that is below the analytical sensitivity of the test.

7. The BD ProbeTec ET LP Assay cannot be used to assess therapeutic success or failure because nucleic acids from L. pneumophila may persist following antimicrobial therapy.

8. The BD ProbeTec ET LP Assay has not been evaluated with environmental samples (e.g., potable water, or waterquality testing).

9. Optimal performance of this assay requires adequate specimen collection and handling.10. The use of the BD ProbeTec ET LP Assay is limited to those personnel who have been trained in the assay procedure

and the BD ProbeTec ET System.11. The BD ProbeTec ET LP Assay provides qualitative results. No correlation can be drawn between the magnitude

of the PAT score and the amount of L. pneumophila DNA in a sample.

EXPECTED RESULTS

A. Prevalence The rate of positivity observed in L. pneumophila testing will vary, depending on test method utilized, age of thepatient, presence of underlying risk factors, geographic location, and most importantly, local disease prevalence,including possible outbreak situations.

B. PAT Score Frequency DistributionA total of 83 retrospective sputum specimens were collected from four clinical sites within the U.S., Europe and Canadaand tested with the BD ProbeTec ET LP Assay. A frequency distribution of the LP PAT Scores compared to culture isshown in Figure 1.

Figure 1: LP PAT Score Frequency Distribution Compared to Culture

C. ControlsDuring the clinical evaluation, control failures for the BD ProbeTec ET LP Assay were observed in one out of 46runs (i.e., one run had a procedural error). The LP PAT scores for the remaining 45 runs are summarized in Table 1.

Table 1: LP PAT Score Distribution for Respiratory and Media Controls

PERFORMANCE CHARACTERISTICS

Prospective StudyThe BD ProbeTec ET LP Assay was evaluated prospectively at seven clinical centers within the United States andCanada during the 2002�2003 respiratory season. A sputum specimen and a urine specimen were collected fromeach patient. Sputum specimens were tested using the BD ProbeTec ET LP Assay, Legionella culture, and a DirectFluorescent Antibody assay (DFA). Urine specimens were tested using a commercially available L. pneumophilaurinary antigen assay.A total of 118 patients met the criteria for inclusion in the study (i.e., radiographic evidence of pneumonia, patients≥ 13 years of age, on antibiotics ≤ 14 days, valid specimen types collected, appropriate reference methods conducted,etc.). From the 118 patients, there were 114 valid BD ProbeTec ET LP Assay results. Results of the sputum specimenswere compared to the sputum culture result to estimate performance characteristics. A specimen was consideredpositive if the culture result was positive. A result was considered negative if the culture result was negative.All initial indeterminate results were to be repeated from the processed specimen or from the original specimen (ifinsufficient processed specimen was available). A specimen that gave an initial and repeat (i.e., final) indeterminate result

Control N Range 5th Percentile Mean Median 95th Percentile

LP Negative 45 0 � 0 0 0 0 0

LP Positive 45 29.4 � 50.7 40.1 46.7 47.6 49.7

Culture Result 0 1 � 19 20 � 39 40 � 60 Total

Negative

Positive

52 0 4 4

2 0 2 19

60

23

Total 54 0 6 23 83

04 42 0 2

19

0

10

20

30

40

50

60

0 1 - 19 20 - 39 40 - 60

LP PAT Score

Freq

uen

cy

Culture -

Culture +

(-) (+)

52

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was not included in the performance characteristics. A specimen that gave an initial indeterminate result and repeatedas positive or negative was included in the performance characteristics. A specimen that gave an initial indeterminateresult and could not be repeated due to insufficient specimen volume remained an "initial indeterminate" result and wasnot included in the performance characteristics.The BD ProbeTec ET LP Assay results from sputum specimens compared to those of culture are summarized in Table 2.

Table 2: BD ProbeTec ET LP Assay - Prospective Sputum Results Compared to Culture

a Of the 114 culture-negative specimens, all were Direct Fluorescent Antibody (DFA) negative. Eighty-seven of the 114patients were also tested with a urinary antigen assay and found to be negative.

b One specimen repeated negative and was included in the specificity calculation. One specimen had insufficientvolume for retesting.

c Two specimens remained indeterminate on repeat testing. One specimen had insufficient volume for repeat testing.NA = Not Applicable

Retrospective StudyThe BD ProbeTec ET LP Assay was also evaluated with 83 retrospective sputum specimens acquired from clinicalsites within the United States, Europe, and Canada. The retrospective specimens were stored frozen for up to sixyears, with the majority of specimens (65.1%; 54/83) stored for less than two years.Each site recorded the original culture result for each retrospective specimen. Each site tested the sputum specimens inthe BD ProbeTec ET LP Assay and compared the results to the culture result. A specimen was considered positive if theculture result was positive. A specimen was considered negative if the culture result was negative. The BD ProbeTec ETLP Assay results from the retrospective sputum specimens compared to those of culture are summarized in Table 3.

Table 3: BD ProbeTec ET LP Assay - Retrospective Sputum Results Compared to Culture

a Eight specimens were culture-negative, BD ProbeTec ET LP Assay-positive. All eight specimens were positive by aurinary antigen assay. PCR testing was performed on six of the eight specimens; all six specimens were positive by PCR.

b Two specimens were culture-positive, BD ProbeTec ET LP Assay-negative. Both specimens were negative by a urinaryantigen assay. PCR testing was performed on both specimens; one specimen was positive by PCR.

c The 23 culture-positive specimens were distributed among the following serogroups: 47.8% (11/23) Serogroup 1;17.4% (4/23) Serogroup 3; 13.0% (3/23) Serogroup 4; 4.3% (1/23) Serogroup 5; 4.3% (1/23) Serogroup 6 and 13%(3/23) Serogroup information not available.

NA = Not ApplicableNOTE: The PCR method used to test discordant culture and BD ProbeTec ET LP Assay results was not an FDA-cleared method.

Culture Percent Agreement Estimates (95%CI)

Site LP Result Positive Negative Total Positive Negative Overall

6 Positive 1 0 1

Negative 0 0 0

Total 1 0 1 100% (1/1)(2.5% � 100%) NA 100% (1/1)

(2.5% � 100%)

8 Positive 16 5 21

Negative 1 24 25

Total 17 29 46 94.1%(16/17)(71.3% � 99.9%)

82.8% (24/29)(64.2% � 94.2%)

87% (40/46)(73.7% � 95.1%)

9 Positive 1 3 4

Negative 0 22 22

Total 1 25 26 100% (1/1)(2.5% � 100%)

88% (22/25)(68.8% � 97.5%)

88.5% (23/26)(69.8% � 97.6%)

10 Positive 3 0 3

Negative 1 6 7

Total 4 6 10 75% (3/4)(19.4% � 99.4%)

100% (6/6)(54.1% � 100%)

90% (9/10)(55.5% � 99.7%)

Overall Positive 21 8a 29

Negative 2b 52 54

Total 23c 60 83 91.3% (21/23)(72% � 98.9%)

86.7% (52/60)(75.4% � 94.1%)

88% (73/83)(79% � 94.1%)

vs. Culture

SiteSensitivity(95% CI) Specificity (95% CI)

IndeterminateInitial/Final

1 NA 100% (17/17)(80.5% � 100%) 0/0

2 NA100% (2/2)

(15.8% � 100%)0/0

3 NA 100% (31/31)(88.8% � 100%) 0/0

6 NA 100% (33/33)(89.4% � 100%) 2/0b

7 NA100% (31/31)

(88.8% � 100%)3/2c

Overall NA 100% (114/114)a

(96.8% � 100%)5/2

9

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Analytical StudiesThe BD ProbeTec ET LP Assay amplification reaction volume is 100 µL of processed sample.

Analytical SensitivityThe analytical sensitivity of the BD ProbeTec ET LP Assay across 14 different serogroups of L. pneumophila wasdetermined by diluting bacterial suspensions to levels of 0, 150, 300 and 450 colony-forming units (CFU) per reaction.Samples were processed and assayed in triplicate. Based on 100% positivity, the analytical sensitivity for serogroups2 � 10 and 12 was 150 CFU/reaction; the actual Limit of Detection (LOD), however, may be less than the lowest leveltested. Based on 100% positivity, the analytical sensitivity for serogroups 1 and 11 was 300 CFU/reaction; serogroup13 was 450 CFU/reaction; and serogroup 14 was 700 CFU/reaction. The analytical sensitivity of the BD ProbeTec ET LP Assay in the presence of a lower respiratory specimen matrixwas determined by spiking a macrophage-infected stock of L. pneumophila serogroup 1 into sputum at levels of 0,150, 300 and 450 CFU per reaction. The specimens were processed and assayed in triplicate. Based on 100%positivity, the analytical sensitivity for spiked lower respiratory specimens was 150 CFU/reaction; the actual LOD,however, may be less than the lowest level tested.

Analytical SpecificityA total of 79 microorganisms (69 bacteria, one yeast and nine viruses) were evaluated using the BD ProbeTec ETLP assay. Bacterial isolates were tested at concentrations ranging from 1 x 106 CFU/mL to 1 x 108 CFU/mL. Viruseswere tested at a concentration of 1 x 106 viral particles/mL. Coccidioides immitis was prepared as a mycelialsuspension equivalent to a McFarland Standard of 5. None of the microorganisms tested produced a positive resultor inhibited the IAC (Table 4).

Table 4: BD ProbeTec ET LP Assay � Analytical Specificity

Interfering SubstancesPotential interfering substances, which may be encountered in lower respiratory specimens, were tested with theBD ProbeTec ET LP Assay in the absence of target or in the presence of 750 CFU/reaction of L. pneumophila. In theabsence of target, none of the substances tested produced a positive result or inhibited the IAC at the concentrationslisted in Table 5. When target was in the presence of the substances at the concentrations listed in Table 5, all samplestested produced a positive result.

Table 5: BD ProbeTec ET LP Assay � Substances Screened for Interference

Lower Respiratory SpecimensSubstances Tested Concentration

Whole Blood (heparin) 2.65%

Lidocaine 2% 0.21%

Sputum Induction Solution (3% NaCl) 0.32%

Azithromycin 0.42 µg/mL

Penicillin G 17 µg/mL

Tetracycline 2.3 µg/mL

Doxycycline 26.5 µg/mL

Ciprofloxacin 4.88 µg/mL

Mycoplasma pneumoniae 5 x 106 cells/mL

Chlamydophila pneumoniae 1.06 x 107 EBs/mL

Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophilapneumoniae 1.06 x 107 cells/mL and 1.06 x 107 EBs/mL, respectively

AcinetobactercalcoaceticusActinomyces israeliiAdenovirus-5Aeromonas hydrophilaBlastomyces dermatitidisBordetellabronchisepticaBordetella parapertussisBordetella pertussisBranhamella catarrhalisCandida albicansChlamydia trachomatis,sero L2Chlamydophilapneumoniae, AR-39Citrobacter freundiiCoccidioides immitisCorynebacteriumdiphtheriaeCorynebacteriumjeikeiumCryptococcusneoformansCytomegalovirusEikenella corrodens

Enterobacter aerogenesEnterobacter cloacaeEnterococcus faecalisEnterococcus faeciumEnterovirus (Echovirus)Escherichia coliFusobacteriumnucleatumHaemophilus influenzaeHaemophilusparainfluenzaeHerpes simplex virus-1Histoplasma capsulatumInfluenza virus AInfluenza virus BKingella kingaeKlebsiella pneumoniaesubsp. ozaenae type 4Klebsiella pneumoniaesubsp. pneumoniaeLactobacillus acidophilusLegionella anisaLegionella bozemaniiLegionella cherriiLegionellacincinnatiensis

Legionella dumoffiiLegionella erythaLegionella fairfieldensisLegionella feeleiiLegionella gormaniiLegionella hackeliaeLegionella jordanisLegionella longbeachaeLegionella maceacherniiLegionella oakridgensisLegionella sainthelensiLegionella spiritensisLegionella worsleiensisMoraxella osloensisMycobacteriumtuberculosisMycoplasmapneumoniaeNeisseria gonorrhoeaeNeisseria meningitidisNeisseria mucosaParainfluenza I virusPeptostreptococcusanaerobiusPorphyromonasasaccharolytica

Prevotella oralisPseudomonasaeruginosaRespiratory Syncytialvirus, Long strainRhinovirusSalmonella choleraesuisserotype EnteritidisSalmonella choleraesuisserotype TyphiSerratia marcescensStaphylococcus aureus,protein A-producingStaphylococcus aureus,non-protein A-producingStaphylococcusepidermidisStenotrophomonasmaltophiliaStreptococcus Group BStreptococcus mutansStreptococcuspneumoniaeStreptococcus pyogenesTatlockia (Legionella)micdadeiVeillonella parvula

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ReproducibilityReproducibility of the BD ProbeTec ET LP Assay was assessed at three laboratories by testing a panel consisting of 24 samples spiked in PBS/BSA. The panel comprised 12 samples that were negative for L. pneumophila; three low(300 CFU/reaction) and three high (500 CFU/reaction) positive samples of L. pneumophila; and three low (30 Elementary Bodies (EB)/reaction, 300 CFU/reaction, 900 cells/reaction, respectively) and three high (50 EB/reaction,500 CFU/reaction, 1500 cells/ reaction, respectively) positive samples each containing Chlamydophila pneumoniae (CP),L. pneumophila (LP), and Mycoplasma pneumoniae (MP). One operator per site tested the panels once a day over threedays. Results are summarized in Table 6.

Table 6: Lower Respiratory Reproducibility Estimates by Sample Level

a One sample excluded from the analysis due to a procedural error.

AVAILABILITYThe following BD ProbeTec� ET products are available:

Cat. No. Description440728 BD ProbeTec� ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay

440731 BD ProbeTec� ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit

440457 BD ProbeTec� ET Accessories Kit (10 Primer Covers, 16 Amplification Sealers 1/2 and 8 Disposal Bags )

440458 BD ProbeTec� ET Pipette Tips 6 x 120

440661 BD ProbeTec� ET 2 mL Sample Tubes and Caps, 200 ea

440679 BD ProbeTec� ET 2 mL Caps, 100

440477 BD ProbeTec� ET Instrument, Ex-U.S.

440478 BD ProbeTec� ET Instrument, U.S. and Canada

440479 BD ProbeTec� ET Priming and Warming Heater, 220V

440480 BD ProbeTec� ET Priming and Warming Heater, 120V

440487 BD ProbeTec� ET Pipettor

440502 BD ProbeTec� ET Lysing Rack

REFERENCES1. Cloud J.L., Carroll K.C., Pixton P., Erall M., Hillyard D.R. (2000) Detection of Legionella species in respiratory

specimens using PCR with sequencing confirmation. J Clin Micro 38:1709-1712

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3. Bartlett, J.G., Dowell, S.F., Mandell, L.A., File, T.M., Musher, D.M., Fine, M.J. 2000. Guidelines from the InfectiousDiseases Society of America - Practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia inadults. Clin.Infect. Dis. 31:347-82.

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7. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection ofworkers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within themeaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.

8. Van der Zee, A., Peeters, M., de Jong, C., Verbakel, H., 2002. QIAGEN DNA extraction kits for sample preparationfor Legionella PCR are not suitable for diagnostic purposes. J. Clin. Microbiol. 40 (3): 1126.

9. Evans, G.E. et al. 2003. Contamination of QIAGEN DNA extraction kits with Legionella DNA. J. Clin. Microbiol.41 (7): 3452-3453.

10. Isenberg, H.D. (ed.) 1992. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol. 1. American Society for Microbiology,Washington, D.C.

Between DayWithin Site Between Site

Panel Member N % Correct Mean PAT SD % CV SD % CV

LP-HIGH 27 100.0% 47.2 0.94 2.00 1.42 3.02LP-LOW 27 100.0% 44.8 0.44 0.98 2.06 4.59CP/LP/MP-HIGH 27 100.0% 46.2 1.13 2.45 1.79 3.88

CP/LP/MP-LOW 26a 100.0% 43.0 0.00 0.00 2.59 6.01Negative 108 100.0% 0.0 � � � �

IAC with LP-negative samples 108 100.0% 47.8 0.43 0.91 0.34 0.70

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!ProbeTec ET Legionella pneumophila(LP) Amplified DNA Assay

Français

APPLICATIONLe test BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay (test BD ProbeTec ET pour le dosaged'ADN amplifié de la famille Legionella pneumophila), à utiliser avec le système BD ProbeTec ET, fait appel à latechnologie d'amplification par déplacement de brin (SDA) comme méthode de détection qualitative directe d'ADNde Legionella pneumophila (sérogroupes 1 à 14) dans les échantillons d'expectoration provenant de patientssuspectés d'être atteints cliniquement de pneumonie. Il s'utilise pour aider au diagnostic présomptif de la maladiedes légionnaires en association avec la mise en culture et d'autres méthodes.

RESUME ET EXPLICATIONLa maladie des légionnaires peut être contractée par l�inhalation d�aérosols contenant de la Legionella ou par micro-aspiration d�eau contaminée. Dans des études européennes et nord-américaines, la Legionella a été rapportéecomme responsable de 2 à 15 % des cas de pneumonie d�origine extra-hospitalière nécessitant une hospitalisation.Le taux de mortalité pour des patients atteints de légionnellose est compris entre 5 et 30 % et le risque de décès estplus élevé chez les personnes âgées ou immunocompromises.1 Quarante espèces de Legionella ont été identifiées etla moitié d�entre elles sont associées à la forme humaine de la maladie. La Legionella pneumophila provoque 90 %des cas de légionellose diagnostiqués. Bien que quatorze sérogroupes de L. pneumophila soient connus, 80 % desinfections à la L. pneumophila sont provoquées par le sérogroupe 1.2

L�importance de l�établissement du diagnostic de la pneumonie et de son étiologie est accrue par l�inquiétudegrandissante concernant l�usage abusif d�antibiotiques. Les résultats des tests diagnostiques de L. pneumophiladoivent être rapidement mis à la disposition du clinicien car il a été démontré que le taux de mortalité augmentesi la mise en place de la thérapie appropriée est retardée. Avec les méthodes de culture traditionnelles, deux joursau minimum sont nécessaires pour développer des microorganismes Legionella à partir d�échantillonsd�expectoration positifs et sept à dix jours pour finaliser un résultat négatif. Outre la culture d�échantillonsd�expectoration, le diagnostic est complété par la détection d�antigène de L. pneumophila du sérogroupe 1 dansles échantillons urinaires pour laquelle des trousses d�immunoenzymologie sont disponibles sur le marché.3Cependant, les test diagnostiques des infections par Legionella donnant des résultats rapides avec une bonnesensibilité et spécificité restent limités.

PRINCIPES DE LA METHODELe test BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay repose sur l�amplification et la détectionsimultanées de l�ADN cible à l�aide d�amorces d�amplification et d�une sonde de détection couplée à un marqueurfluorescent. Les réactifs SDA desséchés sont contenus dans deux micropuits distincts jetables. L�échantillon traité estajouté au micropuit d�amorçage, qui contient les amorces d�amplification, la sonde de détection couplée à unmarqueur fluorescent et d�autres réactifs nécessaires à l�amplification. Les amorces amplifient une région de 68 pairesde base du gène mip (macrophage infectivity potentiator) de L. pneumophila, conservée sur l'ensemble dessérogroupes de l'espèce. A l�issue de l�incubation, le mélange réactionnel est transféré dans le micropuitsd�amplification, lequel contient deux enzymes (une ADN polymérase et une endonucléase de restriction) nécessairesau SDA. Les micropuits d�amplification sont scellés avec une bande d�étanchéité pour empêcher la contamination, puisincubés dans un lecteur de fluorescence thermorégulé qui évalue la génération de produits amplifiés dans chaqueréaction. Chaque réaction co-amplifie et détecte un témoin d�amplification interne (TAI) ce qui permet de vérifier queles conditions sont adaptées à l�amplification et de diminuer le risque de résultat négatif erroné provoqué par laprésence d�inhibiteurs de test. La présence ou l�absence d�ADN de L. pneumophila est déterminée en calculant lesscores PAT (Passes After Threshold - dépassements de seuil) de l�échantillon à l�aide de valeurs de seuil prédéterminées.L�instrument rapporte automatiquement l�un des résultats suivants : positif, négatif ou indéterminé.

REACTIFS ET MATERIELSChaque trousse de réactifs de BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay contient :

Micropuits d�amorçage de Legionella pneumophila (LP), (1x24)

6 oligonucléotides ≥ 7,5 pmole, dNTPs ≥ 15,2 nmole, 2 sondes de détection ≥ 22,5 pmole,

Oligonucléotide de synthèse ≥ 1500 exemplaires

Micropuits d�amplification de Legionella pneumophila (LP), (1x24)

Enzyme de restriction : ≥ 33 UI, ADN polymérase ≥ 14 UI

10 couvercles d�amorçage, 16 bandes d�étanchéité pour l�amplification (1/2), 8 sacs à déchets

Trousse de contrôle et diluant de milieu et respiratoire BD ProbeTec ET (CF*/LP/MP**) :

Contenu : Diluant respiratoire et de milieu : bicine, phosphate de potassium, hydroxyde de potassium, DMSO etProclin, 10 témoins positifs (CF/LP/MP) : ≥ 1050 ng d'ADN de sperme de saumon, ≥ 47,3 µg de Tris, ≥ 9,0 µg d'EDTA,≥ 3600 copies du plasmide CF, ≥ 4800 copies du plasmide LP, ≥ 5400 copies du plasmide MP ; 10 témoins négatifs(CF/LP/MP) : ≥ 1050 ng d'ADN de sperme de saumon, ≥ 47,3 µg de Tris, ≥ 9,0 µg d'EDTA; 100 tubes 2 mL à bouchon-pression

* Fait référence au test BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay

** Fait référence au test BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay

Instruments, matériel et consommables : Instrument et plaque pour instrument BD ProbeTec ET, bloc chauffantde lyse BD ProbeTec ET, bloc chauffant d�amorçage et de préchauffage BD ProbeTec ET, multipipette BD ProbeTecET, portoir et source d�alimentation, portoir de tubes échantillons 2 mL, jeu d�accessoires BD ProbeTec ET, cônes depipette BD ProbeTec ET.

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Matériaux requis mais non fournis : Hotte biologique de securité de Classe II, agitateur à vortex, -20 °C et/ou-70 °C (ou inférieure) congélateur cyclique sans auto-dégivrage, microcentrifugeuse à 16 000 x g, bains-marie,thermomètre numérique, portoir de bain-marie à couvercle à vis, autres portoirs de tubes appropriés, mini-trousses d�ADN fécal QIAGEN QIAamp, 96 � 100 % Ethanol, écouvillons BBL CultureSwab EZ, tubes échantillonde 2 mL et bouchons BD ProbeTec ET, gants jetables, indicateurs résistants à l�alcool, micropipettes pouvantdistribuer des volumes de 25 à 1000 µL, cônes de pipettes résistants aux aérosols, eau distillée, L. pneumophilaATCC 33152 (Philadelphia-1), albumine bovine (Fraction V) 0,2 % (P/v) dans du sérum physiologique à 0,85 %(p/v), 1 % (v/v) hypochlorite de sodium contenant de l�Alconox.*

* Dissoudre 7,5 g d�Alconox dans 1 L d�une solution d�hypochlorite de sodium à 1 % (v/v) et mélanger. Préparerune nouvelle solution chaque jour.

Impératifs de manipulation et de conservation : Les trousses de réactifs BD ProbeTec ET LP sont conservées àune température comprise entre 2 et 33 °C. Ne pas utiliser les trousses de réactifs non-entamées au-delà de la datede péremption. Une fois qu�un sachet est ouvert, les micropuits restent stables pendant 12 semaines si le sachet estcorrectement refermé ou jusqu�à la date de péremption, la première condition remplie prévalant. Ne pas congeler.

La trousse de contrôle et le diluant de milieu et respiratoire BD ProbeTec ET (CF/LP/MP) peuvent être conservés à unetempérature comprise entre 2 et 33 °C. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de la date de péremption. Ne pas congeler.

Avertissements et précautionsRéservé au diagnostic in vitro.

1. Des microorganismes pathogènes, notamment les virus de l�hépatite et de l�immunodéficience humaine, sontsusceptibles d�être présents dans les échantillons cliniques. Respecter les « Précautions standard »4-7 et lesconsignes en vigueur dans l�établissement pour manipuler tout objet contaminé avec du sang ou d�autresliquides organiques.

2. Accomplir les étapes de manipulation et de traitement de l�échantillon des voies respiratoires inférieuresjusqu�à l�étape d�incubation à 70 °C dans un laboratoire de sécurité biologique de classe II.

3. Pendant l�étape d�incubation à 70 °C, utiliser un portoir de bain-marie avec un couvercle à vis pour garantir unmeilleur confinement des échantillons des voies respiratoires potentiellement nocifs à l�organisme.

4. Le diluant de milieu et respiratoire BD ProbeTec ET contient du diméthylsulfoxyde (DMSO). Le diméthyl-sulfoxyde est nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Eviter le contact avec les yeux ettoujours porter des gants de protection pendant les procédures de manipulation. En cas de contact avec lesyeux, laver immédiatement à grande eau et consulter un médecin. Eviter tout contact avec la peau ; en cas deprojection accidentelle, laver immédiatement à grande eau.

5. Consulter le manuel de la mini-trousse d�ADN fécal QIAamp pour les informations de sécurité concernant lesréactifs QIAGEN utilisés par cette méthode. Ne pas placer les réactifs QIAGEN dans des solutions d�hypochlorite.Ne pas exposer les réactifs QIAGEN à l�hypochlorite.

6. Certains rapports ont suggéré que les trousses d�extraction QIAGEN DNA ne sont pas adaptées à la polymérisationen chaîne (PCR) de Legionella car les réactifs sont susceptibles d�être contaminés par l�ADN de Legionella.8,9 Bienque ce risque soit faible et que des Legionella spp. autres que L. pneumophila aient été identifiées dans ces études,l�utilisateur doit vérifier la performance de chaque nouveau lot de réactifs QIAGEN avant leur utilisation sur deséchantillons cliniques.

7. Même s�il n�est pas nécessaire de disposer de postes de travail dédiés, car la conception de BD ProbeTec ET réduitla possibilité de contamination par le produit d�amplification dans l�environnement de travail, d�autresprécautions s�imposent pour éviter la contamination, en particulier pour éviter la contamination des échantillonsau cours du traitement.

8. Les sachets de réactifs contenant des micropuits d�amorçage et des micropuits d�amplification non utilisésDOIVENT être refermés soigneusement après ouverture. Vérifier la présence du dessiccatif avant de refermerles sachets de réactifs.

9. La plaque contenant les micropuits d�amplification DOIT être convenablement scellée avec la bande d�étanchéitéd�amplification avant son transfert du bloc chauffant d�amorçage et de préchauffage BD ProbeTec ET jusqu�àl�instrument BD ProbeTec ET. La bande d�étanchéité garantit un milieu réactionnel clos pour l�amplification etla détection. Elle est indispensable pour éviter la contamination de l�instrument et de la paillasse par des produitsd�amplification. Ne retirer à aucun moment les bandes d�étanchéité placées sur les micropuits.

10. Les micropuits d�amorçage contenant du liquide résiduel (après transfert du liquide des micropuits d�amorçagedans les micropuits d�amplification) représentent une source de contamination cible. Sceller soigneusement lesmicropuits d�amorçage avec la bande d�étanchéité avant de les jeter.

11. Pour empêcher la contamination de la paillasse par des produits d�amplification, utiliser les sachets à déchetsfournis avec les jeux de réactifs pour éliminer les micropuits d�amplification analysés. Vérifier que les sachetssont convenablement fermés avant de les éliminer.

12. CHANGER DE GANTS aux endroits indiqués lors du traitement des échantillons et de la procédure de test pouréviter toute contamination croisée des échantillons. Si les gants entrent en contact avec un échantillon, enchanger immédiatement pour éviter de contaminer d�autres échantillons.

13. En cas de contamination de la paillasse ou du matériel avec les échantillons ou les témoins, nettoyer complètementla zone contaminée avec une solution d�hypochlorite de sodium à 1 % (v/v) contenant de l�Alconox et rincersoigneusement à l�eau. Laisser sécher complètement la surface avant de procéder à d�autres tests. Avant denettoyer les réactifs de traitement des échantillons QIAGEN, essuyer les zones concernées avec de l�eau, puisutiliser une solution d�hypochlorite de sodium à 1 % (v/v) contenant de l�Alconox.

14. Utiliser exclusivement la multipipette BD ProbeTec ET et les cônes de pipette BD ProbeTec ET pour transférerles échantillons traités dans les micropuits d�amorçage puis dans les micropuits d�amplification.

15. Suivre les procédures de laboratoire homologuées pour éliminer les cônes de pipette usagés, les tubeséchantillon, les micropuits d�amorçage et les autres consommables. Eliminer les consommables avec prudence.Fermer et éliminer les récipients à déchets lorsqu�ils sont pleins au 3/4 ou quotidiennement (la premièrecondition remplie prévalant).

16. Ne pas échanger ou mélanger les micropuits, les témoins ou les réactifs de traitement avec ceux de troussesportant des numéros de lot différents.

17. Contacter le service technique en cas de situation inhabituelle, comme un déversement dans l�instrumentBD ProbeTec ET ou une contamination par de l�ADN impossible à éliminer par nettoyage.

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PRÉLÈVEMENT ET TRANSPORT DES ÉCHANTILLONS1. Prélèvement et transport des échantillons

a. Prélever les échantillons conformément aux recommandations du Clinical Microbiology Procedures Handbook10

ou du manuel de procédures utilisé dans le laboratoire.2. Conservation et transport des échantillons

� Les échantillons peuvent être conservés/transportés à une température comprise entre 18 � 33 °Cpendant une durée ne pas dépassant 6 h.

� Les échantillons peuvent être réfrigérés à une température comprise entre 2 � 8 °C pendant une duréene dépassant pas 3 jours.

� Les échantillons peuvent être conservés à une température inférieure ou égale à -20 °C pendant unedurée ne dépassant pas 14 semaines.

MODE OPERATOIRE DU TESTConsulter le manuel d�utilisation du système BD ProbeTec ET pour connaître les instructions détaillées de fonctionnementet de maintenance des éléments du système.

A. Préparation des instruments :1. Mettre les instruments sous tension et les laisser préchauffer avant de débuter le test.

a. Il faut environ 90 min au bloc chauffant d�amorçage et de préchauffage pour parvenir à la températureadéquate et s�y stabiliser.Le point de consigne statique de l�élément d�amorçage du bloc chauffant d�amorçage et de préchauffageest de 72,5 °C.Le point de consigne statique de l�élément de préchauffage du bloc chauffant d�amorçage et de préchauffageest de 54 °C.

b. L�instrument BD ProbeTec ET est commandé par ordinateur et nécessite environ 30 min de préchauffage.2. Contrôler la température des blocs chauffants avant de débuter le test. Enregistrer les températures dans le BD

ProbeTec ET System Maintenance Log (journal de maintenance du système BD ProbeTec ET).a. Bloc chauffant d�amorçage et de préchauffage

Le thermomètre du bloc chauffant d�amorçage doit indiquer une température comprise entre 72 � 73 °C.Le thermomètre du bloc de préchauffage doit indiquer une température comprise entre 53,5 � 54,5 °C.

3. Contrôler la température affichée sur l�écran du BD ProbeTec ET. La température doit être comprise entre 47,5et 55,0 °C. Enregistrer les températures dans le BD ProbeTec ET System Maintenance Log (journal demaintenance du système BD ProbeTec ET).

B. Multipipette :Consulter le manuel d�utilisation du système BD ProbeTec ET pour plus d�informations sur les fonctions du clavierde la multipipette BD ProbeTec ET. De plus, la multipipette BD ProbeTec ET doit être nettoyée après chaqueutilisation. Consulter l�équipe du service technique pour bénéficier d�assistance lors des opérations de nettoyage etde maintenance de la multipipette BD ProbeTec ET.Les programmes suivants sont nécessaires pour réaliser le test BD ProbeTec ET LP. Le programme 1 transfère leliquide des échantillons traités vers les micropuits d�amorçage LP. Le programme 5 transfère le liquide des micropuitsd�amorçage LP dans les micropuits d�amplification LP. Programmer la multipipette comme suit :

Programme 1 : 1. Mettre la multipipette sous tension (ON). La multipipette émet un bip, fait clignoter « ZERO » puis le numéro

de version du logiciel et émet de nouveau un bip.2. Appuyer sur la touche « Prog » (Programme) bleue. Pour sélectionner le programme 1, appuyer sur la touche

« Vol » (Volume) jusqu�à ce que le chiffre « 1 » s�affiche. Appuyer sur « Enter ».3. Pour entrer dans le mode de programmation, maintenir enfoncée la touche « Prog ». Tout en gardant la

touche « Prog » enfoncée, appuyer sur la touche de fonction spéciale à l�aide d�un cône de pipette ou del�extrémité d�un trombone.

4. Appuyer sur « Fill » (Remplir). Appuyer sur la flèche dirigée vers le haut jusqu�à ce que 200 s�affiche. Appuyersur « Enter ».

5. Appuyer sur « Disp » (Distribuer). Appuyer sur la flèche dirigée vers le haut jusqu�à ce que 150 s�affiche.Appuyer sur « Enter ».

6. Appuyer une seconde fois sur « Enter » pour enregistrer le programme et quitter. Un bip retentit pourindiquer que la programmation est terminée.

7. Vérifier le programme en appuyant sur la gâchette de pipetage pour progresser au fil des étapes. A chaqueétape, définir la vitesse d�aspiration/ distribution à l�aide de la touche « Vol ». L�indicateur de vitesse apparaîtà chaque étape. Utiliser la touche « Vol » pour ajuster l�indicateur de vitesse afin de faire apparaître 2 carrésaux étapes « Fill » et « Disp ».

Programme 51. Appuyer sur la touche « Prog ». Pour sélectionner le programme 5, appuyer sur la touche « Vol » jusqu�à ce

que le chiffre « 5 » s�affiche. Appuyer sur « Enter ».2. Pour entrer dans le mode de programmation, maintenir enfoncée la touche « Prog » (Programme). Tout en

gardant la touche « Prog » enfoncée, appuyer sur la touche de fonction spéciale à l�aide d�un cône de pipetteou de l�extrémité d�un trombone.

3. Appuyer sur « Fill » (Remplir). Appuyer sur la flèche dirigée vers le haut jusqu�à ce que 100 s�affiche. Appuyersur « Enter ».

4. Appuyer sur « Disp » (Distribuer). Appuyer sur la flèche dirigée vers le haut jusqu�à ce que 100 s�affiche.Appuyer sur « Enter ».

