Molecular technologies for food authentication. The case of fruit purées adulteration

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EDITORICHIRIOTTI

GIUGNO 2009 ANNO 48 - N. 492

Industrie

industriealimentari

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Industrie Alimentari - XLVIII (2009) giugno - 17

MAuro Musto*Metapontum Agrobios s.r.l. - s.s. 106 Jonica Km 448.2 - 75010 Metaponto - Mt - Italia

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tecnologie molecolari per

l’autenticazione degli alimenti.

il caso dell’adulterazione delle puree di frutta

Molecular technologies for food authentication. the case of fruit purées adulteration

Parole chiave: frode alimentare, qualità degli alimenti, puree di frutta, multiplex PcrKey words: food fraud, food quality, fruit purées, multiplex Pcr

summarY

new, accurate and reliable methods for food authentication are required

to protect consumers from fraud. DnA based techniques allow to

determine the presence or absence of certain ingredients in complex products or the identification of specific characteristics of single

food components. the reliability of these approaches is described

in this article, in which a multiplex Pcr assay was applied to verify the

authenticity of some preparations, labelled as “strawberry purées” and suspected to be adulterated with apple purée after chemical

analysis. this simple case confirms that a combination of molecular and

chemical methods can be useful to detect adulteration of foods.

sommario

Per proteggere il consumatore dalle frodi, nuovi metodi accurati

ed affidabili per l’autenticazione degli alimenti risultano necessari.

Le tecniche basate sullo studio del DnA permettono di determinare

la presenza o l’assenza di certi ingredienti in prodotti complessi

o l’identificazione di specifiche caratteristiche di ciascuna

componente alimentare. L’affidabilità di questi approcci è descritta in

quest’articolo, in cui una multiplex Pcr è stata realizzata per verificare l’autenticità di alcune preparazioni,

etichettate come “purea di fragola” e sospettate di essere state adulterate

con purea di mela dopo aver condotto delle analisi chimiche. Questo semplice caso conferma

che una combinazione di metodi molecolari e chimici può essere utile per individuare l’adulterazione degli

alimenti.

1. INTRODUZIONE

Il 15 marzo viene celebrata la giornata europea del consuma-tore, una manifestazione che si propone di informare il pubbli-co sulla politica europea per la protezione dei consumatori, oltre 490 milioni di persone che, come scrive Meglena Kuneva, commis-sario responsabile per la politica dei consumatori, sono la “linfa vitale dell’economia europea”. L’iniziativa richiama l’attenzio-ne sulla centralità del cittadino nella dimensione comunitaria e sul suo ruolo strategico nel mer-cato interno europeo. Una netta inversione di rotta a seguito delle emergenze alimentari che hanno messo in crisi diversi comparti produttivi, un atto dovuto per contrastare la crescente sfiducia del consumatore non solo ver-

so chi produce e distribuisce gli alimenti che acquista, ma anche verso coloro che dovrebbero vi-gilare sui rischi alimentari per garantire i loro interessi e la loro salute.Ciononostante, le ultime crona-che riportano una serie impres-sionante di casi di frode alimen-tare (mozzarella, vino, olio, sur-gelati, ecc.), un annoso problema che mina seriamente il tentativo di restaurare la consumer confi-dence. Senza contare che dietro la fraudolenta variazione della composizione e/o degli aspetti esteriori dell’alimento si può na-scondere il grave rischio di aller-gie, intolleranze e tossinfezioni alimentari.L’emergenza che ne deriva sotto-linea la necessità di attuare severi controlli volti a smascherare le pratiche fraudolente, motivo per

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18 - Industrie Alimentari - XLVIII (2009) giugno

Fig. 1 - Rappresentazione schematica della reazione a catena della polimerasi (PCR).

