ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА МОЧЕПОЛОВОГО ТРИХОМОНИАЗА.ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПЛАСТИКОВОГО КОНВЕРТА “IN POUCH TV”.

Мельник А.А., к.б.н.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения общее количество новых случаевзаболеваний инфекциями, передающимися половым путем в мире составило 489,9миллионов человек. Из них 276,4 мил. случаев относится к инфекции Trichomonas vaginalis,которое занимает первое место по распространенности (1,2). Высокая частотабессимптомных форм данной инфекции позволяет отнести трихомониаз к неконтролируемым инфекциям, относительно частыми осложнениями болезни, трудностьюлабораторной диагностики скрытых (хронических) форм. Трихомоноз имеет важноемедицинское, социальное и экономическое значение не только из-за высокойраспространенности инфекции, но и из-за доказанной роли Trichomonas vaginalis каккофактора ВИЧ-инфекции и рака шейки матки. Поэтому основной задачей сегодняшнего дняявляется совершенствование методов обнаружения Trichomonas vaginalis, основанных насовременных достижениях лабораторной диагностики. Впервые возбудитель трихомониаза был обнаружен в гнойных выделениях из влагалищаженщин и секрета урогенитального тракта у мужчин в 1836 году французским врачомАльфредом Донне. В начале он предположил связь между патологическими выделениями уженщин и этим микроорганизмом, но потом отказался от этой идеи. В 1837 г. этотмикроорганизм получил название Trihomonas, т.к. был похож на двух простейших Trichade иMonas. В течение 80 лет эти влагалищные микроорганизмы считались безвредными живымисуществами и их длительное время считали сапрофитами пока в 1916 году О. Хен изГермании не подтвердил связь между паразитом и трихомониазом. С этого периодаTrihomonas признана патогенным паразитом и инфекцией, передающейся половым путем. Несмотря на то, что трихомонада – одноклеточный организм, ее строение довольно сложное.Форма трихомонад обычно грушевидная, но при прикреплении и взаимодействии с клеткамислизистых оболочек у них появляются «щупальца» и по форме они напоминают амеб.Генетический материал трихомонад содержит около 60 000 генов, отвечающих за выработкубелков. На поверхности оболочки этот паразит имеет более 300 разных белков из десятигрупп протеинов. По этой причине (большое количество белков-антигенов) многиекоммерческие серологические тесты по определению антигенов и антител являются низко-чувствительными.У человека могут обитать три вида трихомонад. В норме в ротовой полости обитаютTrichomonas tenax, в толстой кишке Trichomonas hominis. Влагалищные паразиты -Trichomonas vaginalis являются патогенными для человека и вызывают трихомониаз, длякоторого характерно комплексное поражение мочеполовой системы.Trichomonas vaginalis имеют грушевидное тело, 14-30 мкм длиной, на переднем конце – 4жгутика, ундулирующая мембрана - до середины тела, аксостиль - через все тело. (Рис.1)

Рис.1. Строение Trichomonas vaginalis (AF – передние жгутики, АХ – аксостиль, СО – коста,опорное образование, HY – гидрогеносомы, N – ядро, РВ – парабазальное тело, PG –парабазальное тело и аппарат Гольджи, RF – рекуррентный жгутик).

Трихомонады являются факультативными анаэробами, облигатными паразитами, утратившиеспособность синтезировать многие макромолекулы. Эти компоненты они получают извагинального и других секретов, при фагоцитозе бактериальных клеток нормальноймикрофлоры мочеполовых путей. Trichomonas vaginalis инфицируют исключительносквамозный эпителий урогенитального тракта. Трихомонады являются и полостными, итканевыми паразитами, т.к. они могут обитать как на поверхностных слоях эпителия,повторяя его рельеф, так и проникать достаточно глубоко в ткани, благодаря наличиюпротеаз (Рис.2).