5. Appuyer sur « Mix » (Mélanger). Appuyer sur la flèche dirigée vers le haut jusqu�à ce que 50 s�affiche. Appuyersur « Enter ».

6. Appuyer une seconde fois sur « Enter » pour enregistrer le programme et quitter. Un bip retentit pourindiquer que la programmation est terminée.

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7. Vérifier le programme en appuyant sur la gâchette de pipetage pour progresser au fil des étapes. A chaqueétape, définir la vitesse d�aspiration/distribution/mélange à l�aide de la touche « Vol ». L�indicateur de vitesseapparaît à chaque étape. Utiliser la touche « Vol » pour ajuster l�indicateur de vitesse afin de faire apparaître2 carrés pour les fonctions d�aspiration et de distribution. Utiliser la touche « Vol » pour ajuster la vitesse demélange afin de faire apparaître 3 carrés.

Contrôle des programmesContrôler les programmes avant de lancer la procédure. Pour cela, mettre la multipipette sous tension (ON).Appuyer sur la touche « Prog » (Programme) bleue. Appuyer sur la touche « Vol » (Volume) jusqu�à ce que lenuméro de programme approprié (1 ou 5) s�affiche. Appuyer sur la touche « Enter ». Utiliser la gâchette depipetage pour progresser au fil des étapes du programme.

Programme 1 : Ce programme aspire 200 µL et distribue 150 µL dans le micropuit LP. L�écran de la multipipettedoit indiquer :

Fill 200 µL � SII

Dispense 150 µL � SII

Programme 5 : Ce programme aspire 100 µL, distribue 100 µL et mélange 50 µL trois fois. L�écran de la multipipettedoit indiquer :



Mix 50 µL � SIII

Zero (clignote)

C. Configuration de plaque :Le rapport de configuration de la plaque est créé par l�instrument BD ProbeTec ET une fois que le type de test,l�identification de l�échantillon, les numéros de lots des témoins et les numéros de lots des trousses ont été entrésdans le système. Le rapport de configuration indique la disposition physique des échantillons et des témoins dechaque plaque à tester. Cette orientation est utilisée à la fois pour la plaque des micropuits d�amorçage et la plaquedes micropuits d�amplification. Pour le test LP, les micropuits d�amorçage sont des barrettes de micropuits gris uni.Les micropuits d�amplification sont des barrettes de micropuits à bandes grises.

D. Traitement des échantillons des voies respiratoires inférieures :

Remarques sur la méthode : � Avant de commencer, consulter le manuel de la mini-trousse d�ADN fécal QIAGEN QIAamp pour prendre

connaissance des remarques et des précautions.

� Remplir un bain-marie avec de l�eau distillée et chauffer à 70 °C (± 5 °C) avant de commencer le traitement del�échantillon.

� Utiliser des indicateurs résistants à l�alcool pour étiqueter les récipients et les tubes.

� Changer les cônes de pipette entre chaque transfert de liquide. Il est recommandé d�utiliser des cônes résistantsaux aérosols.

� Avant de l�utiliser, laisser le diluant de milieu et respiratoire BD ProbeTec ET (CF/LP/MP) se mettre à températureambiante et mélanger en renversant délicatement les récipients.

� Aliquoter la quantité de diluant de milieu et respiratoire BD ProbeTec ET (CF/LP/MP) dans un récipient propre.Pour estimer la quantité nécessaire, utiliser 0,4 mL pour chaque échantillon et rajouter 1 à 2 mL pour faciliterle pipetage. Pour éviter la contamination du diluant, ne pas reverser le diluant résiduel dans le flacon.

1. Préparer les réactifs QIAGEN (consulter la section « Préparation des réactifs » du manuel de la mini-troussed�ADN fécal QIAamp).

2. Laisser les échantillons se réchauffer jusqu�à atteindre la température ambiante.

3. Etiqueter un tube à essai à bouchon-pression de 2 mL pour chaque échantillon à tester.

Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte biologique de sécurité :4. Vortexer par impulsion les échantillons pendant 5 � 15 s pour bien mélanger.

5. Prélever 350 µL d�échantillon à la pipette pour l�introduire dans le tube étiqueté.

REMARQUE : Les échantillons d'expectoration sont parfois difficiles à pipeter correctement. Dans ce cas, utiliser lesgraduations le long du tube pour vérifier que le bon volume est distribué dans le tube. Ou sinon, utiliser commeguide un tube dans lequel 350 µL d�eau ont été distribués.

6. CHANGER DE GANTS après l�ajout des échantillons.

7. Pipetter 150 µL de tampon QIAGEN ASL dans chaque tube à échantillon.

8. Pipetter 25 µL de protéinase K QIAGEN dans chaque tube à échantillon.

9. Pipetter 500 µL de tampon de lyse QIAGEN AL dans chaque tube à échantillon.

10. Boucher chaque tube et vortexer par impulsion pendant 5 s. Mettre les tubes dans un portoir de bain-marieavec un couvercle à vis.

Les étapes suivantes peuvent être effectuées en dehors d�une hotte biologique de sécurité :11. Incuber les tubes dans un bain-marie à 70 °C (± 5 °C) pendant 15 min.

12. Après 15 min, retirer les tubes du bain-marie et centrifuger (à 16 000 x g) pendant environ 5 s.

13. Retirer les tubes de la centrifugeuse. Ouvrir chaque tube et ajouter 500 µL d�éthanol à 96 � 100 %.

14. Reboucher chaque tube et vortexer par impulsion pendant 5 s.

15. Centrifuger les échantillons (à 16 000 x g) pendant environ 5 s.

16. Etiqueter une colonne QIAGEN et un tube de prélèvement pour chaque échantillon.

17. Transférer 700 µL d�échantillon à la colonne QIAGEN étiquetée de façon adéquate.

18. Centrifuger les tubes (à 16 000 x g) pendant 1 min.

19. Transférer les colonnes dans de nouveaux tubes de prélèvement QIAamp. Jeter les tubes contenant le filtrat.

20. Transférer délicatement encore 700 µL de l�échantillon dans la colonne appropriée.

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22. Transférer les colonnes dans des tubes de prélèvement QIAamp propres. Jeter les tubes contenant le filtrat.

23. Ouvrir les colonnes QIAamp et ajouter à chacune 500 µL de tampon de lavage QIAGEN AW1.


25. Transférer les colonnes dans de nouveaux tubes de prélèvement QIAamp. Jeter les tubes contenant le filtrat.

26. Ouvrir les colonnes QIAamp et ajouter à chacune 500 µL de tampon de lavage QIAGEN AW2.


28. Transférer les colonnes dans les tubes de prélèvement QIAamp finaux. Jeter les tubes contenant le filtrat.

REMARQUE : Le tube de prélèvement doit maintenant être etiqueté.

REMARQUE : Il faut être prudent pour garantir qu�aucun liquide n�adhère au fond de la colonne. Le transfert dulavage résiduel dans le tube de prélèvement peut affecter les résultats.

29. Ouvrir les colonnes et ajouter à chacune 225 µL de tampon d�élution QIAGEN AE.

30. Incuber à température ambiante pendant 1 min.


32. Jeter les colonnes.

33. Etiqueter un tube à essai à vis de 2 mL pour chaque échantillon.

34. Transférer 400 µL de diluant de milieu et respiratoire (CF/LP/MP) dans chaque tube à vis.

REMARQUE : Pour l�étape 38, remplir un bain-marie avec de l�eau distillée et porter à ébullition.

35. Transférer 200 µL d�élution dans le tube correctement étiqueté contenant 400 µL de diluant de milieu etrespiratoire (CF/LP/MP).

36. Boucher chaque tube et vortexer par impulsion pendant 5 s.

37. Préparer les témoins. Consulter la section Préparation des échantillons témoin des voies respiratoiresinférieures (Section E).

38. Transférer les échantillons et les témoins dans un portoir de bain-marie.

39. Mettre le portoir de bain-marie dans l�eau bouillante pendant 5 min.

40. Retirer le portoir de bain-marie et laisser les tubes se refroidir à la température ambiante pendant 15 min.

AVERTISSEMENT : Prendre soin d�éviter des brûlures provoquées par le portoir de bain-marie ou par les surfaces dubain-marie.

41. Après le refroidissement, centrifuger les échantillons (à 16 000 x g) pendant environ 5 s.

REMARQUE : Après avoir porté les échantillons à ébullition :

a. Les échantillons peuvent être conservés jusqu�à 6 h à une température comprise entre 18 � 30 °C et testéssans devoir être portés à ébullition à nouveau.

b. Les échantillons peuvent être conservés jusqu�à 3 jours à une température comprise entre 2 � 8 °C. Dans cecas, ils doivent être vortexés et portés à ébullition à nouveau avant de procéder au test.

c. Les échantillons peuvent être conservés jusqu�à 14 semaines à une température de ≤ -20 °C. Dans ce cas, ilsdoivent être décongelés à température ambiante, vortexés et portés à ébullition à nouveau avant deprocéder au test.

42. Les échantillons sont prêts pour le Mode opératoire BD ProbeTec ET LP Assay (Section F).

E. Préparation des échantillons témoin des voies respiratoires inférieures :1. Pour chaque série (plaque) à tester, préparer un tube témoin négatif (CF/LP/MP) et un tube témoin positif

(CF/LP/MP). Si une plaque contient plus d�un numéro de lot de jeu de réactifs, tester les témoins avec chaquelot.

2. Avant utilisation, renverser délicatement le tampon AE QIAGEN et le diluant de milieu et respiratoire.

3. Déboucher le tube témoin négatif (CF/LP/MP).

4. A l�aide d�un nouveau cône de pipette pour chaque tube témoin, ajouter 200 µL de tampon AE QIAGEN.

5. A l�aide d�un nouveau cône de pipette pour chaque tube témoin, ajouter 400 µL de diluant de milieu etrespiratoire.

6. Bien reboucher le tube.

7. Déboucher le tube témoin positif (CF/LP/MP).

8. A l�aide d�un nouveau cône de pipette pour chaque tube témoin, ajouter 200 µL de tampon AE QIAGEN.

9. A l�aide d�un nouveau cône de pipette pour chaque tube témoin, ajouter 400 µL de diluant de milieu etrespiratoire.

10. Bien reboucher le tube.

11. Vortexer les tubes témoin pendant 5 s.

12. Les témoins sont prêts à être portés à ébullition. Consulter la section Traitement des échantillon des voiesrespiratoires inférieures (Section D).

F. Mode opératoire du test BD ProbeTec ET LP Assay :

REMARQUE : Avant d�entamer les étapes du mode opératoire, disposer les échantillons et les témoins traitésdans un portoir capable d�accueillir des tubes échantillon de 2 mL, tel que le portoir de tube à échantillon 2 mLBD ProbeTec ET, compatible avec la multipipette BD ProbeTec ET.

1. Retirer et jeter les bouchons des échantillons et des témoins refroidis.

2. CHANGER DE GANTS avant de poursuivre pour éviter la contamination.

3. A l�aide du rapport de configuration de la plaque, préparer la plaque de micropuits d�amorçage � voirConfiguration de plaque (Section C).

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4. Procéder comme suit pour refermer les sachets de micropuits :a. Placer le sachet sur une surface plane. D�une main, maintenir à plat le côté ouvert.b. En appliquant une pression, faire glisser les doigts à l�extérieur de la fermeture, en allant d�un bord à l�autre

du sachet.c. Vérifier que le sachet est fermé.

5. Sélectionner le Programme 1 sur la multipipette BD ProbeTec ET.6. Prélever les cônes de pipette. Déplier la multipipette BD ProbeTec ET en tirant le bouton approprié sur toute

sa longueur. REMARQUE : Vérifier que les cônes sont bien en place sur la multipipette pour éviter les fuites.

7. Aspirer 200 µL dans la première colonne d�échantillons. 8. Replier doucement la multipipette, appliquer les cônes de pipette contre les parois des micropuits et distribuer

150 µL dans la colonne de micropuits d�amorçage correspondante (1 A-H).REMARQUE : Ne pas replier la multipipette au-dessus des échantillons ou des micropuits pour ne pas risquerd�entraîner une contamination. Des mouvements brusques peuvent causer la formation de gouttelettes oud�aérosols.

9. Jeter les cônes de pipette. Relâcher la gâchette de pipetage pour réinitialiser la multipipette.REMARQUE : Jeter les cônes de pipette avec précaution pour éviter la formation de gouttelettes ou d�aérosolssusceptibles de contaminer la paillasse.

10. Prélever de nouveaux cônes de pipette, déplier la multipipette et aspirer 200 µL dans la deuxième colonned�échantillons.

11. Replier doucement la multipipette, appliquer les cônes de pipette contre les parois des micropuits et distribuer150 µL dans la colonne de micropuits d�amorçage correspondante (2 A-H).

12. Jeter les cônes de pipette.13. Poursuivre le transfert des autres échantillons de la série.14. Couvrir la plaque de micropuits d�amorçage avec le couvercle d�amorçage et laisser incuber la plaque à

température ambiante pendant au moins 20 min. (Peut reposer jusqu�à 6 h.) REMARQUE : Reboucher les tubeséchantillon traités avec de nouveaux bouchons. CHANGER DE GANTS.

15. A l�issue de l�incubation d�amorçage, préparer la plaque de micropuits d�amplification. Disposer les micropuitsd�amplification dans la plaque conformément au rapport de configuration de la plaque (identique à la plaqued�amorçage). Refermer le sachet de micropuits comme expliqué à l�étape 4.

16. Retirer le couvercle de la plaque de micropuits d�amorçage et transférer celle-ci dans le bloc chauffant d�amorçage.Placer IMMEDIATEMENT la plaque de micropuits d�amplification dans le bloc chauffant de préchauffage.

17. Régler la minuterie à 10 min. (REMARQUE : le temps est déterminant dans cette étape).18. A l�issue des 10 min (± 1 min) d�incubation, sélectionner le Programme 5 de la multipipette.19. Prélever les cônes de pipette et transférer 100 µL de la colonne 1 de la plaque de micropuits d�amorçage à la

colonne 1 de la plaque de micropuits d�amplification. Appliquer l�extrémité des cônes de pipette contre laparoi des micropuits et distribuer le liquide. Laisser ensuite la multipipette mélanger automatiquement leliquide présent dans les micropuits. Soulever délicatement la multipipette et l�écarter de la plaque. Ne pastoucher les autres micropuits.

20. Jeter les cônes de pipette. Prélever de nouveaux cônes de pipette pour transférer le mélange réactionnel desmicropuits d�amorçage dans les micropuits d�amplification, colonne par colonne, en changeant de cônes entrechaque colonne.

21. Lorsque la dernière colonne est transférée, retirer la face protectrice d�une bande d�étanchéité d�amplification(une bande d�étanchéité d�amplification (1/2) peut couvrir jusqu�à 6 colonnes ; si la plaque compte plus de 6colonnes, une bande d�étanchéité complète doit être utilisée). Tenir la bande d�étanchéité par les bords et lacentrer sur les micropuits. Utiliser les guides présents sur le bloc chauffant de préchauffage pour faciliter la miseen place de la bande d�étanchéité. Appuyer sur la bande pour assurer l�étanchéité des micropuits.

22. A partir de l�interface utilisateur BD ProbeTec ET, faire sortir la platine, ouvrir la porte et soulever le couverclede la plaque. Transférer IMMEDIATEMENT (dans les 30 s) la plaque de micropuits d�amplification scellée versl�instrument BD ProbeTec ET et lancer la série (consulter le manuel d�utilisation du système BD ProbeTec ETpour plus d�informations).

23. Après avoir lancé la série, accomplir les étapes de la procédure de nettoyage qui suivent :a. Sceller les micropuits d�amorçage avec une bande d�étanchéité d�amplification et sortir la plaque du bloc

chauffant d�amorçage et de préchauffage. Avertissement : Température supérieure à 70 °C. Utiliser legant antichaleur pour sortir la plaque.

b. Laisser refroidir la plaque sur la paillasse pendant 5 min.c. Sortir les micropuits d�amorçage scellés de la plaque en saisissant la bande d�étanchéité par les deux côtés,

puis en soulevant verticalement les micropuits ensemble. Placer les micropuits scellés dans un sac à déchetset fermer le sac.

d. Nettoyer la plaque métallique :Rincer la plaque avec une solution d�hypochlorite de sodium à 1 % (v/v) contenant de l�Alconox.Rincer la plaque à l�eau.Entourer la plaque d�une serviette en papier propre et laisser sécher complètement avant de réutiliser.

24. Lorsque la série est terminée, les résultats des tests s�impriment.25. Faire sortir la platine, ouvrir la porte et retirer la plaque. Refermer la porte et replacer la platine à l�intérieur

de l�instrument.26. Sortir les micropuits d�amplification scellés de la plaque. Attention : Ne pas retirer la bande d�étanchéité

apposée sur les micropuits. Les micropuits scellés peuvent aisément être sortis en bloc de la plaque ensaisissant la bande d�étanchéité par le haut et le bas, puis en soulevant l�ensemble verticalement hors de laplaque. Placer les micropuits scellés dans un sac à déchets. Fermer le sac.

27. Nettoyer la plaque métallique :Rincer la plaque avec une solution d�hypochlorite de sodium à 1 % (v/v) contenant de l�Alconox.Rincer la plaque à l�eau.Entourer la plaque d�une serviette en papier propre et laisser sécher complètement avant de réutiliser.

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28. A l�issue de la dernière série, accomplir les procédures de nettoyage suivantes :a. Imbiber des serviettes en papier ou des compresses avec une solution d�hypochlorite de sodium à 1 % (v/v)

contenant de l�Alconox et frotter la paillasse et les surfaces externes du bloc chauffant d�amorçage et depréchauffage, du portoir de tube à échantillons de 2 mL, des bains-marie, de la centrifugeuse et del�instrument BD ProbeTec ET. Laisser la solution sur les surfaces pendant 2 � 3 min. Imbiber des serviettesen papier ou des compresses avec de l�eau et essuyer la solution de nettoyage. Changer fréquemment deserviette ou de compresse pour appliquer la solution de nettoyage et rincer à l�eau. Humidifier des serviettesen papier ou des compresses avec une solution d�hypochlorite de sodium à 1 % (v/v) contenant de l�Alconoxet essuyer la poignée de la multipipette (UNIQUEMENT LA POIGNÉE). Après 2 � 3 min, essuyer la poignéeavec des serviettes en papier ou des compresses humidifiées avec de l�eau.

b. Immerger le portoir de bain-marie et les plaques dans une solution de sodium hypochlorite à 1 % (v/v)contenant de l�Alconox pendant 1 � 2 min. Rincer soigneusement à l�eau et laisser sécher à l�air.

c. Recharger la multipipette.d. Eliminer le sac à déchets scellé et les déchets à risque biologique conformément aux procédures d�élimination

en vigueur pour les déchets contaminés.29. Effectuer les procédures suivantes au moins une fois par semaine :

a. Jeter l�eau des bains-marie.b. Nettoyer les bains-marie avec une solution d�hypochlorite de sodium à 1 % (v/v) contenant de l�Alconox.

Rincer à l�eau et laisser sécher à l�air.c. Remplir à nouveau d�eau distillée.

Contrôle de qualitéEffectuer les contrôles de qualité conformément aux réglementations nationales et/ou internationales, auxexigences des organismes d�homologation concernés et aux procédures de contrôle de qualité en vigueur dansl�établissement. Il est recommandé à l�utilisateur de consulter les directives CLSI (anciennement NCCLS) et laréglementation CLIA correspondantes pour plus d�informations sur les modalités de contrôle de qualité.Le diluant de milieu et respiratoire et les témoins sont fournis ensemble dans la trousse de diluant de milieu etrespiratoire et de témoins (CF/LP/MP). Inclure un témoin positif et un témoin négatif dans chaque série de tests sur uneplaque et pour chaque nouveau numéro de lot de trousse de réactifs. Les témoins peuvent être disposés au hasard. Letémoin positif détecte une non-conformité significative du réactif. Le témoin négatif détecte une contamination duréactif et/ou de l�environnement. Les témoins positif et négatif doivent donner un résultat positif et négatif,respectivement, pour que les résultats des échantillons puissent être pris en compte. Si les témoins ne produisent pasles résultats escomptés, la série de tests est considérée comme non valide et l�instrument ne rapporte pas les résultatsdu patient. Si les témoins de la série ne donnent pas les résultats attendus, reprendre la totalité de la série en utilisantun nouveau jeu de témoins, de nouveaux micropuits et d�échantillons traités. S�il reste de l�échantillon traité de façoninadéquate pour un autre test, retraiter une autre aliquote de l�échantillon primaire. Si les témoins répétés ne donnentpas les résultats attendus, contacter le service technique (voir « Interprétation des résultats »).Comme le témoin positif (CF/LP/MP) est utilisé à la fois pour les tests CF, LP et MP, le bon positionnement desbarrettes de micropuits est important pour garantir la conformité des résultats rapportés. Se reporter à la sectionConfiguration de plaque (Section C) pour connaître le bon positionnement des barrettes de micropuits.Un témoin d�amplification interne (TAI) est desséché dans le micropuits d�amorçage. Le TAI contient un acidenucléique cible qui est amplifié en présence de la matrice échantillon. L�objectif du TAI est de confirmer la validitéde la réaction d�amplification et d�identifier les inhibitions potentielles dans l�échantillon traité.

Témoins de traitement des échantillonsLes témoins de traitement des échantillons peuvent être testés conformément aux exigences des organismesnormatifs concernés. Un témoin positif doit valider l�ensemble du système de test. A cette fin, les échantillonsconnus pour être positifs peuvent servir de témoins en étant traités et testés conjointement avec les échantillonsindéterminés. Les échantillons utilisés comme témoins de traitement doivent être conservés, traités et testésconformément à la notice d�emploi. Des témoins de traitement des échantillons qui simulent des échantillons desvoies respiratoires inférieures peuvent également être préparés comme décrit ci-dessous :1. Retirer un flacon de L. pneumophila ATCC 33152 (Philadelphia-1) lyophilisé conservé à une température

inférieure ou égale à -20 °C.2. Réhydrater avec 1 mL de sérum physiologique à 0,85 % (p/v) contenant 0,2 % (p/v) d�albumine bovine (Fraction V).3. Diluer une solution mère de L. pneumophila réhydratée à 1/100 000 dans du sérum physiologique à 0,85 % (p/v)

contenant 0,2 % (p/v) d'albumine bovine (Fraction V).4. Pipetter 350 µL de L. pneumophila dilué dans un tube à bouchon-pression.5. Poursuivre en se conformant aux instructions de la section Traitement des échantillons des voies respiratoires

inférieures (Section D).

Dépistage de la présence d�ADN contaminantAu moins une fois par mois, accomplir les procédures suivantes pour dépister la présence d�ADN contaminant sur lapaillasse et le matériel. Le contrôle du poste de travail est essentiel pour détecter une contamination avant qu�unproblème ne se développe. 1. Pour chaque zone* à tester, utiliser un écouvillon BBL CultureSwab EZ.2. Etiqueter un tube à essai à vis de 2 mL pour chaque zone à tester. Pipetter 600 µL de diluant de milieu et

respiratoire dans chaque tube et ajouter 300 µL de tampon AE QIAGEN ou d�eau distillée standardiséemoléculaire. Vortexer pendant 5 s pour mélanger.

3. Tremper le premier écouvillon dans le diluant préparé à l�étape 2 et essuyer la première zone d�un mouvementample.

4. Faire tourner l�écouvillon dans le diluant et le presser fermement contre le côté du tube. Reboucher le tube etvortexer pendant 5 s. Jeter l�écouvillon.

5. Répéter la procédure pour chaque zone à tester.6. Mettre le portoir de bain-marie dans l�eau bouillante pendant 5 min. Retirer le portoir de bain-marie et laisser

les échantillons se refroidir à la température ambiante pendant 15 min.7. Après refroidissement, centrifuger les échantillons (à 16 000 x g) pendant environ 5 s. 8. Pendant que les tubes chauffent, utiliser des serviettes de papier propres imbibées d�eau pour éliminer les

traces de mélange de tampons présentes sur les surfaces testées.

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9. Une fois que les échantillons ont refroidi, passer au Mode opératoire du test BD ProbeTec ET LP Assay(Section F).

*Les zones qu�il est recommandé de tester sont notamment : les surfaces du portoir de bain-marie, lamicrocentrigufeuse, le bloc chauffant d�amorçage et de préchauffage, les plaques noires à micropuits, la poignéede la multipipette, les touches sensitives de l�instrument, le clavier de l�instrument, les surfaces sèches des bains-marie, les surfaces les portoirs d�échantillon et les paillasses, y compris les zones de traitement des échantillons.

Si une zone donne un résultat positif, nettoyer la zone avec une solution d�hypochlorite de sodium à 1 % (v/v)contenant de l�Alconox fraîchement préparée. S�assurer que toute la zone est humidifiée par la solution denettoyage et laisser reposer la solution pendant 2 min au minimum ou jusqu�à ce que la surface soit sèche. Sinécessaire, éliminer la solution de nettoyage en excès à l�aide d�une serviette en papier propre. Essuyer la zone avecune serviette en papier imbibée d�eau et laisser sécher. Tester de nouveau la zone. Renouveler l�opération jusqu�àce que le test soit négatif. Si la contamination persiste, contacter le service technique pour plus d�informations.

INTERPRETATION DES RESULTATSLa présence ou l�absence d�ADN de L. pneumophila est déterminée en calculant les scores PAT (Passes AfterThreshold - dépassements de seuil) de l�échantillon à l�aide de valeurs de seuil prédéterminées. Le score PAT est unevaleur utilisée pour évaluer l�amplitude du signal produit par la réaction. Des valeurs élevées indiquent que le seuila été atteint dans les premiers stades de l�amplification, tandis que des valeurs basses indiquent que le seuil a étéatteint à un moment plus tardif de la réaction. L�amplitude du score PAT n�est pas corrélative à la concentrationd�ADN de L. pneumophila dans l�échantillon.

Si les contrôles du test ne donnent pas les résultats attendus, les résultats obtenus sur les échantillons cliniques nedoivent pas être pris en considération. Voir la section Contrôle de qualité pour connaître les valeurs attendues pourles témoins. Les résultats rapportés sont déterminés comme suit :

Enchantillons des voies respiratoires inférieures :

a Répéter le test BD ProbeTec ET LP Assay à partir du tube d'échantillon traité. Si l�échantillon traité ne contientplus suffisamment de volume d�échantillon traité, répéter le test avec l�échantillon d�origine. Si le résultat du testrépété est positif ou négatif, interpréter comme décrit ci-dessus. En cas de nouveau résultat indéterminé, solliciterun nouvel échantillon.

Détermination du seuil LP et TAI :Les valeurs de seuil de l�ADN de L. pneumophila ciblé et du TAI ont d�abord été établies à l�aide de l�analyse de la courbede fonction d�efficacité de l�observateur des données obtenues par des témoins positifs et négatifs. Ces valeurs de seuilont été vérifiées par des études cliniques rétrospectives portant sur des échantillons des voies respiratoires inférieurespositifs et négatifs à L. pneumophila. Ces valeurs de seuil ont ensuite été validées par d�autres études cliniques.

LIMITES DE LA PROCEDURE1. Le test BD ProbeTec ET LP Assay est spécifique aux sérogroupes 1 - 14 de L. pneumophila uniquement. Aucun autre

sérogroupe de L. pneumophila n'a été testé.2. Le test BD ProbeTec ET LP Assay ne détecte pas les infections dues à d'autres espèces de Legionella.3. Les caractéristiques de performances du test BD ProbeTec ET LP Assay ont été établies uniquement avec des

échantillons d'expectoration. Les performances du test avec d�autres types d�énchantillons n�ont pas été évaluées. 4. Le test BD ProbeTec ET LP Assay a été évalué uniquement chez des patients âgés de 13 ans minimum.

Score PATCible LP Cible TAI Résultat Interprétation Rapport

> 0 > ou = 0 Positif ADN de L. pneumophila DNAdétecté par SDA.

Positif pour lesmicroorganismesappartenant aux sérogroupes 1 - 14 de L. pneumophila, suggérantune infection actuelle. Des tests supplémentairessont nécessaires pouridentifier le sérogroupe,éventuellement à des finsépidémiologiques.

= 0 > 0 Négatif ADN de L. pneumophila DNAnon détecté par SDA.

Présumé négatif pour lesmicroorganismesappartenant aux sérogroupes1-14 de L. pneumophila dansun échantillon des voiesrespiratoires inférieures,suggérant aucune infectionactuelle ou passée.L�infection causée parLegionella ne peut pas êtreécartée pour les raisonssuivantes : 1) les sérogroupesautres que 1-14 et les autresLegionella spp. peuventprovoquer la maladie, 2) leniveau d�ADN présent estpeut-être inférieur au seuilde détection du test.

= 0 = 0 Indéterminé Inhibition du témoind�amplification. Des testssupplémentaires sontnécessaires à l�interprétationdes résultats.a

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5. Comme pour la plupart des tests diagnostiques, les résultats du test BD ProbeTec ET LP Assay doivent êtreinterprétés conjointement avec les autres données de laboratoire et les autres données cliniques disponibles.

6. Un résultat négatif n�exclut pas l�éventualité d�une infection car les résultats du test peuvent être affectés parun prélèvement inapproprié des échantillons, une erreur technique, une substitution d�échantillons, uneantibiothérapie concomitante ou une concentration d�ADN de L. pneumophila dans l�échantillon inférieure àla sensibilité analytique du test.

7. Le test BD ProbeTec ET LP Assay ne peut pas être utilisé pour évaluer le succès ou l�échec d�un traitement carles acides nucléiques de L. pneumophila peuvent avoir persisté à l�issue de l�antibiothérapie.

8. Le test BD ProbeTec ET LP Assay n�a pas été évalué avec des échantillons environnementaux (eau potable outest de qualité de l�eau par exemple).

9. L�efficacité optimale du test suppose un prélèvement et une préparation des échantillons de manière appropriée.

10. L�utilisation du test BD ProbeTec ET LP Assay est réservée aux personnes ayant reçu une formation suffisantepour réaliser ce test et familiarisées avec le système BD ProbeTec ET.

11. Le test BD ProbeTec ET LP Assay fournit des résultats qualitatifs. L�amplitude du score PAT n�est pas corrélativeau nombre d�ADN de L. pneumophila présents dans un échantillon.

RESULTATS ATTENDUS

A. PrévalenceLe taux de résultats positifs observés lors d�un test de détection de L. pneumophila peut varier en fonction de laméthode utilisée, l�âge du patient, la présence de facteurs de risque sous-jacents, la région géographique et, plusimportant encore, de la prévalence locale de la maladie, voire de situations d�épidémie.

B. Distribution de fréquences des scores PATAu total, 83 échantillons d'expectoration rétrospectifs ont été prélevés sur quatre sites cliniques des Etats-Unis,d'Europe et du Canada, et testés avec le BD ProbeTec ET LP Assay. Une distribution de fréquences des scores LP PATcomparées à celles de culture est représentée à la Figure 1.

Figure 1 : Distribution des fréquences de score LP PAT comparées à celles de culture

C. TémoinsLors de l'évaluation clinique, des résultats non conformes pour le test BD ProbeTec ET LP Assay ont été observés surl'une des 46 séries (série ayant fait l'objet d'une erreur de procédure). Les scores PAT LP pour les 45 séries restantessont résumés dans le Tableau 1.

Tableau 1 : Distribution de score PAT LP pour les témoins des voies respiratoires et des milieux

CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES

Etude prospectiveLe test BD ProbeTec ET LP Assay a été évalué prospectivement dans sept centres cliniques aux Etats-Unis et auCanada pendant la saison d�infections resperatoires des années 2002 et 2003. Un échantillon d'expectoration et unéchantillon d'urine ont été prélevés sur chaque patient. Les échantillons d'expectoration ont été testés à l'aide duBD ProbeTec ET LP Assay, d'une culture de Legionella et du test d'immunofluorescence directe. Les échantillonsd'urine ont été soumis à un test de détection de l'antigène urinaire de L. pneumophila disponible sur le marché.

Témoin N Intervalle 5ème percentile Moyenne Médiane 95ème percentile

LP négatif 45 0 � 0 0 0 0 0

LP positif 45 29,4 � 50,7 40,1 46,7 47,6 49,7

Résultat de la culture 0 1 � 19 20 � 39 40 � 60 Total

Négatif

Positif

52 0 4 4

2 0 2 19

60

23

Total 54 0 6 23 83

04 42 0 2

19

0

10

20

30

40

50

60

0 1 - 19 20 - 39 40 - 60

Score PAT LP

Fréq

uen

ce

Culture -

Culture +

(-) (+)

52

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Au total, 118 patients ont répondu aux critères de qualification pour l'étude (preuve radiographique de pneumonie,patients âgés de 13 ans minimum, sous antibiothérapie pendant une période d'au moins 14 jours, types d'échantillonsprélevés valides, utilisation de méthodes de référence appropriées, etc.). Sur ces 118 patients, on a obtenu 114résultats de test BD ProbeTec ET LP Assay valides. Les résultats des échantillons d'expectoration ont été comparés àceux des cultures d'expectoration pour évaluer les caractéristiques de performances. Un échantillon est considérécomme positif lorsque le résultat de la culture est positif. Un échantillon est considéré comme négatif lorsque lerésultat de la culture est négatif.

Tous les tests ayant produit un résultat initial indéterminé ont dû être répétés sur l'échantillon traité ou surl'échantillon d'origine (si la quantité d'échantillon traité disponible était insuffisante). Tout échantillon ayant produitdes résultats initial et final indéterminés n'était pas pris en compte dans les caractéristiques de performances. Toutéchantillon ayant donné un résultat initial indéterminé, puis un résultat final positif ou négatif a été pris en comptedans les caractéristiques de performances. Tout échantillon qui a produit un résultat initial indéterminé et n'a pas pusubir un contre-test en raison d'un volume insuffisant d'échantillon est demeuré indéterminé et n'a pas été pris encompte dans les caractéristiques de performances.

Le Tableau 2 récapitule les résultats du test BD ProbeTec ET LP Assay des échantillons d'expectoration par rapportaux cultures.

Tableau 2 : Résultats prospectifs du test BD ProbeTec ET LP Assay des échantillons d'expectoration par rapport aux cultures

a Les 114 échantillons négatifs à la culture étaient tous négatifs au test d'immunofluorescence directe. 87 patients sur114 ont également subi un test de détection de l'antigène urinaire et ont été jugés négatifs.

b Un échantillon a été jugé négatif après contre-test et a été pris en compte dans les calculs de spécificité. Unéchantillon n'était pas en quantité suffisante pour permettre un nouveau test.

c Deux échantillons sont demeurés indéterminés après contre-test. Un échantillon n'était pas en quantité suffisantepour permettre un contre-test.