(Beneke e Hagen, 1998; Unseld et al., 1995).Molte delle tecniche basate sullo studio del DNA fanno riferimen-to alla reazione a catena della polimerasi o PCR (fig. 1), in cui, data una sequenza di DNA e due corte sequenze oligonucleotidiche (primer), di cui una complemen-tare ad un tratto di filamento ad un’estremità del DNA da ampli-ficare (forward) e l’altra comple-mentare ad un altro tratto posto all’altra estremità (reverse), in presenza di un enzima polime-rasi termostabile (Taq) e di una miscela di desossinucleotidi trifo-sfati (dNTPs), è possibile copiare tantissime volte il tratto (sequenza target) compreso tra i due primer da poterlo visualizzare in un gel d’agarosio e identificarlo attraver-so il confronto con una marcatore di peso molecolare noto. Nel caso in cui si volessero amplificare più sequenze target si dovrebbero uti-

il quale la validità e l’applicabilità di diverse tecniche di valutazio-ne e certificazione dell’origine e della qualità degli alimenti ven-gono valutate e discusse (Woolf e Primrose, 2004). In questo scenario, le tecniche basate sullo studio del DNA stanno incon-trando notevoli consensi. La loro applicabilità è stata dimostrata in diversi ambiti, dall’adulterazione di prodotti di origine animale (Meyer et al., 1995; Piknova et al., 2002; Sanjuan e Comesana, 2002) alla contaminazione mi-crobica (Agarwal et al., 2002), dal rilevamento di transgeni vegetali (Hubner et al., 2001) all’identi-ficazione di potenziali allergeni (Holzhauser et al., 2000), ecc. Il successo di questo tipo di analisi dipende principalmente dal fat-to che il DNA, rispetto ad altre molecole, è presente in ogni cel-lula e risulta relativamente sta-bile in molti processi alimentari

lizzare più coppie di primer speci-fici, realizzando così una multi-plex PCR. Attraverso questo tipo di approccio, ad esempio, è stato possibile riconoscere le diverse specie (bovina, suina, avicola, ovina, caprina, equina) da cui era stata ottenuta la carne utilizzata per la produzione di vari prepa-rati alimentari (Matsunaga et al., 1999).La potenzialità di questo approc-cio può essere meglio intesa at-traverso il semplice caso di stu-dio riportato di seguito. Il caso in questione fa riferimento alla sostituzione della purea di frago-la, più costosa e più deperibile, con quella di mela, considerata di minore pregio. Se non dichia-rata in etichetta, tale sostituzio-ne si configura come un illecito che può addirittura causare pro-

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blemi di salute in quei consuma-tori allergici alla mela: infatti, se gli allergeni contenuti in questo frutto non vanno incontro ad una rapida denaturazione durante la trasformazione possono causare diversi disturbi, tra i quali la sin-drome orale allergica (Ortolani et al., 1988).

2. IL CASO: ADULTERAZIONE DELLE PUREE DI FRUTTA

2.1 Preparazione dei campioni

Frutti di fragola (Fragaria x ana-nassa, cv. “Tudla”) e di mela (Malus Domestica, cv. “Impera-tore”) sono stati lavati, tagliati e utilizzati per la formazione di 5 campioni dalla diversa compo-sizione. Ogni campione è stato triturato separatamente per 5-7 minuti al fine di ottenere una purea omogenea. A ciascuna delle suddette puree è stato assegnato un codice di laboratorio identifi-cativo della composizione di par-tenza, quest’ultima nota solo al responsabile dello studio pilota: ai collaboratori, infatti, era stato detto che si trattava di campioni di puree appartenenti alla stessa matrice, la fragola. In tal modo, è stato possibile effettuare le analisi di laboratorio su campioni di pu-ree dalla composizione reale igno-ta. I risultati di seguito discussi fanno riferimento a campioni di puree numerati da 1 a 5 secondo la seguente composizione per-centuale:- purea 1: 100% fragola;- purea 2: 75% fragola e 25% mela;- purea 3: 50% fragola e 50% mela;

- purea 4: 25% fragola e 75% mela;- purea 5: 100% mela.

