PENGARUH PHA DAN SEA PADA INDEKS MITOSIS

SEL LIMFOSIT MACACA FASCICULARIS

Masnelli Lubis, Iwiq Indrawati

Puslitbang KeselamatanRadiasi dan Biomedika Nuklir - BATAN

ABSTRAK

PENOARUH PHA DAN SEA PADA INDEKS MITOSIS SEL LIMFOSIT MACACA

FASCICULARIS. Telah dilakukan pcngamatan pcngaruh PHA (Phytohemagglutinin) dan SEA (StaphylocU\:cal

Enterotoxin A) pacta indeks mitosis sellimfosit Macaca fascicularis. Sebanyak 0,5 ml darab sel limfosit Macaca

fascicularis yang distimulasi dengan PHA atau SEA dibiakkan dalam media 10 ml RPMI + 1,0 ml Fetal Bouvine

Serum (FBS) + 0,1 ml L-glutamin + 0,15 ml PHA atau 0,1 ml SEA (0,5~lg/ml) + 0,1 ml colcbisin pacta subu 37°C

selama 96 jam. Hasil pengamatan menunjukkan babwa frekuensi Indeks mitosis dengan menggunakan PHA lebih

tinggi jika dibandingkan dengan SEA. Frekuensi rata-rata indeks mitosis dengan PHA adalah 18.56 %, sedangkan

dengan SEA adalah 8.3 %.

ABSTRA CT

THE EFFECT OF PHA AND SEA ON MITOTIC INDEX OF LIMPHOCYTE CELL OF

MACACA FASCICULARIS. The observation of int1uences of PHA (phytohemaglutinin) and SEA

(staphilucoccal enterotoxin A) on mitotic index of limphocyte of Macaca Fascicularis had been done.

Half milliliters of limphocyte cells stimulated with PHA or SEA were cultured in 10 ml RPMI + I.t) ml

Fetal Bouvine SentIn ( FBS ) + 0.1 ml L- glutarnin + 0.15 ml PHA or 0.1 ml SEA ( 0,5 ~g/rnl ) + U.I ml

Colchisin on 37°C for 96 horn-soThe result demonstrated that the frequency of mitotic index stimulated

with PHA was higher than that of SEA. The average of mitotic index with PHA was 18.56 %, and withSEA was 8.3 %.

I.PENDAHULUAN

Dalarn mempelajari efek radiasi extema

pacta manusia. tidak dapat.. dilakukan secaralangsung dengan menggunakan manusia sebagai

objek penelitian, tetapi hams melalui simulasi

dengcUl hewcUl percobaan yang sifat fisiologi dan

patologinya harnpir sarna. yaitu Macaca

fasciclila.ds (kera ekor panjeing), akhir-akhir ini

hewan tersebut sering digunakan sebagai heWaIl

penelitiaIl yang paling cocok dalarn penelitian

ilmiah YaIIg ada kaitarmya dengan maIlUsia. (1).

Efek radiasi pengion pacta maIlUsia dapat

dipelajaI'i melalui pengarnataII clan paI'arneter sel

lirnt"osit daI'ah perifer misalnya aIlalisa adanya

perubahan bentuk morfologi khromosom yaituaberasi khromosom dimana kerusakan

khromosom yang spesifik akibat radiasi pengion

dikenal dengan bentuk disentrik, daII beberapa

analisa lainnya. Sellimfosit darah perifer manusia

dapat diperbanyak dalarn biakan sel dengaII

menarnbahkaII mitogen Phytohemagglutinin

(FHA), dimana mitogen ini berfungsi WIttikmemicu sel limfosit melllbelah diri.

Penggunaan PHA dalarn biak:an sel lirnt"ositlllanusia di laboratoriwn Biollledika WIttik

lllendapatkan selllletafase cukup mellluaskaIl.