1 2 3Рис.2. Обнаружение Trichomonas vaginalis (1 - подвижные трихомонады в нативномпрепарате, 2 - трихомонады после окраски, 3 - электронная микроскопия трихомонад наэпителиальной клетке).

Существуют различные клинические классификации мочеполового трихомониаза. Взависимости от длительности заболевания и интенсивности реакции организма на внедрениевозбудителя, различают следующие формы трихомониаза:- свежий (острый, подострый, торпидный) ;- хронический (торпидное течение и давность заболевания свыше двух месяцев);- трихомонадоносительство (при наличие трихомонад в выделениях из влагалищаотсутствуют объективные и субъективные симптомы заболевания). Особенностью течения трихомониаза на современном этапе является то, что яркиеклинические проявления заболевания встречаются все реже, преобладают вялотекущие,малосимптомные формы.Местом внедрения трихомонад (входными воротами) у женщин является слизистаявлагалища. Затем постепенно они попадают в уретру, парауретральные ходы и цервикальныйканал. Возникают вульвиты, вестибулиты, бартолиниты, аднекситы, пиосальпингиты,кольпиты, эндометриты, эндоцервициты, эрозии шейки матки, циститы, уретриты. Длямочеполового трихомониаза характерно многоочаговое поражение мочеполовой системы ивозникновение осложнений, в том числе первичного и вторичного бесплодия,неразвивающейся беременности и самопроизвольных выкидышей. Симптомы - зуд, жжение,дизурические расстройства, боли при половых актах. В 75% случаев - серозно-гнойные,пенистые, желто-зеленые тягучие выделения. Для тяжелых форм характерны множественныекровоизлияния, эрозии слизистой оболочки. Примерно у 2% пациенток могут бытьобнаружены незначительно выраженные геморрагии на слизистой влагалища, шейки матки ицервикального канала ("клубничное проявление") (Рис.3).

Рис.3. «Клубничное проявление» в шейке матки у женщин при инфицировании Trichomonas vaginalis.

До 25-50% инфицированных женщин имеют бессимптомное носительство. Клиническиесимптомы развиваются только у половины таких пациенток в течение 6-ти месяцев послепервичного обращения.У мужчин местом обитания Trichomonas vaginalis является уретра, предстательная железа исеменные пузырьки. Мужской трихомониаз часто протекает бессимптомно или со стертымисимптомами, что связано с удалением значительной части трихомонад при мочеиспускании.Общие жалобы у мужчин включают скудные, слизисто-гнойные выделения, дизурию, слабыйзуд или жжение немедленно после коитуса. Осложнения, связанные с трихомониазом,включают такие урогенитальные заболевания как простатит, везикулит, баланопостит,эпидидимит. Кроме уретры, при трихомониазе у 30–50% мужчин поражаютсябульбоуретральные железы, предстательная железа, семенные пузырьки, мочевой пузырь. Хронический простатит как осложнение трихомонадного уретрита диагностируется у 10–40% больных.Лабораторная диагностика урогенитального трихомониаза основывается на обнаружении висследуемом материале Trichomonas vaginalis. Диагноз не может быть поставленисключительно на основании клинической картины, т.к. симптомы, характерные длятрихомониаза встречаются только у 2 % пациентов. Ещё в 1980 году были представленырезультаты, свидетельствующие о том, что если диагноз трихомоноза устанавливать толькона основании клинической картины, то 88 % инфицированных Trichomonas vaginalis женщинбудет дан ложноотрицательный результат, а у 29 % неинфицированных диагноз был быпоставлен ошибочно (3). В связи с тем, что клинические симптомы зачастую не отражаютреальной картины заболевания, для диагноза трихомонадной инфекции необходимоприменение лабораторных методов диагностики, которые включают микроскопические,культуральные, серологические и молекулярно-биологические исследования.

В настоящее время существуют следующие лабораторные методы исследования TrichomonasVaginalis (5-8) (Табл.1).