2.2 Analisi chimiche

La misura del pH è stata effet-tuata sul surnatante delle puree diluite in acqua bidistillata e sot-toposte a centrifugazione (Saied et al., 2005).La determinazione del conte-nuto in acido ascorbico totale (AAT), espresso come mg per 100 g di purea fresca (PF), è avvenuta mediante titolazione con una soluzione di 2,6-dich-lorophenolindophenol (Wang e Camp, 2000).I solidi solubili totali (SST), espressi in °Brix, sono stati misu-rati con un rifrattometro digitale, utilizzando il surnatante recupe-rato da puree sottoposte a centri-fugazione (Saied et al., 2005).Antociani totali e polifenoli tota-li sono stati estratti utilizzando una soluzione di metanolo acidi-ficato (Cheel et al., 2007); succes-sivamente, gli estratti sono stati centrifugati, filtrati e destinati alle analisi. Per la determinazione del contenuto in antociani totali (AT) – espresso come mg di pelar-gonidina-3-glucoside (Pg 3-glc) per 100 g di PF – è stata misu-rata l’assorbanza degli estratti ad una lunghezza d’onda di 515 nm (Woodward, 1972). Lo stesso estratto è stato utilizzato per la determinazione del contenuto in polifenoli totali (PT) attraverso il saggio di Folin-Ciocalteau (FC), in cui la reazione di ossidazione degli estratti dovuta all’aggiunta del reattivo di FC viene neutra-lizzata con carbonato di sodio. L’assorbanza dei campioni dalla conseguente colorazione blu è stata misurata a 760 nm, estrapo-

lando poi dalla retta di taratura la concentrazione di polifenoli totali espressa come mg equiva-lenti di acido gallico (GAE) per 100 g di PF (Singleton e Rossi, 1965).

2.3 Analisi molecolari

L’estrazione del DNA è avvenuta modificando il protocollo propo-sto da Doyle e Doyle (1990): la metodica, basata sull’impiego del bromuro del cetiltrimetilammo-nio (CTAB), è stata migliorata at-traverso l’utilizzo di un tampone di lavaggio costituito da sodio ace-tato, per rimuovere i polisaccaridi, e polivinilpirrolidone (PVP), per eliminare i polifenoli (Mercado et al., 1999). La qualità del DNA estratto è stata verificata attraver-so una corsa elettroforetica su gel d’agarosio all’1%.L’amplificazione degli estratti è stata realizzata attraverso una multiplex PCR che prevedeva l’utilizzo di due coppie di primer:1) F18 (5’-AAACGGCTACCA-CATCCAAG-3’) e R18 (5’-CCTC-CAATGGATCCTCGTTA-3’) per l’amplificazione di un frammento di DNA lungo 153 bp interno al gene 18S rRNA, specie specifico di mela (GenBank Accessione # DQ341382);2) EMFxaCAD1Cf (5’-GAGGAG-GAAGCTCTTAAACACC-3’) e EMFxaCAD1Cr (5’-GCAGAA-ACTGTGTCAATGATCC-3’) per l’amplificazione di un frammento di DNA lungo 209 bp interno al gene Fragaria x ananassa cinnamyl alcohol dehydrogenase (cad), spe-cie specifico di fragola (GenBank Accessione # AF320110).Ciascuna reazione è stata ese-guita in un volume finale di 50 µL utilizzando circa 0,1 µg di DNA genomico, 20 mM di

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Optimized DyNAzyme Buffer, 0,2 mM di dNTPs, 0,4 mM per primer e 2,5 U di DyNAzyme II DNA Polymerase (Finnzymes). Le amplificazioni sono state ot-tenute utilizzando il termocicla-tore PTC-200 (Peltier Thermal Cycler) con il seguente proto-collo: 94°C per 5 min, seguite da 40 cicli di 94°C per 30 sec, 61,3°C per 30 sec e 72°C per 1 min, ed un’estensione finale di 72°C di 5 min. I prodotti di PCR sono stati visualizzati su un gel d’agarosio all’1,5%.