SO = Sans objet

Etude rétrospectiveLe test BD ProbeTec ET LP Assay a également été évalué sur 83 échantillons d'expectoration rétrospectifs obtenus sur dessites cliniques des Etats-Unis, d'Europe et du Canada. Les échantillons rétrospectifs ont été congelés pendant des périodesallant jusqu'à six ans ; la majorité des échantillons (65,1 %, soit 54/83) a été conservée pendant moins de deux ans.

Chaque site a enregistré le résultat de la culture d�origine pour chaque échantillon rétrospectif. Chaque site a testéles échantillons d'expectoration avec le test BD ProbeTec ET LP Assay et a comparé les résultats à ceux des cultures.Un échantillon est considéré comme positif lorsque le résultat de la culture est positif. Un échantillon est considérécomme négatif lorsque le résultat de la culture est négatif.

Le Tableau 3 récapitule les résultats du test BD ProbeTec ET LP Assay des échantillons d'expectoration rétrospectifspar rapport aux cultures.

par rapport à culture

Site Sensibilité(IC à 95 %) Spécificité (IC à 95 %) Indéterminé

Initial/Final

1 SO 100% (17/17)(80,5% � 100%) 0/0

2 SO100% (2/2)

(15,8% � 100%)0/0

3 SO 100% (31/31)(88,8% � 100%) 0/0

6 SO 100% (33/33)(89,4% � 100%) 2/0b

7 SO100% (31/31)

(88,8% � 100%)3/2c

Global SO 100% (114/114)a

(96,8% � 100%)5/2

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Tableau 3 : Test BD ProbeTec ET LP Assay

a Huit échantillons étaient négatifs à la culture et positifs au test BD ProbeTec ET LP Assay. Les huit échantillonsétaient positifs au test de détection de l'antigène urinaire. Le test PCR a été effectué sur six échantillons sur huit ;ces six échantillons étaient positifs au PCR.

b Deux échantillons étaient positifs à la culture et négatifs au test BD ProbeTec ET LP Assay. Les échantillons étaienttous deux négatifs au test de détection de l'antigène urinaire. Le test PCR a été effectué sur les deux échantillons ;un échantillon était positif au PCR.

c Les 23 échantillons positifs à la culture étaient distribués dans les sérogroupes suivants : 47,8 % (11/23) sérogroupe 1 ;17,4 % (4/23) sérogroupe 3 ; 13,0 % (3/23) sérogroupe 4 ; 4,3 % (1/23) sérogroupe 5 ; 4,3 % (1/23) sérogroupe 6 et13 % (3/23) informations de sérogroupe non disponibles.

SO = sans objet

REMARQUE : La méthode PCR utilisée pour tester des résultats de culture et de test BD ProbeTec ET LP Assaycontradictoires n'est pas une méthode agréée par la FDA.

Etudes analytiquesLe volume réactionnel d�amplification de BD ProbeTec ET LP Assay est de 100 µL d�échantillon traité.

Sensibilité analytiqueLa sensibilité analytique de BD ProbeTec ET LP Assay sur 14 sérogroupes différents de L. pneumophila a étédéterminée en diluant des suspensions bactériennes à 0, 150, 300 et 450 unités formant colonies (UFC) par réaction.Les échantillons ont été traités et testés en triple exemplaire. En se basant sur une positivité de 100 %, la sensibilitéanalytique des sérogroupes de 2 à 10 et 12 était de 150 UFC/réaction ; cependant, la limite de détection (LDD) étaitpeut-être inférieure au plus petit niveau testé. En se basant sur une positivité de 100 %, la sensibilité analytiquedes sérogroupes 1 et 11 était de 300 UFC/réaction ; celle du sérogroupe 13 était de 450 UFC/réaction ; celle dusérogroupe 14 était de 700 UFC/réaction.

La sensibilité analytique de BD ProbeTec ET LP Assay en présence de matrice d�échantillons des voies respiratoiresinférieures a été déterminée en chargeant une souche infectée au macrophage de L. pneumophila de sérogroupe 1dans des expectorations à 0, 150, 300 et 450 UFC par réaction. Les échantillons ont été traités et testés en tripleexemplaire. En se basant sur une positivité de 100 %, la sensibilité analytique des échantillons des voiesrespiratoires inférieures chargée était de 150 UFC/réaction ; cependant, la limite de détection (LDD) était peut-êtreinférieure au plus petit niveau testé.

Spécificité analytiqueAu total, 79 microorganismes (69 bactéries, une levure et neuf virus) ont été évalués à l�aide de BD ProbeTec ET LPAssay. Les isolats bactériens ont été testés avec des concentrations allant de 1 x 106 UFC/mL à 1 x 108 UFC/mL. Lesvirus ont été testés avec une concentration de 1 x 106 particules virales/mL. Coccidioides immitis a été préparé ensuspension mycélienne équivalant au standard McFarland 5. Aucun des microorganismes testés n�a produit derésultat positif ou a inhibé le TAI (Tableau 4).

Culture Estimations de concordance en pourcentage (IC à 95 %)

Site Résultat LP Positif Négatif Total Positif Négatif Global

6 Positif 1 0 1

Négatif 0 0 0

Total 1 0 1 100% (1/1)(2,5% � 100%) SO 100% (1/1)

(2,5% � 100%)

8 Positif 16 5 21

Négatif 1 24 25

Total 17 29 46 94,1% (16/17)(71,3% � 99,9%)

82,8% (24/29)(64,2% � 94,2%)

87% (40/46)(73,7% � 95,1%)

9 Positif 1 3 4

Négatif 0 22 22

Total 1 25 26 100% (1/1)(2,5% � 100%)

88% (22/25)(68,8% � 97,5%)

88,5% (23/26)(69,8% � 97,6%)

10 Positif 3 0 3

Négatif 1 6 7

Total 4 6 10 75% (3/4)(19,4% � 99,4%)

100% (6/6)(54,1% � 100%)

90% (9/10)(55,5% � 99,7%)

Global Positif 21 8a 29

Négatif 2b 52 54

Total 23c 60 83 91,3% (21/23)(72% � 98,9%)

86,7% (52/60)(75,4% � 94,1%)

88% (73/83)(79% � 94,1%)

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Tableau 4 : BD ProbeTec ET LP Assay � Spécificité analytique

SUBSTANCES INTERFÉRENTESLes substances potentiellement interférentes, susceptibles d�être présentes dans des échantillons des voiesrespiratoires inférieures, ont été testées avec le test BD ProbeTec ET LP Assay en l�absence de cible ou en présencede 750 UFC/réaction de L. pneumophila. En absence de cible, aucune des substances testées n�a donné de résultatpositif ou inhibé le TAI aux concentrations répertoriées dans le Tableau 5. Lorsque la cible était en présence dessubstances aux concentrations répertoriées dans le tableau 5, tous les échantillons testés ont produit un résultat positif.

Tableau 5 : BD ProbeTec ET LP Assay � Dépistage de substances interférentes

ReproductibilitéLa reproductibilité du test BD ProbeTec ET LP Assay a été évaluée dans trois laboratoires en testant un groupe de 24échantillons chargés en PBS/SAB. Le groupe comportait 12 échantillons négatifs au L. pneumophila ; trois échantillonspositifs au L. pneumophila à basse sensibilité (300 UFC/réaction) et à haute sensibilité (500 UFC/réaction) ; troiséchantillons positifs à basse sensibilité (respectivement 30 corps d�inclusion (CI)/réaction, 300 UFC/réaction, 900cellules/réaction) et trois échantillons positifs à haute sensibilité (respectivement 50 CI/réaction, 500 UFC/réaction,1500 cellules/ réaction), tous contenant Chlamydophila pneumoniae (CP), L. pneumophila (LP) et Mycoplasmapneumoniae (MP). Sur chaque site, un opérateur a testé les groupes une fois par jour pendant trois jours. Les résultatssont présentés dans le Tableau 6.

Echantillons des voies respiratoires inférieures

Substance testée Concentration

Sang total (héparine) 2,65%

Lidocaine 2 % 0,21%

Solution induisant l�expectoration (3 % de NaCl) 0,32%

Azithromycine 0,42 µg/mL

Pénicilline G 17 µg/mL

Tétracycline 2,3 µg/mL

Doxycycline 26,5 µg/mL

Ciprofloxacine 4,88 µg/mL

Mycoplasma pneumoniae 5 x 106 cellules/mL

Chlamydophila pneumoniae 1,06 x 107 CI/mL

Mycoplasma pneumoniae et Chlamydophilapneumoniae

1,06 x 107 cellules/mL et 1,06 x 107 CI/mL,respectivement

Acinetobactercalcoaceticus

Actinomyces israelii

Adenovirus-5

Aeromonas hydrophila

Blastomyces dermatitidis

Bordetellabronchiseptica

Bordetella parapertussis

Bordetella pertussis

Branhamella catarrhalis

Candida albicans

Chlamydia trachomatis,séro L2

Chlamydophilapneumoniae, AR-39

Citrobacter freundii

Coccidioides immitis

Corynebacteriumdiphtheriae

Corynebacteriumjeikeium

Cryptococcusneoformans

Cytomegalovirus

Eikenella corrodens

Enterobacter aerogenes

Enterobacter cloacae

Enterococcus faecalis

Enterococcus faecium

Enterovirus (Echovirus)

Escherichia coli

Fusobacteriumnucleatum

Haemophilus influenzae

Haemophilusparainfluenzae

Herpesvirus-1

Histoplasma capsulatum

Virus de l�influenza detype A

Virus de l�influenza detype B

Kingella kingae

Klebsiella pneumoniaessp. ozaenae type 4

Klebsiella pneumoniaesubsp. pneumoniae

Lactobacillus acidophilus

Legionella anisa

Legionella bozemanii

Legionella cherrii

Legionellacincinnatiensis

Legionella dumoffii

Legionella erytha

Legionella fairfieldensis

Legionella feeleii

Legionella gormanii

Legionella hackeliae

Legionella jordanis

Legionella longbeachae

Legionella maceachernii

Legionella oakridgensis

Legionella sainthelensi

Legionella spiritensis

Legionella worsleiensis

Moraxella osloensis

Mycobacteriumtuberculosis

Mycoplasmapneumoniae

Neisseria gonorrhoeae

Neisseria meningitidis

Neisseria mucosa

Virus de parainfluenza I

Peptostreptococcusanaerobius

Porphyromonasasaccharolytica

Prevotella oralis

Pseudomonasaeruginosa

Virus syncytialrespiratoire, souchelongue

Rhinovirus

Salmonella choleraesuissérotype Enteritidis

Salmonella choleraesuissérotype Typhi

Serratia marcescens

Staphylococcus aureus,productrice de protéine A

Staphylococcus aureus,non-productrice deprotéine A

Staphylococcusepidermidis

Stenotrophomonasmaltophilia

Streptococcus du groupe B

Streptococcus mutans

Streptococcuspneumoniae

Streptococcus pyogenes

Tatlockia (Legionella)micdadei

Veillonella parvula

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Tableau 6 : Estimations de la reproductibilité pour les échantillons des voies respiratoires inférieures par niveau d'échantillon

a Un échantillon a été exclus de l�analyse à cause d�une erreur de procédure.

CONDITIONNEMENTLes produits BD ProbeTec ET suivants sont disponibles :

N° réf. Description440728 BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay

440731 BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit

440457 BD ProbeTec ET Accessories Kit (10 couvercles d�amorçage, 16 bandes d�étanchéité pour l�amplification(1/2) et 8 sacs à déchets)

440458 BD ProbeTec ET Pipette Tips 6 x 120

440661 BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tubes and Caps, 200 chaque

440679 BD ProbeTec ET 2 mL Caps, 100

440477 BD ProbeTec ET Instrument; sauf Etats-Unis.

440478 BD ProbeTec ET Instrument; Etats-Unis et Canada.

440479 BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, 220 V


440487 BD ProbeTec ET Pipettor

440502 BD ProbeTec ET Lysing Rack

BIBLIOGRAPHIE : voir la rubrique �References� du texte anglais.


Deutsch

VERWENDUNGSZWECKDer BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET DNA-Amplifikationstestzum Nachweis von Legionella pneumophila (LP)) wird mit dem BD ProbeTec ET-System verwendet und nutzt dieTechnologie der Strangverdrängungsamplifikation (SDA) für den direkten qualitativen Nachweis von Legionellapneumophila-DNA (Serogruppen 1 - 14) in Sputumproben von Patienten mit klinischem Verdacht auf Pneumonie. Ersoll zusammen mit Kulturen und anderen Methoden in der Verdachtsdiagnose der Legionärskrankheit hilfreich sein.

ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNGLegionärskrankheit kann durch Einatmen von Legionella-haltigen Aerosolen oder durch Mikroaspiration vonkontaminiertem Wasser übertragen werden. Aus Studien in Europa und Nordamerika geht hervor, dass 2 � 15 %der ambulant erworbenen Pneumonien, die eine stationäre Behandlung erfordern, von Legionella verursachtwerden. Die Letalitätsrate bei Patienten mit Legionellose beträgt 5 � 30 %, wobei das Risiko für einen tödlichenVerlauf bei älteren und immungeschwächten Patienten höher ist.1 Die Hälfte der bisher identifizierten vierzigLegionella-Spezies verursacht Erkrankungen beim Menschen. Legionella pneumophila verursacht 90 % derdiagnostizierten Legionellose-Fälle. Obgleich vierzehn Serogruppen von L. pneumophila bekannt sind, werden 80 % der L. pneumophila-Infektionen durch Serogruppe 1 verursacht.2

Diagnostik und Ätiologie der Pneumonie sind aufgrund der zunehmenden Problematik übermäßiger Antibiotika-Verordnung von größter Wichtigkeit. Diagnostische Testergebnisse für L. pneumophila sollten dem behandelndenArzt schnell zur Verfügung gestellt werden, da die Mortalität bei verzögerter Einleitung der entsprechendenTherapie nachweislich steigt. Traditionelle Kulturmethoden erfordern mindestens zwei Tage zur Anzüchtung vonLegionella-Organismen aus positiven Sputumproben und insgesamt sieben bis zehn Tage zur Bestätigung einesnegativen Ergebnisses. Als Zusatz für Kulturmethoden werden Enzymimmunoassays zum Nachweis von Antigen derL. pneumophila-Serogruppe 1 aus Urinproben im Handel angeboten.3 Diagnostische Tests auf Legionella-Infektionen, die bei guter Empfindlichkeit und Spezifität schnell Ergebnisse liefern, sind jedoch weiterhin nurbegrenzt erhältlich.

VERFAHRENSGRUNDLAGENDer BD ProbeTec ET DNA-Amplifikationstest zum Nachweis von Legionella pneumophila (LP) basiert auf demgleichzeitigen Amplifizieren und Nachweisen der Ziel-DNA mit Hilfe von Amplifizierungs-Primern und einer mitfluoreszierendem Farbstoff markierten Nachweissonde. Die SDA-Reagenzien werden in zwei separaten Einweg-Mikroschälchen getrocknet. Die aufbereitete Probe wird in das Priming-Mikroschälchen gegeben, das bereits dieAmplifizierungs-Primer, eine mit fluoreszierendem Farbstoff markierte Nachweissonde und andere, für die

D�un jour àl�autre sur un site

D�un jour àl�autre

Membre du groupe N % corrects PAT moyen SD % CV SD % CV

LP-HIGH 27 100,0% 47,2 0,94 2,00 1,42 3,02LP-LOW 27 100,0% 44,8 0,44 0,98 2,06 4,59CP/LP/MP-HIGH 27 100,0% 46,2 1,13 2,45 1,79 3,88

CP/LP/MP-LOW 26a 100,0% 43,0 0,00 0,00 2,59 6,01Négatif 108 100,0% 0,0 � � � �

TAI avec échantillons négatifs à LP 108 100,0% 47,8 0,43 0,91 0,34 0,70

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Amplifikation erforderliche Reagenzien enthält. Die Primer amplifizieren einen aus 68 Basenpaaren bestehendenBereich des Mip- (Macrophage Infectivity Potentiator-) Gens von L. pneumophila, das bei allen Serogruppen derSpezies vorhanden ist. Nach der Inkubation wird das Reaktionsgemisch in das Amplifizierungs-Mikroschälchentransferiert, das zwei für die SDA-Reaktion erforderliche Enzyme enthält (eine DNA-Polymerase und eineRestriktionsendonuklease). Die Amplifizierungs-Mikroschälchen werden zum Schutz vor Kontaminierungverschlossen und anschließend in einem temperaturregulierten Fluoreszenzmessgerät inkubiert, das jede Reaktionauf die Entstehung von Amplifikationsprodukten überwacht. Bei jeder Reaktion wird gleichzeitig eine interneAmplifikationskontrolle (IAC) amplifiziert und nachgewiesen, um sicherzustellen, dass die Bedingungen für eineAmplifikation geeignet sind, und um die Gefahr falsch-negativer Ergebnisse aufgrund von Hemmstoffen zureduzieren. Das Vorliegen oder Fehlen von L. pneumophila-DNA wird bestimmt, indem die PAT-Werte (Passes AfterThreshold) für die Probe berechnet und mit zuvor bestimmten Schwellenwerten verglichen werden. Das Gerät gibtdie Ergebnisse automatisch als positiv, negativ oder unbestimmt aus.

REAGENZIEN UND MATERIALIENJede Reagenzienpackung des BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay enthält:

Legionella pneumophila (LP) Priming-Mikroschälchen, (1 x 24)

6 Oligonukleotide ≥ 7,5 pmol, dNTP ≥ 15,2 nmol, 2 Nachweissonden ≥ 22,5 pmol,

Synthetik-Oligonukleotide ≥ 1500 Kopien

Legionella pneumophila (LP) Amplifizierungs-Mikroschälchen, (1 x 24)

Restriktionsenzym: ≥ 33 Einheiten, DNA-Polymerase ≥ 14 Einheiten

10 Priming-Abdeckungen, 16 Amplifizierungsdeckelsiegel (1/2), 8 Entsorgungsbeutel

BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (BD ProbeTec ET-Kit mit Atemwegsproben-/Medienverdünnungsmittel und Kontrollen) (CF*/LP/MP**):

Inhalt: Proben- und Medienverdünnungsmittel: Bicin, Kaliumphosphat, Kaliumhydroxid, DMSO und Proclin, 10 (CF/LP/MP)positive Kontrollen: ≥ 1050 ng DNA aus Lachssperma, ≥ 47,3 µg Tris, ≥ 9,0 µg EDTA, ≥ 3600 Kopien CF-Plasmid, ≥ 4800Kopien LP-Plasmid, ≥ 5400 Kopien MP-Plasmid; 10 (CF/LP/MP) negative Kontrollen: ≥ 1050 ng DNA aus Lachssperma, ≥ 47,3 µg Tris, ≥ 9,0 µg EDTA; 100 2-mL-Röhrchen mit Schnappdeckel

* BD ProbeTec ET DNA-Amplifikationstest zum Nachweis von Chlamydiaceae (CF)

** BD ProbeTec ET DNA-Amplifikationstest zum Nachweis von Mycoplasma pneumoniae (MP)

Geräte, Utensilien und Verbrauchsmaterialien: BD ProbeTec ET-Gerät und Geräteplatte, BD ProbeTec ET-Lysierblock, BD ProbeTec ET-Priming- und Wärmeblock, BD ProbeTec ET-Pipette, -ständer und -Stromversorgung,2-mL-Probenröhrchenhalter, BD ProbeTec ET-Zubehörkit, BD ProbeTec ET-Pipettenspitzen.

Benötigtes, jedoch nicht mitgeliefertes Arbeitsmaterial: Biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II,Vortexmischer, Gefrierschrank (-20 °C und/oder -70 °C oder kälter) ohne Abtauautomatik, Mikrozentrifuge (16 000 x g), Wasserbäder, digitales Thermometer, Wasserbadständer mit Schraubdeckel, andere geeigneteProbenröhrchenständer, QIAGEN QIAamp DNA Stool Mini Kits, 96 � 100 % Ethanol, BBL CultureSwab EZ-Tupfer,BD Probetec ET 2 mL Probenröhrchen und Verschlüsse, Einweghandschuhe, alkoholbeständige Markierungsstifte,Mikropipetten für 25 � 1000 µL, aerosolbeständige Pipettenspitzen, destilliertes Wasser, L. pneumophila ATCC 33152(Philadelphia-1), 0,2 % (Gramm-Vol.%) Rinderalbumin (Fraktion V) in 0,85 % (Gramm-Vol.%) Kochsalzlösung, 1 %(Vol.%) Natriumhypochlorit mit Alconox.*

* 7,5 g Alconox in 1 L 1%iger (Vol.%) Natriumhypochloritlösung auflösen und mischen. Täglich frisch herstellen.

Aufbewahrung und Handhabung: Die BD ProbeTec ET LP-Reagenzienpackungen können bei 2 � 33 °Caufbewahrt werden. Ungeöffnete Reagenzienpackungen nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden.Nach dem Öffnen des Beutels sind die ordnungsgemäß verschlossenen Mikroschälchen 12 Wochen lang bzw. biszum Verfallsdatum haltbar (es gilt der jeweils frühere Zeitpunkt). Nicht einfrieren.

Das BD ProbeTec ET-Kit mit Atemwegsproben-/Medienverdünnungsmittel und Kontrollen (CF/LP/MP) kann bei 2 � 33 °Caufbewahrt werden. Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Nicht einfrieren.

Warnungen und VorsichtsmassnahmenIn-vitro-Diagnostikum.

1. Klinische Proben können pathogene Mikroorganismen, wie z. B. Hepatitis-Viren und HIV, enthalten. BeimUmgang mit allen mit Blut oder anderen Körperflüssigkeiten kontaminierten Artikeln sind die �AllgemeinenVorsichtsmaßnahmen�4-7 sowie die einschlägigen Institutionsrichtlinien zu beachten.

2. Die Handhabung und Aufbereitung von Proben aus den unteren Atemwegen vor der Hitzedeaktivierung bei70 °C sind in einer Sicherheitswerkbank der Klasse II durchzuführen.

3. Als weitere Schutzmaßnahme für potenziell infektiöse Proben aus den unteren Atemwegen sollte während derHitzedeaktivierung bei 70 °C ein Wasserbadständer mit Schraubdeckel verwendet werden.

4. Das BD ProbeTec ET-Verdünnungsmittel für Atemwegsproben und Medien enthält Dimethylsulfoxid (DMSO).DMSO ist beim Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken gesundheitsschädlich. Berührungmit den Augen vermeiden und bei der Handhabung stets Handschuhe tragen. Bei Berührung mit den Augensofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mitviel Wasser.

5. Sicherheitshinweise zur Handhabung der in diesem Verfahren verwendeten QIAGEN-Reagenzien sind demHandbuch für das QIAamp DNA Stool Mini Kit zu entnehmen. QIAGEN-Reagenzien dürfen nicht inBleichlösungen entsorgt werden. QIAGEN-Reagenzien dürfen keinen Bleichlösungen ausgesetzt werden.

6. Einigen Berichten zufolge sind QIAGEN DNA-Extraktionskits nicht für Legionella-PCR-Verfahren geeignet, dadie Reagenzien möglicherweise mit Legionella-DNA kontaminiert sind.8,9 Obgleich diese Möglichkeit gering istund andere Legionella-Spezies außer L. pneumophila in diesen Studien identifiziert wurden, sollte der Anwenderdie Leistung jeder neuen Charge von QIAGEN-Reagenzien vor der Anwendung bei Patientenproben bestätigen.

7. Aufgrund der BD ProbeTec ET-Konstruktion, die das Amplikon-Kontaminierungsrisiko im Testbereich reduziert,ist zwar kein dedizierter Arbeitsbereich erforderlich, jedoch müssen anderweitige Vorsichtsmaßnahmen,insbesondere zur Vermeidung von Probenkontaminierungen während der Aufbereitung, getroffen werden.

8. Reagenzienbeutel mit nicht verwendeten Priming-Mikroschälchen und Amplifizierungs-Mikroschälchen nach demÖffnen UNBEDINGT wieder sorgfältig verschließen. Vor dem Verschließen der Reagenzienbeutel sicherstellen, dassTrockenmittel vorhanden ist.

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9. Die Platte mit den Amplifizierungs-Mikroschälchen MUSS vor dem Verlegen der Platte aus dem BD ProbeTecET-Priming- und Wärmeblock in das BD ProbeTec ET-Gerät mit Amplifizierungsdeckelsiegeln verschlossenwerden. Das Verschließen gewährleistet einen geschlossenen Reaktionsverlauf bei der Amplifikation und beimNachweis und ist notwendig, um eine Kontaminierung des Geräts und des Arbeitsbereichs mitAmplifikationsprodukten zu vermeiden. Die Abdeckung keinesfalls von den Mikroschälchen entfernen.

10. Priming-Mikroschälchen mit Flüssigkeitsresten (nach dem Transfer der Flüssigkeit aus den Priming-Mikroschälchen in die Amplifizierungs-Mikroschälchen) stellen eine mögliche Ziel-Kontaminierungsquelle dar.Die Priming-Mikroschälchen vor dem Entsorgen sorgfältig mit einem Plattendeckelsiegel verschließen.

11. Zur Entsorgung der Amplifizierungs-Mikroschälchen nach dem Test die in den Reagenzienpackungen enthaltenenEntsorgungsbeutel verwenden, um eine Kontaminierung des Arbeitsbereichs mit Amplifikationsprodukten zuvermeiden. Vor der Entsorgung sicherstellen, dass die Beutel ordnungsgemäß verschlossen sind.

12. Um Kreuzkontaminierungen der Proben zu vermeiden, sind bei bestimmten Schritten der Probenaufbereitungund des Testverfahrens die HANDSCHUHE ZU WECHSELN. Sollten die Handschuhe mit den Proben in Berührungkommen, sind sie unverzüglich zu wechseln, um keine anderen Proben zu kontaminieren.

13. Sollten Arbeitsbereich oder Gerätschaften durch Proben oder Kontrollen kontaminiert werden, denkontaminierten Bereich mit 1%igem (Vol.%) Natriumhypochlorit mit Alconox reinigen und gründlich mitWasser spülen. Vor weiteren Tests alle Flächen vollständig trocknen lassen. Vor der Beseitigung von QIAGEN-Probenaufbereitungsreagenzien die betreffenden Bereiche mit Wasser abwischen, bevor die 1%ige (Vol.%)Natriumhypochloritlösung mit Alconox verwendet wird.

14. Für den Transfer aufbereiteter Proben in die Priming-Mikroschälchen und den Probentransfer aus denPriming-Mikroschälchen in die Amplifizierungs-Mikroschälchen ausschließlich die BD ProbeTec ET-Pipette undBD ProbeTec ET-Pipettenspitzen verwenden.

15. Bei der Entsorgung gebrauchter Pipettenspitzen, Probenröhrchen, Priming-Mikroschälchen und sonstigerEinwegmaterialien sind etablierte einschlägige Laborverfahren anzuwenden. Die Einwegmaterialien sorgfältigentsorgen. Abfallbehälter verschließen und entsorgen, sobald sie zu ¾ gefüllt sind oder auch täglich (jenachdem, was früher zutrifft).

16. Mikroschälchen, Kontrollen oder Aufbereitungsreagenzien aus Kits mit verschiedenen Chargennummern nichtgegeneinander austauschen oder kombinieren.

17. In Sonderfällen, wie z. B. bei Verschüttungen im BD ProbeTec ET-Gerät oder DNA-Kontaminierungen, die sichnicht bereinigen lassen, den technischen Kundendienst verständigen.

PROBENENTNAHME UND TRANSPORT1. Probenentnahme

a. Alle Proben sind gemäß den Empfehlungen im Clinical Microbiology Procedures Handbook10 oder demVerfahrenshandbuch des jeweiligen Labors zu entnehmen.

2. Aufbewahrung und Transport von Proben

� Proben höchstens 6 h bei 18 � 33 °C aufbewahren/transportieren.

� Proben können höchstens 3 Tage im Kühlschrank bei 2 � 8 °C aufbewahrt werden.

� Proben können höchstens 14 Wochen bei mindestens -20 °C eingefroren werden.

TESTVERFAHRENBezüglich spezifischer Anweisungen zum Systembetrieb und zur Wartung der Systemkomponenten, siehe dasBenutzerhandbuch für das BD ProbeTec ET-System.

A. Gerätevorbereitung:1. Vor Testbeginn das Gerät einschalten und aufwärmen lassen.

a. Die Aufwärm- und Stabilisierungsdauer für Priming- und Wärmeblock beträgt ca. 90 min.

Der Sollwert für die Priming-Komponente des Priming- und Wärmeblocks ist 72,5 °C.

Der Sollwert für die Wärmekomponente des Priming- und Wärmeblocks ist 54 °C.

b. Das BD ProbeTec ET-Gerät ist softwaregesteuert; die Aufwärmdauer beträgt ca. 30 min.

2. Vor Testbeginn die Blocktemperaturen überprüfen. Die Temperaturen im BD ProbeTec ET-Systemwartung-sprotokoll aufzeichnen.

a. Priming- und Wärmeblock

Der Thermometermesswert des Priming-Blocks muss zwischen 72 � 73 °C betragen.

Der Thermometermesswert des Wärmeblocks muss zwischen 53,5 � 54,5 °C betragen.

3. Die auf dem BD ProbeTec ET-Bildschirm angezeigte Temperatur überprüfen. Der Temperaturwert muss 47,5 � 55,0 °Cbetragen. Die Temperaturen im BD ProbeTec ET-Systemwartungsprotokoll aufzeichnen.

B. Pipette:Bezüglich ausführlicher Erläuterungen zu den Tastaturfunktionen für die BD ProbeTec ET-Pipette, siehe dasBenutzerhandbuch für das BD ProbeTec ET-System. Die BD ProbeTec ET-Pipette muss nach jeder Anwendunggereinigt werden. Anleitungen zur ordnungsgemäßen Reinigung und Wartung der BD ProbeTec ET-Pipette sindbeim technischen Kundendienst erhältlich.

Zur Durchführung des BD ProbeTec ET LP-Tests sind die folgenden Programme erforderlich. Programm 1 dient zumTransfer von Flüssigkeit aus den aufbereiteten Proben in die LP Priming-Mikroschälchen. Programm 5 dient zumTransfer von Flüssigkeit aus den LP Priming-Mikroschälchen in die LP Amplifizierungs-Mikroschälchen. Die Pipettefolgendermaßen programmieren:

Programm 1: 1. Pipette EINschalten. Die Pipette gibt einen Piepton aus, es blinkt �ZERO� (null), es blinkt die Software-

Versionsnummer, und es erfolgt ein weiterer Piepton.

2. Die blaue �Prog�-Taste (Programm) drücken. Die �Vol�-Taste (Volumen) drücken, bis �1� für die Wahl vonProgramm 1 angezeigt wird. �Enter� (Eingabe) drücken.

3. Zum Aufrufen des Programmierungsmodus die �Prog�-Taste drücken und gedrückt halten. Bei gedrückter�Prog�-Taste die Sonderfunktionstaste mit einer Pipettenspitze oder dem Ende einer Heftklammer drücken.

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4. �Fill� (Aspirieren) drücken. Die Nach-Oben-Taste drücken, bis 200 angezeigt wird. �Enter� drücken.

5. �Disp� (Dispensieren) drücken. Die Nach-Oben-Taste drücken, bis 150 angezeigt wird. �Enter� drücken.

6. Erneut �Enter� drücken, um das Programm zu speichern und den Modus zu beenden. Der Abschluss derProgrammierung sollte durch einen Piepton angezeigt werden.

7. Zur Überprüfung des Programms den Auslöser drücken, um die einzelnen Schritte zu durchlaufen. BeimDurchlaufen der einzelnen Schritte die Aspirations-/Dispensierrate mit Hilfe der �Vol�-Taste einstellen. Beijedem Schritt erscheint die Geschwindigkeitsanzeige. Mit Hilfe der �Vol�-Taste die Geschwindigkeitsanzeige soeinstellen, dass 2 Quadrate für die Schritte �Fill� und �Disp� erscheinen.

Programm 51. Die �Prog�-Taste drücken. Die �Vol�-Taste drücken, bis �5� für die Wahl von Programm 5 angezeigt wird.

�Enter� drücken.

2. Zum Aufrufen des Programmierungsmodus die �Prog�-Taste drücken und gedrückt halten. Bei gedrückter�Prog�-Taste die Sonderfunktionstaste mit einer Pipettenspitze oder dem Ende einer Heftklammer drücken.

3. �Fill� drücken. Die Nach-Oben-Taste drücken, bis 100 angezeigt wird. �Enter� drücken.

4. �Disp� drücken. Die Nach-Oben-Taste drücken, bis 100 angezeigt wird. �Enter� drücken.

5. �Mix� (Mischen) drücken. Die Nach-Oben-Taste drücken, bis 50 angezeigt wird. �Enter� drücken.

6. Erneut �Enter� drücken, um das Programm zu speichern und den Modus zu beenden. Der Abschluss derProgrammierung sollte durch einen Piepton angezeigt werden.

7. Zur Überprüfung des Programms den Auslöser drücken, um die einzelnen Schritte zu durchlaufen. BeimDurchlaufen der einzelnen Schritte die Aspirations-/Dispensier-/Mischrate mit Hilfe der �Vol�-Taste einstellen.Bei jedem Schritt erscheint die Geschwindigkeitsanzeige. Mit Hilfe der �Vol�-Taste die Geschwindigkeitsanzeigeso einstellen, dass 2 Quadrate für die Schritte �Fill� und �Disp� erscheinen. Mit Hilfe der �Vol�-Taste die Misch-Geschwindigkeitsanzeige so einstellen, dass 3 Quadrate erscheinen.

Überprüfen der ProgrammeVor Beginn des Verfahrens sollten die Programme überprüft werden. Zum Überprüfen des Programms die PipetteEINschalten. Die blaue �Prog�-Taste drücken. Die �Vol�-Taste (Volumen) drücken, bis die entsprechendeProgrammnummer (1 oder 5) angezeigt wird. �Enter� (Eingabe) drücken. Mit Hilfe des Pipettier-Auslösers dasProgramm Schritt für Schritt durchlaufen.

