Universidade de São Paulo

Instituto de Química de São Carlos

Otimização de método “QuEChERS” para determinação de

sulfonamidas presentes em lodo floculado com posterior análise

em LC-ESI-TOF.

Edvaldo Vasconcelos Soares Maciel

Orientador: Professor Doutor Álvaro José dos Santos Neto

São Carlos, dezembro de 2014.

AUTORIZO A DIVULGAÇÃO E REPRODUÇÃO DE TODO O CONTEÚDO

CONTIDO NESTE TRABALHO PARA FINS DIDÁTICOS OU DE PESQUISA, COM

A DEVIDA CITAÇÃO SOBRE A FONTE DO MESMO.

“Todo homem tem o direito de decidir sobre o seu próprio destino”

Robert Nesta Marley

Dedicatória

Ao senhor Maciel e a dona Cida pelo amor e por acreditarem em mim durante todo

este tempo, sem vocês eu jamais chegaria até aqui.

Agradecimentos

Agradeço ao Professor Doutor Álvaro José dos Santos Neto, pelo apoio,

paciência, pelos conselhos, e por ter me dado a oportunidade de desenvolver

este trabalho.

Ao grupo de cromatografia do IQSC, principalmente a Maraíssa pela ajuda,

paciência e a amizade.

A Professora Doutora Eny Maria Vieira e ao Professor Doutor Igor Renato

Bertoni Olivares, por serem profissionais que eu me espelho e admiro, e por

terem aceitado fazer parte da minha banca.

A minha namorada Thaís, pela paciência, carinho e acima de tudo por estar

ao meu lado nas horas mais difíceis.

A toda a República Irmãos Metralha pelos ensinamentos, pelo abrigo e por ter

feito de mim um homem com seus alicerces fincados na amizade e no amor

pelas pessoas e pela família.

Aos meus avós de consideração José Alceu e Dona Jandira, pelo amor e

carinho por alguém que nunca fez parte da família.

A minha turma, principalmente ao Rodrigo, Leonardo, Douglas, Augusto,

Fernando pelos dias de estudo, ou pelas práticas de laboratório sempre feitas

com esforço e alegria.

E por último a Deus, pela energia e pela fé que sempre foi o meu jogo de

cintura para as horas difíceis.

Resumo

Este presente trabalho tem como enfoque a otimização de um método baseado em “QuEChERS” para preparo de amostra proveniente de lodo de esgoto, com posterior identificação de compostos denominados sulfonamidas utilizados na formulação de antibióticos de uso veterinário e humano. O método denominado “QuEChERS” surgiu da necessidade de se criar um procedimento de preparo amostral melhorado considerando a necessidade de realizar diversas análises de rotina em laboratórios. Sendo assim, podemos dizer que o mesmo apresenta certa simplicidade, resumida em poucas etapas onde rapidamente pode-se obter um “clean-up” da amostra com a utilização de poucos recursos como: volume de solvente, e pessoal treinado. Para o tratamento da amostra em questão, foi então empregado o método com algumas modificações, que foram avaliadas através de planejamento experimental obtido pelo software “STATISTICA”. O desenvolvimento do projeto foi então efetuado com a realização de testes considerando variáveis como: fase orgânica utilizada na extração, proporção e volume de fase aquosa/orgânica, quantidade de sal complexante (NaCL e MgSO4) e utilização de adsorvente como PSA, C18 e grafite, permitindo assim que o procedimento fosse otimizado visando a melhor condição de utilização do método “QuEChERS” considerando a matriz lodo e a classe de analitos das sulfonamidas. As variáveis independentes (proporção de ACN e H2O como solvente de extração, volume de solvente, proporção de NaCl e quantidade de MgSO4) da etapa de extração foram então avaliadas de acordo com planejamento experimenta e mostraram-se significativas para o aumento da eficiência de extração a proporção de água e acetonitrila utilizadas como solventes de extração e quantidade de MgSO4. A partir dos resultados obtidos pelo planejamento a melhor condição de extração foi obtida com 4,0 g de amostra, 8,0 mL de solvente na proporção 80% ANC (0,1% ácido fórmico) e 20% H2O, 30% de NaCl (m/v) e 40 mg de MgSO4.

ABSTRACT

The aim of this work is to approach the optimization of a method based on "QuEChERS" for sample preparation from sewage sludge, with subsequent identification of compounds called sulfonamides used in the formulation of veterinary and human drugs. The method known as "QuEChERS" arose from the need to creating sample preparation methods, considering to realize various routine analysis in laboratories.Thus, we can say that it presents certain simplicity, summarized in a few steps where you can quickly get a "clean-up" of the sample with the use of limited resources such as volume of solvent, and trained personnel. For the treatment of the sample in question, the method was used with some modifications, which were evaluated using the obtained experimental design software "Statistica". The development project was made with procediments considering variables, such as: organic phase used in the extraction, proportion and volume of water / organic phase, amount of complexing salt (NaCl and MgSO4) and use of adsorbent as PSA, C18 and graphite , thus enabling the procedure to be optimized aiming better utilization condition of the method "QuEChERS" considering the sludge matrix and analyte class of sulfonamides. The independent variables (ratio of ACN and H2O as solvent extraction, solvent volume ratio of amount of NaCl and MgSO 4) the extraction step were evaluated according to design experiment and were significant for increasing the extraction efficiency, the proportion of water and acetonitrile used as solvent extraction and the amount of MgSO4. By the results obtained from the planning experimental, the best extraction condition was 4.0 g of sample, 8.0 mL of solvent in the proportion 80% ACN (0.1% formic acid) and 20% H2O, 30% NaCl (w / v) and 40 mg of MgSO4.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................1

2 OBJETIVOS..........................................................................14

3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS................................15

3.1 MATERIAIS...............................................................15

3.2 MÉTODOS.................................................................17

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES..........................................20

5 CONCLUSÃO........................................................................31

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................33

1

1 INTRODUÇÃO

Com o mundo atual globalizado e a tecnologia se desenvolvendo na direção

da inclusão e de estar ao alcance de todas as pessoas, os mais variados setores

industriais vem crescendo e tomando proporções antes não imagináveis desde a

sua escala de produção até a demanda por matéria prima.