NarnwI demikiaII dalarn penelitiaII

menggunakaII hew ail kera Macaca Fascicllians,

penggunaan mitogen PHA dalarn biakan sel

limfosit daI'ah kera untuk mendapatkan sel

limfosit YaIlg berrnitosis dalarn jmnlah yang

optimal temyata hasilnya tidak sebaik hasil

biakan sel limfosit manusia. Dalarn publikasi

penelitiarmya, Hill Dkk (1) melaporkan toxin

Staphlylococcal Enterotoxin A (SEA) dalarn

biakaII sel limfosit darah perifer kera rhesus

dewasa yang diiradiasi dengaII konsellu'asi

128Prosiebilg Seminar Teknologi Kese1:lJ1J:1l:JnRadi:lsi d:zn Biomedik:l Nuklir I

0,5J..lg/ml,dimana penggWlaan reagen tersebutmemberikan indeks mitosis rata-rata 0,11metafase/sel.

raJa dasarnya PHA clan SEA mempWlyai

fungsi clan peran yang sarna dalam memicuproses mitosis sel limfosit, namWl demikianseberapa besar pengaruh clan efesiensiperbandingannya belum diketahui. Oleh karenaitu perlu dilakukan penelitian Wltuk mengujikemampuan mitogen PHA dan toxin SEA dalammemicu pembelahan sel limfosit darah keradeng,m menghitWlgfrekuensi Indeks mitosis.

II. TEORl'

Mitogen adalah bahan yang dapat memicu

teljadinya mitosis. Mitogen yang dikenal clan

telall b<myak digmlakan dalam biakan sel

limfosit darah perifer mmmsia adalah

Phytohemagglutinin (PHA) ymlg dibuat dari

extract mucoprotein ymlg berasal dmi kacmlg

merall (Plwseolus vulgaris). PHA dalam biakan

sel limfosit berfungsi sebagai pemicu

trmlsfonnasi sel limfosit menjadi sel limfosit

muda (limfoblast) dml menghasilkml limfosit

kecil (2.3). Menurut Hill, dkk (1) Mitogen PHA

sangal baik bekelja dalam biakml lilllfosit

mmlUsia maupun bewaIl kera (Macaca

Niscicu/;/ljs) dalalll menstilllulasi limfosit T

unluk bcqJloriferasi.

Slaphyloeoecal enterotoxin A (SEA)

adalall toxin ymlg diproduksi oleh bactelium

Stapl1ylococus AIlIl:US (1). SEA smlgat

berpotcnsi dalmn Illenstimulasi linlfosit raJa

IllmlUsia pada konsentrasi fg/llll. Carlsson, Dkk

(1988).

Pcngukurml daya mitosis dari sellimfosit

dapal dikelahlli dcngml mcnghitung jllmlall sel.

y,mg bcnnilosis sccm"a mikroskopik. Bcntuk

Illorfologi dari sel linlfosit dibawah mikroskopadalah sbb :

1. Sel linlfosit biasa (sel linlfosit yang tidak

bertransformasi) adalah sel yang berbentukbulat kecil berwarna gelap, radar, dmllllelllpWlyaidiameter antara 8 - 12 J..l.1ll

2. Sel linlfoblast/blastosit (sel limfosit ymlg

bertransformasi) adalah sel yang berbentukbulat, agak besar, belwama merah kebilll-billlan, clanberdiameter antara 12- 50 J..lm

3. Sel dalam fase mitosis adalah sellimfoblastdalam keadaan berrnitosis clan dibedakan

dalam beberapa fase mitosis.a. Profase ..

Melllpakan fase dimana terliliat illudingsel nukleus sudah mula.i menghilmlg,

clan tampak benang-benang krolllatinradar, bergerombol.

b. Metafase ..

Merupakan fase dimmla terlihatkromosom yang tersebar belllkuran

panjmlg sampai pendek. Dindingnukleus sudah tidak tampak atau hilangsama sekali.

Anafase ..