Programm 1: Dieses Programm aspiriert 200 µL und dispensiert 150 µL in das LP-Mikroschälchen. Die Pipetten-anzeige sollte folgendermaßen aussehen:



Programm 5: Dieses Programm aspiriert 100 µL, dispensiert 100 µL und mischt 50 µL drei Mal. Die Pipettenanzeigesollte folgendermaßen aussehen:



Mix 50 µL � SIII

Null (blinkt)

C. Platten-Layout:Der Plattenanordnungsbericht wird vom BD ProbeTec ET-Gerät ausgegeben, nachdem Testart, Proben-ID, Kontroll-chargennummern und Kit-Chargennummern in das System eingegeben wurden. Der Plattenanordnungsberichtzeigt die physische Anordnung der Proben und Kontrollen auf jeder zu testenden Platte. Diese Anordnung wirdsowohl für die Priming-Mikroschälchenplatte als auch für die Amplifizierungs-Mikroschälchenplatte verwendet. DiePriming-Mikroschälchen für den LP-Test sind durchgehend graue Mikroschälchen-Streifen. Die Amplifizierungs-Mikroschälchen sind grau gestreifte Mikroschälchen-Streifen.

D. Aufbereitung von Proben aus den unteren Atemwegen:

Hinweise zum Vorgehen: � Vor Beginn die wichtigen Verfahrens- und Sicherheitshinweise im Handbuch für das QIAGEN QIAamp DNA

Stool Mini Kit beachten.

� Vor der Probenaufbereitung ein Wasserbad mit destilliertem Wasser füllen und auf 70 °C (± 5 °C) erhitzen.

� Die Behälter und Röhrchen mit einem alkoholbeständigen Markierungsstift kennzeichnen.

� Nach jedem Flüssigkeitstransfer die Pipettenspitze wechseln. Die Verwendung von aerosolbeständigen Pipetten-spitzen wird empfohlen.

� Das BD ProbeTec ET-Atemwegsproben- und Medienverdünnungsmittel (CF/LP/MP) auf Raumtemperaturerwärmen lassen und vor der Verwendung durch behutsames Umkehren mischen.

� Die benötigte Menge BD ProbeTec ET-Atemwegsproben- und Medienverdünnungsmittel (CF/LP/MP) in einensauberen Behälter geben. Zur Abschätzung der benötigten Menge 0,4 mL für jede Probe verwenden undweitere 1 � 2 mL zugeben, um das Pipettieren zu erleichtern. Um Kontaminierungen des Verdünnung-smittels zu vermeiden, Verdünnungsmittelreste nicht in die Flasche zurückgießen.

1. Die QIAGEN-Reagenzien vorbereiten (siehe den Abschnitt zur Vorbereitung der Reagenzien im Handbuch fürdas QIAamp DNA Stool Mini Kit).

2. Die Proben auf Raumtemperatur aufwärmen lassen.

3. Für jede zu untersuchende Probe ein 2-mL-Röhrchen mit Schnappdeckel kennzeichnen.

Die nachstehenden Schritte müssen in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden:4. Die Proben 5 � 15 s im Vortexmischer gründlich mischen.

5. 350 µL Probe in das gekennzeichnete Röhrchen pipettieren.

HINWEIS: Sputumproben sind u.U. schwer in genauer Menge zu pipettieren. In diesem Fall die Masseinteilungen amRöhrchen verwenden, um sicherzustellen, dass das korrekte Volumen in das Röhrchen gegeben wird. Alternativdazu kann ein Röhrchen mit 350 µL Wasser als Richtlinie verwendet werden.

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6. Nach der Zugabe der Proben die HANDSCHUHE WECHSELN.

7. In jedes Röhrchen 150 µL QIAGEN ASL-Puffer pipettieren.

8. In jedes Röhrchen 25 µL QIAGEN Proteinase K pipettieren.

9. In jedes Röhrchen 500 µL QIAGEN AL-Lysierpuffer pipettieren.

10. Jedes Röhrchen mit einem Deckel verschließen und 5 s im Vortexmischer mischen. Die Röhrchen in einenWasserbadständer mit Schraubdeckel stellen.

Die nachstehenden Schritte können ausserhalb einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden:11. Die Röhrchen 15 min im Wasserbad bei 70 °C (± 5 °C) inkubieren.

12. Die Röhrchen nach 15 min aus dem Wasserbad nehmen und etwa 5 s bei 16 000 x g zentrifugieren.

13. Die Röhrchen aus der Zentrifuge nehmen. Den Deckel jedes Röhrchens abnehmen und 500 µL 96 � 100%igesEthanol zugeben.

14. Die Röhrchen wieder verschließen und 5 s mit dem Vortexmischer mischen.

15. Die Proben etwa 5 s bei 16 000 x g zentrifugieren.

16. Für jede Probe eine QIAGEN-Säule (Spin Column) und ein Sammelröhrchen kennzeichnen.

17. 700 µL Probe in die entsprechend gekennzeichnete QIAGEN-Säule geben.

18. Die Röhrchen etwa 1 min bei 16 000 x g zentrifugieren.

19. Die Säulen in neue QIAamp-Sammelröhrchen geben. Die Röhrchen mit dem Filtrat verwerfen.

20. Weitere 700 µL Probe vorsichtig in die entsprechende Säule geben.


22. Die Säulen in saubere QIAamp-Sammelröhrchen geben. Die Röhrchen mit dem Filtrat verwerfen.

23. Die QIAamp-Säulen öffnen und je 500 µL QIAGEN AW1-Waschpuffer zugeben.


25. Die Säulen in neue QIAamp-Sammelröhrchen geben. Die Röhrchen mit dem Filtrat verwerfen.

26. Die QIAamp-Säulen öffnen und je 500 µL QIAGEN AW2-Waschpuffer zugeben.


28. Die Säulen in die letzten gekennzeichneten QIAamp-Sammelröhrchen geben. Die Röhrchen mit dem Filtratverwerfen.

HINWEIS: Das Sammelröhrchen sollte zu diesem Zeitpunkt gekennzeichnet sein.

HINWEIS: Sicherstellen, dass keine Flüssigkeit am Boden der Säule haften bleibt. Eine Übertragung vonWaschlösungsrückständen in das Sammelröhrchen kann die Ergebnisse beeinträchtigen.

29. Die Säulen öffnen und je 225 µL QIAGEN AE-Elutionspuffer zugeben.

30. Bei Raumtemperatur 1 min inkubieren.


32. Die Säulen entsorgen.

33. Für jede Probe ein 2-mL-Röhrchen mit Schnappdeckel kennzeichnen.

34. Jedem Röhrchen 400 µL Atemwegsproben- und Medienverdünnungsmittel (CF/LP/MP) zugeben.

HINWEIS: Ein Wasserbad mit destilliertem Wasser füllen und für Schritt 38 zum Kochen bringen.

35. 200 µL Eluat in das entsprechend gekennzeichnete Röhrchen mit 400 µL Atemwegsproben- und Medien-verdünnungsmittel (CF/LP/MP) überführen.

36. Die Röhrchen verschließen und 5 s mit dem Vortexmischer mischen.

37. Die Kontrollen vorbereiten. Siehe Aufbereitung der Kontrollen für Proben aus den unteren Atemwegen(Abschnitt E).

38. Die Proben und Kontrollen in einen Wasserbadständer stellen.

39. Den Wasserbadständer 5 min in das kochende Wasser stellen.

40. Nach Ablauf der 5 min den Wasserbadständer herausnehmen und die Röhrchen bei Raumtemperatur 15 minabkühlen lassen.

WARNUNG: Vorsichtig vorgehen, um Verbrühungen durch das kochende Wasser, den Wasserbadständer oderheißen Flächen des Wasserbads zu vermeiden.

41. Nach dem Abkühlen etwa 5 s bei 16 000 x g zentrifugieren.

HINWEIS: Nach dem Abkochen der Proben:

a. Können diese bis zu 6 h bei 18 � 33 °C aufbewahrt und ohne erneutes Abkochen getestet werden.

b. Können diese bis zu 3 Tage bei 2 � 8 °C aufbewahrt werden. Vor dem Testen müssen die Proben mit demVortexmischer gemischt und erneut abgekocht werden.

c. Können diese bis zu 14 Wochen bei ≤ -20 °C aufbewahrt werden. Vor dem Testen müssen die Proben beiRaumtemperatur aufgetaut, mit dem Vortexmischer gemischt und erneut abgekocht werden.

42. Die Proben können nun nach den Anleitungen unter Durchführung des BD ProbeTec ET LP-Tests (Abschnitt F)getestet werden.

E. Aufbereitung der Kontrollen für Proben aus den unteren Atemwegen:1. Für jeden Lauf (jede zu testende Platte) ein Röhrchen negative Kontrolle (CF/LP/MP) und ein Röhrchen positive

Kontrolle (CF/LP/MP) aufbereiten. Sollte die Platte mehr als eine Reagenzienpackung-Chargennummerumfassen, sind für jede Charge Kontrollen mitzuführen.

2. Den QIAGEN AE-Puffer und das Atemwegsproben- und Medienverdünnungsmittel vor der Verwendungbehutsam umkehren.

3. Die Kappe des Röhrchens mit der negativen Kontrolle (CF/LP/MP) entfernen.

4. Für jedes Kontrollröhrchen eine neue Pipettenspitze verwenden und 200 µL QIAGEN AE-Puffer zugeben.

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5. Für jedes Kontrollröhrchen eine neue Pipettenspitze verwenden und 400 µL Atemwegsproben- undMedienverdünnungsmittel zugeben.

6. Das Röhrchen wieder fest verschließen.

7. Die Kappe des Röhrchens mit der positiven Kontrolle (CF/LP/MP) entfernen.

8. Für jedes Kontrollröhrchen eine neue Pipettenspitze verwenden und 200 µL QIAGEN AE-Puffer zugeben.

9. Für jedes Kontrollröhrchen eine neue Pipettenspitze verwenden und 400 µL Atemwegsproben- undMedienverdünnungsmittel zugeben.

10. Das Röhrchen wieder fest verschließen.

11. Die Kontrollröhrchen 5 s mit dem Vortexmischer mischen.

12. Die Kontrollen können nun abgekocht werden. Siehe Aufbereitung von Proben aus den unteren Atemwegen(Abschnitt D).

F. Durchführung des BD ProbeTec ET LP-Tests:

HINWEIS: Vor der Durchführung des Tests die aufbereiteten Proben und Kontrollen in einem Ständer für 2-mL-Probenröhrchen aufstellen (z. B. dem BD ProbeTec ET 2-mL-Röhrchenständer), der mit der BD ProbeTec ET-Pipettekompatibel ist.

1. Die Kappen der abgekühlten Proben- und Kontrollröhrchen entfernen.

2. Vor dem weiteren Vorgehen die HANDSCHUHE WECHSELN, um Kontaminierungen zu vermeiden.

3. Anhand des Plattenanordnungsberichts die Priming-Platte vorbereiten � siehe Platten-Layout (Abschnitt C).4. Die Beutel mit den Mikroschälchen wieder folgendermaßen verschließen:

a. Den Beutel auf eine ebene Fläche legen. Das offene Ende mit einer Hand flach halten.

b. Unter Druckausübung mit dem Finger über den Außenrand der Dichtung fahren (von Beutelrand zu Beutelrand).

c. Sicherstellen, dass der Beutel fest verschlossen ist.

5. An der BD ProbeTec ET-Pipette Programm 1 wählen.

6. Pipettenspitzen aufnehmen. Die BD ProbeTec ET-Pipette ausfahren; dazu den Abstandsregler vollständigherausziehen.HINWEIS: Sicherstellen, dass die Spitzen fest auf der Pipette sitzen, um Sickerverluste zu vermeiden.

7. Aus der 1. Probenspalte 200 µL aspirieren.

8. Die Pipette behutsam kollabieren, die Pipettenspitzen an den Schälchenrändern abstreifen und 150 µL in dieentsprechende Spalte der Priming-Mikroschälchen (1 A � H) dispensieren.HINWEIS: Die Pipette nicht über Proben oder Mikroschälchen kollabieren, da dies zu Kontaminierung führenkönnte. Durch abrupte Bewegungen können Tröpfchen oder Aerosole entstehen.

9. Die Spitzen auswerfen. Die Pipette durch Drücken des Pipettenauslösers zurücksetzen.HINWEIS: Die Spitzen vorsichtig auswerfen, um die Bildung von Tröpfchen oder Aerosolen zu vermeiden, durchdie der Arbeitsbereich kontaminiert werden könnte.

10. Neue Spitzen aufnehmen, die Pipette ausfahren, und 200 µL aus der 2. Probenspalte aspirieren.

11. Die Pipette behutsam kollabieren, die Pipettenspitzen an den Schälchenrändern abstreifen, und 150 µL in diezweite Spalte der Priming-Mikroschälchen (2 A � H) dispensieren.

12. Die Spitzen auswerfen.

13. Die restlichen Proben für den Lauf transferieren.

14. Die Priming-Mikroschälchenplatte mit der Priming-Abdeckung bedecken und mindestens 20 min bei Raum-temperatur inkubieren. (Bis zu 6 h ruhen lassen.) HINWEIS: Die aufbereiteten Proben mit neuen Kappenverschließen. HANDSCHUHE WECHSELN.

15. Zum Abschluss der Priming-Inkubation die Amplifizierungs-Mikroschälchenplatte vorbereiten. DieAmplifizierungs-Mikroschälchen so auf einer Platte konfigurieren, dass sie dem Plattenanordnungsberichtentsprechen (wie bei der Priming-Platte). Die Beutel mit den Mikroschälchen wieder verschließen, wie in Schritt4 beschrieben.

16. Die Abdeckung der Priming-Mikroschälchenplatte entfernen, und die Platte in den Priming-Block transferieren.Die Amplifizierungs-Mikrotiterplatte SOFORT zum Vorwärmen in den Wärmeblock geben.

17. Den Zeitgeber auf 10 min einstellen. (HINWEIS: Bei diesem Schritt ist die genaue Zeiteinhaltungausschlaggebend.)

18. Nach Ablauf der Inkubationsdauer von 10 min (± 1 min) an der Pipette das Programm 5 wählen.

19. Pipettenspitzen aufnehmen und 100 µL aus Spalte 1 der Priming-Mikrotiterplatte zu Spalte 1 derAmplifizierungs-Mikrotiterplatte übertragen. Die Pipettenspitzen an den Schälchenrändern abstreifen und dieFlüssigkeit dispensieren. Nach dem Dispensieren die Flüssigkeit in den Schälchen von der Pipette automatischmischen lassen. Die Pipette vorsichtig von der Platte abheben. Darauf achten, dass keine anderen Schälchenberührt werden.

20. Die Spitzen auswerfen. Neue Spitzen aufnehmen und das Reaktionsgemisch weiterhin Spalte für Spalte aus denPriming-Mikroschälchen in die Amplifizierungs-Mikroschälchen übertragen (dabei für jede Spalte neue Spitzenverwenden).

21. Nach dem Übertragen der letzten Spalte die Rückseite eines Amplifizierungsdeckelsiegels abziehen. (EinAmplifizierungsdeckelsiegel (1/2) deckt bis zu 6 Spalten ab. Umfasst die Platte mehr als 6 Spalten MUSS einvollständiger Bogen Deckelsiegel verwendet werden.) Das Deckelsiegel an den Kanten fassen und über denMikroschälchen zentrieren. Die Markierungen am Wärmeblock erleichtern das Anbringen des Deckelsiegels.Das Deckelsiegel nach unten andrücken, um sicherzustellen, dass sämtliche Mikroschälchen vollständigverschlossen sind.

22. An der BD ProbeTec ET-Benutzerschnittstelle den Träger ausfahren, die Tür öffnen und die Plattenabdeckunganheben. Die verschlossene Amplifizierungs-Mikroschälchenplatte SOFORT (innerhalb von 30 s) in das BD ProbeTec ET-Gerät einsetzen und den Lauf einleiten. (Bezüglich ausführlicher Anweisungen, siehe dasBenutzerhandbuch für das BD ProbeTec ET-System.)

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23. Nach dem Einleiten des Laufes die folgenden Aufräumarbeiten erledigen:

a. Die Priming-Mikroschälchen mit dem Amplifizierungsdeckelsiegel verschließen und die Platte aus demPriming- und Wärmeblock entnehmen. WARNUNG: Die Temperatur beträgt über 70 °C. Daher zumEntnehmen der Platte Wärmeschutzhandschuhe anlegen.

b. Die Platte auf der Arbeitsfläche 5 min abkühlen lassen.

c. Die verschlossenen Priming-Mikroschälchen aus der Platte entfernen; dazu das Deckelsiegel an beidenSeiten fassen und gemeinsam mit den Schälchen gerade nach oben herausheben. Die verschlossenenMikroschälchen in einen Entsorgungsbeutel geben und diesen verschließen.

d. Die Metallplatte säubern:

Die Platte mit einer Lösung aus 1%igem (Vol.%) Natriumhypochlorit und Alconox spülen.

Die Platte mit Wasser abspülen.

Die Platte in ein sauberes Papiertuch wickeln und vor dem erneuten Gebrauch vollständig trocknen lassen.

24. Nach Abschluss des Laufes wird ein Ausdruck der Testergebnisse erstellt.

25. Den Plattenträger aus der Bühne herausbewegen, die Tür öffnen, und die Platte entnehmen. Die Tür schließen,und die Plattenbühne wieder in das Gerät bewegen.

26. Die verschlossenen Amplifizierungs-Mikroschälchen aus der Platte entfernen. VORSICHT: Das Deckelsiegelnicht von den Mikroschälchen entfernen. Die verschlossenen Mikroschälchen können leicht gemeinsamentnommen werden; dazu das Deckelsiegel oben und unten fassen und gerade nach oben aus der Platteherausheben. Die verschlossenen Mikroschälchen in den Entsorgungsbeutel geben. Den Beutel verschließen.

27. Die Metallplatte säubern:

Die Platte mit einer Lösung aus 1%igem (Vol.%) Natriumhypochlorit und Alconox spülen.

Die Platte mit Wasser abspülen.

Die Platte in ein sauberes Papiertuch wickeln und vor dem erneuten Gebrauch vollständig trocknen lassen.

28. Nach dem letzten Lauf des Tages die folgenden Reinigungsmaßnahmen durchführen:

a. Papiertücher oder Gazekissen mit der Lösung aus 1%igem (Vol.%) Natriumhypochlorit und Alconox tränkenund auf Arbeitsflächen und die Außenflächen des Priming- und Wärmeblocks, des 2-mL-Probenröhrchenständers, der Wasserbäder, der Zentrifuge und des BD ProbeTec ET-Geräts auftragen. DieLösung 2 � 3 min auf den Flächen belassen. Papiertücher oder Gazekissen mit Wasser tränken und dieReinigungslösung entfernen. Beim Auftragen der Reinigungslösung und beim Spülen mit Wasser die Tücheroder Gazekissen häufig wechseln. Papiertücher oder Gazekissen mit einer Lösung aus 1%igem (Vol.%)Natriumhypochlorit mit Alconox befeuchten und den Pipettengriff damit abwischen (AUSSCHLIESSLICH DENGRIFF). Den Griff nach 2 � 3 min mit wasserbefeuchteten Papiertüchern oder Gazekissen abwischen.

b. Den Wasserbadständer und die Platten 1 � 2 min in 1%iges (Vol.%) Natriumhypochlorit mit Alconoxeinlegen. Gründlich mit Wasser spülen und an der Luft trocknen lassen.

c. Die Pipette aufladen.

d. Den verschlossenen Entsorgungsbeutel und den Beutel mit biogefährlichem Abfall gemäß der etabliertenVerfahren für kontaminierten Abfall entsorgen.

29. Die nachstehenden Verfahren mindestens einmal wöchentlich durchführen:

a. Das Wasser in den Wasserbädern entsorgen.

b. Die Wasserbäder mit einer Lösung aus 1%igem (Vol.%) Natriumhypochlorit mit Alconox reinigen. Mitsauberem Wasser nachspülen und trocknen lassen.

c. Erneut mit destilliertem Wasser füllen.

QualitätskontrolleDie Qualitätskontrollen müssen unter Einhaltung der örtlich, landesweit und/oder bundesweit geltendenBestimmungen oder der Auflagen der Akkreditierungsorganisationen sowie der Standard-QualitätskontrollverfahrenIhres Labors erfolgen. Es wird empfohlen, die korrekten Qualitätskontrollverfahren den geltenden CLSI (ehemalsNCCLS)-Richtlinien und CLIA-Bestimmungen zu entnehmen.

Das Atemwegsproben- und Medienverdünnungsmittel sowie die Kontrollen werden zusammen im Respiratory andMedia Diluent and Control Kit (CF/LP/MP) geliefert. Beim Testen jeder Platte und für jede neue Reagenzien-Kit-Chargennummer müssen je eine positive Kontrolle und eine negative Kontrolle mitgeführt werden. Die Kontrollenkönnen randomisiert platziert werden. Die positive Kontrolle dient zur Überprüfung erheblichen Reagenzienversagens.Die negative Kontrolle dient zur Überprüfung auf Reagenzien- und/oder Umgebungskontaminierung. Die positive unddie negative Kontrolle müssen positiv bzw. negativ ausfallen, damit Probenergebnisse berichtet werden können. Wenndie Kontrollen nicht erwartungsgemäß ausfallen, ist der Testlauf ungültig, und die Patientenergebnisse werden vomGerät nicht berichtet. Wenn die Testkontrollen nicht die erwarteten Ergebnisse erbringen, den gesamten Lauf mit einemneuen Kontrollenset, neuen Mikroschälchen und den aufbereiteten Proben wiederholen. Falls nicht genügendaufbereitetes Probenmaterial für einen Wiederholtest vorhanden ist, eine weitere Teilmenge der ursprünglichen Probeaufbereiten. Falls der Wiederholungstest weiterhin nicht die erwarteten Ergebnisse liefert, bitte den technischenKundendienst verständigen (siehe "Interpretation der Testergebnisse").

Das Priming-Mikroschälchen enthält eine aufgetrocknete interne Amplifikationskontrolle (IAC). Die IAC enthält einNukleinsäure-Ziel, das in Gegenwart der Probenmatrix amplifiziert wird. Diese IAC dient zur Validierung derAmplifikationsreaktion und der Identifizierung potenzieller Hemmstoffe in der aufbereiteten Probe.

Proben als VerfahrenskontrollenProbenkontrollen können in Übereinstimmung mit den Anforderungen der jeweiligen Akkreditierungsorganisationengetestet werden. Das gesamte Testsystem sollte mit einer positiven Kontrolle getestet werden. Zu diesem Zweckkönnen bekannt positive Proben als Kontrollen dienen, indem sie mit unbekannten Proben aufbereitet und getestetwerden. Proben, die als Verfahrenskontrollen verwendet werden, müssen gemäß den Angaben in derPackungsbeilage aufbewahrt, aufbereitet und getestet werden. Probenkontrollen, die Proben aus den unterenAtemwegen simulieren, können auch wie nachstehend beschrieben hergestellt werden.

1. Ein Röhrchen gefriergetrocknete L. pneumophila ATCC 33152 (Philadelphia-1) aus dem Gefrierschrank (mindestens-20 °C) nehmen.

2. Mit 1 mL 0,85%iger (Gramm-Vol.%) Kochsalzlösung mit 0,2 % Rinderalbumin (Fraktion V) rehydrieren.

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3. Die rehydrierte L. pneumophila-Stammlösung in einer Lösung aus 0,2 % (Gramm-Vol.%) Rinderalbumin(Fraktion V) und 0,85 % (Gramm-Vol.%) Kochsalzlösung 1:100 000 verdünnen.

4. 350 µL der verdünnten L. pneumophila-Lösung in ein Röhrchen mit Schnappdeckel pipettieren.

5. Wie unter Aufbereitung von Proben aus den unteren Atemwegen (Abschnitt D) beschrieben aufbereiten.

Überprüfung auf Vorliegen von DNA-Kontaminierungen Die folgenden Testverfahren sollten mindestens einmal im Monat durchgeführt werden, um den Arbeitsbereich unddie Geräteoberflächen auf das Vorliegen von DNA-Kontaminierungen zu überprüfen. Die Überprüfung des Umfeldsist äußerst wichtig, um eine Kontaminierung bereits vor der Entstehung von Schwierigkeiten zu erkennen.

1. Für jeden zu testenden Bereich* einen BBL CultureSwab EZ-Abstrichtupfer verwenden.

2. Für jeden zu testenden Bereich ein 2-mL-Röhrchen mit Schnappdeckel kennzeichnen. 600 µL Atemwegsproben-und Medienverdünnungsmittels in jedes Röhrchen pipettieren und 300 µL QIAGEN AE-Puffer oder destilliertesWasser (molecular grade) zugeben. 5 s mit dem Vortexmischer mischen.

3. Die rehydrierte L. pneumophila-Stammlösung in einer Lösung aus 0,85 % (Gramm-Vol.%) Kochsalzlösung mit0,2 % (Gramm-Vol.%) Rinderalbumin (Fraktion V) im Verhältnis 1:100 000 verdünnen.

4. Den Abstrichtupfer im Verdünnungsmittel drehen und an der Röhrchenwand ausdrücken. Das Röhrchen wiederverschließen und 5 s mit dem Vortexmischer mischen. Den Abstrichtupfer entsorgen.

5. Dieses Verfahren für jeden zu testenden Bereich wiederholen.

6. Die Röhrchen in einen Wasserbadständer stellen und 5 min im kochenden Wasserbad erhitzen. Den Ständer ausdem Wasser nehmen und die Proben vor dem weiteren Vorgehen bei Raumtemperatur 15 min abkühlen lassen.

7. Nach dem Abkühlen etwa 5 s bei 16 000 x g zentrifugieren.

8. Während der Erhitzung der Röhrchen mit Hilfe eines wassergetränkten sauberen Tuches diePuffermischungsrückstände von den getesteten Bereichen entfernen.

9. Nachdem die Proben abgekühlt sind, mit der Durchführung des BD ProbeTec ET LP-Tests (Abschnitt F)fortfahren.

*Es wird empfohlen u. a. folgende Bereiche zu testen: Oberflächen des Wasserbadständers, der Mikrozentrifuge,des Priming- und Wärmeblocks, der schwarzen Mikroschälchenplatten, des Pipettengriffs, der Berührungstastendes Geräts, der Geräte-Tastatur, der Wasserbäder, der Probenständer und der Arbeitsflächen, einschließlichAufbereitungsbereichen.

Wenn ein Bereich ein positives Ergebnis zeigt, diesen mit frischem 1%igem (Vol.%) Natriumhypochlorit mit Alconoxsäubern. Sicherstellen, dass der gesamte Bereich mit der Reinigungslösung benetzt wird, und die Lösung mindestens2 min bzw. bis zum Trocknen einwirken lassen. Falls erforderlich, überschüssige Lösung mit einem sauberen Tuchaufnehmen. Den Bereich mit einem sauberen, mit Wasser getränkten Tuch abwischen und trocknen lassen. DenBereich erneut testen. Bis zum Erhalt negativer Ergebnisse wiederholen. Falls sich die Kontaminierung nichtbeseitigen lässt, bitte zusätzliche Informationen vom technischen Kundendienst anfordern.

INTERPRETATION DER ERGEBNISSEDas Vorliegen bzw. das Fehlen von L. pneumophila-DNA wird bestimmt, indem die PAT-Werte (Passes AfterThreshold) für die Probe berechnet und mit zuvor bestimmten Schwellenwerten verglichen werden. Der PAT-Wertist ein Maßstab zur Beurteilung der Stärke des Signals, das bei der Reaktion entsteht. Für diesen Maßstab bedeutenhöhere Werte, dass der Schwellenwert im Anfangsstadium der Amplifikation erreicht wurde, während niedrigereWerte bedeuten, dass der Schwellenwert in späteren Phasen der Reaktion erreicht wurde. Die Höhe des PAT-Wertsgibt keinen Aufschluss über die Konzentration von L. pneumophila-DNA in der Probe.

Falls die Kontrollergebnisse nicht erwartungsgemäß ausfallen, sollten die Patientenergebnisse nicht berichtetwerden. Bezüglich der erwarteten Kontrollwerte, siehe den Abschnitt zur Qualitätskontrolle. Berichtete Ergebnissewerden wie folgt bestimmt:

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Proben aus den unteren Atemwegen:

a Den BD ProbeTec ET LP-Test anhand der aufbereiteten Röhrchenprobe wiederholen. Wenn keine ausreichendeMenge des aufbereiteten Probenmaterials verfügbar ist, anhand der ursprünglichen Probe wiederholen. Wenn dasWiederholergebnis positiv oder negativ ausfällt, ist es wie oben zu interpretieren. Wenn das Wiederholergebnisunbestimmt ausfällt, eine neue Probe anfordern.

Bestimmung des LP- und IAC-Schwellenwerts:Die Schwellenwerte für die L. pneumophila-Ziel-DNA und die IAC wurden ursprünglich anhand von ROC-Kurvenanalysen von Daten positiver und negativer Kontrollen ermittelt. Diese Schwellenwerte wurden in klinischenStudien sowie mit retrospektiven L. pneumophila-positiven und -negativen Proben der unteren Atemwegebestätigt. Die Schwellenwerte wurden danach in weiteren klinischen Studien validiert.

VERFAHRENSBESCHRÄNKUNGEN1. Der BD ProbeTec ET LP-Test ist nur spezifisch für L. pneumophila der Serogruppen 1 - 14. Andere L. pneumophila-

Serogruppen wurden nicht getestet.2. Der BD ProbeTec ET LP-Test erkennt keine Infektionen, die von anderen Legionella-Spezies verursacht werden.3. Die Leistungsmerkmale für den BD ProbeTec ET LP-Test wurden ausschließlich mit Sputumproben bestimmt.

Das Verhalten bei anderen Probenarten wurde nicht untersucht. 4. Der BD ProbeTec ET LP-Test wurde bisher nur für Patienten über 13 Jahren beurteilt. 5. Wie bei zahlreichen anderen diagnostischen Tests sollten die Ergebnisse des BD ProbeTec ET LP-Tests in

Verbindung mit anderen dem behandelnden Arzt zur Verfügung stehenden Labordaten und klinischen Dateninterpretiert werden.

6. Ein negatives Testergebnis schließt die Möglichkeit einer Infektion nicht aus, da die Testergebnisse durchunsachgemäße Probenentnahme, technische Fehler, Probenverwechslung, gleichzeitige Antibiotika-Therapieoder eine L. pneumophila-DNA-Konzentration unterhalb der analytischen Nachweisgrenze beeinträchtigtwerden können.

7. Der BD ProbeTec ET LP-Test kann nicht zur Beurteilung eines Therapieerfolgs oder -versagens verwendetwerden, da Nukleinsäuren von L. pneumophila auch nach einer Antibiotikatherapie vorliegen können.

8. Der BD ProbeTec ET LP-Test wurde noch nicht an Umweltproben (z. B. Trinkwasser oder bei Wasserqualität-sprüfungen) beurteilt.

9. Voraussetzung für die optimale Leistung dieses Tests ist die ordnungsgemäße Probenentnahme undHandhabung.

10. Die Verwendung des BD ProbeTec ET LP-Tests beschränkt sich auf Personal, das im Testverfahren geschult undmit dem BD ProbeTec ET-System vertraut ist.

11. Der BD ProbeTec ET LP-Test liefert qualitative Ergebnisse. Die Höhe des PAT-Werts erlaubt keinen Aufschlussüber die Konzentration der L. pneumophila-DNA in einer Probe.

ZU ERWARTENDE ERGEBNISSE

A. Prävalenz Die Rate der positiven Ergebnisse bei L. pneumophila-Tests variiert je nach Testmethode, Alter des Patienten,vorhandenen Risikofaktoren, geographischer Lage und vor allem lokalen Krankheitsvorkommen, einschließlichKrankheitsausbrüchen.

B. PAT-Wert-HäufigkeitsverteilungInsgesamt 83 retrospektive Sputumproben wurden an vier Kliniken in den USA, Europa und Kanada gesammelt undmit dem BD ProbeTec ET LP-Test getestet. Eine Häufigkeitsverteilung der LP-PAT-Werte ist in Abbildung 1 dargestellt.

PAT-WertLP-Ziel IAC-Ziel Ergebnis Interpretation Bericht

> 0 > oder = 0 Positiv Nachweis von L. pneumophila-DNA mittels SDA.

Positiv für Organismen der L. pneumophila-Serogruppen1 - 14, deutet aufgegenwärtige Infektion hin.Weitere Tests zurIdentifizierung der Serogruppenotwendig, falls fürepidemiologische Zweckeerforderlich.

= 0 > 0 Negativ Kein Nachweis von L. pneumophila-DNA mittelsSDA.

Präsumtiv negativ fürOrganismen der L. pneumophila-Serogruppen1 � 14 in einer Probe aus denunteren Atemwegen; deutetauf keine gegenwärtige oderzurückliegende Infektion hin.Eine Infektion durchLegionella kann nichtausgeschlossen werden, da:1) andere Serogruppen außer1 � 14 und andere Legionella-Spezies Infektionenverursachen können und 2)die DNA-Konzentration ggf.unterhalb der Nachweisgrenzedes Tests liegt.

= 0 = 0 Unbestimmt Amplifikationskontrollegehemmt. Zur Interpretationder Ergebnisse sindzusätzliche Test erforderlich.a

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Abbildung 1: Häufigkeitsverteilung der LP-PAT-Werte im Vergleich zu Kulturen

C. KontrollenWährend der klinischen Beurteilung versagte die Kontrolle des BD ProbeTec ET LP-Tests bei einem von 46 Testläufen(d.h. bei einem Testlauf trat ein Verfahrensfehler auf). Die LP-PAT-Werte für die restlichen 45 Testläufe sind in Tabelle 1zusammengefasst.

Tabelle 1: Häufigkeitsverteilung der LP-PAT-Werte von Atemwegsproben- und Medien-Kontrollen

LEISTUNGSMERKMALE

Prospektive StudieDer BD ProbeTec ET LP-Test wurde während der Erkältungssaison 2002 � 2003 an sieben Kliniken in den USA und inKanada prospektiv beurteilt. Von jedem Patienten wurden eine Sputum- und eine Urinprobe entnommen. Sputumprobenwurden mit dem BD ProbeTec ET LP-Test, in Legionella-Kultur und mit einem direkten Fluoreszenz-Antikörper-Test (DFA)getestet. Urinproben wurden mit einem handelsüblichen L. pneumophila-Urinantikörper-Test getestet.

Insgesamt 118 Patienten entsprachen den Kriterien für die Aufnahme in die Studie (d.h. radiologischnachgewiesene Pneumonie, Alter ≥ 13 Jahre, Antibiotikatherapie seit ≤ 14 Tagen, gültige Probenarten entnommen,Durchführung entsprechender Referenzmethoden usw.). Die BD ProbeTec ET LP-Testergebnisse von 114 der 118Patienten waren gültig. Zur Beurteilung der Leistungsmerkmale wurden die Ergebnisse der Sputumproben mit denErgebnissen der Sputumkultur verglichen.

