HMG‐CoA Reductase Inhibitor Simvastatin Mitigates VEGF‐Induced  “Inside‐Out” Signaling to Extracellular Matrix by Preventing RhoA Activation 

Hanshi Xu1, Lixia Zeng1, Hui Peng1, Sheldon Chen1, Jonathan Jones2, Teng‐Leong Chew2, Mehran M. Sadeghi3, Yashpal S. Kanwar4, and Farhad R. Danesh1

 1Division of Nephrology/Hypertension, 2Dept. of Cell and Molecular Biology, 

Feinberg School of Medicine, Chicago, IL, 3Division of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 4Dept. of Pathology, Northwestern University, Chicago, IL.  

Running title: VEGF‐induced inside‐out signaling  

Address correspondence: Farhad R. Danesh, M.D. Feinberg School of Medicine Northwestern University 303 E. Chicago Avenue Searle Building 10‐440 Chicago, IL 60611 Tel: 312‐5034753 e‐mail: f‐rahimi@northwestern.edu 

1

Page 1 of 40Articles in PresS. Am J Physiol Renal Physiol (June 13, 2006). doi:10.1152/ajprenal.00092.2006

Copyright © 2006 by the American Physiological Society.

ABSTRACT

The 3‐hydroxy‐3‐methylglutaryl coenzyme A (HMG‐CoA) reductase inhibitors exert 

modulatory  effects  on  a  number  of  cell  signaling  cascades  by  preventing  the 

synthesis  of  various  isoprenoids  derived  from  the  mevalonate  pathway.  In  the 

present  study,  we  describe  a  novel  pleiotropic  effect  of  HMG‐CoA  reductase 

inhibitors, also  commonly known as  statins, on vascular  endothelial growth  factor 

(VEGF)‐induced type IV collagen accumulation. VEGF is an angiogenic polypeptide 

that  is  also  known  to  play  a  central  role  in  endothelial  cell  permeability  and 

differentiation. Recently, VEGF has also been  implicated  in promoting extracellular 

matrix (ECM) accumulation, although the precise signaling mechanism that mediates 

VEGF‐induced  ECM  expansion  remains  poorly  characterized.  Elucidation  of  the 

mechanisms  through which VEGF exerts  its effect on ECM  is clearly a prerequisite 

for  both  understanding  the  complex  biology  of  this molecule  as well  as  targeting 

VEGF  in  several  pathological  processes.  To  this  end,  this  study  explored  the 

underlying  molecular  mechanisms  mediating  VEGF‐induced  ECM  expansion  in 

mesangial cells. Our findings show that VEGF stimulation elicits a robust increase in 

ECM accumulation  that  involves RhoA activation, an  intact actin cytoskeleton, and 

β1  integrin  activation.  Our  data  also  indicate  that  simvastatin,  via  mevalonate 

depletion,  reverses  VEGF‐induced  ECM  accumulation  by  preventing  RhoA 

activation.  

Key words: HMG‐CoA reductase inhibitor, extracellular matrix, VEGF, focal 

adhesion, mevalonate 

2

Page 2 of 40

INTRODUCTION 

Many of the cells in tissues are embedded in an extracellular matrix (ECM) that 

provides not only scaffolding support for the cell, but it also presents environmental 

cues to the cell which affect ultimately many aspects of a cell’s fate, including its 

proliferation, differentiation, motility, and death. In the kidneys, the mesangial cells 

are embedded in mesangial matrix, a basement membrane‐like PAS‐positive ECM. 

The mesangial matrix, although composed of the same protein macromolecules as 

the glomerular basement membrane, is more coarsely fibrillar and less electron dense 

than the latter. Despite the importance of mesangial matrix in health and disease, 

little is known regarding the cross‐talk between mesangial cells and mesangial 

matrix and the signaling events that contribute to mesangial ECM expansion at the 

present time. For instance, expansion of the mesangial matrix is considered to be a 

major hallmark of diabetic nephropathy (23, 26). However, the signaling events that 

mediate mesangial matrix expansion in the diabetic milieu remain controversial. 

Interestingly, a number of recent observations have suggested that the vascular 

endothelial growth factor (VEGF), a multifunctional cytokine, may play a central role 

in the pathogenesis of microvascular complications of diabetes including diabetic 

nephropathy through its modulatory effects on ECM (5, 8, 9, 28, 40, 45). Therefore, in 

the current study, we explored the underlying molecular mechanisms of VEGF‐

induced ECM expansion in mesangial cells. In particular, we tested the role of RhoA 

activation in actin cytoskeletal remodeling leading to aberrant ECM synthesis and 

accumulation.    

3

Page 3 of 40

The guanine nucleotide‐binding protein Rho family, consisting of Rho, Rac, and 

Cdc42, are 20‐ to 40‐kD monomeric G proteins that can cycle between two inter‐

convertible forms: GDP‐bound (inactive) and GTP‐bound (active) states (34, 46). 

Several growth factors can promote the exchange of GDP to GTP on Rho proteins 

resulting in membrane translocation and activation of GTP‐bound Rho proteins. The 

Rho family of small GTPases are involved in a number of essential biological 

activities of the cell including actin stress fiber formation, cell motility, and cell 

aggregation (1, 37). More recently, Rho GTPases have also emerged as key regulators 

in the regulation of integrin‐mediated signaling (4, 11, 12).  

Integrins are heterodimeric transmembrane molecules that consist of α and β 

subunits. The main ligands for integrins are extracellular matrix adhesive proteins 

and cellular counter‐receptors. High‐affinity ligand binding requires that integrins to 

become activated by undergoing conformational changes regulated by “inside‐out” 

signaling. In turn, integrin ligation triggers “outside‐in” signaling that regulate, 

among many other functions, gene regulation and cell motility (13, 14, 18, 42, 44). 