No âmbito das indústrias químicas não tem sido diferente, já que na situação

atual inúmeros produtos utilizados pelos seres humanos têm sua origem ligada a

processos químicos, o que causa um alerta nas autoridades governamentais ligadas

a preservação ambiental, pois com a crescente demanda na fabricação de novos

produtos oriundos de atividades laboratoriais surge também uma crescente geração

de resíduos que pode vir a contaminar bens naturais como a água e o solo, assim

como os animais e a própria humanidade.

Levando em conta este cenário descrito acima, é plausível que também haja

um maior incentivo das autoridades e esforço da comunidade cientifica no

desenvolver de novas técnicas aplicadas aos processos realizados que visem uma

redução dos impactos ambientais gerados pelas atividades industriais considerando

toda a sua linha de produção até o uso do produto final.

Neste trabalho o enfoque foi nas indústrias farmacêuticas onde os remédios

criados são constituídos de substâncias ativas que atualmente estão sendo

classificadas como uma classe emergente de contaminantes afetando organismos

terrestres e principalmente aquáticos1,2.

Pesquisas recentes documentam a ocorrência destes compostos

farmacêuticos em águas naturais e em efluentes de tratamento de esgoto urbano,

em níveis de concentração na escala de μg/L e ng/L.3,4,5,6

Abaixo temos um esquema representativo das diversas formas de entradas

das sulfonamidas no meio ambiente.

2

Figura 1 – Esquema representativo das diversas formas de contaminação das sulfonamidas

ao meio ambiente.

Fonte:.BARAN, W., 2011, p 2.

Dentro da ampla classe de compostos farmacêuticos, podemos citar os

antibióticos como sendo aqueles de maior periculosidade quando encontrados no

meio ambiente, visto que em contato com organismos vivos podem acabar gerando

resistência ao uso desses medicamentos, diminuindo assim a efetividade no

combate a diversos tipos de doenças.

Isso é resultado do aumento no uso dessas drogas por atividades ligadas a

criação de rebanhos, aves e peixes assim como fruto do hábito das pessoas de se

automedicarem fazendo uso sem orientação de tais substâncias que podem resistir

as reações das vias metabólicas sendo excretadas com até 90% da quantidade

inicialmente ingerida, acarretando em uma seleção de caráter genético onde apenas

as bactérias mais perigosas se reproduzem, causando preocupação e necessidade

de que se tenha legislações e procedimentos para monitorar, medir e controlar este

tipo de resíduo gerado7,8.

Inclusa nessa gama de agentes antibacterianos, está a classe das

sulfonamidas, que são utilizadas desde a década de 1930 para tratamento de

3

doenças em seres humanos devido ao seu grande espectro de ação que se mostra

eficaz contra bactérias gram positivas e gram negativas, além de ser considerado

um remédio de baixo custo para a linha de produção e comercialização, fato que

também faz com que essa classe de fármacos seja utilizada no uso veterinário9,10.

Esta classe de antibióticos sintéticos deriva-se da substância conhecida como

sulfonilamida e existem diversos compostos antimicrobianos que contém o grupo

sulfonamida como uma espécie de radical similar formando então um conjunto de

cerca de 150 SNs diferentes11.

A estrutura molecular com propriedades bacteriostáticas a que nos referimos

esta representada na figura 2, sendo composta por um radical (-N4H2) em uma das

extremidades, seguido de um anel benzênico unido a um grupo sulfonil ligado a

outro grupo amida que serve como sítio para ligação de outros radicais, gerando

então as diversas sulfonamidas que tem sido reportada ao longo da história12.

Figura 2 – Estrutura geral das sulfonamidas.

Olhando para a parte farmacológica, observa-se que as sulfonamidas tem

estrutura semelhante a do p-aminobenzóico também conhecido como PABA,

composto importante para reações de síntese de ácido fólico por parte das

bactérias. Sendo assim, as sulfonamidas agem como agentes competidores pelos

sítios ativos de uma enzima denominada dipropteroato sintetase, o que impede a

síntese de ácido fólico por parte das bactérias impedindo assim a sua

proliferação13,14.

Devido a diversidade de sulfonamidas existentes e seus diferentes modos de

ação, elas são largamente utilizadas nos dias atuais tanto para uso humano quanto

veterinário e como não há tratamento espécifico para tais resíduos que são deixados

no meio ambiente, a contaminação é inevitável, causando resistência por parte das

4

bactérias e mutações da enzima dipropteroato sintetase, o que dificulta a ação das

sulfonamidas no mecanismo de inibição da síntese do ácido fólico diminuindo sua

eficácia no combate as enfermidades13,15,16,17.

Sendo assim é preciso estudo para a criação de novos métodos que

identifiquem e quantifiquem esses antibióticos em nosso ambiente. O problema é

que tais agentes bacterostáticos se encontram em quantidades minímas em

matrizes complexas com diversos tipos de interferentes que podem prejudicar uma

determinação final de sua concentração, logo se faz necessário o uso de métodos

que limpem e preparem tais amostras para posterior uso de técnicas de separação e

quantificação desses contaminantes.