Eine Probe wurde als positiv beurteilt, wenn das Kulturergebnis positiv war. Für alle anfänglich unbestimmtenErgebnisse musste der Test mit der aufbereiteten Probe oder der ursprünglichen Probe wiederholt werden (wenndie aufbereitete Probe nicht ausreichend war). Eine Probe, die anfänglich und wiederholt (d.h. endgültig)unbestimmte Ergebnisse lieferte, wurde nicht in die Bestimmung der Leistungsmerkmale miteinbezogen. EineProbe, die anfänglich unbestimmte Ergebnisse lieferte und bei der Testwiederholung positiv oder negativ war,wurde in die Bestimmung der Leistungsmerkmale miteinbezogen. Eine Probe, die anfänglich ein unbestimmtesErgebnis lieferte und die aufgrund von mangelndem Probenvolumen nicht erneut getestet werden konnte, bliebals �anfänglich unbestimmt� eingestuft und wurde nicht in die Bestimmung der Leistungsmerkmale miteinbezogen.

Die Ergebnisse des BD ProbeTec ET LP-Tests der Sputumproben im Vergleich zu Kulturergebnissen sind in Tabelle 2zusammengefasst.

Kontrolle N Bereich 5. Perzentil Mittelwert Medianwert 95. Perzentil

LP-negativ 45 0 � 0 0 0 0 0

LP-positiv 45 29,4 � 50,7 40,1 46,7 47,6 49,7

Kulturergebnis 0 1 � 19 20 � 39 40 � 60 Gesamt

Negativ

Positiv

52 0 4 4

2 0 2 19

60

23

Gesamt 54 0 6 23 83

04 42 0 2

19

0

10

20

30

40

50

60

0 1 - 19 20 - 39 40 - 60

LP-PAT-Wert

Häu

fig

keit

Kultur -

Kultur +

(-) (+)

52

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Tabelle 2: BD ProbeTec ET LP-Test - Ergebnisse von prospektiven Sputumproben im Vergleich zuKulturergebnissen

a Alle 114 kulturnegativen Proben erwiesen sich im direkten Fluoreszenz-Antikörper-Test (DFA) als negativ. 87 der 114Patienten wurden zusätzlich mit einem Urinantigen-Test getestet und erwiesen sich als negativ.

b Eine Probe erwies sich im Wiederholungstest als negativ und wurde in die Spezifitätsberechnung miteinbezogen.Eine Probe konnte aufgrund von mangelndem Volumen nicht erneut getestet werden.

c Zwei Proben blieben auch nach wiederholten Tests unbestimmt. Eine Probe konnte aufgrund von mangelndemVolumen nicht erneut getestet werden.

NZ = Nicht zutreffend

RETROSPEKTIVE STUDIEDer BD ProbeTec ET LP-Test wurde ebenfalls anhand von 83 retrospektiven Sputumproben aus Kliniken in den USA,Europa und Kanada beurteilt. Die retrospektiven Proben waren bis zu 6 Jahre eingefroren, wobei der Großteil derProben (65,1 %; 54/83) weniger als 2 Jahre eingefroren war.Jedes Labor protokollierte das ursprüngliche Kulturergebnis jeder retrospektiven Probe. Jedes Labor testete dieSputumproben mit dem BD ProbeTec ET LP-Test und verglich die Ergebnisse mit den Kulturergebnissen. Eine Probewurde als positiv beurteilt, wenn das Kulturergebnis positiv war. Eine Probe wurde als negativ beurteilt, wenn dasKulturergebnis negativ war.Die Ergebnisse des BD ProbeTec ET LP-Tests der retrospektiven Sputumproben im Vergleich zu den Kulturergebnissensind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Tabelle 3: Der BD ProbeTec ET LP-Test

a Acht Proben waren kulturnegativ und im BD ProbeTec ET LP-Test positiv. Alle acht Proben waren in einemUrinantigen-Test positiv. Bei sechs der acht Proben wurde ein PCR-Test durchgeführt. Alle sechs Proben erwiesensich dabei als positiv.

b Zwei Proben waren kulturpositiv und im BD ProbeTec ET LP-Test negativ. Beide Proben waren in einem Urinantigen-Test negativ. Bei beiden Proben wurde ein PCR-Test durchgeführt; eine Probe erwies sich dabei als positiv.

c Die 23 kulturpositiven Proben gehörten den folgenden Serogruppen an: 47,8 % (11/23) Serogruppe 1; 17,4 %(4/23) Serogruppe 3; 13,0 % (3/23) Serogruppe 4; 4,3 % (1/23) Serogruppe 5; 4,3 % (1/23) Serogruppe 6 und 13 %(3/23) ohne Serogruppeninformation.

NZ = Nicht zutreffendHINWEIS: Die zum Testen der in Kultur und im BD ProbeTec ET LP-Test abweichenden Proben angewendete PCR-Methode war kein von der FDA anerkanntes Verfahren.

Kultur % Übereinstimmung (95 % VI)

Labor LP-Ergebnis Positiv Negativ Gesamt Positiv Negativ Insgesamt

6 Positiv 1 0 1

Negativ 0 0 0

Total 1 0 1 100% (1/1)(2,5% � 100%) NZ 100% (1/1)

(2,5%, 100%)

8 Positiv 16 5 21

Negativ 1 24 25

Total 17 29 46 94,1% (16/17)(72,7% � 99,9%)

82,8% (24/29)(64,2% � 94,2%)

87% (40/46)(73,7% � 95,1%)

9 Positiv 1 3 4

Negativ 0 22 22

Total 1 25 26 100% (1/1)(2,5% � 100%)

88% (22/25)(68,8% � 97,5%)

88,5% (23/26)(69,8% � 97,6%)

10 Positiv 3 0 3

Negativ 1 6 7

Total 4 6 10 75% (3/4)(19,4% � 99,4%)

100% (6/6)(54,1% � 100%)

90% (9/10)(55,5% � 99,7%)

Insgesamt Positiv 21 8a 29

Negativ 2b 52 54

Total 23c 60 83 91,3% (21/23)(72% � 98,9%)

86,7% (52/60)(75,4% � 94,1%)

88% (73/83)(79% � 94,1%)

im Vergleich zur Kultur

LaborEmpfindlichkeit

(95 % VI)Spezifität (95 % VI) Unbestimmt

Anfänglich/endgültig

1 NZ 100% (17/17)(80,5% � 100%) 0/0

2 NZ100% (2/2)

(15,8% � 100%)0/0

3 NZ 100% (31/31)(88,8% � 100%) 0/0

6 NZ 100% (33/33)(89,4% � 100%) 2/0b

7 NZ100% (31/31)

(88,8% � 100%)3/2c

Insgesamt NZ 100% (114/114)a

(96,8% � 100%)5/2

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Analytische StudienDas Volumen für die BD ProbeTec ET LP-Amplifikationsreaktion beträgt 100 µL der aufbereiteten Probe.

TestempfindlichkeitDie Empfindlichkeit des BD ProbeTec ET LP-Tests über 14 verschiedene L. pneumophila-Serogruppen wurdebestimmt, indem Bakteriensuspensionen auf 0, 150, 300 und 450 KBE pro Reaktion verdünnt wurden. Die Probenwurden verarbeitet und im Dreifachansatz getestet. Ausgehend von einer Positivitätsrate von 100 %, lag dieTestempfindlichkeit bei den Serogruppen 2 � 10 und 12 bei 150 KBE/Reaktion; die tatsächliche Nachweisgrenze liegtjedoch ggf. unter der niedrigsten getesteten Konzentration. Ausgehend von einer Positivitätsrate von 100 %, lagdie Testempfindlichkeit bei den Serogruppen 1 und 11 bei 300 KBE/Reaktion, bei Serogruppe 13 betrug sie 450KBE/Reaktion und bei Serogruppe 14 betrug sie 700 KBE/Reaktion.

Die Empfindlichkeit des BD ProbeTec ET LP-Tests bei Proben aus den unteren Atemwegen wurde bestimmt, indemSputum mit einer makrophageninfizierten Stammsuspension von L. pneumophila in Konzentrationen von 0, 150,300 und 450 KBE pro Reaktion beimpft wurde. Die Proben wurden verarbeitet und im Dreifachansatz getestet.Ausgehend von einer Positivitätsrate von 100 %, lag die Testempfindlichkeit bei den beimpften Proben bei 150KBE/Reaktion; die tatsächliche Nachweisgrenze liegt jedoch ggf. unter der niedrigsten getesteten Konzentration.

TestspezifitätInsgesamt 79 Mikroorganismen (69 Bakterien, eine Hefe und neun Viren) wurden mit dem BD ProbeTec ET LPgetestet. Die Bakterienisolate wurden bei Konzentrationen zwischen 1 x 106 KBE/mL und 1 x 108 KBE/mL getestet.Die Viren wurden bei einer Konzentration von 1 x 106 Viruspartikeln/mL getestet. Coccidioides immitis wurde alsFadenpilzsuspension entsprechend einem Standard von 5 McFarland vorbereitet. Keiner der getestetenMikroorganismen lieferte ein positives Ergebnis oder hemmte die IAC (Tabelle 4).

Tabelle 4: BD ProbeTec ET LP � Testspezifität

STÖRSUBSTANZENPotenzielle Störsubstanzen, die ggf. in Proben aus den unteren Atemwegen zu finden sind, wurden bei Fehlen desZielorganismus bzw. bei Vorliegen von 750 KBE L. pneumophila pro Reaktion mit dem BD ProbeTec ET LP getestet.Bei Fehlen des Zielorganismus lieferte keine der Störsubstanzen ein positives Ergebnis oder hemmte die IAC bei denin Tabelle 5 aufgelisteten Konzentrationen. Wenn der Zielorganismus zusammen mit den Substanzen in den inTabelle 5 angeführten Konzentrationen vorhanden war, waren die Ergebnisse aller getesteten Proben positiv.



Adenovirus-5







Candida albicans

Chlamydia trachomatis,Serogruppe L2







Cytomegalovirus

Eikenella corrodens






Escherichia coli




Herpesvirus-1


Influenzavirus A

Influenzavirus B

Kingella kingae

Klebsiella pneumoniaessp. ozaenae Typ 4



Legionella anisa


Legionella cherrii


Legionella dumoffii

Legionella erytha


Legionella feeleii

Legionella gormanii


Legionella jordanis







Moraxella osloensis





Neisseria mucosa

Parainfluenza-Virus I



Prevotella oralis


RSV, langer Stamm

Rhinovirus

Salmonella choleraesuisSerotyp Enteritidis

Salmonella choleraesuisSerotyp Typhi

Serratia marcescens

Staphylococcus aureus,Protein-A-produzierend

Staphylococcus aureus,nicht Protein-A-produzierend



Streptococcus Gruppe B





Veillonella parvula

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Tabelle 5: BD ProbeTec ET LP-Test � Auf Interferenz getestete Substanzen

ReproduzierbarkeitDie Reproduzierbarkeit des BD ProbeTec ET LP-Tests wurde an drei Labors beurteilt, indem eine Serie aus 24 PBS/BSA-beimpften Proben getestet wurde. Die Serie bestand aus 12 L. pneumophila-negativen Proben; dreischwach (300 KBE/Reaktion) und drei stark (500 KBE/Reaktion) positiven L. pneumophila-Proben; sowie dreischwach (30 EK/Reaktion bzw. 300 KBE/Reaktion bzw. 900 Zellen/Reaktion) und drei stark (50 EK/Reaktion bzw. 500 KBE/Reaktion bzw. 1500 Zellen/Reaktion) positiven Proben, die alle Chlamydophila pneumoniae (CP), L. pneumophila (LP) und Mycoplasma pneumoniae (MP) enthielten. Ein Anwender pro Labor testete die Serieneinmal täglich an drei Tagen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst.

Tabelle 6: Reproduzierbarkeitsschätzungen für Proben aus den unteren Atemwegen nachProbenkonzentration

a Eine Probe wurde aufgrund eines Verfahrensfehlers aus der Analyse ausgeschlossen.

LIEFERBARE PRODUKTEDie folgenden BD ProbeTec ET-Produkte sind erhältlich:

BEST.- NR. BESCHREIBUNG440728 BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay


440457 BD ProbeTec ET Accessories Kit (10 Priming-Abdeckungen, 16 Amplifikationsdeckelsiegel 1/2 und 8Entsorgungsbeutel)

440458 BD ProbeTec ET Pipette Tips, 6 x 120

440661 BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tubes and Caps, 200 pro Packung


440477 BD ProbeTec ET Instrument, Ausland

440478 BD ProbeTec ET Instrument, USA und Kanada





LITERATURNACHWEIS: S. �Reference� im englischen Text.

Tag zu Tag innerhalbdes Labors Labor zu Labor

Probe N % korrekt PAT-Wert SA % VK SA % VK


CP/LP/MP-LOW 26a 100,0% 43,0 0,00 0,00 2,59 6,01Negativ 108 100,0% 0,0 � � � �

IAC mit LP-negativen Proben 108 100,0% 47,8 0,43 0,91 0,34 0,70

Proben aus den unteren Atemwegen

Getestete Substanzen Konzentration

Vollblut (heparinisiert) 2,65%

Lidocain (2 %) 0,21%

Sputuminduktionslösung (3 % NaCl) 0,32%

Azithromycin 0,42 µg/mL

Penicillin G 17 µg/mL

Tetracyclin 2,3 µg/mL

Doxycyclin 26,5 µg/mL

Ciprofloxacin 4,88 µg/mL

Mycoplasma pneumoniae 5 x 106 Zellen/mL

Chlamydophila pneumoniae 1,06 x 107 CI/mL

Mycoplasma pneumoniae und Chlamydophilapneumoniae 1,06 x 107 Zellen/mL und 1,06 x 107 CI/mL

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Italiano

USO PREVISTOIl BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay (dosaggio amplificato del DNA della Legionellapneumophila (LP) BD ProbeTec ET), da utilizzarsi con il sistema BD ProbeTec ET, impiega la tecnologia SDA (StrandDisplacement Amplification), per la rilevazione qualitativa diretta del DNA di Legionella pneumophila (sierogruppi 1 - 14)in campioni di espettorato provenienti da pazienti per i quali ci sia un sospetto clinico di polmonite. Il suo uso è previstonella diagnosi presuntiva di legionellosi unitamente alla coltura e ad altri metodi.

SOMMARIO E SPIEGAZIONEIl morbo del legionario può essere contratto mediante inalazione di aerosol contenenti la Legionella o mediantemicroaspirazione di acqua contaminata. Da studi condotti in Europa e Nord America è emerso che la Legionella èla causa del 2 � 15% dei casi di polmonite contratta in comunità che richiedono il ricovero in ospedale. Il tasso dimortalità dei pazienti affetti da legionellosi è del 5 � 30%, con i pazienti più anziani o immunocompromessi amaggior rischio di decesso.1 Sono state identificate quaranta diverse specie di Legionella, metà delle quali correlatea patologie umane. La Legionella pneumophila è la causa del 90% dei casi di legionellosi diagnosticati. Sebbenesiano noti quattordici sierogruppi di L. pneumophila, l�80% delle infezioni da L. pneumophila sono causate dalsierogruppo 1.2

È sempre più importante formulare la diagnosi di polmonite e comprenderne l�eziologia alla luce dei problemiderivanti da un utilizzo eccessivo di antibiotici. I risultati dei test diagnostici per la L. pneumophila devono esseremessi rapidamente a disposizione dei clinici, in quanto è stato dimostrato che la mortalità aumenta quando siritarda a somministrare una terapia adeguata. Con i metodi di coltura tradizionali occorrono come minimo duegiorni per ottenere la crescita degli organismi della Legionella in campioni di espettorato positivi, e da sette a diecigiorni in totale per rendere definitivo un risultato negativo. Oltre alla coltura, sono disponibili in commercio kit diimmunodosaggi enzimatici per la rilevazione dell�antigene del sierogruppo 1 della L. pneumophila, utilizzabili sucampioni di urina.3 I test diagnostici per le infezioni da Legionella con una buona sensibilità in grado di fornire unrisultato rapido sono tuttavia limitati.

PRINCIPI DELLA PROCEDURAIl dosaggio amplificato del DNA della Legionella pneumophila (LP) BD ProbeTec ET si basa sulla simultaneaamplificazione e determinazione del DNA target mediante primer di amplificazione e una sonda marcata conindicatore fluorescente. I reagenti SDA sono liofilizzati in due micropozzetti monouso separati. Il campione preparatoviene aggiunto alla striscia di micropozzetti di priming che contiene i primer di amplificazione, la sonda marcata conindicatore fluorescente e gli altri reagenti necessari per l�amplificazione. I primer amplificano una regione dellacoppia di basi 68 del gene potenziatore dell'infettività del macrofago della L. pneumophila, conservato in tutti isierogruppi della specie. Dopo l�incubazione, la miscela reattiva viene trasferita nel micropozzetto di amplificazioneche contiene due enzimi (una DNA polimerasi e una endonucleasi di restrizione) necessari per l�SDA. I micropozzettidi amplificazione vengono sigillati per evitare la contaminazione e poi incubati in un lettore fluorescentetermocontrollato che esegue il monitoraggio di ciascuna reazione per la formazione di prodotti amplificati. Ognireazione coamplifica e rileva un controllo interno di amplificazione (Internal Amplification Control, IAC), il cui scopoè verificare l�esistenza di condizioni adatte all�amplificazione e ridurre la possibilità di ottenere falsi negativi dovutialla presenza di inibitori del dosaggio. La presenza o assenza del DNA della L. pneumophila viene determinatacalcolando i punteggi PAT (Passes After Threshold, superamenti della soglia) del campione, in base a valori di sogliapredeterminati. Lo strumento indica i risultati come positivi, negativi o indeterminati.

REAGENTI E MATERIALIOgni confezione di reagenti per il dosaggio amplificato del DNA della Legionella pneumophila (LP) BD ProbeTecET contiene:Micropozzetti di priming della Legionella pneumophila (LP), (1x24) 6 oligonucleotidi ≥ 7,5 pmol, dNTP ≥ 15,2 nmol, 2 sonde indicatrici ≥ 22,5 pmol, Oligonucleotide sintetico ≥ 1500 copieMicropozzetti di amplificazione della Legionella pneumophila (LP), (1x24) Enzima di restrizione: ≥ 33 unità, DNA polimerasi ≥ 14 unità10 copri-priming, 16 sigillanti per amplificazione (metà), 8 buste per rifiutiKit di controllo e diluente per campioni respiratori e terreni BD ProbeTec ET (CF*/LP/MP**):Contenuto: Diluente per terreno e campioni respiratori: bicina, fosfato di potassio, idrossido di potassio, DMSO eProclin; 10 controlli positivi (CF/LP/MP): ≥ 1050 ng DNA di sperma di salmone, ≥ 47,3 µg Tris, ≥ 9,0 µg EDTA, ≥ 3600copie di plasmide CF, ≥ 4800 copie di plasmide LP, ≥ 5400 copie di plasmide MP; 10 controlli negativi (CF/LP/MP): ≥ 1050 ng DNA di sperma di salmone, ≥ 47,3 µg Tris, ≥ 9,0 µg EDTA; 100 provette da 2 mL con tappo a pressione* Fare riferimento al BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay** Fare riferimento al BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay

Strumenti, attrezzatura e materiali d�uso e consumo: strumento BD ProbeTec ET e relativa piastra, termobloccoper lisi BD ProbeTec ET, incubatore per riscaldamento e priming BD ProbeTec ET, pipettatore BD ProbeTec ET, supportoe alimentatore, cestello per provette da 2 mL, kit di accessori BD ProbeTec ET, puntali per pipette BD ProbeTec ET.

Materiali richiesti ma non forniti: armadio di sicurezza biologica di classe II, miscelatore vortex, congelatore contemperatura -20 °C e/o -70 °C (o minore) senza dispositivo no frost, microcentrifuga con capacità di 16.000 x g,bagnomaria, termometro digitale, contenitore per bagnomaria con coperchio a vite, altri cestelli per provetteportacampioni adatti, minikit fecali per il DNA QIAamp della QIAGEN, etanolo al 96 � 100%, tamponi BBLCultureSwab EZ, provette portacampioni da 2 mL e tappi BD ProbeTec ET, guanti monouso, pennarelli resistentiall�alcol, micropipette in grado di erogare volumi di 25 � 1000 µL, puntali per pipette resistenti agli aerosol, acquadistillata, ATCC 33152 (Philadelphia-1) L. pneumophila, albumina bovina (frazione V) allo 0,2% (w/v) in soluzionesalina allo 0,85% (w/v), ipoclorito di sodio all�1% (v/v) con Alconox.** Sciogliere 7,5 g di Alconox in un 1 L di soluzione di ipoclorito di sodio all�1% (v/v) e miscelare. Preparare una

miscela fresca ogni giorno.

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Requisiti di preparazione e conservazione: Le confezioni di reagenti LP BD ProbeTec ET possono essereconservate a 2 � 33 °C. Non usare dopo la data di scadenza le confezioni di reagenti non aperte. Una volta apertala busta, i micropozzetti sono stabili per 12 settimane, se opportunamente risigillati, o fino alla data di scadenza, aseconda di quale delle due si verifica prima. Non congelare.

Il kit di controllo e il diluente per campioni respiratori e terreni BD ProbeTec ET (CF/LP/MP) possono essere conservatia 2 � 33 °C. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Non congelare.

Avvertenze e precauzioniPer uso diagnostico in vitro.

1. I campioni clinici possono contenere microrganismi patogeni, inclusi i virus dell�epatite e i virus dell�immunodeficienzaumana. Manipolare tutti i materiali e gli articoli contaminati con sangue e altri fluidi biologici in conformità alle normedell�istituto e alle �Precauzioni standard�.4-7

2. Le fasi di manipolazione e preparazione di campioni prelevati dalle basse vie respiratorie precedenti alla fasedi incubazione a 70 °C devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II.

3. Durante la fase di incubazione a 70 °C, utilizzare un contenitore per bagnomaria con coperchio a vite permaggiore protezione dai campioni a potenziale rischio biologico.

4. Il diluente per campioni respiratori e terreni BD ProbeTec ET contiene dimetilsolfossido (DMSO). Il DMSO(dimetilsolfossido) è nocivo per inalazione, contatto con la pelle e per ingestione. Evitare il contatto con gli occhie indossare sempre i guanti quando lo si manipola. In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente eabbondantemente con acqua e consultare un medico. In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamentee abbondantemente con acqua.

5. Per informazioni sulla sicurezza con i reagenti QIAGEN utilizzati in questa procedura consultare il manuale delminikit fecale per il DNA QIAamp. Non smaltire i reagenti QIAGEN in soluzioni di candeggina. Non esporre ireagenti QIAGEN alla candeggina.

6. È stato segnalato che i kit di estrazione del DNA QIAGEN non sono adatti alla reazione a catena della polimerasi(PCR) per la Legionella, a causa della potenziale contaminazione dei reagenti da parte del DNA dellaLegionella.8,9 Sebbene le probabilità che questo accada siano basse, e nonostante in questi studi siano stateidentificate specie di Legionella diverse dalla L. pneumophila, è opportuno verificare le prestazioni di ogninuovo lotto di reagenti QIAGEN prima di utilizzarli per i campioni dei pazienti.

7. Sebbene non siano richiesti ambienti di lavoro dedicati, dato che la configurazione del sistema BD ProbeTecET riduce la possibilità di contaminazione da amplicon nell�area di analisi, è tuttavia necessario adottare altreprecauzioni per controllare la contaminazione, in particolare per evitare di contaminare i campioni durante lapreparazione.

8. Una volta aperte, le buste di reagenti che contengono micropozzetti di priming e di amplificazione non utilizzatiDEVONO essere richiuse con attenzione. Prima di richiudere le buste dei reagenti, assicurarsi che contengano ilsacchetto di essiccante.

9. Prima del trasferimento dall�incubatore per riscaldamento e priming BD ProbeTec ET allo strumento BD ProbeTecET, la piastra che contiene i micropozzetti di amplificazione DEVE essere opportunamente sigillata con il sigillantedi amplificazione. La chiusura a tenuta garantisce una reazione isolata per l�amplificazione e la determinazione edè necessaria per evitare la contaminazione dello strumento e dell�area di lavoro da parte dei prodottidell�amplificazione. Non rimuovere mai dai micropozzetti il materiale sigillante.

10. I micropozzetti di priming contenenti liquido residuo, dopo il trasferimento del liquido dai micropozzetti dipriming a quelli di amplificazione, costituiscono una fonte di contaminazione del target. Prima di eliminare imicropozzetti di priming, sigillarli accuratamente con il sigillante per piastra.

11. Per evitare di contaminare l�ambiente di lavoro con i prodotti dell�amplificazione, usare le buste per rifiutiincluse nelle confezioni dei reagenti per smaltire i micropozzetti di amplificazione già sottoposti a test. Primadello smaltimento, assicurarsi che le buste siano ben chiuse.

12. Per evitare la contaminazione crociata dei campioni, CAMBIARE I GUANTI quando specificato durante la preparazionedei campioni e la procedura di dosaggio. Se i guanti vengono a contatto con i campioni, cambiarli immediatamenteper evitare la contaminazione di altri campioni.

13. Nel caso di contaminazione dell�area di lavoro o dell�attrezzatura da parte dei campioni o controlli, pulireaccuratamente le superfici contaminate con una soluzione di ipoclorito di sodio all�1% (v/v) con Alconox esciacquare abbondantemente con acqua. Prima di procedere ad altre analisi, lasciare asciugare completamente lasuperficie. Nel caso si debbano asciugare versamenti di reagenti QIAGEN di preparazione del campione, pulire lezone interessate con acqua prima di utilizzare la soluzione di ipoclorito di sodio all�1% (v/v) contenente Alconox.

14. Per il trasferimento dei campioni preparati ai micropozzetti di priming e per trasferire i campioni daimicropozzetti di priming ai micropozzetti di amplificazione, usare esclusivamente il pipettatore e i puntali perpipette BD ProbeTec ET.

15. Per eliminare i prodotti usati, come i puntali per pipette, le provette portacampioni, i micropozzetti di priminge tutti gli articoli monouso, attenersi alle disposizioni stabilite dal laboratorio. Eliminare con attenzione tutti iprodotti monouso. Sigillare ed eliminare i contenitori dei rifiuti quando sono pieni per ¾ o ogni giorno (aseconda di quale delle due condizioni si verifica prima).

16. Non scambiare o miscelare controlli o reagenti di preparazione di kit aventi numeri di lotto diversi e i pozzetti.

17. In caso di situazioni insolite, ad esempio un versamento all�interno dello strumento BD ProbeTec ET o unacontaminazione da DNA che non si riesce ad eliminare con la pulizia, rivolgersi all�assistenza tecnica.

RACCOLTA E TRASPORTO DEI CAMPIONI1. Raccolta dei campioni

a. I campioni devono essere prelevati seguendo le disposizioni del Clinical Microbiology Procedures Handbook10

(Manuale di procedure microbiologiche cliniche) o il manuale delle procedure fornito dal laboratorioutilizzato.

2. Trasporto e conservazione dei campioni

� I campioni devono essere conservati/trasportati a 18 � 33 °C per non oltre 6 h.

� I campioni possono essere refrigerati a 2 � 8 °C per non oltre 3 giorni.

� I campioni possono essere conservati a -20 °C o temperature inferiori per non oltre 14 settimane.

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PROCEDURA DEL TESTPer le istruzioni specifiche relative al funzionamento e alla manutenzione dei componenti del sistema, consultare ilManuale d�uso del sistema BD ProbeTec ET.

A. Preparazione dello strumento1. Prima di iniziare il dosaggio, occorre accendere lo strumento e lasciarlo riscaldare.

a. Per riscaldare e stabilizzare l�incubatore per riscaldamento e priming occorrono circa 90 min.

Il setpoint per il componente di priming dell�incubatore per riscaldamento e priming è di 72,5 °C.

Il setpoint per il componente di riscaldamento dell�incubatore è di 54 °C.

b. Lo strumento BD ProbeTec ET è controllato dal software e per riscaldarsi richiede circa 30 min.

2. Prima di iniziare il dosaggio, controllare le temperature degli incubatori. Registrare le temperature nel registrodi manutenzione del sistema BD ProbeTec ET.a. Incubatore per riscaldamento e priming

Il termometro dell�incubatore per priming deve indicare 72 � 73 °C.

Il termometro dell�incubatore per riscaldamento deve indicare 53,5 � 54,5 °C.

3. Controllare la temperatura visualizzata sullo schermo del sistema BD ProbeTec ET. La temperatura deve esseredi 47,5 � 55,0 °C. Registrare le temperature nel registro di manutenzione del sistema BD ProbeTec ET.

B. PipettatorePer spiegazioni dettagliate relative alle funzioni del tastierino del pipettatore BD ProbeTec ET, consultare ilManuale d�uso del sistema BD ProbeTec ET. È inoltre necessario pulire il pipettatore BD ProbeTec ET dopo ogniutilizzo. Per informazioni sulla corretta pulizia e manutenzione del pipettatore BD ProbeTec ET rivolgersiall�assistenza tecnica.

Per eseguire il dosaggio LP BD ProbeTec ET sono necessari i programmi seguenti. Programma 1: trasferisce il liquidodai campioni preparati ai micropozzetti di priming LP. Programma 5: trasferisce il liquido dai micropozzetti dipriming LP ai micropozzetti di amplificazione LP. Programmare il pipettatore come descritto di seguito.

Programma 1: 1. Accendere il pipettatore. Il pipettatore emetterà un bip, verrà visualizzato �ZERO� lampeggiante, quindi il

numero di versione del software, in seguito emetterà un altro bip.

2. Premere il tasto blu �Prog� (Programma). Premere il tasto �Vol� (Volume) fino a quando viene visualizzato �1�per selezionare il Programma 1. Premere �Enter� (Invio).

3. Per accedere alla modalità di programmazione, tenere premuto il tasto �Prog�. e spingerecontemporaneamente il tasto Funzione speciale con la punta di una pipetta o di una graffetta.

4. Premere �Fill� (Riempimento). Premere la freccia Su fino a quando viene visualizzato 200. Premere �Enter�.

5. Premere �Disp� (Dispensazione). Premere la freccia Su fino a quando viene visualizzato 150. Premere �Enter�.

6. Premere �Enter� una seconda volta per memorizzare il programma e uscire. Un �bip� dovrebbe indicare che laprogrammazione è completa.

7. Verificare il programma premendo il trigger per avanzare da ciascun passaggio al successivo e impostare perciascun passaggio le velocità di aspirazione/dispensazione usando il tasto �Vol�. Ad ogni passaggio apparel�indicatore di velocità. Usare il tasto �Vol� per regolare l�indicatore di velocità in modo che visualizzi 2quadratini per i passaggi di �Fill� e �Disp�.

Programma 5: 1. Premere il tasto �Prog�. Premere il tasto �Vol� fino a quando viene visualizzato �5� per selezionare il

Programma 5. Premere �Enter�.

2. Per accedere alla modalità di programmazione, tenere premuto il tasto �Prog� e spingere contemporaneamenteil tasto Funzione speciale con la punta di una pipetta o di una graffetta.

3. Premere �Fill�. Premere la freccia Su fino a quando viene visualizzato 100. Premere �Enter� (Invio).

4. Premere �Disp�. Premere la freccia Su fino a quando viene visualizzato 100. Premere �Enter�.

5. Premere �Mix�. Premere la freccia Su fino a quando viene visualizzato 50. Premere �Enter�.

6. Premere �Enter� una seconda volta per memorizzare il programma e uscire. Un �bip� dovrebbe indicare che laprogrammazione è completa.

7. Verificare il programma premendo il trigger per avanzare da ciascun passaggio al successivo e impostare perciascun passaggio le velocità di aspirazione/dispensazione/miscelazione usando il tasto �Vol�. Ad ognipassaggio appare l�indicatore di velocità. Usare il tasto �Vol� per regolare l�indicatore di velocità in modo chevisualizzi 2 quadratini per le funzioni di aspirazione e dispensazione. Usare il tasto �Vol� per regolare la velocitàdi miscelazione in modo che visualizzi 3 quadratini.

Revisione del programmaPrima di iniziare la procedura, accendere il pipettatore per rivedere tutti i programmi. Per rivedere il programma,accendere il pipettatore. Premere il tasto blu �Prog�. Premere il tasto �Vol� fino a quando viene visualizzato ilnumero del programma corretto (1 o 5). Premere il tasto �Enter�. Usare il trigger del pipettatore per avanzare nelprogramma da un passaggio al successivo.

Programma 1: Questo programma aspira 200 µL e dispensa 150 µL nel micropozzetto LP. Sul display del pipettatoredeve essere visualizzato quanto segue.



Programma 5: Questo programma aspira 100 µL; dispensa 100 µL e miscela 50 µL tre volte. Sul display delpipettatore deve essere visualizzato quanto segue.



Mix 50 µL � SIII

Zero (lampeggiante)

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C. Layout delle piastreIl rapporto di layout delle piastre viene generato dallo strumento BD ProbeTec ET una volta caricati nel sistema iltipo di dosaggio, l�identificazione del campione, i numeri di lotto dei controlli e i numeri di lotto dei kit. Il rapportodi layout delle piastre mostra la disposizione fisica dei campioni e dei controlli su ciascuna piastra da analizzare.Questo orientamento viene usato sia per la piastra di micropozzetti di priming che per la piastra di micropozzettidi amplificazione. I micropozzetti di priming per il dosaggio LP sono disposti su strisce di colore grigio uniforme. Imicropozzetti di amplificazione sono disposti su strisce grigie rigate.

D. Trattamento di campioni delle basse vie respiratorie:

Note Procedurali: � Prima di iniziare, consultare il manuale del minikit fecale per il DNA QIAamp della QIAGEN per note procedurali

e precauzioni importanti.� Preparare un bagnomaria con acqua distillata e riscaldarlo a 70 °C (± 5 °C) prima di iniziare la preparazione dei

campioni.� Utilizzare pennarelli resistenti all�alcol per etichettare contenitori e provette.� Cambiare i puntali delle pipette fra un trasferimento di liquido e l�altro. Si consiglia di utilizzare puntali con

barriera anti-aerosol.� Far riscaldare a temperatura ambiente il diluente per campioni respiratori e terreni BD ProbeTec ET (CF/LP/MP),

quindi, prima di usarlo, miscelarlo delicatamente capovolgendolo.� Dispensare la quantità necessaria di diluente per campioni respiratori e terreni (CF/LP/MP) BD ProbeTec ET in

un contenitore pulito. Per stimare la quantità necessaria, calcolare 0,4 mL di diluente per ogni campione eaggiungerne altri 1 � 2 mL per agevolare il pipettaggio. Per evitare la contaminazione del diluente � Nonversare di nuovo nel flacone il diluente residuo.