3. RISULTATI

3.1 Analisi chimiche

Il valore del pH riscontrato oscilla da un minimo di 3,47 per la purea 1 ad un massimo di 3,71 per la purea 5 (fig. 2). Tali valori sono concordi con quelli riportati da precedenti ricerche condotte su cultivar diverse: Lara et al. (2006), ad esempio, riferiscono valori di 3,16 per frutti di “Pájaro”, mentre per “Korona” ed “Elsanta” i valori risultano, rispettivamente, di 3,70 e 3,76 (Saied et al., 2005). Seb-bene la rassegna della letteratura possa rassicurare circa la bontà del risultato ottenuto, l’analisi statistica dei dati, evidenziando differenze significative tra tutte le puree, suscita una certa perplessi-tà, dal momento che dovrebbero contenere tutte la stessa matrice e, quindi, dare lo stesso valore di pH.La perplessità aumenta se si pren-de in considerazione il contenuto in acido ascorbico totale, altret-tanto diverso tra le puree (fig. 3): il range, in questo caso, va da un minimo di 2,89 (purea 5) ad un massimo di 43,97 mg per 100 g

Fig. 2 - Valori medi del pH delle puree.Le medie contrassegnate da lettere uguali non differiscono significativamente (Tukey, P<0,05).

Fig. 3 - Contenuto medio in acido ascorbico totale (AAT) delle puree.Le medie contrassegnate da lettere uguali non differiscono significativamente (Tukey, P<0,05).

Fig. 4 - Valori medi dei solidi solubili totali (SST) delle puree.Le medie contrassegnate da lettere uguali non differiscono significativamente (Tukey, P<0,05).

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di prodotto (purea 1). Sahari et al. (2004) riportano un contenuto di 52 mg/100 g in frutti di cultivar “Kordestan”, mentre in “Senga Sengana” e “Jonsok” il valore è più prossimo a quello da noi ri-scontrato nella purea 1 (43,5 e 49,7, rispettivamente; Hakala et al., 2003).Differenze significative sono sta-te riscontrate anche in termini di solidi solubili totali (fig. 4), con un andamento decrescente dei °Brix dalla purea 5 (13,37) alla purea 1 (8,11). Quest’ulti-mo valore è molto più prossimo a quello rinvenuto in fragole del-le cultivar “Allstar” (8,1; Zheng et al. 2007), “Oso Grande” (8,5; Cordenunsi et al., 2003) e “Ga-riguette” (8,7; Lambert et al., 1999).L’ipotesi dell’origine comune delle puree vacilla ulteriormente attraverso il confronto del conte-nuto in antociani totali (fig. 5), nettamente maggiore nella purea 1 (21,62 mg/100 g) e progressi-vamente decrescente nel resto delle puree, fino al valore mini-mo di 1,50 mg (purea 5). Zheng et al. (2007) riportano un valo-re di 20,07 mg/100 g in fragole di cultivar “Allstar”, più o meno simile a quello di altre cultivar, quali “Senga Sengana”, “Koro-na” e “Honeoye” (Wicklund et al., 2005).I dati in letteratura fin qui citati sembrerebbero garantirci la pre-senza di fragola solo nella purea 1, i cui parametri chimici, peral-tro, sono sempre risultati stati-sticamente diversi da quelli delle altre puree. Questa conclusione, tuttavia, non può totalmente es-sere accettata se si considera che il contenuto in polifenoli totali (fig. 6) non è risultato signifi-cativamente diverso tra le pri-

me tre puree (ben al di sopra di 200 mg/100 g), così come non sono emerse differenze signifi-cative confrontando le medie di alcune coppie di puree (2 e 3; 2 e 4; 3 e 4). Solo il campione 5 differisce significativamente da tutti gli altri (115,10 mg/100 g): il contenuto di quest’ultimo è molto simile a quello riscon-trato in fragole di cultivar “Al-lstar” (102 mg/100 g) da Zheng et al. (2007), sebbene i risulta-ti di un altro studio condotto su altre tre cultivar (“Dover”,

“Campineiro” e “Oso Grande”) riportino un contenuto attorno ai 300 mg/100 g (Cordenunsi et al., 2005). In questo caso, nem-meno la letteratura può fornire un giudizio obiettivo.

3.2 Analisi molecolari

La fig. 7a mostra come l’elet-troforesi su gel d’agarosio pos-sa essere usata per analizzare la qualità del DNA estratto dalle 5 puree oggetto di studio. Even-tuali impurità presenti negli

Fig. 5 - Contenuto medio in antociani totali (AT) delle puree.Le medie contrassegnate da lettere uguali non differiscono significativamente (Tukey, P<0,05).