Quando se trata de amostras de origem ambiental é de extrema importância

que os processos de preparo de amostras sejam efetivos e eliminem quaisquer

impurezas presentes, além de permitir a concentração dos analitos de interesse para

uma melhor identificação final.

Atualmente com políticas de preservação do meio ambiente, do contexto da

química verde e dos interesses financeiros dos setores industriais, são exigidos cada

vez mais métodos que executem o processo de “clean-up” amostral de maneira

rápida, usando o mínimo de reagentes e gerando pouco resíduo. Técnicas como a

SPE (Solid Phase Extractation), MEPS (Micro-Extractation by Packed Sorbent),

SPME (Solid Phase Micro-Extractation) e “QuEChERS” (“quick”, “easy”, “cheap”,

“effective”, “rugged” and “safe”) tem sido usadas, revelando níveis satisfatórios de

desempenho no processo de preparo da amostra, além de proporcionar taxas de

recuperação dos analitos e de redução de efeitos de matriz cada vez melhores

frente a métodos anteriormente utilizados. Vale ressaltar que cada uma dessas

técnicas tem suas particularidades porém no geral elas se assemelham por serem

processos limpos, econômicos e simples de serem executados, fatos que as tornam

mais viáveis do ponto de vista industrial e ambiental18,19,20,21.

Dentre os locais onde se tem encontrado a maior parte dos contaminantes de

origem farmacêutica destaca-se o solo, que possuí características porozas

contendo matéria inorgânica e orgânica favorecendo assim interações adsortivas

dessa matriz com os mais diversos tipos de compostos incluindo os fármacos22.

5

Outra importante matriz atingida por este tipo de contaminação são as águas

subterrâneas e de rios, levando em conta que o solo desencadeia papel fundamental

na preservação de ecossistemas adjacentes por realizar a filtragem de certas

substâncias23. O lodo de esgoto, também conhecido como biosólido, proveniente de

estações de tratamento está incluso tanto no solo onde é usado como adubo

orgânico quanto nos efluentes de águas residurárias onde é gerado.

Considerando então a força das interações de adsorção entre o lodo e os

resíduos de interesse, o processo de identificação e quantificação de tais analitos

tem certo grau elevado de difilcudade, pois para extraí-los de uma matriz complexa

como essa é necessário um método efetivo que garanta confiabilidade na limpeza

da amostra24,25,26.

Levando em conta esses fatores, o método QuEChERS surge como uma

alternativa aos métodos anteriormente utilizado, desenvolvido no ano de 2003 que

até os dias atuais vem sendo utilizado e aprimorado revelando altos níveis de

recuperação, baixo consumo de reagentes e gerações de resíduos, mostrando-se

adequado para o estudo proposto27.

Inicialmente a metodologia “QuEChERS” foi desenvolvida com o objetivo de

ser aplicada em amostras de origem alimentar com a finalidade de extrair e isolar

algumas classes de pesticidas e inseticidas como: os organoclorados,

organofosforados e os organonitrogenados. Portanto o método deveria ter uma

ampla faixa de atuação sendo classificado como um método “MRMs” (Multiclass and

Multiresidue Methods). A necessidade de se desenvolver uma nova metodologia de

sucesso na identificação dessas classes de contaminantes provém da consciência

ambiental que vinha se criando durante a década de 90, já que os pesticidas são

uma classe de resíduos com mais de 50 anos de estudos e desenvolvimentos de

diversas metodologias, porém nenhuma capaz de cobrir toda a faixa de

contaminantes polares e apolares nos reportando uma faixa de recuperação e

repetibilidade aceitável27,28. A flexibilidade é uma das principais vantagens do

método escolhido para esse estudo, pois desde a sua criação em 2003, inúmeras

pesquisas reportam adaptações do processo de extração “QuEChERS” para torná-lo

mais adequado e reprodutivo para determinado tipo de matriz29,30.

6

Fluxograma 1 - Procedimento original criado por (Anastassiades et al, 2003);

Como era de se esperar a metodologia “QuEChERS” inicial contempla poucos

passos de extração, sendo considerada simples e de fácil execução podendo ser

conduzida por pessoas com um treinamento mínimo aceitável no manuseio

laboratorial.

Porém para este presente trabalho onde procura-se otimizar tal procedimento,

faz-se necessário entender cada um dos passos, as interações e efeitos gerados

pelos reagentes usados, sendo assim uma explicação mais teórica da metodologia

em geral deve ser feita.

O método original de preparo de amostra “QuEChERS” pode ser dividido em

algumas etapas como:

7

i) Fragmentação e homogenização: Como a massa da matriz utilizada no

método é menor em relação a outras técnicas tradicionais de extração,

existe a necessidade de se fragmentar a amostra inicial (geralmente na

ordem de quilogramas) e homogenizar a mesma para se obter uma

maior superfície de contato na hora de extrair os componentes.

ii) Extração e partição: Devido à natureza das matrizes utilizadas nesse

método serem alimentares ou ambientais, sempre há uma grande

porcentagem de água nas mesmas, por isso é necessário a adição de

um solvente orgânico como etapa de extração, para que haja a

separação entre a fase aquosa e a orgânica com posterior migração

dos analitos de interesse para a fase orgânica. Logo este é o papel

exercido pelo solvente utilizado no método, geralmente acetonitrila,

podendo ser também acetona ou acetato de etila.