Integrin β subunit cytoplasmic domains are required for integrin activation, whereas 

α cytoplasmic domain usually plays a regulatory role. Once integrins are activated, 

one of the earliest changes initiated by their activation is tyrosin phosphorylation of 

proteins such as talin, paxilin, and the cytosolic focal adhesion kinase (FAK) (31, 38). 

FAK phosphorylation is considered to be a critical step in the integrin‐mediated 

signaling events. In this study, we report a critical role for β1 integrin activation and 

FAK phosphorylation in VEGF signaling to ECM. 

4

Page 4 of 40

A growing body of evidence is suggesting that HMG‐CoA reductase inhibitors 

(statins), by inhibiting mevalonate (MEV) biosynthesis, may also exert modulatory 

effects on several signaling pathways beyond their cholesterol‐lowering properties 

(27, 36, 47). For instance, we and others have previously provided evidence that some 

of the beneficial effects of statins in the diabetic milieu may be mediated through 

their modulatory effects on several signaling pathways (6, 7, 55). In the present study, 

we extend our previous observations and describe the underlying signaling 

mechanism through which VEGF leads to increased type IV collagen accumulation 

in mesangial cells. We also explored the effect of mevalonate depletion by using 

simvastatin (SMV), a hydrophobic statin, on VEGF‐induced signaling pathway. 

 

 

 

5

Page 5 of 40

MATERIALS & METHODS 

Reagents and antibodies 

Recombinant rat VEGF165 was obtained from R&D Systems (Minneapolis, MN). 

DMEM/F12, FBS, and PBS were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA). 

Mevalonate (MEV) was purchased from Sigma Chemicals (St. Louis, MO). Rho A 

Activation Assay Kit was obtained from Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). 

Rho A antibody was purchased from Santa Cruz (Santa Cruz, CA). The monoclonal 

anti‐β1 integrin subunit (active conformation) antibody, clone HUTS‐4, and function‐

blocking monoclonal mouse anti‐β1 integrin antibody were purchased from 

Chemicon Inc. (Temecula, CA). The monoclonal anti‐β1 integrin subunit (active 

conformation) antibody, clone HUTS‐21 was purchased from (BD PharMingen, San 

Diego, CA) and Collagen IV antibody was from Novus Biologicals (Littleton, CO), 

and cytochalasin D was obtained from Sigma Chemicals (ST. Louis, MO). Rhodamine 

phalloidin was purchased from Molecular Probes (Eugene, OR). SMV was kindly 

provided by Merck & Co, Inc. (West Point, PA). Both SMV and MEV were chemically 

activated as described previously (6, 7, 55).  

Cell Culture and transfection 

Early passaged (3‐10th passage) rat glomerular mesangial cells (6, 7, 55) were grown 

in DMEM/F12 medium containing 10% FBS, 100 U/ml penicillin, and 100 μg/ml 

streptomycin in a humidified incubator at 37°C under 5% CO2. Transfections of RhoA 

mutants were performed as described previously (6, 7, 55). Briefly, in transfection 

studies, cells were grown to 50%‐‐60% confluence and then transfected with 1 μg of 

6

Page 6 of 40

fusion plasmid DNA using LipofectAMINE Reagent according to the manufacturer’s 

protocol (Invitrogen). Subsequently, the transfected colonies were grown in growth 

medium containing 800  μg/ml G418 until the cells achieve ~70% confluence. 

Plasmids containing wild type RhoA (pcDNA3 RhoA) and dominant negative RhoA 

construct (pcDNA3 RhoA N17) were generous gifts of Dr. Jacob Sznajder 

(Northwestern University, Chicago, IL). In transfection studies, control experiments 

were performed using lipofectAMINE alone as an additional control group. 

Rho A activity pull‐down assay 

RhoA activity was measured by a pull‐down assay according to the instructions by 

the manufacturer (Rho Activity Assay Kit, Upstate Biotechnology). Briefly, 107 cells 

were grown in 100‐mm dishes, washed in ice‐cold PBS twice, and lysed in ice‐cold 

MLB buffer (25 mM HEPES [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% NP‐40, 10 mM MgCl2, 1.0 

mM EDTA, and 2 % glycerol).The samples were centrifuged and incubated for 45 

min at 4°C with 10 μl of rhotekin agarose to precipitate GTP‐bound Rho. Precipitated 

complexes were washed three times in MLB buffer and resuspended in 30 μl of 2 x 

Laemmli buffer. Total and precipitates were analyzed by performing SDS‐PAGE and 

Western blot analysis using monoclonal anti‐RhoA antibody at a dilution of 1:500. 

Confocal laser scanning fluorescence microscopy 

MCs were grown on glass coverslips. The cells were fixed with 3% 

paraformaldehyde and permeabilized with 0.2% Triton X‐100 in PBS for 10 min at 

room temperature. The cells were incubated with anti‐phospho‐FAK antibody for 1 h 

at room temperature, and then incubated with FITC‐conjugated secondary antibody 

7

Page 7 of 40

(Zymed Laboratories, San Francisco, CA). To detect F‐actin, cells were incubated 

with rhodamine phalloidin (1:100) for 30 m at 37°C after fixation and 

permeabilization. The coverslips were mounted on glass slides with antifade 

mounting media (Molecular Probes) and examined using a confocal fluorescence 

microscope (Zeiss LSM510, Thornwood, NY). 

Flow‐cytometric analysis 

Near‐confluent growth‐arrested mesangial cells were pre‐treated with simvastatin or 

vehicle control for 12‐18 hrs, after which VEGF (50 ng/ml) was added to the medium. 