Merupakan fare dimanakrolllosom yang tersebar

ukman panjang sama pendek, Illaslllg-masing IllelllbelahIllenjadiduCt.Telopase ..Melllpakan fase dimana inti selterlihat clan scl membelah menjadidua sel anak masing - masing

Illempunyai pasangan identik sebagaikrOllloSOIlldiploid. ( 5 )

c.

terliliat

dengan

d

Frek'Uensi Indeks mitosis adalah persentase sel

dalmn keadaml mitosis (4) clan dapat dihitWlg

deng<Ul nunus :

Jumlah sellilllfosit yang berrnitosis ( metafase )lndeks Mitosis = x 100%

Jwnlah selmuh sel hitWlg

III. TATA KEIUA

Bahan-bahan

1. RPMI - 1640mediwn (Sigma)2. Fetal Bovine Serum (FBS)

3. L- glutarnin4. Penicillin Streptomycin (penstrep)5. Phytohemagglutinin (PHA) Gibco6. Staphylococcal enterotoxin A (SEA)7. KCI 0,56 %

8. Lannan Call1oy(Methanol:asarn asetat=3:1)9. Giema 4 %

10. Oil iImnersion11. CoIchisin

Alat- alai

1. Mikroskop2.' Laminarflow

3. Inkubator

4. Gas CO25. Waterbath

6. Sentrifus

7. Tabwlg kultur

8. Siryng 0.1 cc clan 10 cc

9. Gas Karbon dioksida (CO2)

CARA PENELITIAN

a. Ruang Lingkup

Penelitian yang akan dilakukan meliputi :1. Macac;] fascicul:1ds (kera ekor panjang)

diambil darah pelTIer sebanyak :t 5ml,

dibiakkan dalarn media RPMI-I640 denganmenggunakan metoda baku pactaLaboratoriwn Biomedika - P3KRBiN.

2. Hasil pallen darah dibuat preparat clandiwal1lai.

3. Sel limfosit basil mitosis yang berbentukmetafase diarnati dibawah mikroskop.

b. Rencana dan Metoda

1. Pembiakan darah.

Disediakan 2 buah tabung kultur,

masing-masing Wltuk pembiakan darah dengan

menggunakan toxin SEA (Staphylococcal

Enterotoxin A) clan mitogen PHA

(Phytohaemogglutinin). Kedalarn masing-masing

tabWlg l'1l1tur dimasukan 10 ml RPMI 1640Sigma, ditarnbah 1,0 ml Fetal Bouvin Serum(FBS), ditambah 0,1 ml L-Glutamin clan 0,1 mlPenstrep. Kemudian ditarnbah 0,5 ml darah keraclan terakhir ditarnbah 0,15 ml PHA atau 0,1 mlSEA. Biakan diinkubasi didalarn inkubator

dengan dialiri gas CO2 selarna 96 jam, 3 jarnsebelUIlldipanen, kedalarn biakan ditarnbah 0,1ml Colchisin.

2. Pemanenan darah,

Biakan dipindahkan kedalarn tabwlg

sentrifus,. diputar selarna 10 menit dengan

kecepatan 1500 Rpm. Supematan dibuang,

endapan divorteks (disentil-sentil) clan ditarnbah

:t 5 ml KCI 0,56 %, dikocok selarna 10 menit

dengan pipet pasteur, biakan dibiarkan didalarn

penangas air selama 15 menit, kemudian

ditarnbah 8 tetes Camoy, dikocok sebentar, daB

dibiarkan lagi selarna 10 menit, kemudian diputar

kembali selarna 10 menit dengan kecepatan yang

sarna, Supematan dibuang clan endapan ditarnbah

:t 8,0 ml larutan Camoy, lain diputar kembali

dengan kecepatan yang sarna. Proses ter~chlll

diulang-ulang sarnpai endapan sd hersih 0,111

wama larutan sudah belling.