iii) Adição do sal: nesta etapa da extração são feitas as adições de NaCl e

MgSO4 a fim de induzir a separação das fases aquosa/orgânica e o

ajuste da polaridade através do efeito denominado “salting-out”, o qual

auxilia promovendo a secagem da fase aquosa aumentando o

coeficiente de distribuição de determinado analito na fase orgânica

diminuindo a presença do mesmo na água, aumentado assim a

eficiência do método de extração.

iv) Adição de padrão interno: adiciona-se uma solução de padrão interno

visando minimizar possíveis erros provenientes das etapas de extração

do método, esta solução pode ser usada em uma etapa inicial do

procedimento, porém se a matriz apresenta uma concentração

significativa de gordura (0,3 g/10,0 mL de acetonitrila) que pode criar

uma camada adicional para onde partes dos analitos podem migrar, é

recomendável a adição deste padrão somente no final do procedimento

analítico de extração.

v) Utilização de composto adsorvente: etapa em que uma alíquota da

amostra é movida para um tubo extrator vazio onde uma pequena

quantidade de composto adsorvente, geralmente PSA (“primary

secondary amine), C18 ou grafite é adicionada e homogeneizada com

a solução para que o material absortivo se distribua por toda a alíquota

8

retendo compostos interferentes provenientes da matriz, realizando

assim um “clean up” adicional do extrato a ser analisado.

vi) Análise da amostra: dependendo da origem do extrato, após a

execução do quinto passo a amostra já pode ser inserida em um GC

ou HPLC para separação e posterior quantificação dos analitos,

geralmente por espectrometria de massas.

Após a escolha da metodologia baseada em “QuEChERS” como o método de

extração, uma otimização para adequar as etapas de processamento e as

quantidades de reagentes utilizados é necessária, já que a matriz de análise é

distinta daquelas empregadas inicialmente pelos criadores do método28.

Sendo assim, o uso de ferramentas quimiométricas para se realizar um

planejamento experimental é indicado, esses estudos podem ser feitos tanto pelo

software “Statistica” quanto por linguagem de progamação usando progamas com o

matlab. O operador pode realizar ensaios em diferentes níveis, variando quantidades

de reagentes e composições, para que através de manipulações estatísticas se

obtenha a melhor condição de resposta do método.

Quando há necessidade de otimização ou validação de um método analítico,

um número elevado de análises se faz necessário, porém é díficil a disponibilidade

de pessoas suficientes para a realização de tal tarefa em tempo hábil. Por isso o uso

dos recusos estatísticos para um planejamento de experimentos retorna dados

confiáveis em um tempo aceitável, garantindo que os recursos investidos em

determinado estudo tragam resultados satisfatórios, beneficiando assim

pesquisadores e empresas que necessitam realizar diversas análises em um curto

espaço de tempo31,32.

Neste presente trabalho, fez-se uso de alguns tipos de planejamentos

experimentais para se estudar e avaliar condições de aplicabilidade do método

“QuEChERS” em amostras de lodo, portanto uma explicação um pouco mais

detalhada das características destes tipos de planejamentos se faz necessária33,34.

i) Planejamento experimental fatorial completo: este tipo de planejamento

é representado por n k, onde o número de níveis é representado por

“n”, enquanto que “k” representa os fatores a serem considerados

durante a análise. Para este tipo de “desenho” estatístico temos 7

9

graus de liberdade, sendo 3 deles responsáveis pelos efeitos

independentes dos fatores, enquanto que os outros 4 estão

relacionados aos efeitos das interações entre esses fatores, ou seja,

para este tipo de planejamento consegue-se visualizar efeitos

singulares assim como relacionados das variáveis presentes no ensaio

em questão.[montgomery]

Figura 3 – Esquema representativo para um planejamento experimental nk.

Fonte: MONTGOMERY, D.C., 2004, p 228.

ii) Planejamento experimental fatorial fracionado: Quando se tem um

grande número de fatores a serem analisados em determinado

experimento, consequentemente tem-se também um aumento na

quantidade de interações que deverão ser consideradas, extendo

assim o tempo necessário para completar um planejamento. Como

tempo é um fator limitante, este tipo de experimento considera apenas

as interações principais (efeitos exercidos pelos fatores de maneira

independente), deixando de lado os efeitos de interação entre as

variáveis, possibilitando assim a realização de apenas uma fração do

planejamento experimental, esse modelo é representado por nk-p, onde

“n” e “k” tem mesma definição que para experimentos fatoriais

completos, enquanto que “p” simboliza o número de efeitos interativos

entre as variáveis a ser desprezado.[montgomery]

iii) Planejamento experimental composto central: Quando se opta por

realizar planejamentos experimentais, principalmente de segunda

ordem, desvios da lineariedade relacionados aos efeitos exercidos

10

pelos fatores podem aparecer, por isso opta-se por realizar (além do

planejamento inicial) um estudo de composto central, que seria a

escolha por um ponto central, pontos axiais (estrela) e a utilização dos

níveis provenientes do planejamento fatorial completo realizado

anteriomente feito (ex: -1, +1), permitindo assim uma estimativa do erro

interno associado ao planejamento, e a geração de superfícies de

resposta que nos permitem a identificação das melhores condições de

utilização do método a ser otimizado. [montgomery, artigo favoritos]

Figura 4 – Esquema representativo para um planejamento de composto central.

Fonte: <http://www.portalaction.com.br/622-631-delineamento-composto-central>

Depois de realizado todo o processo de estudo da matriz, da classe dos

analitos, do preparo da amostra e do tratamento estatístico, é possível realizar a

quantificação e identificação dos compostos através de técnicas cromatográficas.