At the end of the indicated times, cells were harvested by HyQTase® (Hyclone, 

Logan, UT) in their culture media and washed twice with 1X DPBS without Ca+2 and 

Mg+2 (400 X g, 5 min, room temperature). Mesangial ells were then resuspended, and 

fixed with 3.7% formaldehyde. Cells were then incubated with total anti‐integrin 

antibody (Chemicon), monoclonal anti‐β1 integrin subunit (active conformation) 

antibodies, clones HUTS‐21 (BD Pharmingen) and HUTS‐4 (Chemicon), in blocking 

buffer (2% goat serum in DPBS without Ca+2 and Mg+2) for 45 min on ice. Cells were 

then incubated with secondary antibodies on ice for 45 min. Flow‐cytometric analysis 

was performed using a Beckman Coulter EPICS®XL‐MCL (Becton Dickinson, CA).   

[3H]‐proline incorporation 

The collagen synthesis was examined by [3H]‐proline incorporation. For these 

experiments, 5x104 cells/well were seeded in 24‐well plates in DMEM/F12 medium 

containing 10% FBS. At confluence, cells were starved with serum‐free medium for 

48 hrs, and then the cells were exposed to various concentrations of VEGF in the 

8

Page 8 of 40

presence or absence of SMV for 24 hrs. 2 μCi of [3H]‐proline (Amersham, Piscataway, 

NJ) and ascorbic acid (50 μg/ml) were added to each well for the last 12 h of 

incubation. The cells were washed twice with ice‐cold PBS, precipitated twice with 

ice‐cold 10% TCA (Sigma), solubilized in 2ml 0.2N NaOH containing 0.1% Triton X‐

100. The samples were taken to liquid scintillation counting. Additional cells seeded 

in parallel were scraped off the plate to detect the protein concentration. Proline 

incorporation was expressed as counts per minute (cpm)/μg protein.  

Western Blotting 

For each experiment, a total of 5x105 cells were seeded, and at subconfluence (~70%), 

cells were made quiescent for 48 h. Cells were rinsed twice with ice‐cold PBS and 

added 0.5 ml of the ice‐cold lysis buffer [50 mM Tris Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 100 

μg/ml PMSF, 0.1% SDS, 1% Nonidet P‐40 (NP‐40), 0.5% sodium deoxycholate, 10 

μg/ml aprotinin, 2 μg/ml leupeptin, 10 mM EDTA], incubated for 20 min on ice, and 

then were scraped and centrifuged. Protein concentrations were determined by the 

BCA protein assay (Pierce, Rockford, IL), and then separated by SDS‐polyacrylamide 

gel electrophoresis and transferred to nitrocellulose membranes. The membranes 

were probed with primary antibodies diluted in TBS‐T containing 5% nonfat milk at 

4°C overnight. The membranes were incubated with the appropriate secondary 

antibodies for 1 h at room temperature. Immunoreactive bands were visualized by 

enhanced chemiluminescence (ECL) reaction. Each blot is representative of at least 

three similar independent experiments. 

For detection of occupied β1 integrins, cells were plated on collagen‐coated slides 

9

Page 9 of 40

prior to VEGF stimulation. Cells were incubated with HUTS‐21 or HUTS‐4 

antibodies for 30 min at 370. Cells were rinsed with PBS, lysed in SDS sample buffer 

and bound antibody was detected by Western blot analysis.   

Statistical analyses 

Data are expressed as mean±SEM. ANOVA with a Student‐Newman‐Keuls test was 

used to evaluate differences between two or more different experimental groups. A 

value of p≤0.05 was considered significant. 

10

Page 10 of 40

RESULTS 

Effects of VEGF and SMV on cell‐associated collagen synthesis 

VEGF‐induced cell‐associated collagen synthesis in mesangial cells (MC) was 

measured by [3H]‐proline incorporation. Serum‐starved cultured rat MCs were 

exposed to incremental concentrations of VEGF for 24 hrs. As shown in Figure 1, 

VEGF stimulation caused a significant increase in [3H]‐proline incorporation in a 

dose‐dependent manner. Co‐treatment of cells with SMV (1 μM) prevented VEGF‐

induced (50 ng/ml) increase in [3H]‐proline uptake. Addition of MEV (300 μM) 

reversed the effect of SMV on [3H]‐proline incorporation indicating that the 

inhibitory effect of SMV on VEGF‐induced [3H]‐proline incorporation was MEV‐

dependent. We next tested whether the inhibitory effect of SMV on VEGF signaling 

was mediated by isoprenoids derived from the mevalonate pathway. To this end, 

VEGF‐stimulated MCs were incubated with SMV (1 μM) and co‐treated with either 

geranyl geranyl pyrophosphate (GGPP) or squalene (SQ), two important isoprenoids 

derived from the mevalonate pathway. GGPP was used since post‐translational 

modification of GGPP is negatively affected by statin‐mediated inhibition of HMG‐

CoA reductase. We also investigated the effect of SQ, an immediate precursor of 

cholesterol, to test whether the inhibitory effect of SMV on VEGF signaling is 

independent of cholesterol biosynthesis. The data on figure 1 show that co‐treatment 

of cells with GGPP but not with SQ reversed the inhibitory effect of SMV, suggesting 

that the modulatory effect of statins on VEGF signaling is geranyl geranyl‐dependent 

but independent of cholesterol synthesis since co‐treatment of cells with SQ failed to 

11

Page 11 of 40

reverse the effect of SMV. Taken together, these findings indicate that the inhibitory 

effect of SMV on VEGF signaling is MEV and geranyl geranyl‐dependent. 