Диагностическийтест

Технология Времяанализа

Чувст-вительность(%)

Специ-фич-ность(%)

Комментарии

Микроскопия Визуализацияс использова-нием микро-скопа.Применяютнативный илиокрашенныйметиленовымсиним или поРомановскому-Гимза,Лейшманупрепарат.

минуты 55-65 100 Субъективизм данногометода проявляется впрепаратах из очагапоражения ("гнойныймазок"), который содер-жит огромное количест-во клеток эпителия,лейкоцитов и различно-го деструктивного мате-риала. В очагепоражения влагалищнаятрихомонада часто пред-ставлена округлымиформами, напоминаю-щими полиморфноядер-ные лейкоциты, поэтомутипичные морфологи-ческие признаки теряют-ся во время фиксации иокрашивания, создаваятрудность для иден-тификации. При иссле-довании мазковложноотрицательные ре-зультаты могут иметьместо с частотойпорядка 25%. Методтребует высокойквалификации исполни-теля.

Культуральныйметод «золотойстандарт»

Культураль-ные среды:СКДС, СГДС,СДС199, средаДжонсона-Трасселя,средаДаймонд,средаКупфербергSTS, средаКупфербергDifco, средаInPouch TV,среда TYM.

5-7суток

75 100 Ограничения, присущие всем культуральным методам: - длительный срок выполнения; - трудности сохранения жизнеспособности трихомонад во время транспортировки.

Серологическиеметоды

Используются следующие

часыТрихомонадная инфек-

методы: реакции агглютинации,связывания комплемента (РСК), реакция непрямой иммунофюо-ресценции (РНИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), ускоренная реакция иммунофлюо-ресценции (РИФ-40).

ция не приводит к раз-витию выраженного гу-морального ответа и им-мунитета. Антитела мо-гут не выявляться либо из-за того, что диагно-стическая система мало-чувствительна для вы-явления их низкого уровня, либо потому, чтововсе не был вызван гуморальный ответ. Антитрихомонадные антитела IgG могут циркулировать в сыво-ротке крови до года пос-ле успешного курса ле-чения, при этом они не обеспечивают имму-нитета. С помощью определения антител не возможно дифференци-ровать течение болезни от реконвалесценции. Насегодняшний день не рекомендуется исполь-зовать для диагностики трихомонадной инфек-ции серологические методы в связи с тем, что существующие на-боры не обладают достаточной чувстви-тельностью, позволяю-щей осуществлять ка-чественную диагности-ку трихомониаза.

Микробиологический метод

Определениеферментатив-ной активнос-ти трихомо-над.

Метод основан на спо-собности трихомонадразлагать глюкозу, маль-тозу, крахмал и гликогенс образованием кислотыи газа. Исследование неполучило широкогораспространения, по-скольку фермента-тивная активность уро-генитальных трихо-монад оказалась весьмавариабельной. Данныйметод рассматриваетсякак исторический.

OSOM BV BLUE Быстрый тест. 10 мин 82-95 97-100 Метод основан на

TM Point of Care. увеличении активностисиалидазы и измененииокрашивания среды сисследуемым образцом.

Полимеразнаяцепная реакция

Методполимеразнойцепнойреакции

часы 83-92 98 Сравнительный анализ эффективности приме-нения различных ва-риантов ПЦР для диаг-ностики Trichomonas vaginalis показал, что только один из пяти праймеров срабатывал «положительно» на культуре трихомонад (4).С разной частотой при использовании ПЦР имеют место ложно-отрицательные резуль-таты, что связано с тех-ническими погрешнос-тями ( недостаточная очистка ДНК-мишени, вариабельность генома-мишени T. Vaginalis). Применение метода ПЦРоправдано при диагностике латентного течения трихомониаза, для выявления Тrihomonas.vaginalis примикст-инфекции уроге-нитального тракта, при скрининговых исследо-ваниях в комплексе с микроскопическим ме-тодом, а также для контроля качества мик-роскопического иссле-дования.