3. Pembualan preparat

Endapan sel diteteskan diatas ohjek gela~

sebanyak 4 tetes (objek gelas dalalll keaoa<UI

dingin), dilewatkan diatas bunsen clan dibiarkan

kering pacta suhu mangan Preparat diwamai

dengan Giemsa 5 % selarna 10 menit, kemudian

dibilas dengan aquadest clan dibiarkan kering

pacta swm mangan. Preparat yang lelall keling

ditutup dengan Cover glass memakai perekal

Entellan daB dibiarkan kcring. sc);Uljlllny;\

dilakukan pengarnatan,

4. Pengamatan Preparat

Preparat diarnati dengan menggunakanmikroskop pacta pembesaran 40 x 100. Setiappandangan dihitung sel metafase clansel blastosit,sel yang mengalami mitosis dapat diamati denganadanya sekwnpulan sel yang telah mengalami

metafase, dimana kromosom terlihat jelas

Pr£l,<:idina ,<>".,;~,,- 'T'~I-- - L -' u

.

terbentuk panjang daD pendek, sedangkan selblastosit dapat dibedakall dengan melihatbentukllya yang lebih besar clan warnanya yang

lebih terang (merah kebil11-biruan ), Indeksmitosis dihitUllgdengan cm"amembagi jumlah selmetafase per jwnlah sel blastosit yang diamatisebanyak 1000 sel. Pengamatau dilalllkandengall 5x ulangan.

IV. RASIL DAN PEMBAHASAN

Bentuk morfologi dari basil biakan sellimfosit Macaca Fascicularis denganmenggUllakanPHA dan SEA, yang dilakukan di

Lab. Biomedika - P3KRBiN ditampilkan pactagambar.

Gambm' l. Bentuk morfologi daIi basil biakml sellimfosil dellgan llIt:llggunak,Ul I'HA

GaIllbm" 2. Bentuk morfologi daIi basil biakan sellimfosit dengan menggwlakan SEA

Prosidini? Semin:lr Teknn/,',ui Kp~<::pl'~rn'~{<Jn1).~rI;..<,;rln~ D:~_,,-I:I.- ,,'--'_1-- ,

Tabel I. Pengamatan frelcuensi Indeks mitosis dengan menggunakan mitogen PHA.

Tabel 2. Pengamatan frekuensi Indeks mitosis dengan menggunakan toxin SEA.

Unluk melakukall evaluasi pengaruh PHA

daB SEA dal;un menghasilkall Indeks mitosis

dilakukall Ik'lh;lIlllin~an frekuensi Indeks mitosis

yall;.!dil);l~ilk:Ulkultur sd pengaruh PHA ataupunst-,.".

Tahel I d;m Tabd 2 menampakkan basil

r..:kll':lI~i Ind.:ks mitosis pada toxin SEA maupull

pad" mit()~.:n I'HA. Dengan menggunakan PHAti'ekuensi lndeks mitosis teramati mulai dari

prepantl peJ1ama adalah 18.5%, preparat ke dua

IX,()',;' pr.:p:mtt ke tiga 17.8%, preparat ke empat

19.6~r(. iliUl preparat ke lima 18.9%, rata-rata

adalah Ix.56'k ([abet I). Sedangkan dengan

menggunakan SEA frekuensi Indeks mitosis

tcralllali mulai d;lIi prepal'at pertama adalah 8.0%,

!Hl'P.II.11I.l' .111.1X,h'}. prepal'at ke tiga 9.0%.

pl.:pal;1I k.: ':11111;1t 7,6% dall prepal'at ke lima

X.3'fr, rata-ratanya adalah 8.3% ( Tabel 2). raJa

peng;unatall ini terlihat bahwa biakan set yang

menggunakall PHA lebih mampu memicu

pembetahall set dibandingkan dengan

menggwlakan SEA. Terdapat perbedafUl yang

signifikall raJa Indeks mitosis PHA dan SEA,

dengall penggwlaaJl mitogen PHA frek.'Uensi

Indeks mitosis lebih tillggi jika dibandingkan

SEA, hill ini mungkin disebabkan karena salah

satu sifat SEA yang toxin, dimana SEA lebih

efektif terhadap sellimfosit Yallg terkella paparall

radiasi dari pada sellimfosit yang tidak telpapari.