We next examined the effect of VEGF and SMV on type IV collagen protein levels by 

Western blot analysis. As shown in Figure 2, cells exposed to incremental 

concentrations of VEGF exhibited significant increase in type IV collagen protein 

levels. Co‐treatment of VEGF‐stimulated cells with SMV (1 μM) abrogated the effect 

of VEGF (50 ng/ml) on cell‐layer collagen type IV protein levels.  The inhibitory effect 

of SMV was reversed when cells were co‐treated with MEV (300 μM).  

Effects of VEGF and SMV on RhoA activity 

We have recently reported that SMV modulates the activation of the Rho family of 

small GTPases in the diabetic milieu (6, 7, 55). To decipher whether RhoA, a member 

of the Rho family of small GTPases, mediates VEGF‐induced collagen accumulation, 

MCs were exposed to VEGF (50 ng/ml), and RhoA activity was measured by an 

affinity pull‐down assay using GST fusion protein rhotekin, which recognizes only 

the active form of RhoA (GTP‐RhoA). VEGF stimulation significantly increased RhoA 

activity in MCs after 20 min (Figure 3). To examine the effect of SMV on VEGF‐

induced RhoA activity, cells stimulated with VEGF were co‐treated with SMV (1 μM). 

As shown in figure 3, co‐treatment of VEGF‐stimulated cells with SMV inhibited 

VEGF‐induced increase in RhoA activity without significantly changing total RhoA 

protein levels. The inhibitory effect of SMV on RhoA activity was reversed when cells 

were co‐treated with MEV (300 μM), indicating that the effect of SMV on VEGF‐

induced RhoA activation was MEV‐dependent.  

12

Page 12 of 40

To establish a link between RhoA activation and VEGF‐induced type IV collagen 

protein levels, MCs were transfected with dominant‐negative mutant (N17RhoA) 

and wild‐type (wt) RhoA. The data in Figure 4 show that VEGF (50 ng/ml) 

stimulation failed to increase cell‐layer collagen IV protein levels in dominant 

negative RhoA transfected cells, indicating a critical role for RhoA activation in 

VEGF‐induced collagen synthesis. 

Effects of VEGF and SMV on the actin cytoskeleton remodeling 

To examine whether VEGF signaling in MCs involves actin cytoskeleton remodeling 

and to elucidate the modulatory effect of SMV on VEGF‐induced cytoskeletal 

remodeling, MCs were incubated with VEGF (50 ng/ml) for 30 min in the presence or 

absence of SMV (1 μM) and the actin cytoskeleton was visualized by rhodamine 

phalloidin staining using scanning confocal electron microscopy. MCs treated with 

VEGF exhibited a significant increase in actin stress fiber formation (Figure 5‐b). 

Upon treatment with SMV (1 μM), the density of stress fibers was significantly 

decreased (Figure 5‐c). Because RhoA is one of the major regulator of actin stress 

fiber formation, we further examined whether RhoA mediates VEGF‐induced stress 

fiber formation. As shown in Figure 5‐d, MCs transfected with dominant negative 

RhoA also showed a significant reduction in VEGF‐induced density of stress fibers, 

indicating that VEGF‐induced actin stress fiber formation was mediated by a RhoA‐

dependent pathway. 

 

13

Page 13 of 40

Effects of VEGF and SMV on tyrosine phosphorylation of focal adhesion 

kinase 

Focal adhesion kinase (FAK), a cytoplasmic protein tyrosine kinase, binds directly to 

the cytoplasmic domain of β1 integrin subunits and plays an important role in the 

integrin‐mediated  signaling pathway (31, 38). To examine the potential involvement 

of FAK phosphorylation in VEGF‐induced signaling, we performed laser scanning 

confocal immunofluorescent microcopy using anti‐phosphorylated FAK (Tyr397) 

antibody. MCs stimulated with VEGF (50 ng/ml) exhibited a significant increase in 

FAK Tyr397 phosphorylation (Figure 6). However, in cells co‐treated with SMV (1 

μM), VEGF‐induced FAK phosphorylation was significantly reduced (Figure 6‐c). 

MCs transfected with dominant negative mutant of RhoA also showed a significant 

decrease in VEGF‐induced FAK phosphorylation (Figure 6‐d) indicating the central 

role of RhoA in VEGF‐induced FAK phosphorylation.  

We also assessed VEGF‐induced total and phosphorylated FAK protein expression 

by Western blot analysis. Whereas VEGF stimulation (50 ng/ml) significantly 

increased phospho‐FAK protein levels, SMV (1 μM) and MCs transfected with 

N17RhoA exhibited significantly lower protein levels of phospho‐FAK. Total FAK 

protein levels were unchanged as shown in Figure 7. Thus, our data indicate that 

VEGF signaling pathway involves FAK phosphorylation, and RhoA mediates VEGF‐

induced FAK phosphorylation.  

For determining whether actin cytoskeleton and FAK phosphorylation are involved 

in VEGF‐induced cell‐associated collagen synthesis, MCs were treated with 

14

Page 14 of 40

cytochalasin D (Cyto D, 1.0 μg/ml). Cyto D, a specific inhibitor of filament actin 

cytoskeleton, has also been shown to abolish FAK phosphorylation (25). As shown in 

Figure 8, VEGF (50 ng/ml) stimulation did not increase the levels of cell‐layer 

collagen type IV in MCs treated with Cyto D, indicating that VEGF‐induced actin 

cytoskeleton reorganization is necessary for VEGF‐induced collagen synthesis. 