APTIMATrichomonasvaginalis Assay

Реакциятранскрип-ционнойамплификации(NASBA-Nucleic acidsequence-basedamplification)

часы 95-100 95-100 Качественный тест амп-лификации нуклеиновыхкислот для обнаружениярибосомальной РНКтрихомонады с исполь-зованием системыPANTER. Тест имеетвысокие показателидиагностической чувст-вительности не толькопо сравнению с мето-дами микроскопии икультурального посева,но и в сравнении с ПЦР.Была показана

возможность с помощьюметода NASBAоценивать наличие жиз-неспособных микроор-ганизмов в образце впроцессе и после тера-пии.

BD AffirmTM VPIII Визуальнаярегистрацияизмененияцвета реакции.

45 мин 92,8 99,9 Использование компле-ментарных последова-тельностей ДНК, кото-рые связываются толькос целевыми нуклеиновы-ми кислотами микро-организма.Метод одобрен FDA.

BD Probe TecTM

TrihomonasVaginalis

Одновремен-ная ампли-фикация и де-текция целе-вой ДНК сиспользова-нием ампли-фикационныхпраймеров ифлуоресцеин-меченной про-бы.

Часы 92-98 98 Метод амплификацииДНК для качественногообнаружения TrihomonasVaginalis на анализатореViperTM System.

Табл.1. Характеристика лабораторных методов для обнаружения Trihomonas Vaginalis.

Из всех методов, которые используются в настоящее время для лабораторного обнаруженияTrihomonas Vaginalis культуральный метод является «золотым стандартом». Однако он неполучил широкого распространения в клинической практике в связи с тем, что длядиагностики необходим инкубационный период от 5 до 7 дней, (вплоть до 11-17 суток, т.к.длительность цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от посевной дозы)являющийся слишком длительным из-за возможности распространения инфекцииинфицированным пациентом. Одним из запатентованных культуральных методов дляобнаружения Trihomonas Vaginalis стала разработка метода пластикового конверта InPouchTV компанией BioMed Diagnostics Inc., USA с помощью которого можно выполнить какнемедленную проверку, так и сохранить культуру для дальнейшего исследования. Тест-система InPouch TV - это двухкамерный мешок, позволяющий выполнять быструю проверкукультуры путём микроскопии через стенку мешка. В Англии в 1997 г было проведеносравнительное исследование чувствительности питательных сред InPouch TV, Diamond иДжонсона-Трасселя. В 4 мл каждой из трех сред добавляли по 30 мкл инокулюма. Результатоценивали на первые, вторые и четвертые сутки. Было показано, что наибольшейчувствительностью обладает питательная среда InPouch TV (87 %) по сравнению с Diamond(60 %) и Джонсона-Трасселя (57 %).

Тест-система In-PouchTM TV (BioMed Diagnostics Inc., USA).Для обнаружения Trichomonas vaginalis как у мужчин, так и у женщин культуральнымметодом («золотой стандарт») была разработана тест-система In-PouchTM TV, котораяотличается высокой надежностью и экономичностью (9-14). Тест-система In-PouchTM TVсодержит высоко селективную питательную среду для Т. Vaginalis, способствующую раннемувыявлению инфекции и выявляющую меньшее число микроорганизмов по сравнению с

другими селективными питательными средами. Это означает, что пациент получаетнеобходимое лечение намного быстрее. Данная тест-система является уникальной длятранспортировки. Выращивание культуры и приготовление нативного мазка сочетаются водной процедуре. (Рис.4).

Рис.4. Набор In-PouchTM TV (BioMed Diagnostics Inc., USA).Тест-система In-PouchTM TV включает в себя защитный барьер в виде пластикового тест-пакета, устойчивого к проникновению кислорода, состоящего из двух камер (полостей) V-образной формы, которые соединены между собой узким проходом. Двухкамерная системапозволяет производить непосредственное наблюдение за только что отобранными образцамив верхней камере до попадания инокулята в нижнюю камеру, где происходит инкубациякультуры (т.е трихомонаду можно определить сразу во взятом материале при наличиидостаточного количества подвижных жгутиковых форм) (Рис.5).