Fig. 6 - Contenuto medio in polifenoli totali (PT) delle puree.Le medie contrassegnate da lettere uguali non differiscono significativamente (Tukey, P<0,05).

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estratti, quali carboidrati, pro-teine e sali, possono interferire con la mobilità elettroforetica degli acidi nucleici legandosi ad essi. I risultati da noi ottenu-ti mostrano maggiori impurità negli estratti delle puree 2, 3 e 5, la cui mobilità appare molto diversa rispetto a quella degli estratti delle rimanenti puree. Le suddette osservazioni indica-no forti differenze tra le matrici di partenza, una differenza con-fermata anche dalle dimensioni delle bande, attraverso le quali è possibile stimare una concentra-

zione di DNA abbastanza simile per le prime tre puree, ma diversa tra la 4 e la 5.L’origine di tali differenze, tut-tavia, può essere spiegata solo analizzando i risultati della multiplex PCR. La fig. 7b mo-stra che il frammento di 209 bp, specifico del gene cad di fragola, è stato amplificato attraverso le reazioni contenenti gli estratti delle prime quattro puree (1, 2, 3 e 4), ad indicare la presenza di fragola nelle suddette puree. Un discorso analogo può essere fatto circa l’amplificazione del

Fig. 7 - Qualità del DNA estratto dalle puree (a) e successiva amplificazione (b).Puree: 1 (linea 1), 2 (linea 2), 3 (linea 3), 4 (linea 4) e 5 (linea 5). Marcatori di peso molecolare (linea M’). Bianco di reazione (linea B).

frammento di 153 bp, specifico del gene 18S rRNA di mela, nelle ultime quattro puree (2, 3 e 4, 5). La contemporanea presenza dei frammenti amplificati nelle puree 2, 3, 4 indica la presenza sia di fragola che di mela nelle matrici. Nella purea 1, invece, è presente solo fragola, così come nella 5 è presente solo mela.Alla luce di questi risultati è pos-sibile affermare che la composi-zione delle 5 puree analizzate è senz’altro diversa e tale diversità è da ascriversi all’impiego della purea di mela in sostituzione di quella di fragola. Il caso, dunque, è chiuso.

4. CONCLUSIONI

Oggigiorno le frodi in campo ali-mentare rappresentano una grave piaga sia per il consumatore che per il produttore. Il primo, come attestano le cronache quotidiane, perde la fiducia non solo nel pro-dotto acquistato ma anche verso chi lo produce, sviluppando una generale diffidenza che, come un fiume in piena, travolge tutti gli addetti del settore interessa-to, anche coloro che, nell’ottica della globalizzazione, tentano di migliorarsi al fine di offrire pro-dotti migliori sui mercati locali ed esteri.Onde evitare che tali sforzi ri-sultino vani, è opportuno l’uti-lizzo di tecniche all’avanguardia nell’autenticazione e nella certi-ficazione della qualità degli ali-menti. In questo senso, l’adozio-ne di approcci multidisciplinari, capaci di integrare discipline di-verse, quali la chimica analitica, la biochimica, la tossicologia, la microbiologia, le tecnologie ali-mentari, la biologia molecolare,

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deve senz’altro essere incorag-giata. Tali indicazioni possono essere desunte dal caso di studio riportato in quest’articolo. Attra-verso una multiplex PCR è stato possibile individuare la presenza (non dichiarata) di purea di mela in quella di fragola, una pratica fraudolenta che interessa diversi frutti utilizzati per la prepara-zione di confetture e succhi di frutta. La presenza di succo di mandarino in quello di arancia, ad esempio, è stata determinata attraverso un approccio simile (Knight, 2000). Nella sua estre-ma semplicità, il nostro caso di studio dimostra come una comu-ne frode alimentare possa essere individuata facilmente quando le classiche tecniche analitiche incontrano quelle basate sullo studio del DNA. A questa con-clusione giungono anche Fügel et al. (2005), i quali, nel verificare la validità di molteplici metodi-che di analisi, auspicano l’adozio-ne di approcci semplici, rapidi e applicabili nell’autenticazione e nel controllo della qualità degli alimenti.

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