Effects of VEGF and SMV on VEGF‐induced β1 integrin activation 

Growing evidence has indicated that β1 integrins mediate growth factor‐dependent 

expansion of ECM in MCs (23, 26). However, whether VEGF‐induced mesangial 

matrix expansion is also mediated by β1 integrin activation and whether RhoA 

activation is necessary for VEGF‐induced β1 integrin activation have not yet been 

explored. Accordingly, we examined the effect of VEGF and SMV on β1 integrin 

activation. Integrins can switch between active and inactive conformations. In the 

inactive state, integrins have a low affinity for ligands. Intracellular signaling events 

such as protein kinase C stimulation can prime the integrins, which result in a 

conformational change that makes the extracellular domain competent for ligand 

binding by exposing the ligand‐binding site. To address the effect of VEGF and SMV 

on β1 integrin activation, serum‐starved MCs were stimulated with VEGF (50 ng/ml) 

and β1 integrin activation was detected by flow cytometry using an antibody (HUTS‐

21) specific for the active conformation of β1 integrin (16, 25, 41, 48). The data 

obtained from flow cytometry in figure 9‐a show that VEGF clearly enhances the 

expression of activated β1 integrins in MCs. The results in figure 9‐a further show 

that SMV ameliorates activation of β1 integrins by VEGF. To test if SMV also 

15

Page 15 of 40

modulates total β1 integrin levels, MCs were stimulated with VEGF (50 ng/ml) and 

total β1 integrin levels were analyzed. The results of flow cytometry indicate that 

VEGF stimulation increased both the total and activated β1 integrin. However, SMV 

only prevented conformational activation of β1 integrin without significantly altering 

total β1 integrin levels (Figure 9‐b).  

To further explore the role of RhoA activation and to examine the effects of VEGF 

and SMV on β1 integrin‐ligand binding, MCs were plated on collagen‐coated slides 

prior to VEGF (50 ng/ml) stimulation. Cells were incubated with HUTS‐21 or HUTS‐4 

antibodies, which specifically recognize the expression of the active conformation of 

β1 integrins, for 30 min at 370. Cells were then lysed in SDS sample buffer and bound 

antibody was detected by Western blot analysis as previously described (48). The 

results in figure 9‐c indicate that stimulation of MCs with VEGF caused a significant 

increase in binding of HUTS‐4 as well as HUTS‐21 (data not shown). Co‐treatment of 

cells with SMV (1 μM) inhibited VEGF‐induced increase in β1 integrin activation. The 

inhibitory effect of SMV was reversed when the cells were co‐treated with MEV (300 

μM). The data in figure 9‐c also indicate that RhoA activation is necessary to 

stimulate β1 integrin activation since VEGF stimulation failed to activate β1 integrin 

in MCs transfected with a dominant negative mutant of RhoA, N17RhoA, indicating 

that VEGF‐induced β1 integrin activation is mediated by a RhoA‐dependent 

pathway. This experiment also provides strong evidence for the proposed VEGF‐

induced “inside‐out” signaling pathway since our data indicate that RhoA activation 

is necessary prior to β1 integrin activation.   

16

Page 16 of 40

To further ascertain that β1 integrin activation is necessary for VEGF‐induced 

collagen synthesis, MCs were treated with a monoclonal function‐blocking anti‐β1 

integrin antibody (20 μg/ml) and stimulated with VEGF (50 ng/ml). As shown in 

Figure 10, VEGF stimulation did not increase the protein levels of cell‐layer collagen 

type IV in MCs when β1 integrin activation was blocked, indicating that β1 integrin 

activation is necessary for VEGF‐induced cell‐layer collagen synthesis. 

17

Page 17 of 40

DISCUSSION 

This study describes the signaling events that are responsible for VEGF‐induced 

collagen IV accumulation in MCs. Our data suggest that VEGF triggers an inside‐out 

signaling pathway in MCs which is characterized by RhoA activation, actin 

cytoskeleton remodeling, intracellular FAK phosphorylation, and β1 integrin 

activation leading to increased type IV collagen synthesis. Thus, the results of the 

present study provide a missing piece of the mechanistic puzzle concerning VEGF‐

induced mesangial matrix expansion. Furthermore, our data also provide strong 

evidence that SMV, by preventing RhoA activation, inhibits VEGF signaling pathway 

and enhanced collagen synthesis in MCs.  

Statins are commonly used drugs in the treatment of patients with 

hypercholesterolemia that have been suggested to exert significant pleiotropic effects 

on cell signaling pathways largely by preventing mevalonic acid biosynthesis (27, 36, 

47, 50, 51) . Mevalonate is necessary for the posttranslational lipid modification 

(isoprenylation) of small GTPase proteins, a process essential for the proper 

translocation of Rho GTPases from the cytosol to the membrane where activation of 

these proteins takes place (3, 15, 43). Previous studies from our laboratory and others 

have indicated that statins modulate several cellular processes by preventing 

prenylation of small Rho GTPases such as RhoA and Rac1 (6, 7, 20, 27, 29, 36, 49, 55). 

In support of a modulatory effect of statins on ECM accumulation, Kim et al. 

reported that lovastatin inhibited high glucose‐induced overexpression of fibronectin 

(20). Similarly, Nishimura et al. showed that pravastatin prevented serum‐induced 

18

Page 18 of 40

type IV collagen secretion (29). The data presented in this study are consistent with 

these previous results by establishing the inhibitory effects of statins on ECM 

expansion. In addition, we have clearly characterized the sequential activation of 

various components of VEGF‐induced signaling pathway in the current study and 

identified the modulatory effect of HMG‐CoA reductase inhibitors and mevalonate 

depletion on VEGF signaling. 