1. Preparare i reagenti QIAGEN (consultare la sezione relativa alla preparazione dei reagenti nel manuale delminikit fecale per il DNA QIAamp).

2. Attendere che i contenitori raggiungano la temperatura ambiente.3. Etichettare una provetta da 2 mL con tappo a pressione per ogni campione da analizzare.

Le seguenti procedure devono essere svolte in un armadio di sicurezza biologica:4. Agitare ad impulsi i campioni su vortex per 5 � 15 s per miscelarli correttamente. 5. Pipettare 350 µL di campione nella provetta etichettata.

N.B. Potrebbe essere difficile pipettare con precisione campioni di espettorato. Se si incontrano difficoltà, utilizzarele tacche sul fianco della provetta come aiuto per verificare che venga erogato il volume corretto. In alternativautilizzare una provetta in cui siano stati dispensati 350 µL d�acqua come guida.6. CAMBIARE I GUANTI dopo l�aggiunta dei campioni.7. Pipettare 150 µL di tampone QIAGEN ASL in ogni provetta contenente un campione.8. Pipettare 25 µL di tampone QIAGEN proteinasi K in ogni provetta contenente un campione.9. Pipettare 500 µL di tampone di lisi QIAGEN AL in ogni provetta contenente un campione.10. Tappare le provette ed agitare a impulsi con vortex per 5 s. Porre le provette a bagnomaria in un contenitore

con tappo a vite.

Le seguenti procedure possono essere svolte all�esterno di un armadio di sicurezza biologica:11. Incubare le provette nel bagnomaria a 70 °C (± 5 °C) per 15 min. 12. Dopo 15 min., estrarre le provette dal bagnomaria e centrifugare (a 16.000 x g) per circa 5 s. 13. Estrarre le provette dalla centrifuga. Aprire ciascuna provetta e aggiungere 500 µL di etanolo al 96 � 100%.14. Ritappare le provette e agitare a impulsi con vortex per 5 s.15. Centrifugare i campioni (a 16.000 x g) per circa 5 s. 16. Etichettare una provetta di raccolta e una colonna di agitazione QIAGEN per ogni campione.17. Trasferire 700 µL di campione nella colonna di agitazione QIAGEN debitamente etichettata.18. Centrifugare le provette (a 16.000 x g) per 1 min. 19. Trasferire le colonne in nuove provette di raccolta QIAamp. Eliminare le provette che contengono il filtrato.20. Trasferire con cautela altri 700 µL di campione nella colonna corretta.21. Centrifugare le provette (a 16.000 x g) per 1 min. 22. Trasferire le colonne in provette di raccolta QIAamp pulite. Eliminare le provette che contengono il filtrato.23. Aprire le colonne QIAamp e aggiungere a ciascuna 500 µL di tampone di lavaggio QIAGEN AW1.24. Centrifugare le provette (a 16.000 x g) per 1 min. 25. Trasferire le colonne in nuove provette di raccolta QIAamp. Eliminare le provette che contengono il filtrato.26. Aprire le colonne QIAamp e aggiungere a ciascuna 500 µL di tampone di lavaggio QIAGEN AW2.27. Centrifugare le provette (a 16.000 x g) per 3 min. 28. Trasferire le colonne nelle provette di raccolta QIAamp finali etichettate. Eliminare le provette che contengono

il filtrato.

N.B. Le provette di raccolta devono essere etichettate a questo punto.

N.B. Prestare attenzione a fare in modo che sul fondo della colonna non rimanga del liquido. Il trasferimento diliquidi di lavaggio residui nella provetta di raccolta può influire sui risultati.29. Aprire le colonne ed aggiungere a ciascuna 225 µL di tampone di eluizione QIAGEN AE.30. Incubare a temperatura ambiente per 1 min.31. Centrifugare le provette (a 16.000 x g) per 1 min. 32. Eliminare le colonne.33. Etichettare a una provetta da 2 mL con tappo a vite per ogni campione.34. Trasferire 400 µL di diluente per campioni respiratori e terreni (CF/LP/MP) in ogni provetta con tappo a vite.

N.B. Preparare un bagnomaria con acqua distillata e portarlo ad ebollizione per utilizzarlo nella fase 38.

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35. Trasferire 200 µL di eluato nella provetta debitamente etichettata contenente 400 µL di diluente per campionirespiratori e terreni (CF/LP/MP).

36. Tappare la provetta e agitare a impulsi con vortex per 5 s.37. Preparare i controlli. Vedere la sezione E, Preparazione dei controlli per campioni delle basse vie

respiratorie.38. Trasferire campioni e controlli in un contenitore per bagnomaria.39. Porre il contenitore per bagnomaria nel bagno di acqua bollente per 5 min.40. Al termine dei 5 min, estrarre il contenitore per bagnomaria e lasciare raffreddare le provette a temperatura

ambiente per 15 min.

AVVERTENZA: fare attenzione a non ustionarsi con l�acqua bollente, il contenitore per bagnomaria o superfici chepotrebbero essere molto calde.41. Dopo il raffreddamento, centrifugare i campioni (a 16.000 x g) per circa 5 s.

N.B. Dopo la bollitura dei campioni:a. È possibile conservarli a 18 � 33 °C per 6 h al massimo e analizzati senza ripetere la bollitura.b. È possibile conservarli a 2 � 8 °C per 3 giorni al massimo. Prima dell�analisi, questi campioni devono essere

agitati con vortex e bolliti nuovamente.c. È possibile conservarli a ≤ -20 °C per 14 settimane al massimo. Prima dell�analisi, questi campioni devono

essere scongelati a temperatura ambiente, agitati con vortex e bolliti nuovamente. 42. I campioni sono pronti per la Procedura di analisi del dosaggio LP BD ProbeTec ET (sezione F).

E. Preparazione dei controlli per campioni delle basse vie respiratorie:1. Per ciascun ciclo di analisi (piastra), preparare una provetta di controllo negativo (CF/LP/MP) e una provetta di

controllo positivo (CF/LP/MP). Se la piastra contiene reagenti con numeri di lotto diversi, occorre sottoporre atest controlli di ciascun lotto.

2. Prima dell�uso, capovolgere delicatamente il tampone QIAGEN AE e il diluente per campioni respiratori e terreni.3. Stappare la provetta di controllo negativo (CF/LP/MP).4. Utilizzando un nuovo puntale per ogni provetta di controllo, aggiungere 200 µL di tampone QIAGEN AE.5. Utilizzando un nuovo puntale per ogni provetta di controllo, aggiungere 400 µL di diluente per campioni respiratori

e terreni.6. Ritappare saldamente la provetta.7. Stappare la provetta di controllo positivo (CF/LP/MP).8. Utilizzando un nuovo puntale per ogni provetta di controllo, aggiungere 200 µL di tampone QIAGEN AE.9. Utilizzando un nuovo puntale per ogni provetta di controllo, aggiungere 400 µL di diluente per campioni

respiratori e terreni.10. Ritappare saldamente la provetta.11. Agitare con vortex le provette dei controlli per 5 s.12. I controlli sono pronti per la bollitura. Vedere la sezione D, Trattamento di campioni delle basse vie

respiratorie.

F. Procedura di analisi del dosaggio LP BD ProbeTec ET:

N.B. Prima di eseguire la procedura di analisi, disporre i campioni e i controlli trattati in un cestello in grado dicontenere provette portacampioni da 2 mL, ad esempio il cestello per provette da 2 mL BD ProbeTec ET, compatibilecon il pipettatore BD ProbeTec ET.1. Stappare le provette dei campioni e i controlli raffreddati ed eliminare i tappi.2. Per evitare la contaminazione, CAMBIARE I GUANTI prima di procedere.3. Utilizzando il rapporto di layout delle piastre, preparare la piastra dei micropozzetti di priming. Vedere la

sezione C, Layout delle piastre.4. Procedere come segue per richiudere e sigillare le buste dei micropozzetti:

a. Posizionare la busta su una superficie piatta. Tenere ferma con una mano l�estremità aperta.b. Esercitando pressione, far scorrere un dito lungo l�esterno della chiusura, da un margine all�altro della busta.c. Assicurarsi che la busta sia sigillata.

5. Selezionare il Programma 1 sul pipettatore BD ProbeTec ET.6. Prendere dei puntali per le pipette. Tirare completamente in fuori la manopola spaziatrice per espandere il

pipettatore BD ProbeTec ET.N.B. Per evitare perdite, assicurarsi che i puntali siano ben fissati sul pipettatore.

7. Aspirare 200 µL dalla prima colonna di campioni. 8. Abbassare con attenzione il pipettatore, portare i puntali delle pipette a contatto con le pareti dei pozzetti e

dispensare 150 µL nella corrispondente colonna di micropozzetti di priming (1 A � H).N.B. Per evitare la contaminazione, non abbassare il pipettatore sui campioni o sui micropozzetti. I movimentibruschi possono causare la dispersione di goccioline o aerosol.

9. Eliminare i puntali. Premere il trigger di pipettaggio per reimpostare il pipettatore.N.B. Eliminare con attenzione i puntali per evitare la dispersione di goccioline o aerosol che potrebberocontaminare l�area di lavoro.

10. Prendere dei nuovi puntali, espandere il pipettatore e aspirare 200 µL dalla seconda colonna di campioni.11. Abbassare con attenzione il pipettatore, portare i puntali delle pipette a contatto con le pareti dei pozzetti e

dispensare 150 µL nella corrispondente colonna di micropozzetti di priming (2 A � H).12. Eliminare i puntali.13. Continuare a trasferire gli altri campioni del ciclo di analisi.14. Coprire la piastra di micropozzetti di priming con il rispettivo coperchio e lasciarla incubare a temperatura

ambiente per almeno 20 min. (L�incubazione può essere protratta fino a 6 h). N.B. Ritappare con nuovi tappi leprovette dei campioni trattati. CAMBIARE I GUANTI.

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15. Al termine dell�incubazione di priming, preparare la piastra di micropozzetti di amplificazione. Disporre imicropozzetti di amplificazione su una piastra, come indicato nel rapporto di layout delle piastre (come per lapiastra di priming). Richiudere e sigillare la busta dei micropozzetti come descritto al passaggio 4.

16. Togliere il coperchio dalla piastra di micropozzetti di priming e trasferirla nell�incubatore di priming. InserireIMMEDIATAMENTE la piastra di micropozzetti di amplificazione nell�incubatore per pre-riscaldarla.

17. Impostare il cronometro su 10 min. (N.B. - per questo passaggio, il tempo è di importanza cruciale).18. Trascorsi i 10 min (± 1 min) di incubazione, selezionare il Programma 5 sul pipettatore.

19. Prendere dei puntali per le pipette e trasferire 100 µL dalla colonna 1 della piastra dei micropozzetti di primingalla colonna 1 della piastra dei micropozzetti di amplificazione. Portare i puntali delle pipette a contatto conle pareti dei pozzetti e dispensare il liquido. Dopo la dispensazione, lasciare che il pipettatore misceliautomaticamente il liquido nei pozzetti. Sollevare con attenzione il pipettatore dalla piastra. Evitare il contattocon altri pozzetti.

20. Eliminare i puntali. Prendere dei nuovi puntali e continuare a trasferire la miscela reattiva dai micropozzetti dipriming ai micropozzetti di amplificazione, una colonna alla volta, usando nuovi puntali per ciascuna colonna.

21. Una volta trasferita l�ultima colonna, rimuovere la pellicola protettiva dal sigillante di amplificazione (Mezzofoglio di sigillante copre al massimo 6 colonne. Se la piastra ha più di 6 colonne, è NECESSARIO usare un fogliointero di sigillante). Afferrare per i bordi il foglio di sigillante e applicarlo sui micropozzetti, servendosi delleguide che si trovano sull�incubatore. Esercitare pressione sul sigillante per assicurarsi che tutti i micropozzettisiano completamente sigillati.

22. Agendo dall�interfaccia utente del sistema BD ProbeTec ET, estrarre il portapiastre, aprire lo sportello e sollevareil coperchio della piastra. Trasferire IMMEDIATAMENTE (entro 30 s) la piastra sigillata di micropozzetti diamplificazione allo strumento BD ProbeTec ET e iniziare il ciclo di analisi. (Per spiegazioni dettagliate, consultareil Manuale d�uso del sistema BD ProbeTec ET.)

23. Una volta iniziato il ciclo, passare alla fase seguente della procedura di pulizia.

a. Sigillare i micropozzetti di priming con del sigillante di amplificazione e rimuovere la piastra dall�incubatoreper riscaldamento e priming. AVVERTENZA: la temperatura supera 70 °C. Per rimuovere la piastra, usareguanti resistenti al calore.

b. Lasciar raffreddare la piastra sul banco per 5 min.

c. Rimuovere dalla piastra i micropozzetti di priming sigillati tenendo il sigillante da entrambi i lati esollevando insieme tutti i pozzetti. Porre i micropozzetti sigillati in una busta per rifiuti e chiuderla.

d. Pulire la piastra metallica.

Sciacquare la piastra con la soluzione di ipoclorito di sodio all�1% (v/v) e Alconox.

Sciacquare la piastra con acqua.

Avvolgerla quindi in una salviettina di carta pulita e lasciarla asciugare completamente prima di riutilizzarla.

24. Al termine del ciclo di analisi verranno stampati i risultati del test.

25. Estrarre il portapiastre dalla stazione, aprire lo sportello e rimuovere la piastra. Chiudere lo sportello e reinserireil portapiastre nello strumento.

26. Togliere dalla piastra i micropozzetti di amplificazione sigillati. ATTENZIONE: non rimuovere dai micropozzettiil materiale sigillante. Per rimuovere tutti insieme i micropozzetti sigillati, afferrare la parte superiore e inferioredel sigillante ed estrarre il tutto sollevandolo dalla piastra. Porre i micropozzetti sigillati nella busta per rifiuti.Sigillare la busta.

27. Pulire la piastra metallica.

Sciacquare la piastra con la soluzione di ipoclorito di sodio all�1% (v/v) e Alconox.

Sciacquare la piastra con acqua.

Avvolgerla quindi in una salviettina di carta pulita e lasciarla asciugare completamente prima di riutilizzarla.

28. Dopo l�ultimo ciclo di analisi della giornata, eseguire le seguenti procedure di pulizia.

a. Utilizzando salviettine di carta o compresse di garza imbevute di soluzione di ipoclorito di sodio all�1% (v/v)e Alconox, pulire i piani di lavoro e le superfici esterne dell�incubatore per riscaldamento e priming, ilcestello per provette portacampioni da 2 mL, i bagnomaria, la centrifuga e lo strumento BD ProbeTec ET.Lasciare agire la soluzione sulle superfici per 2 � 3 min. Impregnare di acqua delle salviettine di carta o dellecompresse di garza e rimuovere la soluzione detergente. Durante l�applicazione della soluzione detergenteed il risciacquo con l�acqua cambiare frequentemente le salviette o la garza. Con delle salviettine di carta odelle compresse di garza imbevute con soluzione di ipoclorito di sodio all�1% (v/v) e Alconox pulirel�impugnatura del pipettatore (SOLO L�IMPUGNATURA). Trascorsi 2 � 3 min, passare sull�impugnatura dellesalviettine di carta o compresse di garza imbevute di acqua.

b. Immergere le piastre e il contenitore per bagnomaria nella soluzione di ipoclorito di sodio all�1% (v/v) conAlconox, per 1 � 2 min. Sciacquare abbondantemente con acqua e lasciare asciugare all�aria.

c. Ricaricare il pipettatore.

d. Eliminare la busta dei rifiuti sigillata e il materiale a rischio biologico in osservanza delle procedure stabiliteper lo smaltimento dei rifiuti contaminati.

29. Almeno una volta alla settimana eseguire le seguenti procedure:

a. Eliminare l�acqua dei bagnomaria.

b. Pulire i contenitori per bagnomaria con una soluzione di ipoclorito di sodio all�1% (v/v) con Alconox.Sciacquare con acqua e lasciare asciugare.

c. Riempire nuovamente con acqua distillata.

Controllo di qualitàLe procedure prescritte per il controllo di qualità devono essere effettuate in conformità alle norme vigenti o airequisiti di accreditazione e alla prassi di controllo di qualità in uso nel laboratorio. Per informazioni sulla prassiappropriata di controllo di qualità, si raccomanda all�utente di consultare le direttive CLSI (già NCCLS) e le norme CLIA.

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Il diluente per campioni respiratori e terreni e i controlli sono forniti in kit (CF/LP/MP). Includere un controllopositivo e un controllo negativo per ogni ciclo di analisi di una piastra e con ogni nuovo numero di lotto del kit direagenti. La disposizione dei controlli può essere casuale. Il controllo positivo serve per verificare il correttofunzionamento del reagente. Il controllo negativo serve per il monitoraggio della contaminazione del reagente e/odell�ambiente. Per la validità dei risultati dei campioni, i risultati dell�analisi del controllo positivo e negativo devonoessere rispettivamente positivo e negativo. Se i controlli non si comportano come previsto, il ciclo di analisi vieneconsiderato non valido e lo strumento non include i risultati nel referto del paziente. Se i controlli analizzati nonforniscono i risultati previsti, ripetere l�intero ciclo di analisi utilizzando un nuovo set di controlli, nuovimicropozzetti e i campioni preparati. Se la quantità di campione preparato fosse inadeguata per la ripetizione deltest, rianalizzare un�altra aliquota del campione primario. Se una volta analizzati nuovamente i controlli non siottengono i risultati previsti, rivolgersi all'assistenza tecnica (vedere "Interpretazione dei risultati del test").

Nel micropozzetto di priming è integrato un controllo interno di amplificazione (Internal Amplification Control-IAC). Il controllo interno di amplificazione contiene un acido nucleico target che viene amplificato in presenza dellamatrice del campione. Questo controllo serve a confermare la validità della reazione di amplificazione e adidentificare una possibile inibizione da parte del campione analizzato.

Controlli di analisi dei campioniÈ possibile sottoporre a test i controlli di analisi dei campioni in osservanza dei requisiti stabiliti dagli enti diaccreditazione appropriati. Un controllo positivo deve poter sottoporre a test l�intero sistema di dosaggio. A talescopo, è possibile utilizzare come controlli dei campioni positivi noti, preparandoli e analizzandoli contestualmentea campioni non noti. I campioni usati come controlli di analisi devono essere conservati, preparati e analizzatisecondo quanto indicato nel foglietto illustrativo del prodotto. I controlli di analisi dei campioni che simulanocampioni delle basse vie respiratorie possono essere preparati anche secondo le istruzioni seguenti:

1. Estrarre un flacone di liofilizzato ATCC 33152 (Philadelphia-1) L. pneumophila dal congelatore a -20 °C otemperatura inferiore.

2. Reidratarlo con 1 mL di soluzione salina allo 0,85% (w/v) contenente lo 0,2% (w/v) di albumina bovina (frazione V).

3. Diluire il ceppo di L. pneumophila reidratato in ragione di 1:100.000 in soluzione salina allo 0,85% (w/v)contenente albumina bovina (frazione V) allo 0,2% (w/v).

4. Pipettare 350 µL di L. pneumophila diluita in una provetta con tappo a pressione.

5. Trattare come descritto nella sezione D, Trattamento di campioni delle basse vie respiratorie.

Monitoraggio della presenza di contaminazione da DNAAlmeno una volta al mese, effettuare le seguenti procedure di analisi per individuare l�eventuale presenza dicontaminazione da DNA sulle superfici dell�area di lavoro e delle attrezzature. Questo monitoraggio dell�ambienteè indispensabile per individuare la contaminazione prima che insorgano problemi.

1. Usare un tampone BBL CultureSwab EZ per ciascuna area* da analizzare.

2. Etichettare una provetta da 2 mL con tappo a vite per ogni area da analizzare. Pipettare 600 µL di diluente percampioni respiratori e terreni in ciascuna provetta e aggiungere 300 µL di tampone QIAGEN AE o acquadistillata a livello molecolare. Agitare con vortex per 5 s per miscelare.

3. Intingere il primo tampone nel diluente preparato nella fase 2 e passarlo sulla prima area muovendolo in variedirezioni.

4. Roteare il tampone nel diluente e premerlo contro il lato della provetta. Ritappare la provetta e agitare convortex per 5 s. Eliminare il tampone.

5. Ripetere la procedura per ogni area da sottoporre a test.6. Porre le provette in un contenitore per bagnomaria e riscaldare in un bagno d�acqua bollente per 5 min.

Estrarre il contenitore dall�acqua bollente e lasciare raffreddare i campioni per 15 min a temperatura ambienteprima di continuare.

7. Dopo il raffreddamento centrifugare i campioni (a 16.000 x g) per circa 5 s. 8. Mentre le provette si riscaldano, usare delle salviettine pulite imbevute di acqua per rimuovere la miscela di

tampone residua dalle superfici sottoposte a test.9. Una volta che i campioni si saranno raffreddati, passare alla procedura di analisi del dosaggio LP BD

ProbeTec ET (sezione F).*Le aree che si raccomanda di sottoporre a test includono: le superfici del contenitore per bagnomaria, lamicrocentrifuga, l�incubatore per riscaldamento e priming, le piastre di micropozzetti neri, l�impugnatura delpipettatore, i tasti a sfioramento dello strumento, la tastiera dello strumento, le superfici del contenitore perbagnomaria non a contatto dell�acqua, le superfici dei cestelli per le provette portacampioni e i banchi di lavoro,incluse le aree per la preparazione dei campioni.

Se per una delle aree si ottiene un risultato positivo, pulirla con una soluzione fresca di ipoclorito di sodio all�1%(v/v) e Alconox. Assicurarsi che la soluzione di pulizia copra l�intera area e resti sulla superficie per almeno 2 min ofino a quando si asciuga. Se necessario, rimuovere l�eccesso di soluzione con una salviettina pulita. Passare sull�areauna salviettina pulita e imbevuta di acqua e lasciare quindi asciugare la superficie. Ripetere l�analisi dell�areainteressata fino a quando si ottengono risultati negativi. Se la contaminazione persiste, rivolgersi all�assistenzatecnica per ulteriori informazioni.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

La presenza o assenza del DNA della L. pneumophila viene determinata calcolando i punteggi PAT (Passes AfterThreshold, superamenti della soglia) del campione, in base a valori di soglia predeterminati. Il punteggio PAT è unvalore metrico usato per valutare l�intensità del segnale generato dalla reazione. Con questa metrica i numeri piùgrandi indicano che la soglia è stata raggiunta nelle fasi precoci dell�amplificazione, mentre numeri più piccoliindicano che la soglia è stata raggiunta in una fase più avanzata della reazione. L�entità del punteggio PAT non èindicativa del livello di DNA della L. pneumophila presente nel campione.

Se i risultati di controllo del dosaggio non sono quelli attesi, non mettere a referto i risultati dei campioni. Per ivalori di controllo previsti, vedere la sezione Controllo di qualità. I risultati inclusi nel referto vengono determinatinel modo seguente.

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Campioni delle basse vie respiratorie.

a Ripetere il dosaggio LP BD ProbeTec ET utilizzando la provetta di campione trattato. Se rimane un volumeinsufficiente di campione preparato, ripetere l�analisi utilizzando il campione originale. Se il risultato dellaripetizione è positivo o negativo, interpretarlo come descritto in precedenza. Se i risultati delle ripetizioni sonoancora indeterminati, richiedere un nuovo campione.

Determinazione della soglia LP e IAC:I valori di soglia per il DNA target della L. pneumophila e del controllo interno di amplificazione (IAC) sono statistabiliti in origine utilizzando le analisi della curva ROC (Receiver Operator Characteristic) dei dati ottenuti dacontrolli positivi e negativi. Questi valori di soglia sono stati verificati nell�ambito di studi clinici e con campioni dellebasse vie respiratorie positivi e negativi alla L. pneumophila. I valori di soglia sono quindi stati convalidati in ulterioristudi clinici.

LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA1. Il dosaggio LP BD ProbeTec ET è specifico unicamente per i sierogruppi 1 - 14 della L. pneumophila. Gli altri

sierogruppi della L. pneumophila non sono stati analizzati.

2. Il dosaggio LP BD ProbeTec ET non rileva le infezioni causate da altre specie di Legionella.

3. Le prestazioni della metodica del dosaggio LP BD ProbeTec ET sono state convalidate esclusivamente con campionidi espettorato. Le performance con altre tipologie di campioni non sono state accertate.

4. Il dosaggio LP BD ProbeTec ET è stato convalidato esclusivamente con pazienti a partire dai 13 anni di età.

5. Come per molti altri test diagnostici, i risultati del dosaggio LP BD ProbeTec ET devono essere interpretaticontestualmente agli altri dati clinici e di laboratorio a disposizione del medico.

6. Un risultato negativo non esclude la possibilità di infezione, in quanto i risultati del dosaggio possono esserecondizionati da errori di raccolta del campione, errori tecnici, scambio di campioni, terapia antibioticaconcomitante o dalla presenza nel campione di una quantità di DNA della L. pneumophila inferiore alla sogliadi sensibilità analitica del test.

7. Il dosaggio LP BD ProbeTec ET non può essere usato per valutare il successo o l�insuccesso terapeutico, inquanto la presenza di acidi nucleici da L. pneumophila può persistere anche dopo la terapia antibiotica.

8. Il dosaggio LP BD ProbeTec ET non è stato convalidato con campioni ambientali (ad es., analisi dell�acquapotabile o della qualità dell�acqua).

9. Per fornire prestazioni ottimali, questo dosaggio richiede una tecnica corretta di raccolta e manipolazione deicampioni.

10. Il dosaggio LP BD ProbeTec ET deve essere usato esclusivamente da personale che abbia ricevuto unapreparazione adeguata per effettuare la procedura di dosaggio e utilizzare il sistema BD ProbeTec ET.

11. Il dosaggio LP BD ProbeTec ET fornisce risultati qualitativi. Non esiste quindi alcuna correlazione tra l�entitàdel punteggio PAT (Passes After Threshold) e la quantità di DNA della L. pneumophila presente in un campione.

RISULTATI ATTESI

A. Prevalenza Il tasso di positività osservato nelle analisi della L. pneumophila varia a seconda del metodo utilizzato, l�età delpaziente, la presenza di fattori di rischio latenti, la posizione geografica e soprattutto la prevalenza locale dellamalattia, comprese possibili situazioni di epidemia.

Punteggio PATTarget LP Target IAC Risultato Interpretazione Referto

> 0 > o = 0 Positivo DNA della L. pneumophilarilevato mediante SDA.

Positivo per gli organismiappartenenti ai sierogruppi 1 - 14 della L. pneumophila, indice diinfezione in corso. Sononecessari altri test peridentificare il sierogruppo, se necessario a finiepidemiologici.

= 0 > 0 Negativo DNA della L. pneumophilanon rilevato mediante SDA.

Presunto negativo per isierogruppi 1 � 14 della L. pneumophila in uncampione delle basse vierespiratorie, indice di assenzadi infezioni correnti opassate. Non è possibileescludere un�infezione daLegionella per le seguentimotivazioni: 1) i sierogruppidiversi da 1 � 14 e le altrespecie di Legionella possonocausare malattie e, 2) illivello di DNA presente puòessere al di sotto del limite dirilevazione del test.

= 0 = 0 Indeterminato Controllo di amplificazioneinibito. Sono necessariulteriori test perl�interpretazione dei risultati.a

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B. Distribuzione della frequenza del punteggio PATSono stati raccolti un totale di 83 campioni di espettorato retrospettivi presso quattro centri clinici negli USA, inEuropa e Canada, i quali sono stati analizzati con il dosaggio LP BD ProbeTec ET. Una distribuzione della frequenzadei punteggi PAT per l�LP a confronto della coltura è illustrata nella Figura 1.

Figura 1 - Distribuzione della frequenza dei punteggi PAT per l�LP a confronto della coltura

C. ControlliDurante la valutazione clinica, sono stati osservati risultati errati dei i controlli del dosaggio LP BD ProbeTec ET inun ciclo di analisi su 46 (ossia in un ciclo era presente un errore procedurale). I punteggi PAT per l�LP dei restanti 45cicli di analisi sono riepilogati nella Tabella 1.

Tabella 1 Distribuzione del punteggio PAT di LP per controlli di campioni respiratori e terreni

PRESTAZIONI DELLA METODICA

Studio prospetticoIl dosaggio LP BD ProbeTec ET è stato valutato prospetticamente presso sette centri clinici ubicati negli Stati Unitie in Canada durante la stagione delle infezioni resperatorie del 2002 � 2003. Da ogni paziente sono stati raccolti uncampione di espettorato e uno di urina. I campioni di espettorato sono stati analizzati utilizzando il dosaggio LP BDProbeTec ET, la coltura della Legionella e un dosaggio anticorpale in fluorescenza diretta (DFA). I campioni di urinasono stati analizzati con un dosaggio dell'antigene urinario della L. pneumophila disponibile in commercio.

118 pazienti in totale soddisfavano i criteri di ammissione allo studio (ad es., prova radiografica della polmonite,pazienti di età superiore ai 13 anni, che assumevano antibiotici da ≤ di 14 giorni, raccolta di campioni di tipo valido,utilizzo di metodi di riferimento corretti, ecc.). Sui 118 pazienti, sono stati ottenuti 114 risultati validi del dosaggioLP BD ProbeTec ET. I risultati dei campioni di espettorato sono stati confrontati con i risultati della colturadell'espettorato per stimare le prestazioni della metodica.

Un campione era considerato positivo se il risultato della coltura era positivo. Un risultato era considerato negativose la coltura era negativa. Tutti i dosaggi inizialmente indeterminati sono stati ripetuti sui campioni trattati outilizzando il campione originale, qualora non fossero disponibili quantità sufficienti di campione trattato. Uncampione con risultato indeterminato sia del test iniziale sia della ripetizione (ossia il test finale) non è stato inclusonella valutazione delle prestazioni della metodica. Un campione che ha dato un risultato iniziale indeterminato eun risultato positivo o negativo con la ripetizione è stato incluso nella valutazione delle prestazioni della metodica.Un campione che ha dato un risultato iniziale indeterminato e per il quale non è stato possibile ripetere l'analisi,poiché il volume era insufficiente, è stato considerato come "inizialmente indeterminato" e non incluso nellavalutazione delle prestazioni della metodica.

I risultati del dosaggio LP BD ProbeTec ET su campioni di espettorato a confronto di quelli della coltura sonoriepilogati nella Tabella 2.

Controllo N Range 5° percentile Media Mediana 95° percentile

LP negativo 45 0 � 0 0 0 0 0

LP positivo 45 29,4 � 50,7 40,1 46,7 47,6 49,7

Risultato della coltura 0 1 � 19 20 � 39 40 � 60 Totale

NegativoPositivo

52 0 4 4

2 0 2 19

60

23

Totale 54 0 6 23 83

04 42 0 2

19

0

10

20

30

40

50

60

0 1 - 19 20 - 39 40 - 60

Freq

uen

za

Coltura -

Coltura +

(-) (+)

Punteggio PAT per l'LP

52

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Tabella 2 Dosaggio LP BD ProbeTec ET - Risultati dei campioni di espettorato prospettici a confrontodella coltura

a Dei 114 campioni con risultato negativo della coltura, tutti sono risultati negativi con il test anticorpale influorescenza diretta (DFA). 87 dei 114 pazienti sono inoltre stati sottoposti a test con un dosaggio dell'antigeneurinario e trovati negativi.

b Un campione è risultato negativo alla ripetizione del test ed è stato incluso nel calcolo della specificità. Di uncampione non era disponibile un volume sufficiente per ripetere il test.

c Due campioni sono rimasti indeterminati dopo la ripetizione del test. Di un campione non era disponibile un volumesufficiente per ripetere il test.

NP = Non pertinente

Studio retrospettivoIl dosaggio LP BD ProbeTec ET è stato inoltre valutato con 83 campioni di espettorato retrospettivi acquisiti dacentri clinici ubicati negli Stati Uniti, in Europa e Canada. I campioni retrospettivi sono stati conservati congelati perun massimo di 6 anni, la maggioranza di essi (il 65,1% ovvero 54/83) sono stati conservati per meno di due anni.Presso ogni centro sono stati registrati i risultati della coltura di ciascun campione retrospettivo. Tutti i centri hannoanalizzato i campioni di espettorato usando il dosaggio LP BD ProbeTec ET e ne hanno messo a confronto i risultaticon quelli della coltura. Un campione era considerato positivo se il risultato della coltura era positivo. Un campioneera considerato negativo se il risultato della coltura era negativo. I risultati del dosaggio LP BD ProbeTec ET sucampioni retrospettivi di espettorato a confronto di quelli della coltura sono riepilogati nella Tabella 3.

Tabella 3 Il dosaggio LP BD ProbeTec ET

a Otto campioni avevano un risultato negativo della coltura e sono risultati positivi con il dosaggio LP BD ProbeTec ET.Tutti e otto i campioni sono risultati positivi con un dosaggio dell'antigene urinario. Il test PCR è stato effettuato susei degli otto campioni; tutti e sei i campioni si sono rivelati positivi mediante questo test.

b Due campioni avevano un risultato positivo della coltura e sono risultati negativi con il dosaggio LP BD ProbeTec ET.Entrambi i campioni sono risultati negativi con un dosaggio dell'antigene urinario. Il test PCR è stato eseguito suentrambi i campioni, uno è risultato positivo mediante questo test.

c I 23 campioni con coltura positiva sono stati distribuiti fra i seguenti sierogruppi: 47,8% (11/23) sierogruppo 1; 17,4%(4/23) sierogruppo 3; 13,0% (3/23) sierogruppo 4; 4,3% (1/23) sierogruppo 5; 4,3% (1/23) sierogruppo 6 e 13% (3/23)informazioni sul sierogruppo non disponibili.