No ramo da cromatografia os processos de separações são regidos por

interações entre uma fase móvel (onde está contido o analito) e uma fase

estacionária, nesta etapa de separação e identificação dos analitos, diferentes

variáveis podem influenciar em uma melhor separação cromatográfica.

Atualmente existem várias técnicas cromatográficas diferenciadas entre si

pelo mecanismo utilizado na separação dos analitos, assim como na natureza da

fase móvel e estacionária a serem utilizadas35.

11

Figura 5 – Principais técnicas de cromatografia.

As técnicas cromatográficas também podem ser classificadas entre as que

utilizam uma coluna como “residência” da fase estacionária e atuam sob alta

pressão e as planares para análises mais simples e objetivas.

No caso de metodologias para preparo de amostra, geralmente são utilizadas

as técnicas de cromatografia mais complexas, que utilizam a coluna de separação,

portanto iremos se ater a explicar somente sobre esses técnicas cromatográficas.

Técnicas em coluna

i) Cromatografia Líquida Clássica: Criada no início do século 20, baseada

em uma fase móvel líquida que passava através de colunas de vidro de

diâmetros internos de 1,0 -> 5,0 cm e comprimentos entre 50,0 ->

500,0 cm, a fases estacionárias utilizadas eram partículas com

diâmetros de até 200,0 mm por onde a solução contendo o analito fluía

até a saída da coluna, onde eram coletadas frações dessa amostra em

tubos de ensaio, e cada fração teoricamente representava um grau de

12

separação entre os compostos presentes. O fato da coluna ser

relativamente grande e não se usar sistemas pressurizados, acabava

resultando análises demoradas, logo esse tipo de técnica serviu mais

como base para o desenvolvimento da cromatografia líquida de alta

eficiência (HPLC)35,36.

ii) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: Utilizada na separação de

compostos com alta massa molar e compostos iônicos, essa técnica

utiliza colunas com comprimento de até 250,0 mm e diâmetro de 4,6

mm contendo partículas de até 10 µm compactadas. A fase móvel é

impulsionada por uma bomba peristáltica elevando o fluxo e

aumentando a pressão do sistema, resultando em altas velocidades de

análise em tempos menores, permitindo a realização de diversas

análises com boa reprodutibilidade e confiabilidade35,36.

iii) Cromatografia com fluído supercrítico: nesta técnica um composto em

seu estado super crítico (CO2, por exemplo) é utilizado como a fase

móvel do sistema de separação. Esse tipo de cromatografia é indicada

para aqueles compostos que dificilmente poderiam ser analisados por

GC ou HPLC, devido a sua baixa volatilização, probabilidade de

degradação em altas temperaturas ou ausências de grupos funcionais

ativos para interações com os detectores presentes em HPLC35,36.

iv) Cromatografia Gasosa: é indicada para amostras termicamente

estáveis e voláteis. Nesse tipo de cromatografia a fase móvel

empregada é um gás inerte que só atua no carregamento dos analitos

coluna a dentro. As separações são realizadas por diferença na

temperatura de ebulição dos compostos em questão e as suas

solubilidades com a fase estacionária, geralmente são usadas

partículas sólidas compactadas na coluna que adsorvem os analitos,

ou partículas líquidas envolvidas por um filme sólido compactado na

coluna. Atualmente o uso de colunas capilares resistentes a

temperaturas na faixa de 450 oC, para aplicabilidade em compostos de

massas moleculares cada vez maiores, tem sido utilizadas juntamente

com novos métodos de injeção como o “cold on-column” e “PTV”

contribuindo assim para o desenvolvimento da cromatografia gasosa

de alta resolução35,36.

13

Com a criação e desenvolvimento de diversas técnicas cromatográficas como

as descritas acima, foi possível obter um controle maior sobre as variáveis que

influenciam na corrida cromatografica, assim como atingir menores tempos e

maiores resoluções na separação das mais variadas classes de compostos

químicos.

No casso desse trabalho a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi

escolhida para realizar o processo de separação e a espectrometria de massas para

a identificação e quantificação das sulfonamidas.[referência sobre HPLC]

Sendo assim, aliando um método de separação efetivo juntamente com as

informações obtidas do planejamento experimental (sobre melhores condições de

extração para o preparo de amostra), espera-se resultados satisfatórios sobre a taxa

de recuperação de fármacos nos mais diversos tipos de matriz, justificando de

maneira positiva o intuito deste trabalho.

14

2 OBJETIVOS

Este trabalho tem como objetivo a otimização de um método para preparo de

amostra baseado em “QuEChERS” visando a extração confiável das sulfonamidas

presentes em lodo floculado, com posterior separação e identificação através de

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a um detector de “tempo de

voô” (TOF)

A escolha deste biosólido como matriz de estudo foi devido ao mesmo

apresentar altas probabilidades de adsorção residual dos mais diversos tipos de

fármacos, incluindo as sulfonamidas11.

15

3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

3.1 MATERIAIS

Durante a fase de desenvolvimento do método, foram usados reagentes

como: acetonitrila (Tedia, grau HPLC) na fase móvel do sistema cromatográfico,

para preparo de amostras e das solução estoque das sulfonamidas, ácido fórmico

98% (Tedia), hidróxido de amônio 30% (Synth), os sais NaCl e MgSO4 e água

purificada através de um sistema milli-Q (Millipore)

Para a obtenção da solução estoque, oito compostos classificados como

sulfonamidas foram utilizados, sendo elas: Sulfacetamida, Sulfadiazina,

Sulfametoxazol, Sulfatiazol, Sulfamerazina, Sulfametizol, Sulfametzaina e

Sulfacloropiridazina.