To decipher VEGF signaling, we initially explored the role of RhoA activation on 

VEGF‐induced signaling pathway in MCs. We showed that RhoA activity is required 

for VEGF‐induced collagen synthesis since MCs transfected with dominant negative 

RhoA mutant failed to increase cell‐layer type IV collagen protein levels in response 

to VEGF. Co‐treatment of MCs with SMV also inhibited VEGF‐induced collagen 

accumulation by preventing RhoA activation. Addition of MEV reversed the 

inhibitory effect of SMV on VEGF‐induced RhoA activity and collagen accumulation, 

indicating that the effect of SMV on VEGF‐induced collagen accumulation was MEV‐

dependent. Taken together, our data suggest that RhoA mediates VEGF‐induced 

collagen synthesis; and SMV inhibits VEGF signaling to ECM by preventing RhoA 

inactivation.   

The list of cellular events instigated by actin cytoskeletal reorganization is rapidly 

growing. For instance, Hubchak et al. showed that TGF β1‐induced collagen 

accumulation is associated with cytoskeleton reorganization (17). Moreover, Cyto D, 

an inhibitor of actin cytoskeletal assembly, has been previously reported to disrupt 

the formation of fibronectin networks (30, 54). In this study, we report that VEGF 

19

Page 19 of 40

induces actin cytoskeletal rearrangement in MCs, and disruption of actin 

cytoskeleton with Cyto D reduces VEGF‐stimulated collagen type IV synthesis. 

Furthermore, our data indicate that VEGF‐induced actin cytoskeletal remodeling is 

mediated by RhoA activation which leads to ß1 integrin activation. Thus, the results 

of this study show that actin cytoskeletal remodeling, regulated by RhoA activation, 

is required for VEGF‐induced collagen synthesis.  

Integrins, a group of heterodimeric transmembrane receptors, play a pivotal role in 

ECM assembly and cell‐ECM interactions (32, 35). A critical role of integrins is to 

provide a link between ECM and the cytoskeleton, whereby ECM ligand‐integrins 

interactions can activate intracellular signaling transduction cascades resulting in 

enhanced gene expression, and cellular differentiation (“outside‐in” signaling) (13, 

42). Interestingly, several recent studies have indicated that signals from within the 

cells can also propagate through integrins and regulate ECM remodeling through an, 

as yet, incompletely understood mechanism termed “inside‐out” signaling (14, 18, 

19, 39, 44). Activation of integrins through inside‐out signaling seems to be mediated 

by increased affinity and/or avidity state of integrins (44). The affinity state of 

integrin is regulated by its conformational changes induced by a number of signaling 

pathways or proteins that interact with the cytoplasmic domains of the integrins. 

Structural studies suggest that modulation of integrin affinity involves changes in the 

spatial relationship of the cytoplasmic and/or transmembrane domains of the α and ß 

subunits (52). The ß cytoplasmic domain is critical for recruitment of integrins to 

focal contacts since its truncation/mutation impairs this process (33). Several 

20

Page 20 of 40

previous studies have suggested a central role for β1 integrin activation in mesangial 

matrix accumulation (21, 22, 24). In this study, we assessed the contribution of β1 

integrin activation on VEGF signaling to ECM. Our data indicate that VEGF 

stimulation significantly increases β1 integrins activity. Moreover, the results of this 

study suggest that SMV inhibits increased affinity of β1 integrins via a MEV‐

dependent pathway. Thus, the data presented in this study provides strong evidence 

indicating that β1 integrins activation is required for VEGF‐induced collagen 

synthesis since a specific β1 integrin blocker prevented increased protein levels of 

cell‐layer collagen type IV. Our study also provides the first evidence that VEGF‐

induced activation of β1 integrins in MCs is mediated by RhoA activation because 

VEGF stimulation failed to increase β1 integrin activity in cells transfected with 

dominant negative mutant of RhoA. Furthermore, our data clearly demonstrate that 

RhoA activation precedes β1 integrin activation consistent with an inside‐out 

signaling. This adds to the growing body of evidence of the importance of RhoA 

activation in inside‐out signaling. 

Several cytoplasmic proteins including talin, α‐actin, and FAK bind to the β1 

cytoplasmic domain of integrins and contribute to integrin‐cytoskeletal interactions 

(2, 10, 31, 38, 53). However, earlier studies on integrin‐dependent cell adhesion and 

signaling demonstrated that integrin clustering could also trigger increased tyrosine 

phosphorylation of a120 kD tyrosine kinase known as FAK (2, 10, 53). FAK activation 

as demonstrated by an increase in phosphorylation on Tyr397 is an integral 

component of the integrin signaling pathway (10, 53). In order to explore whether 

21

Page 21 of 40

FAK phosphorylation was involved in VEGF‐induced signaling pathway, we 

examined the effect of VEGF and SMV on FAK phosphorylation. The data presented 

in this study suggest that FAK phosphorylation is involved in the inside‐out VEGF‐

dependent signaling by transmitting RhoA activation and actin cytoskeletal cues to 

ECM leading ultimately to collagen accumulation. Our data indicate that VEGF 

stimulation increased FAK Tyr397 phosphorylation, and FAK phosphorylation was 

inhibited by SMV. We also showed that VEGF failed to increase FAK 

phosphorylation in MCs transfected with dominant negative mutant of RhoA. Thus, 

our results suggest that VEGF, via a RhoA‐dependent pathway, mediates tyrosine 

phosphorylation of FAK. 