Рис.5. Общий вид тест-системы In-pouch TV.

Питательная среда тест-системы In-PouchTM содержит следующие компоненты: пептоны,мальтозу и другие сахара, аминокислоты, дрожжевой экстракт, антигрибковые иантибактериальные агенты в фосфатном буфере, основой которого являетсяфизиологический раствор.Процедура выполнения теста.1. Инокуляция. Извлечь из набора тест-систему In-PouchTM . Расправить мешочек во избежании загибов.Убедиться в том, что жидкая среда, содержащаяся в верхней камере, находится ниже уровня

ленты покрытия во избежании случайного пролива жидкости во время вскрытия тест-системы. Разорвать тест-пакет вдоль линии метки, расположенной над покрытием. Раскрытьтест-пакет таким образом, чтобы можно было ввести тампон, раздвинув в стороны петли,расположенные в средней части ленты покрытия. Вставить тампон с образцом в жидкостьверхней камеры тест-пакета. Аккуратно экстрагировать образец из тампона, сжимая егомежду стенками верхней камеры, после чего поместить тампон в контейнер длябиологически опасных материалов (Рис.6).

Рис.6. Процесс инокуляции образца.

При проведении инокуляции осадка мочи (1-2 капли мочи), осадок можно инокулировать втест-систему с помощью одноразовой стеклянной стерильной пипетки. Появление пузырьковв процессе инокуляции должно быть сведено к минимуму.

2. Срочная интерпретация результатов микроскопического исследования (нативныйпрепарат). Сжать закрытый тест-пакет, отогнуть верхний край вниз и трижды скатать. Затянутьпроволочные концы петель, расположенных на ленте, с тем, чтобы зажать скатанный участок.Поместить верхнюю камеру тест-пакета на возвышенную платформу микроскопа,расположив пакет таким образом, чтобы нижняя часть верхней камеры оказалась нанесколько миллиметров выше нижней границы зажима. Закрыть и зафиксировать зажим надмешочком. Мешочек следует рассматривать с верхней стороны зажима микроскопа.Произвести наблюдение под микроскопом под малым увеличением (100 х). Использоватьбольшее увеличение (200-400 х) в случаях, когда требуется подтверждение (Рис.7).

Рис.7. Инокуляция образца и микроскопирование.

3. Концентрация образцовКлеточный материал можно концентрировать, если подержать мешочек в вертикальномположении не менее 15 мин перед микроскопией. Обычно трихомонады концентрируются в

нижней части камеры. Произвести микроскопическое исследование с целью обнаруженияподвижных организмов.