Sendo os padrões para a realização dos testes fornecidos pela Sigma –

Aldrich.

Tabela 1 – Estrutura das sulfonamidas, massa molecular e pka.

Nome Massa

Molar

pKa Estrutura

Sulfacetamida 214,24 5,43

Sulfadiazina 250,28 6,81

Sulfametoxazol 253,28 5,81

Sulfatiazol 255,32 7,24

16

Sulfamerazina 264,30 7,35

Sulfametizol 270,33 5,51

Sulfametazina 278,33 7,89

Sulfacloropiridazina 284,72 5,90

A solução estoque (SE) foi preparada em acetonitrila na concentração de 400

mg . L-1 e armazenada em refrigeração durante todo o processo de desenvolvimento

do método. Outras soluções denominadas de trabalho (ST) eventualmente em

concentrações diferentes da solução estoque foram preparas a partir de uma

solução intermediária (SI), que visando a não degradação da solução estoque era

feita a partir da mesma.

O preparo da amostra a ser testada no processo de extração (“QuEChERS” )

utilizou lodo floculado cedido pelo laboratório de processos biológicos (LPB), o qual

foi mantido na geladeira do laboratório de cromatografia da USP (CROMA).

Antes de pesar as alíquotas de lodo a serem utilizadas nos testes, o excesso

de água contido foi retirado através de filtração a vácuo com um funil de Büchner.

Em seguida porções de 4,0 g do lodo “seco” foram pesadas e transferidas para

tubos falcon de 50,0 mL onde a contaminação com as sulfonamidas foi feita usando

as soluções de trabalho (ST) nas concentrações desejadas.

Por último os tubos foram deixados abertos dentro da capela do laboratório

por 60 minutos afim de que toda a acetonitrila presente nas soluções de trabalho

utilizadas fosse volatilizada, após estes passos as amostras foram mantidas sob

refrigeração por 48h antes do início do processo de extração.

17

As condições utilizadas na etapa de separação e detecção dos analitos foi o

uso de um sistema HPLC da série 20A Prominence, Shimadzu operando em fase

reversa, equipado com uma coluna Agilent C18 ( 2,1 mm x 100mm x 2,7 µm),

temperatura do forno a 40o C, volume de injeção de 5,0 µL, fase móvel de

acetonitrila e água, ambas acidificadas a 0,1% com ácido fórmico.

Para a detecção e quantificação das sulfonamidas em questão fez-se uso de

um espectrômetro de massas híbrido, modelo micrOTOF-Q II (Bruker) operando no

modo full SCAN, com ionização por eletrospray (ESI) no modo positivo sob voltagem

no capilar de 3,5 kV, a temperatura na fonte estava em 200o C, o fluxo do gás

secante manteve-se em 8,0 L . min-1 e utilizou-se uma pressão de 4,0 bar para o

nebulizador.

3.2 MÉTODO

Primeiramente variáveis como massa de lodo utilizada e composição da fase

extratora foram testadas de maneira independente, nos reportando que a quantidade

e composição escolhida inicialmente eram as melhores, porque assemelhavam-se

bastante com aquelas usadas no método de extração original. Sendo assim fixou-se

em 4,0 g a quantidade de lodo utilizada por amostra, e o uso de acetonitrila/água na

composição da fase extratora.

Depois de escolhida uma metodologia baseada em “QuEChERS” para o

processo de extração, a otimização das etapas de análise foi realizada através de

planejamento experimental gerado pelo software “STATISTICA”.

Com a realização de um planejamento quimiométrico fatorial, fica possível

evidenciar e quantificar a importância das variáveis que afetam no decorrer do

processo de extração, assim como avaliar o efeito independente ou relacionado

delas, dentro do desempenho final do método analítico.

Como o planejamento experimental deve abranger todas as variáveis com

potencial para afetar o método de extração, inicialmente foram escolhidas as

variáveis “originais” presentes no método “QuEChERS” desenvolvido para análise

de pesticida em matrizes alimentícias.

18

Sendo assim um planejamento fatorial fracionário 24-1 foi realizado, visando

obter informações sobre a maneira como as variáveis clássicas influenciavam de

modo independente o método utilizado para a análise de sulfonamidas em lodo

granular.

Foram realizados no total oito experimentos avaliando dois níveis (-1, +1),

com a quantidade a ser otimizada de cada variável clássica empregada na

métodologia a ser otimizada.

Tabela 2 – Fatores avaliados e níveis apresentados no planejamento experimental 2(4-1)

Variáveis

Níveis Avaliados

-1 +1

Volume da solução

extratora

2 3

ACN/H2O 2:1 4:1

NaCl (%) 10 30

MgSO4 (mg) 40 80

Os experimentos foram realizados seguindo etapas adaptadas de um modelo

próximo ao original empregado em “QuEChERS”

19

Fluxograma 2 – Etapas do preparo de amostra baseado no método “QuEChERS” utilizadas no trabalho.

Secagem de Lodo

(filtração a vácuo);

Pesagem do lodo em

tubo falcon (50 mL);

Adição de solução

contaminante;

Amosstra em repouso

por 48h;

Adição de NaCl (s) +

vortex;

Centrífuga 3400 rpm;

Tranferência fase

orgânica para tudo

falcon (15 mL);

Adição de MgSO4

anidro + vortex;

Centrifuga 3400 rpm;

Análise em LC-ESI-

TOF;

Secagem em fluxo de

N2 + resuspenção em

H2O

tranfere 2 mL para

ephendorf;

20

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

Após a realização dos testes propostos no planejamento experimental 24-1 e

análise dos cromatogramas obtidos para cada sulfonamida presente na amostra, os

picos foram integrados e as áreas referentes a cada composto “transcritas” para o

software – STATISTICA – 7.0.