Nilai ini lebih rendah hila dibandillgkan dengan

hasil penelitian Hill Dkk (1) yang menggunakan

kera rhesus raJa konsentrasi SEA 0,5 Ilg/ml.

menghasilkan Indeks mitosis 0, II metafase/sel.Diketahui babwa frek.'Uensi Indeks mitosis

dalam suatu k.'U!tmset limfosit pada darah tanpa

perlakuan inadiasi (0 gy) dapat digunakan Wltuk

menguji kemampuan mitogen dalam memicu

pembelahan sel, semakin tinggi Indeks mitosis

dalam preparat berarti proses pembelahan set

berhasil dengan baik. Semakin banyak sel yang

mellgal:ulIi metafase akall scmakin mudah

pengamatall preparat dalam mendapatkan jwnlall

kromosom sebanyak 46.

Toxin SEA sebagai stimulan raJa

pembelahan set limfosit daIam biakan set

diharapkan dapat menghasilkan dengan jW'l1lah

set metafase yang lebih banyak, tetapi ternyata

mitogen PHA memperlihatkan Indeks mitosis

yang lebih tinggi dibadingkan SEA, juga PHA

mudah didapat dari pada SEA.

n_- -'."-

No. Preparat Jumlah Jumlah Frekuensisel Blastosit Set metafase Indek Mitosis

l. 1000 185 set 18.5%

2. 1000 180 set 18.0%3, 1000 178 set 17.8%

4. 1000 196 set 19.6%

5. 1000 189 set 18.9%

Rata - rata 1000 185.6set 18,56%

No. Preparat Jumlah Jumlah Frekuensi

set Blastosit set metafase lndek Mitosis

1. 1000 80 set 8.0%

2. 1000 86 set 8.6%

3. 1000 90 set 9.0%

4. 1000 76 set 7.6%

5. 1000 83 set 8.3%

Rata -rata 1000 83 set 8,3%

KESIMPULAN

Dari basil pengamatan yang dilal'UkaIlsepe11i diatas, tel1lyata mitogen PHAmellstimulasi pe11wnbuhan sel limfosit MacacaFasciculads lebih baik jika dibandingkan dellgantoxin SEA, hal tersebut dapat dilihat dari

baIlyakllya sel metafase yang teraIuati pactaprepaI.al.

UCAPAN TERIMA KASm

Penulis mengucapkaIl terima kasih alasbaIltUaIl rekaIl-rekan pacta BidaIlg Biomedika

untuk menyelesaikan makalah ill.

DAFTAR PUST AKA

1. SOESANTO MANGKOEWIDJAJA, Peme-

Jjhw"<7aIJ,pembiakan da.n pellggunaWJ hewa.u

percobaab di daerah tlVpis. Penerbit UI (UI-

PRESS), 1988.

HILL. F.S., Dkk, (1994), Metaphase yields

li( J/11 sti/pphylococcaJ ellteroto:dn A

sfilllllli/fed peniJheml blood ~vJ11pl/()(:vtesol

IIIlIImdii/ted iwd iJwdiated i/gcd rhesus

/11l1nkey_\:Inl. J. Radial. BioI., Vol. 66, No.4.3X1-384.

UNITED NATIONS (1969), RCp0l1 ol the

Unifed Ilatiolls ..,'cielltJiic Collmllttee Oil The

Eikcts oj" Atomic Radiation, General

Assembly: Twenty-fourth session, supple-

ment No. 13(A/7613), p. 109.

ISKANDAR, OENTOENG, (1981), The

MiCIOIJlIcleus test, Disertasi, Hal. 7.