4. Культивирование и интерпретация результатов микроскопического исследования.Быстро переместить содержимое из верхней камеры мешочка в нижнюю камеру. Скатыватьтест-пакет сверху вниз до тех пор, пока лента не займет положение сверху этикетки. Загнутьпроволочные концы петелек на ленте, чтобы зажать скатанный участок. Выполнение данногодействия способствует поддержанию анаэробных условий культивирования. Инкубироватьтест-пакеты в вертикальном положении при температуре +370 С в течение 18-24 часов. Перединтерпретацией результатов надавить пакет о край стола снизу вверх (5 раз), чтобыперемешать содержимое. Поместить нижнюю часть нижней камеры на возвышеннуюплатформу открытого зажима микроскопа, затем закрыть и зафиксировать зажим над тест-пакетом. Исследовать под микроскопом при малом увеличением (100 х). Произвестиежедневную оценку результатов исследования с целью обнаружения подвижных трихомонадна протяжении 5-7 дней. Не принимать ошибочное движение коричневой массы мельчайшихчастиц побочных веществ (продуктов распада клеток) за проявление активности трихомонад.ИнтерпретацияИнокулят, содержащий от 1 до 10 подвижных организмов считается достаточным дляподтверждения положительного результата анализа.Преимущества Тест-система In-PouchTM TV:- может использоваться в амбулаторных условия, в кабинете врача;- возможность обнаружения Trihomonas vaginalis в урогенитальных соскобах, осадке мочи,эякуляте, вагинальном отделяемом, цервикальной слизи; - тест является менее трудоемким благодаря сочетанию двух процедур в одном тесте;- тест способен обнаруживать единичные трихомонады;- высокоселективная среда ингибирует рост других микроорганизмов, кроме Trihomonasvaginalis, что существенно облегчает интерпретацию результатов;- безопасность в использовании. Нет необходимости в окрашивании и приготовлении мазковпри работе с нативной Trihomonas vaginalis. Среда с патогенным биологическим материаломполностью остается в изолированном пакете, тем самым предотвращая прямой контакт сбиологически опасным материалом;- удобство хранения и транспортировки. Компактная, небьющаяся упаковка, не требующаяжестких температурных режимов хранения;- срок годности набора 1 год с момента производства, Таким образом, используя Тест-система In-PouchTM TV можно получить возможностьиспользовать культуральную бактериологичскую диагностику в условиях обычнойлаборатории.

ЛИТЕРАТУРА1. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data. Global incidence and prevalence of selectedcurable sexually transmitted infections - 2008. 1.Sexually transmitted diseases - epidemiology.2.Chlamydia trachomatis. 3.Neisseria gonorrhoeae 4.Syphilis.5.Trichomonas vaginalis.2. WHO Global strategy for the prevention and control of sexually transmitted infections: 2006–2015:breaking the chain of transmission, 2007.3. Fouts A., Kraus S. Trichomonas vaginalis: reevaluation of its clinical presentation and laboratory diagnosis // J. Infect. Dis. - 1980. - Vol. 141. - P.137 - 143.4. Crusitti T, Van Dyck E, Fbdellati S, Lada M.Trichomonasvaginalis. Comparison of PCRtechniques for the diagnosis of Trichomonasvaginalis //Inst for Tropical Medicine,Anverp, Belgium. IntJSTD&AIDS 2001.5. Briselden AM. J Clin Microbiol. 1994; Demeo LR. Am J Obstet Gynecol. 1996; 6. Huppert JS. J Clin Microbiol. 2005; Nye MB. Am J Obstet Gynecol. 2009; 7. Van Der Pol B. J Clin Microbiol. 2006. 8. Van Der Pol; Schwebke; Taylor: Posters STI & AIDS, 20139. Borchardt, K.A. and Smith, R.F. (1991).An evaluations of an inpouch TV culture method fordiagnosis Trichomonas vaginalis infection, Gentourin.Med.;67:49-52.10. Borchardt,K. A. ;AL-Haraci, S. and Maida,N.(1995). Prevalence of Trichomonas vaginalis inamal sexually transmitted disease clinic by interview, wet mount microscopy and In-Pouch TV culture ,Genitrourin. Med.;11:405-406.11. Borchardt,K.A.; Zhang,M.Z.; Shing,H. and Flink,k.(1997). A comparison of the sensitivityof the In-Pouch TV, Diamond's, and Trichosel media for detection of Trichomonasvaginalis, Genitourin Med.; 73:297-29812. Draper D, et al., Detection of T. vaginalis in pregnant women with the InPouch TV culture system, J Clinical. Microbiology. 1993;31:1016-1018. 13. Borchardt KA, et al. A Clinical Evaluation of Trichomoniasis in San Jose, Costa Rica using the InPouch TV test. Genitourin Med. 1992;68:328-330. 14. Barenfanger J, et al., Timing ad inoculation of the pouch makes no difference in increased detection of T. vaginalis by the InPouch™ Method. J Clinical Microbiology. 2002;40:1387-9.