In conclusion, we have demonstrated that VEGF‐induced collagen accumulation 

involves several mediators that include activation of small GTPase protein, RhoA, 

reorganization of the actin cytoskeleton, FAK phosphorylation and activation of β1 

integrins. Based on these data, we propose an inside‐out signaling model for VEGF‐

induced mesangial matrix expansion. This model provides several novel targets in 

the therapeutic approach to the abnormal mesangial matrix expansion observed in 

the diabetic milieu. Our study also provides a new rationale to the use of statins, 

independent of their cholesterol‐lowering properties, in the early stages of DN. 

ACKNOWLEDGEMENT:  

This  study  was  supported  by  grants  from  the  National  Institutes  of  Health (DK67604 and DK064106), and American Diabetes Association (1‐03‐RA‐15). 

22

Page 22 of 40

REFERENCES 

 1. Burridge K, Wennerberg, K. Rho and Rac take center stage. Cell 116: 167-179, 2004. 2. Calderwood DA, Zent R, Grant R, Rees DJG, Hynes RO, and Ginsberg MH. The Talin Head Domain Binds to Integrin beta Subunit Cytoplasmic Tails and Regulates Integrin Activation. J Biol Chem 274: 28071-28074, 1999. 3. Casey PJ. Protein lipidation in cell signaling. Science 268:: 221-225, 1995. 4. Clark EA, King, W.G., Brugge, J.S., Symons, M., Hynes, R.O. Integrin-mediated Signals Regulated by members of the Rho Family of GTPases. J Cell Biol 142: 573-586, 1998. 5. Cooper ME, Vranes, D., Youssef, S., Stacke, S.A. Cox, A.J., Rizkalla, B., Casley, D.J., Bach, L.A., Kelly, D.J., Gilbert, R.E. Increased renal expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors in experimental diabetes. Diabetes 48: 2229-2239, 1993. 6. Danesh FR, Sadeghi MM, Amro N, Philips C, Zeng L, Lin S, Sahai A, and Kanwar YS. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase inhibitors prevent high glucose-induced proliferation of mesangial cells via modulation of Rho GTPase/ p21 signaling pathway: Implications for diabetic nephropathy. PNAS 99: 8301-8305, 2002. 7. Danesh FR and Y.S. K. Modulatory effects of HMG-CoA reductase inhibitors in diabetic microangiopathy. FASEB J 18: 805-815, 2004. 8. de Vriese AS, Tilton, R.G., Elger, M., Stephan, C.C., Kriz, W., Lameire, N.H. Antibodies against vascular endothelial growth factor improve early renal dysfunction in experimental diabetes. J Am Soc Nephrol 12: 993-1000, 2001. 9. Flyvbjerg A, Dagnes-Hansen, F., Flyvbjerg, A., Dagnaes-Hansen, F., De Vriese, A.S., Schrijvers, B.F., Tilton, R.G., Rasch, R. Amelioration of long-term renal changes in obese type 2 diabetic mice by a neutralizing vascular endothelial growth factor antibody. Diabetes 51, 2002. 10. Frisch S, Vuori K, Ruoslahti E, and Chan-Hui P. Control of adhesion-dependent cell survival by focal adhesion kinase. J Cell Biol 134: 793-799, 1996. 11. Fukata M, Nakagawa M, Kuroda S, and Kaibuchi K. Cell adhesion and Rho small GTPases. J Cell Sci 112: 4491-4500, 1999. 12. Geiger B, Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K.M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix-cytoskeleton crosstalk. Nat Rev Mol Cell Biol 2:: 793-805, 2001. 13. Giancotti FG and Ruoslahti E. Integrin Signaling. Science 285: 1028-1033, 1999. 14. Ginsberg M, Partridge A, and Shattil S. Integrin regulation. Curr Opin Cell Biol 17: 509-516, 2005. 15. Goldstein J and Brown M. Regulation of the mevalonate pathway. Nature 343: 425-430, 1990. 16. Gomez M, Luque, A., del Pozo, M.A., Hogg, N., Sanchez-Madrid, F., Cabanas, C. Functional relevance during lymphocyte migration and cellular localization of activated beta1 integrins. Eur J Immunol 27: 8-16, 1997. 17. Hubchak SC, Runyan CE, Kreisberg JI, and Schnaper HW. Cytoskeletal Rearrangement and Signal Transduction in TGF-{beta}1-Stimulated Mesangial Cell Collagen Accumulation. J Am Soc Nephrol 14: 1969-1980, 2003. 18. Hughes P and Pfaff M. Integrin affinity modulation. Trends Cell Biol 8: 359-364, 1998. 19. Hynes R. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell 110: 673-687, 2002.