NP = non pertinente

Coltura Percentuale di concordanza con le previsioni (95%CI)

Centro Risultato LP Positivo Negativo Totale Positivo Negativo Globale

6 Positivo 1 0 1

Negativo 0 0 0

Totale 1 0 1 100% (1/1)(2,5% � 100%) NP 100% (1/1)

(2,5% � 100%)

8 Positivo 16 5 21

Negativo 1 24 25

Totale 17 29 46 94,1% (16/17)(71,3% � 99,9%)

82,8% (24/29)(64,2% � 94,2%)

87% (40/46)(73,7% � 95,1%)

9 Positivo 1 3 4

Negativo 0 22 22

Totale 1 25 26 100% (1/1)(2,5% � 100%)

88% (22/25)(68,8% � 97,5%)

88,5% (23/26)(69,8% � 97,6%)

10 Positivo 3 0 3

Negativo 1 6 7

Totale 4 6 10 75% (3/4)(19,4% � 99,4%)

100% (6/6)(54,1% � 100%)

90% (9/10)(55,5% � 99,7%)

Globale Positivo 21 8a 29

Negativo 2b 52 54

Totale 23c 60 83 91,3% (21/23)(72% � 98,9%)

86,7% (52/60)(75,4% � 94,1%)

88% (73/83)(79% � 94,1%)

rispetto a coltura

SitoSensibilità(95% CI)

Specificità (95% CI) IndeterminatoIniziale/Finale

1 NP 100% (17/17)(80,5% � 100%) 0/0

2 NP100% (2/2)

(15,8% � 100%)0/0

3 NP 100% (31/31)(88,8% � 100%) 0/0

6 NP 100% (33/33)(89,4% � 100%) 2/0b

7 NP100% (31/31)

(88,8% � 100%)3/2c

Globale NP 100% (114/114)a

(96,8% � 100%)5/2

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Studi analiticiIl volume della reazione di amplificazione del dosaggio LP BD ProbeTec ET è pari a 100 µL di campione trattato.

Sensibilità analiticaLa sensibilità analitica del dosaggio LP BD ProbeTec ET su 14 sierogruppi diversi di L. pneumophila è statadeterminata diluendo sospensioni batteriche a livelli di 0, 150, 300 e 450 unità formanti colonie (UFC) per reazione.I campioni sono stati analizzati in triplicato. In base alla positività del 100%, la sensibilità analitica dei sierogruppi2 � 10 e 12 è stata di 150 UFC/reazione; il limite di rilevamento (LOD � Limit of Detection) effettivo può tuttaviaessere inferiore al livello minore sottoposto a test. In base alla positività del 100%, la sensibilità analitica deisierogruppi 1 e 11 è stato di 300 UFC/reazione, per il sierogruppo 13 è stato di 450 UFC/reazione e per il sierogruppo14 di 700 UFC/reazione.

La sensibilità analitica del dosaggio LP BD ProbeTec ET in presenza di una matrice del campione delle basse respiratorieè stata determinata aggiungendo all�espettorato un ceppo di L. pneumophila sierogruppo 1 infettato da macrofagi alivelli di 0, 150, 300 e 450 UFC per reazione. I campioni sono stati analizzati in triplicato. In base alla positività del 100%,la sensibilità analitica dei campioni delle basse vie respiratorie con l�aggiunta è stata di 150 UFC/reazione; il limite dirilevamento (LOD) effettivo può tuttavia essere inferiore al livello minore sottoposto a test.

Specificità AnaliticaSono stati valutati in totale 79 microrganismi (69 batteri, un lievito e nove virus) utilizzando il dosaggio LPBD ProbeTec ET. Gli isolati batterici sono stati analizzati a concentrazioni in un range da 1 x 106 UFC/mL a 1 x 108 UFC/mL.I virus sono stati analizzati a una concentrazione di 1 x 106 particelle virali/mL. È stata preparata una sospensionemiceliale di Coccidioides immitis equivalente a uno standard McFarland di 5. Nessuno dei microrganismi analizzatiha prodotto un risultato positivo o inibito l�IAC (Tabella 4).

Tabella 4 Dosaggio LP BD ProbeTec ET � Specificità analitica

SOSTANZE INTERFERENTISostanze potenzialmente interferenti, che possono essere riscontrate in campioni delle basse vie respiratorie sonostate analizzate con il dosaggio LP BD ProbeTec ET in assenza di target o in presenza di 750 UFC/reazione diL. pneumophila. In assenza di target, nessuna delle sostanze sottoposte a test ha prodotto un risultato positivo oha inibito l�IAC alle concentrazioni elencate nella Tabella 5. Con il target in presenza di sostanze alle concentrazionielencate nella Tabella 5, tutti i campioni analizzati hanno prodotto un risultato positivo.



Adenovirus-5







Candida albicans

Chlamydia trachomatis,siero L2







Cytomegalovirus

Eikenella corrodens






Escherichia coli




Herpesvirus-1


Virus dell�influenza A

Virus dell�influenza B

Kingella kingae

Klebsiella pneumoniaesubsp. ozaenae tipo 4



Legionella anisa


Legionella cherrii


Legionella dumoffii

Legionella erytha


Legionella feeleii

Legionella gormanii


Legionella jordanis







Moraxella osloensis





Neisseria mucosa

Virus dellaparainfluenza I



Prevotella oralis


Virus respiratoriosinciziale, catena lunga

Rhinovirus

Salmonella choleraesuissierotipo Enteritidis

Salmonella choleraesuissierotipo Typhi

Serratia marcescens

Staphylococcus aureus,produttore di proteina A

Staphylococcus aureus,non produttore diproteina A



Streptococco di gruppo B





Veillonella parvula

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Tabella 5 Dosaggio LP BD ProbeTec ET � Sostanze sottoposte a screening per l�interferenza

RiproducibilitàLa riproducibilità del dosaggio LP BD ProbeTec ET è stata valutata presso tre laboratori sottoponendo a test unpannello costituito da 24 campioni con l�aggiunta di PBS/BSA. Il pannello comprendeva 12 campioni negativi alla L.pneumophila; tre campioni positivi alla L. pneumophila con valore basso (300 UFC/reazione) e tre con valore alto(500 UFC/reazione); nonché tre campioni positivi con valori bassi (rispettivamente, 30 organismielementari/reazione, 300 UFC/reazione, 900 cellule/reazione) e tre con valori alti (rispettivamente 50 organismielementari/reazione, 500 UFC/reazione, 1500 cellule/reazione) ciascuno dei quali contenente Chlamydophilapneumoniae (CP), L. pneumophila (LP) e Mycoplasma pneumoniae (MP). Un operatore per centro ha sottopostoogni giorno i pannelli ad analisi per tre giorni. La Tabella 6 riassume i risultati.Tabella 6: Stime della riproducibilità su campioni delle basse vie respiratorie per livello del campione

a Un campione escluso dall�analisi a causa di un errore procedurale.

DISPONIBILITÀSono disponibili i seguenti prodotti BD ProbeTec ET

N. di cat. Descrizione440728 BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay


440457 BD ProbeTec ET Accessories Kit (10 copri-priming, 16 sigillanti per amplificazione a metà e 8 buste per rifiuti)

440458 BD ProbeTec ET Pipette Tips, 6 x 120

440661 BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tubes and Caps, 200 di ciascuno


440477 BD ProbeTec ET Instrument, per uso fuori dagli USA

440478 BD ProbeTec ET Instrument, per uso in USA e Canada





BIBLIOGRAFIA: Vedere �References� nel testo inglese.

Da un giornoall�altro

Stesso centro

Da un centroall�altro

Membro del pannello N % correttaPunt. PAT

medio DS % CV DS % CV


CP/LP/MP-LOW 26a 100,0% 43,0 0,00 0,00 2,59 6,01Negativo 108 100,0% 0,0 � � � �

IAC con campioni negativi alla LP 108 100,0% 47,8 0,43 0,91 0,34 0,70

Campioni delle basse vie respiratorieSostanze analizzate Concentrazione

Sangue intero (eparina) 2,65%

Lidocaina 2% 0,21%

Soluzione per l�induzione di espettorato (3% NaCl) 0,32%

Azitromicina 0,42 µg/mL

Penicillina G 17 µg/mL

Tetraciclina 2,3 µg/mL

Doxiciclina 26,5 µg/mL

Ciprofloxacina 4,88 µg/mL


Chlamydophila pneumoniae 1,06 x 107 EBs/mL

Mycoplasma pneumoniae e Chlamydophila pneumoniae rispettivamente 1,06 x 107 cellule/mL e 1,06 x 107 EBs/mL

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Español

USO PREVISTOBD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay (Análisis de ADN amplificado para Legionellapneumophila (LP) BD ProbeTec ET), para uso con el sistema BD ProbeTec ET, utiliza la tecnología de amplificaciónpor desplazamiento de cadenas (SDA, Strand Displacement Amplification) para la detección cualitativa directa deADN de Legionella pneumophila (serogrupos 1 - 14) en muestras de esputo de pacientes con neumonía presuntiva.Junto con el cultivo y otros métodos, se ha diseñado para facilitar el diagnóstico presuntivo de la legionelosis oenfermedad de los legionarios.

RESUMEN Y EXPLICACIONLa enfermedad de los legionarios puede contraerse por inhalación de aerosoles que contengan Legionella o lamicroaspiración de agua contaminada. En estudios realizados en Europa y Norteamérica, se ha comunicado que laLegionella es la causa del 2 al 15% de los casos de neumonía extrahospitalaria que requieren hospitalización. La tasade mortalidad de los pacientes con legionelosis es del 5 al 30%, entre los que los pacientes de edad y losinmunodeprimidos corren el mayor riesgo de fallecimiento1. Se han identificado cuarenta especies diferentes deLegionella, la mitad de las cuales se relaciona con enfermedades humanas. Legionella pneumophila causa el 90%de los casos diagnosticados de legionelosis. Aunque se conocen catorce serogrupos de L. pneumophila, el 80% delas infecciones por L. pneumophila son causadas por el serogrupo 12.

Se ha realzado la importancia de establecer un diagnóstico de neumonía y su etiología debido a la creciente inquietudpor el uso excesivo de antibióticos. Los resultados de las pruebas diagnósticas de L. pneumophila deben estardisponibles al médico clínico rápidamente porque se ha demostrado que se incrementa la mortalidad si se demora laadministración del tratamiento adecuado. Con los métodos de cultivo tradicionales, se demora dos días como mínimopara cultivar organismos Legionella a partir de muestras de esputo positivas y un total de siete a diez días para finalizarun resultado negativo. Como complemento para el cultivo, se encuentran disponibles comercialmente equipos deinmunoensayos enzimáticos para la detección del antígeno del serogrupo 1 de L. pneumophila en muestras de orina3.No obstante, siguen siendo limitadas las pruebas diagnósticas de las infecciones por Legionella que proporcionanresultados rápidos con buena sensibilidad y especificidad.

PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTOEl Análisis de ADN amplificado para Legionella pneumophila (LP) BD ProbeTec ET se basa en la amplificación ydetección simultáneas de ADN diana utilizando cebadores de amplificación y una sonda detectora marcada confluorescencia. Los reactivos SDA se deshidratan en dos micropocillos desechables diferentes. La muestra procesadase agrega al micropocillo de cebado, que contiene los cebadores de amplificación, la sonda detectora marcada confluorescencia y otros reactivos necesarios para la amplificación. Los cebadores amplifican una región de 68 pares debases del gen potenciador de la capacidad de infección de los macrófagos (mip) de L. pneumophila que se preservaen todos los serogrupos de la especie. Tras la incubación, se transfiere la mezcla de reacción al micropocillo deamplificación, que contiene dos enzimas (una ADN polimerasa y una endonucleasa de restricción) necesarias parala SDA. Los micropocillos de amplificación se tapan herméticamente para evitar la contaminación y, a continuación,se incuban en un lector de fluorescencia de control térmico que controla la formación de productos amplificados encada reacción. Cada reacción coamplifica y detecta un control de amplificación interno, cuyo propósito es verificarque existen las condiciones adecuadas para la amplificación y reducir la posibilidad de comunicar un resultadonegativo falso debido a la presencia de inhibidores de ensayo. La presencia o ausencia de ADN de L. pneumophilase determina calculando las puntuaciones PAT (Passes After Threshold) de la muestra según los valores de umbralpredeterminados. El instrumento comunica automáticamente los resultados como positivos, negativos oindeterminados.

REACTIVOS Y MATERIALESCada análisis de ADN amplificado para Legionella pneumophila (LP) BD ProbeTec ET contiene lo siguiente:

Micropocillos de amplificación para Legionella pneumophila (LP), (1x24)

6 oligonucleótidos ≥ 7,5 pmol, dNTP ≥ 15,2 nmol, 2 sondas detectoras ≥ 22,5 pmol,

Oligonucleótido sintético ≥ 1500 copias

Micropocillos de amplificación para Legionella pneumophila (LP), (1x24)

Enzima de restricción: ≥ 33 unidades, ADN polimerasa ≥ 14 unidades

10 cubiertas de cebado, 16 cierres herméticos de amplificación (1/2), 8 bolsas de desecho

Equipo de control y diluyente de medios y muestras respiratorias BD ProbeTec ET (CF*/LP/MP**):

Contenido: Diluyente de medios y muestras respiratorias: bicina, fosfato potásico, hidróxido potásico, DMSO y Proclin;10 controles positivos (CF/LP/MP): ≥ 1050 ng ADN de esperma de salmón, ≥ 47,3 µg Tris, ≥ 9,0 µg EDTA, ≥ 3600 copiasde plásmido de CF, ≥ 4800 copias de plásmido de LP, ≥ 5400 copias de plásmido de MP; 10 controles negativos(CF/LP/MP): ≥ 1050 ng ADN de esperma de salmón, ≥ 47,3 µg Tris, ≥9,0 µg EDTA; 100 tubos de 2 mL con tapa inviolable

* Se refiere al análisis de ADN amplificado para la familia Chlamydiaceae (CF) BD ProbeTec ET

** Se refiere al análisis de ADN amplificado para Mycoplasma pneumoniae (MP) BD ProbeTec ET

Instrumentos, equipo y materiales: Instrumento y placa del instrumento BD ProbeTec ET, estufa de lisis BDProbeTec ET, estufa de cebado y calentamiento BD ProbeTec ET, pipeta BD ProbeTec ET, soporte y fuente dealimentación, gradilla para tubos de muestra de 2 mL, equipo de accesorios BD ProbeTec ET, puntas de pipeta BD ProbeTec ET.

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Materiales necesarios pero no suministrados: Cabina de seguridad biológica de clase II, agitador vórtex,congelador sin ciclos de temperatura antiescarcha fijado a una temperatura de -20 °C y/o -70 °C (o inferior),microcentrífuga capaz de 16.000 x g, baños María, termómetro digital, gradilla de baño María con tapa atornillable,otras gradillas de tubos de muestras adecuadas, mini equipos para ADN de muestras fecales QIAGEN QIAamp, etanolal 96 � 100%, torundas BBL CultureSwab EZ, tubos de muestras de 2 mL y tapones BD ProbeTec ET, guantesdesechables, marcadores resistentes al alcohol, micropipetas con una capacidad de dispensación de 25 � 1000 µL,puntas de pipeta resistentes a los aerosoles, agua destilada, L. pneumophila ATCC 33152 (Philadelphia-1), albúminabovina (fracción V) 0,2% (p/v) en solución salina al 0,85% (p/v), hipoclorito sódico al 1% (v/v) con Alconox.

* Disolver 7,5 g de Alconox en 1 L de solución de hipoclorito sódico al 1% (v/v) con Alconox y mezclar. Preparar enfresco diariamente.

Requisitos de conservación y manipulación: Los juegos de reactivos BD ProbeTec ET LP pueden conservarse auna temperatura de 2 °C a 33 °C. No utilizar después de la fecha de caducidad los juegos de reactivos que no hayansido abiertos. Una vez abierta una bolsa, los micropocillos son estables durante 12 semanas si se cierran de maneraapropiada o hasta la fecha de caducidad, lo que suceda antes. No congelar.

El equipo de control y diluyente de medios y muestras respiratorias BD ProbeTec ET (CF/LP/MP) puede conservarsea una temperatura de 2 °C a 33 °C. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. No congelar.

Advertencias y precaucionesPara uso diagnóstico in vitro.

1. En las muestras clínicas puede haber microorganismos patógenos, como los virus de la hepatitis y el virus de lainmunodeficiencia humana. Para la manipulación de todos los elementos contaminados con sangre u otroslíquidos corporales deben seguirse las �Precauciones estándar�4-7 y las directrices del centro.

2. Los pasos de manipulación y procesamiento de las muestras de las vías respiratorias inferiores antes del paso deincubación a 70 °C deben realizarse en una cabina de seguridad biológica de clase II.

3. Durante el paso de incubación a 70 °C, utilizar una gradilla de baño María con tapa atornillable parasuministrar contención adicional a las muestras de las vías respiratorias inferiores con posible peligro biológico.

4. El diluyente de medios y muestras respiratorias BD ProbeTec ET contiene dimetilsulfóxido (DMSO). El DMSO esnocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel. Evítese el contacto con los ojos y utilícenseguantes durante su manipulación. En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente conagua y acúdase a un médico. Después del contacto con la piel, lávese inmediatamente con abundante agua.

5. Consultar el manual del mini equipo para ADN de muestras fecales QIAamp para leer la información deseguridad acerca de los reactivos QIAGEN utilizados en este procedimiento. No eliminar los reactivos QIAGENcon soluciones de lejía. No exponer los reactivos QIAGEN a los efectos de la lejía.

6. Se han comunicado casos que sugieren que los equipos de extracción de ADN QIAGEN no son adecuados parala reacción en cadena de polimerasa (PCR) de Legionella, debido a la posibilidad de que los reactivos secontaminen con ADN de Legionella8,9. Aunque es poco probable que esto suceda, y se han identificado especiesLegionella diferentes de L. pneumophila en dichos estudios, el usuario debe verificar el rendimiento de cadalote nuevo de reactivos QIAGEN antes de utilizarlos con muestras de pacientes.

7. Aunque no se requieren áreas de trabajo específicas, ya que el diseño de BD ProbeTec ET reduce la posibilidadde contaminación con productos de amplificación en el entorno de análisis, es preciso observar otrasprecauciones para controlar la contaminación, especialmente para evitar la contaminación de las muestrasdurante su procesamiento.

8. Las bolsas de reactivos que contienen micropocillos de cebado y micropocillos de amplificación sin usar DEBENvolver a cerrarse herméticamente con cuidado después de abrirlas. Debe verificarse que hay un agentedeshidratante antes de volver a cerrar herméticamente las bolsas de reactivos.

9. La placa que contiene los micropocillos de amplificación DEBE taparse de manera apropiada con el cierrehermético de amplificación antes de transferir la placa de la estufa de cebado y calentamiento BD ProbeTecET al instrumento BD ProbeTec ET. El cierre hermético garantiza una reacción cerrada para amplificación ydetección y es necesario para evitar la contaminación del instrumento y del área de trabajo con productos deamplificación. No retirar el material de cierre hermético de los micropocillos en ningún momento.

10. Los micropocillos de cebado con líquido residual (tras la transferencia de líquido de éstos a los micropocillos deamplificación) representan una fuente de contaminación objeto de investigación. Los micropocillos de cebadodeben sellarse con cuidado con el cierre hermético de la placa antes de su eliminación.

11. Para evitar la contaminación del entorno de trabajo con productos de amplificación, deben utilizarse las bolsasde desechos suministradas en los juegos de reactivos para desechar los micropocillos de amplificaciónanalizados. Antes de desechar las bolsas hay que asegurarse de que estén correctamente cerradas.

12. DEBEN CAMBIARSE LOS GUANTES en ciertos pasos del procesamiento de las muestras y del procedimiento deanálisis para evitar la contaminación cruzada de las muestras. Si los guantes entran en contacto con muestras,deben reemplazarse inmediatamente para evitar la contaminación de otras muestras.

13. En caso de contaminación del área de trabajo o del equipo con muestras o controles, limpiar a conciencia elárea contaminada con hipoclorito sódico al 1% (v/v) con Alconox y enjuagar a conciencia con agua. Antes derealizar nuevos análisis, debe dejarse que se seque completamente la superficie. Antes de limpiar la salpicadurade cualquier reactivo de procesamiento de muestras QIAGEN, limpiar profundamente con agua las zonasafectadas y luego utilizar una solución de 1% (v/v) de hipoclorito sódico con Alconox.

14. Utilizar únicamente la pipeta BD ProbeTec ET y las puntas de pipeta BD ProbeTec ET para la transferencia demuestras procesadas a los micropocillos de cebado y de éstos a los micropocillos de amplificación.

15. Seguir los procedimientos de laboratorio habituales al desechar las puntas de pipeta usadas, los tubos demuestras, los micropocillos de cebado y otros materiales desechables. Eliminar con cuidado los materialesdesechables. Cerrar herméticamente y desechar los recipientes de desechos cuando estén llenos en ¾ de sucapacidad o diariamente (lo que ocurra antes).

16. No intercambiar ni mezclar micropocillos, controles ni reactivos para procesamiento de equipos que tengannúmeros de lote diferentes.

17. Comuníquese con el servicio técnico en caso de una situación inusual, como una salpicadura en el instrumentoBD ProbeTec ET o contaminación por ADN que no pueda eliminarse mediante los procedimientos de limpieza.

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RECOGIDA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS1. Recogida de las muestras

a. Todas las muestras deben recogerse conforme a las recomendaciones del manual Clinical MicrobiologyProcedures Handbook10 o el manual de procedimientos de cada laboratorio.

2. Almacenamiento y transporte de las muestras� Las muestras pueden almacenarse/transportarse a una temperatura de 18 � 33 °C durante 6 h como

máximo.� Las muestras pueden refrigerarse a una temperatura de 2 � 8 °C durante 3 días como máximo.� Las muestras pueden almacenarse a una temperatura de hasta -20 °C durante 14 semanas como máximo.

PROCEDIMIENTO DE ANALISIS Consultar el manual del usuario del sistema BD ProbeTec ET para obtener instrucciones específicas sobre lautilización y el mantenimiento de los componentes del sistema.

A. Preparación instrumental:1. Los instrumentos deben estar encendidos y debe dejarse que se calienten antes de iniciar el análisis.

a. La estufa de cebado y calentamiento requiere aproximadamente 90 min para su calentamiento y estabilización. El punto de ajuste para el componente de cebado de la estufa de cebado y calentamiento es 72,5 °C.El punto de ajuste para el componente de calentamiento de la estufa de cebado y calentamiento es 54 °C.

b. El instrumento BD ProbeTec ET está controlado por software y requiere aproximadamente 30 min paracalentarse.

2. Deben controlarse las temperaturas de la estufa antes de iniciar el análisis. Registrar las temperaturas en elregistro de mantenimiento del sistema BD ProbeTec ET.a. Estufa de cebado y calentamiento

El termómetro de la estufa de cebado debe marcar entre 72 °C y 73 °C.El termómetro de la estufa de calentamiento debe marcar entre 53,5 °C y 54,5 °C.

3. Comprobar la temperatura mostrada en la pantalla del instrumento BD ProbeTec ET. La temperatura debe estarentre 47,5 °C y 55,0 °C. Registrar las temperaturas en el registro de mantenimiento del sistema BD ProbeTec ET.

B. Pipeta:Consultar el manual del usuario del sistema BD ProbeTec ET para obtener explicaciones detalladas sobre lasfunciones del teclado de la pipeta BD ProbeTec ET. Además, la pipeta BD ProbeTec ET debe limpiarse después decada uso. Consultar al representante de servicio técnico para obtener instrucciones acerca de la limpieza ymantenimiento adecuados de la pipeta BD ProbeTec ET.Se requieren los siguientes programas para realizar el análisis de LP BD ProbeTec ET. El programa 1 transfierelíquido de las muestras procesadas a los micropocillos de cebado de LP. El programa 5 transfiere líquido de losmicropocillos de cebado de LP a los micropocillos de amplificación de LP. Programar la pipeta de la siguiente forma:

Programa 1: 1. Encender la pipeta. La pipeta emitirá un pitido, mostrará parpadeando en pantalla �ZERO� y después el

número de versión del software y, a continuación, emitirá otro pitido.2. Presionar la tecla �Prog� (Programa) azul. Presionar la tecla �Vol� (Volumen) hasta que aparezca en pantalla

�1� para seleccionar el programa 1. Presionar �Enter� (Aceptar). 3. Para entrar en el modo de programación, mantener presionada la tecla �Prog� (Programa). Al presionar la

tecla �Prog� (Programa), presionar al mismo tiempo la tecla de función especial con una punta de pipeta o conel extremo de un clip sujetapapeles.

4. Presionar �Fill� (Rellenar). Presionar la tecla de flecha hacia arriba hasta que se muestre en pantalla. Presionar�Enter� (Aceptar).

5. Presionar �Disp� (Dispensar). Presionar la tecla de flecha hacia arriba hasta que se muestre en pantalla 150.Presionar �Enter� (Aceptar).

6. Presionar �Enter� (Aceptar) una segunda vez para guardar el programa y salir. Debe oírse un pitido que indicaque la programación ha terminado.

7. Verificar el programa presionando el accionador para avanzar en cada paso. A medida que se avance en cadapaso, ajustar la velocidad de aspiración/dispensación utilizando la tecla �Vol� (Volumen). En cada paso apareceel indicador de velocidad. Utilizar la tecla �Vol� para ajustar el indicador de velocidad para mostrar doscuadrados para los pasos �Fill� (Rellenar) y �Disp� (Dispensar).

Programa 5:1. Presionar la tecla �Prog� (Programa). Presionar la tecla �Vol� (Volumen) hasta que aparezca en pantalla �5�

para seleccionar el programa 5. Presionar �Enter� (Aceptar). 2. Para entrar en el modo de programación, mantener presionada la tecla �Prog�. Al presionar la tecla �Prog�

(Programa), presionar al mismo tiempo la tecla de función especial con una punta de pipeta o con el extremode un clip sujetapapeles.

3. Presionar �Fill� (Rellenar). Presionar la tecla de flecha hacia arriba hasta que se muestre en pantalla 100.Presionar �Enter� (Aceptar).

4. Presionar �Disp� (Dispensar). Presionar la tecla de flecha hacia arriba hasta que se muestre en pantalla 100.Presionar �Enter� (Aceptar).

5. Presionar �Mix� (Mezclar). Presionar la tecla de flecha hacia arriba hasta que se muestre en pantalla 50.Presionar �Enter� (Aceptar).

6. Presionar �Enter� (Aceptar) una segunda vez para guardar el programa y salir. Debe oírse un pitido que indicaque la programación ha terminado.

7. Verificar el programa presionando el accionador para avanzar en cada paso. A medida que se avanza en cadapaso, ajustar la velocidad de aspiración/dispensación/mezcla utilizando la tecla �Vol� (Volumen). En cada pasoaparece el indicador de velocidad. Utilizar la tecla �Vol� (Volumen) para ajustar el indicador de velocidad paramostrar dos cuadrados para las funciones de aspiración y dispensación. Utilizar la tecla �Vol� (Volumen) paraajustar la velocidad para la mezcla de forma que se muestren tres cuadrados.

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Revisión de los programasDeben revisarse los programas antes de iniciar el procedimiento. Para revisar los programas, encender la pipeta.Presionar la tecla �Prog� (Programa) azul. Presionar la tecla �Vol� (Volumen) hasta que se muestre en pantalla elnúmero de programa apropiado (1 ó 5). Presionar la tecla �Enter� (Aceptar). Utilizar el accionador de pipeteadopara avanzar paso a paso por el programa.

Programa 1: Este programa aspira 200 µL y dispensa 150 µL en el micropocillo de LP. La pantalla de la pipeta debemostrar el siguiente mensaje:Fill 200 µL � SIIDispense 150 µL � SII

Programa 5: este programa aspira 100 µL, dispensa 100 µL y mezcla 50 µL tres veces. La pantalla de la pipeta debemostrar el siguiente mensaje:Fill 100 µL � SIIDispense 100 µL � SIIMix 50 µL � SIIIZero (parpadeando)

C. Disposición de las placas:El instrumento BD ProbeTec ET genera el informe de disposición de las placas una vez que se han registrado en elsistema el tipo de análisis, la identificación de las muestras, los números de lote de los controles y los números delote de los equipos. El informe de disposición de las placas muestra la disposición física de las muestras y loscontroles para cada placa que se va a analizar. Esta orientación se utiliza para la placa de micropocillos de cebadoy para la placa de micropocillos de amplificación. Para el análisis de LP, los micropocillos de cebado son tiras demicropocillos de color gris liso. Los micropocillos de amplificación son tiras de micropocillos de color gris a rayas.

D. Procesamiento de muestras de las vías respiratorias inferiores:

Notas relativas al procedimiento: � Consultar el manual del mini equipo para ADN de muestras fecales QIAGEN QIAamp para leer notas de

procedimiento y precauciones importantes antes de comenzar.� Llenar un baño María con agua destilada y calentar a 70 °C (± 5 °C) antes de comenzar con el procesamiento

de las muestras.� Utilizar marcadores resistentes al alcohol para etiquetar los recipientes y tubos.� Cambiar las puntas de pipeta cada vez que transfiera líquidos. Se recomienda el uso de puntas resistentes a los

aerosoles.� Permitir que el diluyente de medios y muestras respiratorias (CF/LP/MP) BD ProbeTec ET llegue a temperatura

ambiente y mezclar invirtiendo suavemente el envase antes de su utilización.� Separar la cantidad necesaria de diluyente de medios y muestras respiratorias (CF/LP/MP) BD ProbeTec ET en

un recipiente limpio. Para calcular la cantidad necesaria, utilizar 0,4 mL por cada muestra y agregar 1 � 2 mLadicionales para facilitar el pipeteado. Para evitar la contaminación del diluyente, no debe verterse denuevo en el frasco la cantidad de diluyente sobrante.

1. Preparar los reactivos QIAGEN (véase �Preparation of Reagents� [Preparación de reactivos] en el manual delmini equipo para ADN de muestras fecales QIAamp).

2. Permitir que las muestras lleguen a temperatura ambiente.3. Etiquetar un tubo de 2 mL con tapa inviolable para cada muestra del análisis.

Los pasos siguientes se deben llevar a cabo en una cabina de seguridad biológica:4. Agitar en vórtex pulsado las muestras durante 5 � 15 s para mezclar bien. 5. Pipetear 350 µL de la muestra en el tubo etiquetado.

NOTA: Las muestras de esputo pueden ser difíciles de pipetear con exactitud. En dicho caso, utilizar las graduacionesdel lado del tubo para facilitar la dispensación del volumen correcto en el tubo. También se puede utilizar un tubocon 350 µL de agua como guía.

6. CAMBIARSE LOS GUANTES después de agregar las muestras.

7. Pipetear 150 µL de tampón ASL QIAGEN en cada tubo de muestras.

8. Pipetear 25 µL de Proteinasa K QIAGEN en cada tubo de muestras.

9. Pipetear 500 µL de tampón de lisis AL QIAGEN en cada tubo de muestras.

10. Tapar cada tubo y agitar en vórtex pulsado durante 5 s. Colocar los tubos en baño María con la tapa atornillada.

Se pueden realizar los siguientes pasos fuera de la cabina de seguridad biológica:11. Incubar los tubos en baño María de 70 °C (± 5 °C) durante 15 min.

12. Después de los 15 min, quitar los tubos del baño María y centrifugar (16.000 x g) durante aproximadamente 5 s.

13. Quitar los tubos de la centrífuga. Abrir cada tubo y agregar 500 µL de etanol al 96 � 100%.

14. Volver a colocar el tapón del tubo y agitar en vórtex pulsado durante 5 s.

15. Centrifugar las muestras (16.000 x g) durante aproximadamente 5 s.

16. Etiquetar una columna de rotación y tubo de recogida QIAGEN para cada muestra.

17. Transferir 700 µL de muestra a la columna de rotación QIAGEN con la etiqueta correspondiente.

18. Centrifugar los tubos (16.000 x g) durante 1 min.

19. Transferir las columnas a nuevos tubos de recogida QIAamp. Desechar los tubos con el filtrado.

20. Transferir con cuidado 700 µL más de la muestra en la columna correspondiente.


22. Transferir las columnas a tubos de recogida QIAamp limpios. Desechar los tubos con el filtrado.

23. Abrir las columnas QIAamp y agregar 500 µL de tampón de lavado AW1 QIAGEN a cada una.


25. Transferir las columnas a nuevos tubos de recogida QIAamp. Desechar los tubos con el filtrado.

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26. Abrir las columnas QIAamp y agregar 500 µL de tampón de lavado AW2 QIAGEN a cada una.


28. Transferir columnas a los tubos de recogida QIAamp etiquetados finales. Desechar los tubos con el filtrado.

NOTA: En este momento se debe etiquetar el tubo de recogida.

NOTA: Tener cuidado para asegurarse de que no quede líquido en el fondo de la columna. La transferencia de restode tampón de lavado en el tubo de recogida puede afectar los resultados.

29. Abrir las columnas y agregar 225 µL de tampón de elución AE QIAGEN a cada una.

30. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min.


32. Desechar las columnas.

33. Etiquetar un tubo de 2 mL roscado para cada muestra.

34. Transferir 400 µL de diluyente de medios y muestras respiratorias (CF/LP/MP) a cada tubo roscado.

NOTA: Llenar un baño María con agua destilada y llevar a punto de ebullición para su uso en el paso 38.

35. Transferir 200 µL de elución al tubo etiquetado correspondiente con 400 µL de diluyente de medios y muestrasrespiratoria (CF/LP/MP).

36. Tapar el tubo y agitar en vórtex pulsado durante 5 s.

37. Preparar los controles. Véase Preparación de controles de las vías respiratorias inferiores (Sección E).38. Transferir las muestras y los controles a una gradilla de baño María.

39. Colocar la gradilla de baño María en el baño María en ebullición durante 5 min.

40. Al final de los 5 min, retirar la gradilla y dejar que los tubos se enfríen a temperatura ambiente durante 15 min.

ADVERTENCIA: Tener cuidado de no quemarse por el agua hirviendo, la gradilla de baño María o las superficies delbaño María que puedan estar calientes.

41. Después de enfriar, centrifugar (16.000 x g) durante aproximadamente 5 s.

NOTA: Después de hervir las muestras:

a. Pueden conservarse a 18 � 30 °C durante un máximo de 6 h y analizarse sin necesidad de volver a hervir.

b. Pueden conservarse durante un máximo de 3 días a 2 � 8 °C. Las muestras deben agitarse en vórtex y volvera hervirse antes del análisis.

c. Pueden conservarse durante un máximo de 14 días a ≤ -20 °C. Las muestras deben descongelarse a temperatura ambiente, agitarse en vórtex y volver a hervirse antes de su análisis.

42. Las muestras están listas para el procedimiento con el análisis de LP BD ProbeTec ET (Sección F).

E. Preparación de controles de las vías respiratorias inferiores:1. Para cada serie (placa) que se vaya a analizar, preparar un tubo de control negativo (CF/LP/MP) y un tubo de

control positivo (CF/LP/MP). Si una placa contiene más de un número de lote de juegos de reactivos, loscontroles deben analizarse con cada lote.