Tabela 3 – Planejamento experimental 2(4-1) com os respectivos fatores, níveis e sulfonamidas presentes.

Com isso, foi possível a obtenção de gráficos de Pareto que informam a

contribuição independente de cada variável no método “QuEChERS” empregado na

extração.

21

Figura 6 – Projeções de pareto para as variáveis do planejamento 2(4-1)

.

22

Observando os gráficos de Pareto fica evidente que a variável que menos

afeta no desempenho do método em questão é a porcentagem de NaCl, portanto

visando um planejamento experimental mais completo, a variável foi retirada.

23

Depois de observado os resultados iniciais, foi então proposto um novo

planejamento experimental completo, ou seja, um planejamento 23 que nos permite

analisar as variáveis de maneira independente e relacionada.

Para isso utilizou-se da mesma ferramenta estatística, ressaltando que novos

experimentos não foram realizados, ou seja, apenas foi retirada a variável “% NaCl”

e os dados foram avaliados de acordo com um planejamenteo fatorial completo 23.

Tabela 4 – Planejamento experimental 2(3) com os respectivos fatores, níveis e sulfonamidas presentes.

Depois de gerado a tabela com o planejamento completo, as mesmas

ferramentas e o mesmo método de análise critica dos dados foi adotado.

Gráficos de Pareto, mostrando a contribuição relacionada e independente das

variáveis para cada sulfonamida presente na amostra, foram gerados e avaliados

com a perspectiva de que uma nova otimização poderia ser realizada frente aos

resultados observados.

Figura 7 – Projeções de pareto para as variáveis do planejamento 2(3)

.

24

25

Ao observar as projeções de Pareto para o planejamento experimental

completo 23, feito com o intuito de verificar a contribuição relacionada entre as

variáveis presentes na extração, assim como de forma independente, podemos

constatar um aumento no efeito combinado das variáveis no método em geral, o que

nos trás primeiramente a certeza de que retirar a variável “% NaCl” foi uma boa

escolha.

Pensando em melhorar ainda mais o método de preparo de amostra, foram

realizados experimentos visando a obtenção de superfícies de resposta de segunda

ordem para cada condição usada, o que se tratava de um planejamento

experimental de composto central.

Este tipo de planejamento experimental é um dos mais comuns de segunda

ordem, e nos retorna uma estiva sobre o erro interno do experimento e informações

sobre os termos axiais ao central, que irão determinar os valores quadráticos

responsáveis por um ajuste mais preciso no rendimento experimental. Basicamente

este tipo de planejamento é realizado escolhendo-se um ponto central, e aplicando

testes experimentais e estatísticos na região em torno do ponto central.[referência

da internet, salva nos favoritos]

Nesse caso uma avaliação sobre as variáveis que seriam englobadas no novo

planejamento foi necessária, considerando então toda a etapa de preparo de

amostra e os passos utilizados pelo método. Chegamos à conclusão que a variável

“Volume de Solvente” não poderia ser alterada, pois como seu efeito na projeção de

Pareto teve sinal negativo, apenas uma diminuição do volume utilizado traria efeitos

positivos no resultado final, e isso seria impossível, pois o volume utilizado já era o

mínimo levando em conta que uma extração de 2,0 mL de fase orgânica se faz

necessária durante os procedimentos, e ao diminuir mais esse valor de volume de

solução extratora, esses 2,0 mL não poderiam ser retirados, comprometendo assim

o método como um todo.

Logo no planejamento composto central, apenas as variáveis “Composição de

Solvente” e a “massa de MgSO4, foram consideradas.

Portanto, foi escolhido um planejamento 22 onde os níveis avaliados ao redor

do ponto central tiveram um α = √2, ou seja, os pontos “estrela” avaliados neste

planejamento tiveram uma abrangência maior que a região delimitada pelo

26

experimento (-1, 0, +1), nos permitindo assim avaliações mais precisas sobre o

rendimento experimental através de projeções de superfície quadráticas. Sendo

assim o experimento foi feito em 4 níveis adjacentes ao centro, sendo eles: (-√2, -1,

+1,+√2), enquanto que o ponto central foi fixado em (0, 0).

Tabela 5 – Planejamento de composto central 2(2) com os respectivos fatores, níveis e sulfonamidas presentes

Vale ressaltar que para este planejamento (diferente do planejamento 23 onde

retiramos a variável NaCl e fizemos apenas ajustes estatísticos), a realização de

novos experimentos foi necessária e estes foram conduzidos com a mesma

metodologia de preparo de amostra aplicada para os outros planejamentos, porém

agora apenas as variáveis quantidade de MgSO4 e proporcão ACN/H2O foram

variadas nos pontos estrela, enquanto que para o ponto central as mesmas

quantidades já otimizadas nos experimentos no planejamento 23 se mantiveram, o

ponto central foi realizado em quadruplicata, visando uma melhor análise sobre os

erros internos provenientes do método.