FRESHNEY IAN, R (1991), CULTURE.OF

ANIMAL CFLLS "A J11wJllill11th/sic

feclwi(jlle"sel:-und edition, Wilky-Liss, New

Yark, p.244.

PRASAD, KEDAR N. (1995), HaIJdbook ol

RADIOBIOLOGY, second Edition,

chapter 2: Basic cell biology, halo 12.

2.

3.

4.

5.

6.

DISKUSI

Lydia A. - P3TIR

1. Apa rujUaIlmengetahui pengaI11hPHA daIlSEA pactaIndeks Mitosis sellimfosit Macacafascicularis?

2. Apa fungsi sel limfosit iru selldiri di dalaIlltubuh M lasciculads?

Masnelli Lubis

1. Tujuannya : Wltuk menguji kemampUaIl

mitogen PHA daD toxin SEA dalaIll

menstimulasi pembelahan sellirnfosit Macaca

fascicularis dengan menghitwIg frekLlensiindeks mitosis.

2. Fungsi sel limfosit pacta Macaca fascicularis

adalah sebagai wnum (untuk menjaga

kekebalan tubuh).

M. Lina - P3TIR

1. Apa dasaIllya Saudara memilih PHA, SEA

Wltuk stimulasi mitosis sel lirnfosit. Mengapatidak dicoba enterotoxin dari bakteri lain

seperti E. Coli, (enterotoxin E. Coli) ?

2. Apa sebabnya PHA lebih besar menstimulasi

sellimfosit daIipada SEA?

3. Hasil pcnelitian saudara frekuensi indeks

mitosis PHA lebih besar dari SEA. Apa

konsenu.asi YaIlg digwlakan Selma ? Dalam

abstrak PHA kasut 0,4 rnl " SEA 0,1 ml.

DengaIl konsentrasi yang berbeda, apa

basil penelitian dapat dibandingkan ?

Masnelli Lubis

1. PHA adalah StimUlaIl yang cocok untuk sel

limfosit manusia daIl telall laIlla digwlakan

dalaIll penelitiaIl abrasi kroniosom baik untuk

kclainall akibat penyakit alan kelaUlaIl baWaaIl

kromosom akibat radiasi SEA telah digunakan

oleh Hill dkk. (1994) dalaIll penelitiannya

menggunakan kera khusus daD hasilnya SEA

sangat efektif untuk sel limfosit yang

diradiasi. SEA yang digIDlakaIl basil produksi

pabrik tidak dibuat sendiri.

2. Mungkill karella PHA lebih efektif terhadap

sel limfosit yang tidak terpaparin radiasi

pengion, demikian sebaliknya, naIllun

0

jawaban yang pasti belum ditemukan dariliterature.

3. Konsentrasi indeks mitosis PHA lebih tinggi

da.ri SEA. Konsentrasi yang digUllak3.11sarna

yaitu 0, I ml PHA alan 0, I rnl SEA uutuk

setiap biak3.11limfosit darah peltier.

Nillo Herlillo - P3KRBiN

I. Apa Y3.1lgdimaksud deng3.11mitosis '?2. Apa efek radiasi pengion radiI sel

d3.1"ahperifer '?

3. Apa yang dimaksud deng3.11interfase ?

limfosit

Mosllelli Lubis

I. Mitosis adalah suatu proses pembelah3.11

sebuah gel menjadi dua gel 3.llak Y3.1lgtidak

diseltai deng3.11pembagi3.11jumlah kromosom

gel. Mitosis ini teljadi hanya radiI gel somatik.

2. Efek radiasi pellgion pada sel limfosit darah

perifer menyebabkan adanya perubahan

jumlah dan bentuk morfologi radiI kromosom,

yaitu aberasi kromosom dimana bentuk

spesitik da.ri aberasi kromosom ini adalah

disentrik, ring d3.1l111ikrolluklei.

3. Illterfase adalah tahapan (periode) pada

pembelah3.11 gel yang dimulai dari profase,llletafase d3.11telofase.