Đề tài Sinh học phân tửĐề tài Sinh học phân tử

Nguyễn Thị Xuân ThảoNguyễn Thị Thúy HằngNguyễn Thị Mỹ ThuậnLê Thị Diệu AnhPhan Hoàng YếnMai Văn ĐiểuTrần Văn ThảoVõ Hiệp

ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNADNA

Định lượng của các axit nucleic là thường được thực hiện để xác định nồng độ trung bình của DNA hoặc RNA có mặt trong hỗn hợp.

Ứng dụng của phương pháp định tính, định lượng DNA được dùng nhiều nhất trong lĩnh vực y học như để chẩn đoán các bệnh học về di truyền

PHƯƠNG PHÁPPHƯƠNG PHÁPĐO QUANG PHỔĐO QUANG PHỔ

Mục đích

Nguyên tắc hoạt động

Các yếu tốảnh hưởng

Mục đíchMục đích

Xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh khiết của phân tử DNA, ARN có trong dung dịch.

Phương pháp đo quang phổ dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của các base Purine và Pyrimidine, độ hấp thụ này tỷ lệ với nồng độ DNA.

Nguyên tắcNguyên tắc

Dựa vào tính chất này mà người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm (OD260nm – Optical Density260nm). 

Một đơn vị OD ở bước sóng 260nm ký hiệu là OD260nm.

OD260nm = 50g/ml cho một dung dịch DNA mạch kép

OD260nm = 40g/ml cho một dung dịch DNA mạch đơn hoặc RNA

Độ hấp thụ ánh sáng của các base

Công thức xác định hàm Công thức xác định hàm lượng DNA trong dung dịchlượng DNA trong dung dịch

DNA mạch đôiHàm lượng ADN (µg/ml)= 50 x OD260nm x n

Trong đó :OD260nm : độ hấp thụ của dung dịch DNA

ở 260 nm50: hệ số chuyển đổi của dung dịch có

nồng độ DNA sợi đôin: hệ số pha loãng

DNA mạch đơn hay ARN

Hàm lượng DNA (µg/ml)= 40 x OD260nm x n

Trong đó :40: hệ số chuyển đổi của dung dịch có

nồng độ DNA sợi đơn.

Các yếu tố ảnh hưởng đến độ Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang phổhấp thụ quang phổ

PH

Nhiệt độ

Nồng độ ion

Tạp chất

protein

Để đánh giá độ tinh sạch của dung dịch DNA, người ta còn đo dung dịch ở bước sóng 280nm là mức hấp thụ cực đại của protein, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các nucleic acid do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleic.

- Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 thì có thể xem dịch chiết DNA là tinh sạch.

- Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm > 2 thì dung dịch chiết RNA là tinh sạch, dung dịch DNA bị biến tính hoặc phân hủy.

- Nếu tỉ lệ OD260nm/OD280nm < 1,8 thì dung dịch DNA,ARN có lẫn tạp chất.

Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, độ chính xác tương đối cao

Nhược điểm: Chỉ kiểm tra được hàm lượng DNA trong mẫu tinh khiết.