Tabela 6 - Fatores avaliados e níveis apresentados no planejamento de

composto central 22

Variáveis independentes

Níveis Codificados

-1,41 -1,0 0 1,0 1,41 ACN/Água 2,59:1 3:1 4:1 5:1 5,41:1

MgSO4 (g) 25,9 30 40 50 54,1

27

Como se trata de uma análise quimiométrica através de um planejamento de

2a ordem, as condições otimizadas de aplicabilidade do método foram avaliadas a

partir de gráficos de superfície para cada sulfonamida presente na amostra,

ajustados a partir dos termos quadráticos obtidos do planejamento, representando o

recuperação e repetibilidade do método para cada ponto, seja ele adjacente (estrela)

ou o central.

Figura 8 - Superfícies de resposta dos pontos testados no planejamento experimental de composto central.

28

Os gráficos de superfície oriundos do experimento composto central, nos

reportaram as condições utilizadas no ponto central como sendo a melhor

encontrada para a utilização do método, pois para as oito sulfonamidas o ponto

central é aquele que tem maior intensidade de resposta na superfície de segunda

ordem, ou seja, este planejamento experimental foi efetivo e nos provou que a

melhor condição encontrada nos testes provenientes do planejamento 24-1 era

realmente a ideal a ser aplicada para o método.

Estudos recentes mencionam a utilização de ferramentas estatísticas na hora

de uma otimização experimental, permitindo assim realizar tais procedimentos em

menor tempo com menos consumo de reagentes, assim como mencionam a

29

efetividade ao se aplicar a metodologia “QuEChERS” na extração de analitos de

origem farmacêutica em amostras de lodo37,38,39.

Como a matriz escolhida para este trabalho não tem origem alimentícia como

aquelas aplicáveis ao método original, uma bateria de experimentos visando avaliar

a contribuição na adição de um composto adsortivo, etapa inicialmente aplicada por

(Anastassiades et al, 2003) foi realizada.

Os testes foram realizados nas condições otimizadas pelo planejamento de

composto central, as quantidades utilizadas foram: 4,0 g de lodo, 8,0 mL de solução

extratora (1,6 mL H2O e 6,4 mL de ACN), 30 % de NaCl e 40 mg de MgSO4.

Figura 9 – Intensidade de área dos picos das sulfonamidas pelo método de extração utilizado (testes

utilizando fase adsorvente e a amostra controle).

Ao observar o gráfico, concluímos, assim como (Bourdat-Deschamps et al,

2014) o uso de uma fase adsorvente no método de preparo de amostra era

dispensável, pois somente sulfametizol e sulfametoxazol responderam melhor

quando usados grafite e PSA respectivamente, enquanto que as seis demais

sulfonamidas presentes na amostra tiveram melhor resposta quando não realizada

esta etapa no método, o que claro é vantagoso pois com menos etapas e uso de

menos reagentes se tem uma melhor rapizes e rentabilidade do método

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

S/N

Controle

PSA

GRA

C18

30

respectivamente. Sendo assim optou-se por excluir essa etapa do método de

preparo amostral40.

31

5 CONCLUSÃO

A otimização de uma metodologia para preparo de amostra baseada em

“QuEChERS” e realizada através de planejamentos experimentais revelou

resultados finais satisfátorios.

O intuito desde o início era adequar os procedimentos e quantidades de

reagentes utilizados a fim de se ter a melhor relação custo/benefício possível, ou

seja, um rendimento e uma aplicabilidade boa para o método sem esquecer de todo

o contexto da química “verde” e a geração de resíduos imposta pelo uso de tal

metodologia.

Os experimentos realizados a partir da tabela de níveis gerados pelo

planejamento experimental fatorial fracionário 2(4-1), permitiu observar a contribuição

independente de cada variável clássica empregada no método, levando a uma

decisão de retirar a variável “% NaCl” já que a mesma revelava ser a variável de

menos efeito sobre a etapa extratora, com isso um novo planejamento, agora

classificado como fatorial completo foi usado.

No planejamento fatorial completo 23, apenas as variáveis: composição da

fase extratora, volume de solvente e quantidade de MgSO4 (mg) foram

consideradas, revelando( através das projeções de pareto) a contribuição independe

e relacionada de tais fatores. Como a variável “volume de solvente” teve sinal

negativo nos gráficos, apenas uma diminuição da mesma acarretaria em melhora na

metodologia, porém não era viável essa diminuição já que o volume utilizado era o

menor possível para a etapa de extração.

Visando o melhor ajuste possível e a melhor otimização para o método

“QuEChERS”, aplicável as oito sulfonamidas presentes no lodo granular, um

planejamento experimental contendo um ponto central foi gerado e somente os

fatores: quantidade de MgSO4 (mg) e composição da fase extratora foram variados

nos níveis adjacentes ao central.

O planejamento em questão nos reportou gráficos de superfície indicando que

as condições utilizadas no ponto central eram aquelas que apresentavam as

melhores taxas de recuperação de analito (observada através das áreas dos picos),

ou seja, uma otimização satisfatória do método.

32

Logo este planejamento de composto central serviu para minimizar erros

internos em nosso experimento e confirmar a condição ideal de utilização do método

“QuEChERS” (encontrada no planejamento experimental fracionário 24-1) como

aplicável a amostras de lodo granular a fim de realizar o “clean up” da amostra para

posterior separação e detecção dos agentes antimicrobianos da classe das

sulfonamidas.

Por último, é importante comentar que o estudo em questão serviu para

mostrar a importância na utilização de ferramentas estatísticas na hora de realizar

uma otimizição experimental, assim como para acrescentar conhecimentos

analíticos sobre procedimentos de preparo de amostra e cromatografia, tornando

esse trabalho uma importante forma de adquirir experiência laboratorial e fixar

conhecimentos trabalhados durante o curso.

33

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