2. Invertir suavemente el tampón AE QIAGEN y el diluyente de medios y muestras respiratorias antes de suutilización.

3. Quitar el tapón del tubo de control negativo (CF/LP/MP).

4. Utilizando una nueva pipeta para cada tubo de control, añadir 200 µL de tampón AE QIAGEN.

5. Utilizando una nueva pipeta para cada tubo de control, añadir 400 µL de diluyente de medios y muestrasrespiratorias.

6. Volver a cerrar con fuerza el tubo.

7. Quitar el tapón del tubo de control negativo (CF/LP/MP).

8. Utilizando una nueva pipeta para cada tubo de control, añadir 200 µL de tampón AE QIAGEN.

9. Utilizando una nueva pipeta para cada tubo de control, añadir 400 µL de diluyente de medios y muestrasrespiratorias.

10. Volver a cerrar con fuerza el tubo.

11. Agitar en vórtex los tubos de control durante 5 s.

12. Los controles están listos para hervir. Véase Procesamiento de muestras de las vías respiratoriasinferiores (Sección D).

F. Procedimiento del análisis de LP BD ProbeTec ET:

NOTA: Antes de realizar el procedimiento de análisis, organizar las muestras y los controles procesados en unagradilla para tubos de muestras de 2 mL, tal como la gradilla de tubos de muestras de 2 mL BD ProbeTec ET,compatible con la pipeta BD ProbeTec ET.

1. Quitar y desechar los tapones de los tubos de muestras y controles enfriados.

2. DEBEN CAMBIARSE LOS GUANTES antes de continuar para evitar la contaminación.

3. Utilizando como referencia el informe de disposición de las placas, preparar la placa de micropocillos de cebado(véase Disposición de las placas en la Sección C).

4. Volver a cerrar herméticamente las bolsas de micropocillos de la siguiente manera.

a. Colocar la bolsa sobre una superficie plana. Mantener plano el extremo abierto con una mano.

b. Al tiempo que se aplica presión, deslizar los dedos por la superficie externa del cierre hermético desde unborde de la bolsa al otro.

c. Comprobar que la bolsa esté cerrada herméticamente.

5. Seleccionar el programa 1 en la pipeta BD ProbeTec ET.6. Recoger las puntas de pipeta. Expandir la pipeta BD ProbeTec ET tirando de la palanca de espaciamiento

totalmente hacia fuera.

NOTA: Es preciso asegurarse de que las puntas estén firmemente fijadas a la pipeta para evitar escapes.

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7. Aspirar 200 µL de la primera columna de muestras.

8. Contraer suavemente la pipeta, tocar con las puntas de pipeta los lados de los pocillos y dispensar 150 µL en lacolumna de micropocillos de cebado correspondiente (1 A � H).

NOTA: No contraer la pipeta sobre las muestras o micropocillos, ya que esto podría causar contaminación. Losmovimientos bruscos pueden causar la formación de gotitas o aerosoles.

9. Desechar las puntas. Presionar el accionador de pipeteado para restablecer la pipeta.

NOTA: Desechar las puntas con cuidado para evitar la formación de gotitas o aerosoles que podrían contaminarla zona de trabajo.

10. Recoger puntas nuevas, expandir la pipeta y aspirar 200 µL de la segunda columna de muestras.

11. Contraer suavemente la pipeta, tocar con las puntas de pipeta los lados de los pocillos y dispensar 150 µL en lacolumna de micropocillos de cebado correspondiente (2A � H).

12. Desechar las puntas.

13. Continuar la transferencia de las muestras restantes para la serie.

14. Cubrir la placa de micropocillos de cebado con la cubierta de cebado y dejar incubar la placa a temperaturaambiente durante al menos 20 min (la incubación puede tener una duración máxima de 6 h). NOTA: Debevolverse a tapar las muestras procesadas con nuevos tapones. DEBEN REEMPLAZARSE LOS GUANTES.

15. Al final de la incubación de cebado, preparar la placa de micropocillos de amplificación. Configurar losmicropocillos de amplificación en una placa tal como se indica en el informe de disposición de las placas (comoen el caso de la placa de cebado). Volver a cerrar herméticamente las bolsas de micropocillos de amplificacióntal como se describe en la paso 4.

16. Retirar la cubierta de la placa de micropocillos de cebado y colocar la placa en la estufa de cebado. ColocarINMEDIATAMENTE la placa de micropocillos de amplificación en la estufa de calentamiento paraprecalentarla.

17. Ajustar el reloj a 10 min. (NOTA: El tiempo es crítico en este paso.)18. Al final del período de incubación de 10 min (+/- 1min), seleccionar el programa 5 en la pipeta.

19. Recoger puntas de pipeta y transferir 100 µL de la columna 1 de la placa de micropocillos de cebado a lacolumna 1 de la placa de micropocillos de amplificación. Dejar que las puntas de pipetas toquen los lados delos pocillos y dispensar el líquido. Tras la dispensación, dejar que la pipeta mezcle automáticamente el líquidoen los pocillos. Elevar con cuidado la pipeta respecto a la placa. Debe evitarse tocar otros pocillos.

20. Desechar las puntas. Recoger puntas nuevas y continuar la transferencia de la mezcla de reacción de losmicropocillos de cebado a los micropocillos de amplificación, columna por columna, utilizando puntas nuevaspara cada columna.

21. Una vez transferida la última columna, quitar la protección de un cierre hermético de amplificación. (Un cierrehermético de amplificación (1/2) cubre hasta 6 columnas. Si la placa tiene más de 6 columnas, DEBE utilizarseun cierre hermético de amplificación de tamaño completo.) Sujetar el cierre hermético por los bordes y aplicarlosobre los micropocillos. Usar las guías de la estufa de calentamiento para facilitar la aplicación del cierrehermético. Presionar hacia abajo sobre el cierre hermético para asegurarse de que todos los micropocillosqueden sellados.

22. En la interfaz del usuario del sistema BD ProbeTec ET, sacar el soporte, abrir la puerta y elevar la cubierta dela placa. Transferir INMEDIATAMENTE (en los 30 s siguientes) la placa de micropocillos de amplificación selladaal instrumento BD ProbeTec ET e iniciar la serie. (Consultar el manual del usuario del sistema BD ProbeTec ETpara obtener instrucciones detalladas.)

23. Después de iniciar la serie, completar la siguiente parte del procedimiento de limpieza:

a. Cerrar herméticamente los micropocillos de cebado con un cierre hermético de amplificación y extraer la placa de la estufa de cebado y calentamiento. ADVERTENCIA: La temperatura es superior a 70 °C. Utilizar el guante termorresistente para extraer la placa.

b. Dejar que la placa se enfríe en el banco de trabajo durante 5 min.c. Extraer de la placa los micropocillos de cebado cerrados herméticamente sujetando por ambos lados del

cierre hermético y extrayendo los pocillos en bloque sin inclinarlos. Colocar los micropocillos en una bolsa de desechos y cerrarla herméticamente.

d. Limpiar la placa metálica:Lavar la placa con la solución de hipoclorito sódico al 1% (v/v) con Alconox.Enjuagar la placa con agua.Envolver la placa en una toalla limpia y dejarla secar completamente antes de volver a utilizarla.

24. Una vez completada la serie, se generará una impresión de los resultados.25. Extraer de la plataforma el soporte de la placa, abrir la puerta y extraer la placa. Cerrar la puerta y volver a

colocar la plataforma de la placa en el interior del instrumento.26. Extraer de la placa los micropocillos de amplificación sellados. PRECAUCION: No extraer el material de

sellado de los micropocillos. Los micropocillos sellados pueden extraerse fácilmente en bloque sujetando elcierre hermético por las partes superior e inferior y extrayéndolos de la placa sin inclinarlos. Colocar losmicropocillos sellados en la bolsa de desechos. Cerrar herméticamente la bolsa.

27. Limpiar la placa metálica:Enjuagar la placa con la solución de hipoclorito sódico al 1% (v/v) con Alconox.Enjuagar la placa con agua.Envolver la placa en una toalla limpia y dejarla secar completamente antes de volver a utilizarla.

28. Después de la última serie del día, realizar los siguientes procedimientos de limpieza: a. Empapar toallas de papel o gasas con la solución de hipoclorito sódico al 1% (v/v) con Alconox y aplicarlas

sobre las encimeras y las superficies externas de la estufa de cebado y calentamiento, la gradilla de tubos demuestras de 2 mL, los baños María, la centrífuga y del instrumento BD ProbeTec ET. Dejar la solución sobre las superficies durante 2 � 3 min. Empapar toallas de papel o gasas con agua y eliminar la solución de limpieza. Cambiar las toallas o gasas a menudo al aplicar la solución de limpieza y al enjuagar con agua. Humedecer toallas de papel o gasas con hipoclorito sódico al 1% (v/v) con Alconox y limpiar el mango de la pipeta (SÓLO EL MANGO). Después de 2 � 3 min, limpiar el mango con toallas de papel o gasas humedecidas con agua.

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b. Sumergir la gradilla de baño María y las placas en hipoclorito sódico al 1% (v/v) con Alconox durante 1 - 2 min.Enjuagar a conciencia con agua y dejar secar al aire.

c. Recargar la pipeta.d. Desechar la bolsa de desechos cerrada herméticamente y la bolsa de peligro biológico conforme a los

procedimientos aprobados para la eliminación de material de desecho contaminado.29. Al menos una vez por semana, realizar los siguientes procedimientos:

a. Desechar el agua de los baños María.b. Limpiar los baños María con la solución de hipoclorito sódico al 1% (v/v) con Alconox. Enjuagar con agua

limpia y secar.c. Llenar con agua destilada.

Control de calidadEl control de calidad debe llevarse a cabo conforme a la normativa local y/o nacional aplicable, a los requisitos delos organismos de acreditación y a los procedimientos estándar de control de calidad del laboratorio. Se recomiendaconsultar las instrucciones de CLSI (antes NCCLS) y normativas de CLIA correspondientes para obtener informaciónacerca de las prácticas adecuadas de control de calidad.Los controles y el diluyente de medios y muestras respiratorias se suministran juntos en el equipo de control ydiluyente de medios y muestras respiratorias (CF/LP/MP). En cada serie de análisis en una placa y para cada nuevonúmero de lote de juego de reactivos debe incluirse un control positivo y un control negativo. Los controles puedencolocarse de forma aleatoria. El control positivo controla un fracaso sustancial del reactivo. El control negativocontrola la contaminación por reactivos y/o la contaminación ambiental. Los controles positivo y negativo deben darun resultado positivo y negativo, respectivamente, en el análisis para que se generen informes de los resultados delas muestras. Si los controles no tienen el rendimiento esperado, la serie de análisis se considera no válida y elinstrumento no generará un informe de los resultados del paciente. Si los controles no dan los resultados previstos,repetir toda la serie de análisis utilizando un juego de controles nuevo, micropocillos nuevos y las muestrasprocesadas. Si queda una cantidad insuficiente de muestra procesada para repetir la prueba, volver a procesar otraalícuota de la muestra principal. Si al repetir los controles no se obtienen los resultados previstos, póngase encontacto con el servicio técnico (véase "Interpretación de los resultados de análisis").El micropocillo de cebado lleva incorporado un control de amplificación interno sec que contiene el ácido nucleicoinvestigado que se amplifica en presencia de la matriz de la muestra. El objetivo de este control de amplificación internoes confirmar la validez de la reacción de amplificación e identificar la posible inhibición en la muestra procesada.

Controles de procesamiento de muestrasLos controles de procesamiento de muestras pueden analizarse conforme a los requisitos de organismos acreditativosadecuados. Un control positivo debe analizar todo el sistema de análisis. Con este propósito, las muestras positivasconocidas pueden servir como controles al ser procesadas y analizadas junto con muestras desconocidas. Las muestrasempleadas como controles de procesamiento deben conservarse, procesarse y analizarse conforme a las instruccionesdel prospecto. Los controles de procesamiento de muestras que simulan el procesamiento de muestras de las víasrespiratorias inferiores también pueden prepararse tal como se describe a continuación:1. Retirar un frasco de L. pneumophila ATCC 33152 (Philadelphia-1) secado por congelación de su almacenamiento

a -20 °C o menos.2. Rehidratar con 1 mL de solución salina al 0,85% (p/v) con 0,2% (p/v) de albúmina bovina (fracción V).3. Diluir la cepa de referencia de L. pneumophila rehidratada a una concentración de 1:100.000 en solución salina

al 0,85% (p/v) con albúmina bovina (fracción V) al 0,2% (p/v).4. Pipetear 350 µL de L. pneumophila diluida en un tubo de tapa inviolable.5. Procesar tal como se describe en Procesamiento de muestras de las vías respiratorias inferiores (Sección D).

Control de la presencia de contaminación por ADNAl menos una vez al mes, debe realizarse el siguiente procedimiento de análisis para controlar la zona de trabajo ylas superficies de los equipos en busca de la presencia de contaminación por ADN. El control ambiental es esencialpara detectar contaminación antes de que se desarrolle un problema. 1. Utilizar una torunda BBL CultureSwab EZ para cada área* que vaya a analizarse.2. Etiquetar un tubo de 2 mL con tapa roscada para cada zona analizada. Pipetear 600 µL de diluyente de medios

y muestras respiratorias en cada tubo y agregar 300 µL de tampón AE QIAGEN o agua destilada de gradomolecular. Agitar en vórtex durante 5 s para mezclar.

3. Impregnar la primera torunda en el diluyente preparado en el paso 2 y pasarla por la primera zona con unmovimiento de barrido amplio.

4. Girar la torunda en el diluyente, exprimiendo contra un lado del tubo. Volver a colocar el tapón del tubo yagitar durante 5 s. Desechar la torunda.

5. Repetir el procedimiento para cada zona a analizar.6. Colocar los tubos en una gradilla de baño María y calentar en agua en ebullición durante 5 min. Retirar la

gradilla del agua en ebullición y dejar enfriar las muestras durante 15 min a temperatura ambiente antes decontinuar.

7. Después de enfriar, centrifugar (16.000 x g) durante aproximadamente 5 s.8. Mientras se calientan los tubos, utilizar toallas limpias empapadas en agua para eliminar los residuos de mezcla

de tampón de las superficies analizadas.9. Una vez que las muestras se hayan enfriado, continuar con el Procedimiento de análisis de LP BD ProbeTec ET

(Sección F).*Las áreas que se recomienda analizar son: superficies de la gradilla de baño María, microcentrífuga, estufa decebado y calentamiento, bandejas de micropocillos negros, mango de la pipeta, teclas táctiles del instrumento,teclado del instrumento, superficies secas de los baños María, superficies de las gradillas de muestras y las mesas detrabajo, incluidas las zonas de procesamiento de las muestras.Si un área da un resultado positivo, limpiarla con una solución recién preparada de hipoclorito sódico al 1% (v/v)con Alconox. Hay que asegurarse de que toda el área esté humedecida con la solución de limpieza y dejar ésta enla superficie durante al menos dos minutos o hasta que se seque. En caso necesario, eliminar el exceso de soluciónde limpieza con una toalla limpia. Limpiar el área con una toalla limpia empapada en agua y dejar que se seque lasuperficie. Volver a analizar el área. Repetir el proceso hasta obtener resultados negativos. Si la contaminación nodesaparece, comunicarse con el Servicio técnico para obtener más información.

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INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

La presencia o ausencia de ADN de L. pneumophila se determina calculando las puntuaciones PAT (Passes AfterThreshold) de la muestra según los valores de umbral predeterminados. La puntuación PAT es una medida utilizadapara valorar la magnitud de la señal generada como resultado de la reacción. Con dicha medida, los números másaltos indican que se ha llegado al umbral en las primeras fases de la amplificación, mientras que los números másbajos significan que se llegó al umbral posteriormente en el proceso de reacción. La magnitud de la puntuación PATno es indicativa de la concentración del ADN de L. pneumophila en la muestra.

Si los controles del análisis no dan los resultados previstos, no deben informarse los resultados del paciente. Véanseen la sección de Control de calidad los valores de control previstos. Los resultados comunicados se determinan de lasiguiente manera:

Muestras de las vías respiratorias inferiores:

a Repetir el análisis de LP BD ProbeTec ET desde el tubo de muestra procesado. Si resta un volumen insuficiente dela muestra procesada, repetir desde la muestra original. Si el resultado del análisis repetido es positivo o negativo,interpretarlo tal como se describe anteriormente. Si los resultados vuelven a ser indeterminados, debe solicitarseuna nueva muestra.

Determinación del umbral de LP y IAC:Los valores de umbral para el ADN deseado de L. pneumophila y de IAC se establecieron inicialmente utilizando losanálisis de datos por medio de curvas características de receptor operador obtenidos de controles positivos ynegativos. Estos valores de umbral se verificaron en estudios clínicos y con muestras retrospectivas de las víasrespiratorias inferiores con resultado positivo y negativo a L. pneumophila. Los valores de umbral luego sevalidaron en estudios clínicos adicionales.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO1. El análisis de LP BD ProbeTec ET es específico exclusivamente para los serogrupos 1 - 14 de L. pneumophila. No

se han analizado otros serogrupos de L. pneumophila. 2. El análisis de LP BD ProbeTec ET no detecta infecciones causadas por otras especies de Legionella. 3. Las características de rendimiento para el análisis de LP BD ProbeTec ET se han establecido sólo con muestras

de esputo. No se ha evaluado el rendimiento con otros tipos de muestras. 4. El análisis de LP BD ProbeTec ET ha sido evaluado solamente con muestras de pacientes de 13 años de edad o más.5. Como en el caso de numerosas pruebas diagnósticas, los resultados del análisis de LP BD ProbeTec ET, deben

interpretarse junto con otros datos analíticos y clínicos de los que disponga el médico.6. Un resultado negativo no excluye la posibilidad de infección, ya que los resultados del análisis pueden verse

afectados por una recogida inadecuada de la muestra, errores técnicos, la mezcla de muestras, tratamientoantibiótico concurrente o la presencia de una cantidad de ADN de L. pneumophila en la muestra inferior a lasensibilidad analítica de la prueba.

7. El análisis de LP BD ProbeTec ET no puede utilizarse para evaluar el éxito o fracaso terapéutico, ya que losácidos nucleicos de L. pneumophila pueden persistir después del tratamiento antimicrobiano.

8. El análisis de LP BD ProbeTec ET no ha sido evaluado por muestras medioambientales (por ej.: agua potable oanálisis de calidad del agua).

9. El rendimiento óptimo de este análisis requiere una recogida y una manipulación apropiadas de las muestras. 10. El uso del análisis LP BD ProbeTec ET está limitado al personal con formación en el procedimiento de análisis

y en el sistema BD ProbeTec ET.

Puntuación PATLP deseado IAC deseado Resultado Interpretación Informe

> 0 > o = 0 Positivo ADN de L. pneumophiladetectado por SDA.

Positivo para los organismospertenecientes a losserogrupos 1 - 14 de L. pneumophila, lo quesugiere infección actual. Serequieren análisis adicionalespara identificar el serogrupo,si es necesario con finesepidemiológicos.

= 0 > 0 Negativo ADN de L. pneumophila nodetectado por SDA.

Negativo presuntivo de losserogrupos 1 � 14 de L. pneumophila en unamuestra de vías respiratoriasinferiores, lo que sugiereausencia de infección actualo reciente. No se debedescartar la infección debidaa Legionella por lassiguientes razones: 1) losserogrupos diferentes de 1 � 14 y otras especies deLegionella pueden causar laenfermedad y, 2) el nivel deADN presente puede serinferior al límite de detecciónde la prueba.

= 0 = 0 Indeterminado Control de amplificacióninhibido. Se requierenpruebas adicionales paralograr la interpretación delresultadoa.

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11. El análisis de LP BD ProbeTec ET proporciona resultados cualitativos. No puede extraerse ninguna correlaciónentre la magnitud de la puntuación PAT y la cantidad de ADN de L. pneumophila presente en una muestra.

RESULTADOS PREVISTOS

A. PrevalenciaLa tasa de positividad observada en el análisis de L. pneumophila variará en función del método de análisisutilizado, la edad del paciente, la presencia de factores de riesgo subyacentes, la ubicación geográfica y, másimportante aún, de la prevalencia local de la enfermedad, incluidas las situaciones de posibles brotes.

B. Distribución de frecuencias de las puntuaciones PATSe recogió un total de 83 muestras retrospectivas de esputo de cuatro centros clínicos de EE.UU., Europa y Canadáy se analizaron con el análisis de LP BD ProbeTec ET. En la Figura 1 se presenta una comparación entre ladistribución de frecuencias de las puntuaciones PAT de LP comparado con el cultivo.

Figura 1: Distribución de frecuencias de puntuación PAT de LP comparado con el cultivo

C. ControlesDurante la evaluación clínica, se observaron fracasos de los controles en el análisis de LP BD ProbeTec ET en unode 46 análisis (es decir, un análisis presentó un error de procedimiento). Las puntuaciones PAT de LP para los 45análisis restantes se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Distribución de la puntuación PAT de LP para controles de medios y muestras respiratorias

CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO

Estudio prospectivoEl análisis de LP BD ProbeTec ET se evaluó prospectivamente en centros clínicos en Estados Unidos y Canadá durantela temporada de infecciones respiratorias de los años 2002 y 2003. Se recogió una muestra de esputo y otra de orinade cada paciente. Las muestras de esputo se analizaron con el análisis de LP BD ProbeTec ET, el cultivo paraLegionella y una prueba de anticuerpos mediante fluorescencia directa (DFA). Las muestras de orina se analizaroncon una prueba disponible comercialmente para la detección de anticuerpos urinarios de L. pneumophila.

Un total de 118 pacientes cumplió los criterios de inclusión en el estudio (es decir, signos radiográficos de neumonía,pacientes de 13 años de edad o más con tratamiento antibiótico durante un máximo de 14 días, tipos de muestrasválidas recogidas, aplicación de métodos de referencia apropiados, etc.). De los 118 pacientes, hubo 114 resultadosválidos con el análisis de LP BD ProbeTec ET. Los resultados de las muestras de esputo se compararon con elresultado del cultivo de dichas muestras para calcular las características de rendimiento.

Se consideró una muestra positiva si el resultado del cultivo fue positivo. Se consideró una muestra negativa si elresultado del cultivo fue negativo. Todos los resultados inicialmente indeterminados se repitieron con la muestraprocesada o con la muestra original (si no se disponía de cantidad suficiente de muestra procesada). En lascaracterísticas de rendimiento no se incluyeron las muestras con resultado indeterminado en el análisis inicial ydespués de repetir el análisis (es decir, en el análisis final). En las características de rendimiento se incluyeron lasmuestras con resultado indeterminado inicial y resultado positivo o negativo final. Las muestras con resultadoindeterminado y cuyo análisis no se pudo repetir debido a volumen insuficiente continuaron con un resultado"inicial indeterminado" y no se incluyeron en las características de rendimiento.

La comparación entre los resultados del cultivo y los del análisis de LP BD ProbeTec ET con muestras de esputo seresumen en la Tabla 2.

Control N Intervalo Percentil 5 Media Mediana Percentil 95

Negativo de LP 45 0 � 0 0 0 0 0

Positivo de LP 45 29,4 � 50,7 40,1 46,7 47,6 49,7

Resultado del cultivo 0 1 � 19 20 � 39 40 � 60 Total

NegativoPositivo

52 0 4 4

2 0 2 19

60

23

Total 54 0 6 23 83

04 42 0 2

19

0

10

20

30

40

50

60

0 1 - 19 20 - 39 40 - 60

Frec

uen

cia

Cultivo –

Cultivo +

(-) (+)

Puntuación PAT de LP

52

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Tabla 2: Comparación entre el cultivo y los resultados del análisis prospectivo de LP BD ProbeTec ETcon muestras de esputo

a De las 114 muestras con resultado negativo en el cultivo, todas dieron un resultado negativo en la prueba deanticuerpos mediante fluorescencia directa (DFA). De los 114 pacientes, 87 también se sometieron a un análisis dedetección de antígenos urinarios, el cual dio un resultado negativo.

b Se repitió el análisis de una muestra que volvió a ser negativa y que se incluyó en el cálculo de la especificidad. Nose dispuso de volumen suficiente para repetir el análisis de una muestra.

c Se repitió el análisis de dos muestras cuyo resultado siguió siendo indeterminado. No se dispuso de volumen suficientepara repetir el análisis de una muestra.

NC = No Corresponde

Estudio retrospectivoEl análisis de LP BD ProbeTec ET también fue evaluado con 83 muestras retrospectivas de esputo obtenidas decentros clínicos de EE.UU., Europa y Canadá. Las muestras retrospectivas se almacenaron congeladas durante unmáximo de seis años, y la mayoría de las muestras (65,1%; 54/83) se almacenó durante menos de dos años.Cada centro registró el resultado del cultivo original para cada muestra retrospectiva. Cada centro analizó lasmuestras de esputo con el análisis de LP BD ProbeTec ET y comparó los resultados con los del cultivo. Se consideróuna muestra positiva si el resultado del cultivo fue positivo. Se consideró una muestra negativa si el resultado delcultivo fue negativo.La comparación entre los resultados del cultivo y los del análisis de LP BD ProbeTec ET con muestras retrospectivasde esputo se resume en la Tabla 3.

Tabla 3: Análisis de LP BD ProbeTec ET

a Ocho muestras dieron un resultado negativo en el cultivo y un resultado positivo en el análisis de LP BD ProbeTec ET.Las 8 muestras dieron un resultado positivo en el análisis de detección de antígenos urinarios. Se realizó un análisis dePCR en 6 de las 8 muestras; las 6 muestras dieron un resultado positivo mediante PCR.

b Dos muestras dieron un resultado positivo en el cultivo y un resultado negativo en el análisis de LP BD ProbeTec ET.Ambas muestras dieron un resultado negativo en el análisis de detección de antígenos urinarios. El análisis de PCRfue realizado en ambas muestras; una de ellas dio un resultado positivo mediante PCR.

c Las 23 muestras con resultado positivo en el cultivo se distribuyeron entre los siguientes serogrupos: serogrupo 1,47,8% (11/23); serogrupo 3, 17,4% (4/23); serogrupo 4, 13,0% (3/23); serogrupo 5, 4,3% (1/23); serogrupo 6, 4,3%(1/23); y 13% (3/23) con información de serogrupo no disponible.

NC = no correspondeNOTA: El método de PCR utilizado para analizar las muestras con resultados discordantes entre el cultivo y el análisisde LP BD ProbeTec ET no está aprobado por la FDA.

Cultivo Cálculos de concordancia porcentual (IC 95%)

Centro Resultado de LP Positivo Negativo Totale Positivo Negativo General

6 Positivo 1 0 1

Negativo 0 0 0

Total 1 0 1 100% (1/1)(2,5% � 100%) NC 100% (1/1)

(2,5% � 100%)

8 Positivo 16 5 21

Negativo 1 24 25

Total 17 29 46 94.1% (16/17)(71,3% � 99,9%)

82.8% (24/29)(64,2% � 94,2%)

87% (40/46)(73,7% � 95,1%)

9 Positivo 1 3 4

Negativo 0 22 22

Total 1 25 26 100% (1/1)(2,5% � 100%)

88% (22/25)(68,8% � 97,5%)

88.5% (23/26)(69,8% � 97,6%)

10 Positivo 3 0 3

Negativo 1 6 7

Total 4 6 10 75% (3/4)(19,4% � 99,4%)

100% (6/6)(54,1% � 100%)

90% (9/10)(55,5% � 99,7%)

General Positivo 21 8a 29

Negativo 2b 52 54

Total 23c 60 83 91.3% (21/23)(72% � 98,9%)

86.7% (52/60)(75,4% � 94,1%)

88% (73/83)(79% � 94,1%)

frente a cultivo

CentroSensibilidad

(IC 95%)Especificidad (IC 95%) Indeterminado

Inicial/Final

1 NC 100% (17/17)(80,5% � 100%) 0/0

2 NC100% (2/2)

(15,8% � 100%)0/0

3 NC 100% (31/31)(88,8% � 100%) 0/0

6 NC 100% (33/33)(89,4% � 100%) 2/0b

7 NC100% (31/31)

(88,8% � 100%)3/2c

General NC 100% (114/114)a

(96,8% � 100%)5/2

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Estudios analíticosEl volumen de reacción de amplificación del análisis LP BD ProbeTec ET es de 100 µL de muestra procesada.

Sensibilidad analíticaLa sensibilidad del análisis LP BD ProbeTec ET en los 14 serogrupos diferentes de L. pneumophila se determinómediante la dilución de suspensiones bacterianas en niveles de 0, 150, 300 y 450 unidades formadoras de colonias(UFC) por reacción. Las muestras se procesaron y analizaron por triplicado. Basándose en un 100% de positividad,la sensibilidad analítica de los serogrupos 2 � 10 y 12 fue de 150 UFC/reacción; no obstante, el límite de detecciónreal fue inferior al nivel más bajo analizado. Basándose en un 100% de positividad, la sensibilidad analítica de losserogrupos 1 y 11 fue de 300 UFC/reacción; la del serogrupo 13 fue de 450 UFC/reacción; y la del serogrupo 14 fuede 700 UFC/reacción.

La sensibilidad del análisis de LP BD ProbeTec ET en presencia de una matriz de muestras de las vías respiratoriasinteriores fue determinada mediante inoculación en esputo del serogrupo 1 de L. pneumophila de referenciainfectado con macrófagos en niveles de 0, 150, 300 y 450 UFC por reacción. Las muestras se procesaron y analizaronpor triplicado. Basándose en un 100% de positividad, la sensibilidad analítica de las muestras inoculadas de las víasrespiratorias inferiores fue de 150 UFC/reacción; no obstante, el límite de detección real fue inferior al nivel másbajo analizado.

Especificidad analíticaSe evaluó un total de 79 microorganismos (69 bacterias, una levadura y nueve virus) utilizando el análisis LPBD ProbeTec ET. Se analizaron aislados bacterianos en concentraciones entre 1 x 106 UFC/mL y 1 x 108 UFC/mL. Seanalizaron virus en una concentración de 1 x 106 partículas virales/mL. Coccidioides immitis fue preparada comosuspensión micelial equivalente a un patrón McFarland Nº 5. Ninguno de estos microorganismos analizadosprodujo resultado positivo ni inhibición a IAC (Tabla 4).

Tabla 4: Análisis LP BD ProbeTec ET, especificidad analítica

SUSTANCIAS INTERFERENTES Se analizaron sustancias potencialmente interferentes que pueden encontrarse en las muestras de las vías respiratoriasinferiores, por medio del análisis LP BD ProbeTec ET en ausencia del microorganismo o en presencia de unaconcentración de 750 UFC/reacción de L. pneumophila. En ausencia del microorganismo, ninguna de las sustanciasanalizadas produjo resultado positivo ni inhibición a IAC en las concentraciones enumeradas en la Tabla 5. En presenciadel microorganismo, todas las muestras analizadas produjeron una señal positiva en presencia de las sustancias en laTabla 5. Con el organismo en presencia de las sustancias indicadas en la Tabla 5 con las concentraciones especificadas,todas las muestras dieron un resultado positivo.



Adenovirus-5







Candida albicans

Chlamydia trachomatis,serotipo L2







Cytomegalovirus

Eikenella corrodens






Escherichia coli




Herpesvirus-1


Virus Influenza A

Virus Influenza B

Kingella kingae

Klebsiella pneumoniaesubsp. ozaenae tipo 4



Legionella anisa


Legionella cherrii


Legionella dumoffii

Legionella erytha


Legionella feeleii

Legionella gormanii


Legionella jordanis







Moraxella osloensis





Neisseria mucosa

Virus Parainfluenza I



Prevotella oralis


Virus RespiratorioSincitial, cepa larga

Rhinovirus

Salmonella choleraesuisserotipo Enteritidis

Salmonella choleraesuisserotipo Typhi

Serratia marcescens

Staphylococcus aureus,productor de proteína A

Staphylococcus aureus,no productor deproteína A



Streptococcus grupo B





Veillonella parvula

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Tabla 5: Análisis de LP BD ProbeTec ET, sustancias analizadas debido a interferencia

ReproducibilidadSe evaluó la reproducibilidad del análisis de LP BD ProbeTec ET en tres laboratorios analizando un panel de 24muestras inoculadas con PBS/BSA. El panel incluyó 12 muestras negativas a L. pneumophila; tres muestras positivasde nivel bajo (300 UFC/reacción) y tres de nivel alto (500 UFC/reacción) de L. pneumophila; y tres muestras positivasde nivel bajo (30 cuerpos elementales (CE)/reacción, 300 UFC/reacción, 900 células/reacción, respectivamente) y tresde nivel alto (50 CE/reacción, 500 UFC/reacción, 1500 células/reacción, respectivamente) con Chlamydophilapneumoniae (CP), L. pneumophila (LP) y Mycoplasma pneumoniae (MP). Un operador por centro analizó los panelesuna vez al día durante tres días. Los resultados se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6: Cálculos de reproducibilidad por nivel de muestra de las vías respiratorias inferiores

a Una muestra excluida del análisis debido a un error de procedimiento.

DISPONIBILIDAD Los siguientes productos BD ProbeTec ET están disponibles:

Nº de cat. Descripción440728 BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay


440457 BD ProbeTec ET Accessories Kit (10 cubiertas de cebado, 16 cierres herméticos de amplificación 1/2 y 8 bolsas de desecho)

440458 BD ProbeTec ET Pipette Tips 6 x 120

440661 BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tubes and Caps, 200 por envase


440477 BD ProbeTec ET Instrument, fuera de EE. UU

440478 BD ProbeTec ET Instrument, EE.UU. y Canadá





REFERENCIAS: Ver �References� en el texto en inglés.

Entre días En elmismo centro Entre centros

Miembro del panel N% de

correcciónPAT media

DE % CV DE % CV


CP/LP/MP-LOW 26a 100,0% 43,0 0,00 0,00 2,59 6,01Negativo 108 100,0% 0,0 � � � �

IAC con muestras negativas a LP 108 100,0% 47,8 0,43 0,91 0,34 0,70

Muestras de las vías respiratorias inferioresSustancias analizadas Concentración

Sangre entera (heparina) 2,65%

Lidocaína 2% 0,21%

Solución inductora del esputo (NaCl al 3%) 0,32%

Azitromicina 0,42 µg/mL

Penicilina G 17 µg/mL

Tetraciclina 2,3 µg/mL

Doxiciclina 26,5 µg/mL

Ciprofloxacina 4,88 µg/mL


Chlamydophila pneumoniae 1,06 x 107 EBs/mL

Mycoplasma pneumoniae y Chlamydophilapneumoniae

1,06 x 107 células/mL y 1,06 x 107 cuerpos elementales(CE)/mL, respectivamente.

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" Becton, Dickinson and Company7 Loveton CircleSparks, Maryland 21152 USA800-638-8663

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ˇ 0 - BD · 2017. 5. 15. · community-acquired pneumonia (CAP) cases that require hospitalization. The case fatality rate for patients with legionellosis is 5 Œ 30%, with elderly