23

Page 23 of 40

20. IL KIM S, HAN DC, and LEE HB. Lovastatin Inhibits Transforming Growth Factor-{beta}1 Expression in Diabetic Rat Glomeruli and Cultured Rat Mesangial Cells. J Am Soc Nephrol 11: 80-87, 2000. 21. Jin D, Fish A, Wayner E, Mauer M, Setty S, Tsilibary E, and Kim Y. Distribution of integrin subunits in human diabetic kidneys. J Am Soc Nephrol 7: 2636-2645, 1996. 22. Kagami S, Border W, Ruoslahti E, and Noble N. Coordinated expression of beta 1 integrins and transforming growth factor-beta-induced matrix proteins in glomerulonephritis. Lab Invest 69: 68-76, 1993. 23. Kanwar YS, Wada, J., Lin, S., Danesh, F.R., Chugh, S.S., Yang, Q., Banerjee, T., Lomasney, J.W. Update of extracellular matrix, its receptors, and cell adhesion molecules in mammalian nephrogenesis. Am J Physiol Renal Physiol 286: F202-215, 2004. 24. Kuhara T, Kagami S, and Kuroda Y. Expression of beta 1-integrins on activated mesangial cells in human glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 8: 1679-1687, 1997. 25. Luque A, Gómez M, Puzon W, Takada Y, Sánchez-Madrid F, and Cabañas C. Activated Conformations of Very Late Activation Integrins Detected by a Group of Antibodies (HUTS) Specific for a Novel Regulatory Region(355-425) of the Common beta1 Chain. J Biol Chem 271: 11067-11075, 1996. 26. Mason RM, Wahab, N.A. Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol 14: 1358-1373, 2003. 27. McFarlane SI, Muniyappa R, Francisco R, and Sowers JR. Pleiotropic Effects of Statins: Lipid Reduction and Beyond. J Clin Endocrinol Metab 87: 1451-1458, 2002. 28. Neufeld G, Cohen, T., Gengrinovitch, S., Poltorak, Z. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB J 13, 1999. 29. Nishimura M, Tanaka T, Yasuda T, Kurakata S, Kitagawa M, Yamada K, Saito Y, and Hirai A. Collagen secretion and growth of mesangial cells require geranylgeranylpyrophosphate. Kidney Int 55: 520-528, 1999. 30. Ohashi T, Kiehart, D.P., Erickson, H.P. Dual labeling of the fibronectin matrix and actin cytoskeleton with green fluorescent protein variants. J Cell Sci 115: 1221-1229, 1997. 31. Parsons JT. Focal adhesion kinase: the first ten years. J Cell Sci 116: 1409-1416, 2003. 32. Pedchenko VK, Chetyrkin SV, Chuang P, Ham A-JL, Saleem MA, Mathieson PW, Hudson BG, and Voziyan PA. Mechanism of Perturbation of Integrin-Mediated Cell-Matrix Interactions by Reactive Carbonyl Compounds and Its Implication for Pathogenesis of Diabetic Nephropathy. Diabetes 54: 2952-2960, 2005. 33. Reszka A, Hayashi Y, and Horwitz A. Identification of amino acid sequences in the integrin beta 1 cytoplasmic domain implicated in cytoskeletal association. J Cell Biol 117: 1321-1330, 1992. 34. Ridley AJ, Hall, A. The small GTP-binding protein Rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell 70: 389-400, 1992. 35. Ruoslahti E and Engvall E. Integrins and Vascular Extracellular Matrix Assembly. J Clin Invest 99: 1149-1152, 1997. 36. Sadeghi MM, Collinge M, Pardi R, and Bender JR. Simvastatin Modulates Cytokine-Mediated Endothelial Cell Adhesion Molecule Induction: Involvement of an Inhibitory G Protein. J Immunol 165: 2712-2718, 2000. 37. Sahai E, Marshall, C.J. RHO-GTPases and cancer. Nat Rev Cancer 2: 133-142, 2002.

24

Page 24 of 40

38. Schaller M. Biochemical signals and biological responses elicited by the focal adhesion kinase. Biochim Biophys Acta 1540: 1-21, 2001. 39. Schoenwaelder S and Burridge K. Bidirectional signaling between the cytoskeleton and integrins. Curr Opin Cell Biol 11: 274-286, 1999. 40. Schrijvers BF, Flyvbjerg A., De Vriese, A.S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney Int 65: 2003-2017, 2004. 41. Schwartz M. Integrin signaling revisited. Trends Cell Biol 11: 466-470, 2001. 42. Schwartz M, Schaller M, and Ginsberg M. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annu Rev Cell Dev Biol 11: 549-599, 1995. 43. Scit G, Tenca, P., Frittoli, E. Signaling from Ras to Rac and beyond: Not just a matter of GEFs. EMBO J 19: 2393-2398, 2000. 44. Shimaoka M, Takagi J, and Springer T. Conformational regulation of integrin structure and function. Annu Rev Biophys Biomol Struct 31: 485-516, 2002. 45. Sugimoto H, Hamano, Y., Charytan, D., Cosgrove, D., Kieran, M., Sudhakar, A., Kalluri, R. Neutralization of circulating vascular endothelial growth factor (VEGF) by anti-VEGF antibodies and soluble VEGF receptor 1 (sFlt-1) induces proteinuria. J Biol Chem 278: 12605-12608, 2003. 46. Takai Y, Sasaki, T., Matozaki, T. (2001) . Small GTP-binding proteins. Physiol Rev 81: 153-208, 2001. 47. Takemoto M and Liao JK. Pleiotropic Effects of 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase Inhibitors. Arterioscler Thromb Vasc Biol 21: 1712-1719, 2001. 48. Tzima E, del Pozo M, Shattil S, Chien S, and Schwartz M. Activation of integrins in endothelial cells by fluid shear stress mediates Rho-dependent cytoskeletal alignment. EMBO J 20: 4639-4647, 2001. 49. Usui H, Shikata K, Matsuda M, Okada S, Ogawa D, Yamashita T, Hida K, Satoh M, Wada J, and Makino H. HMG-CoA reductase inhibitor ameliorates diabetic nephropathy by its pleiotropic effects in rats. Nephrol Dial Transplant 18: 265-272, 2003. 50. Vincent L, Albanese P, Bompais H, Uzan G, Vannier J, Steg P, Soria J, and Soria C. Insights in the molecular mechanisms of the anti-angiogenic effect of an inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Thromb Haemost 89: 530-537, 2003. 51. Vincent L, Soria C, Mirshahi F, Opolon P, Mishal Z, Vannier J-P, Soria J, and Hong L. Cerivastatin, an Inhibitor of 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase, Inhibits Endothelial Cell Proliferation Induced by Angiogenic Factors In Vitro and Angiogenesis in In Vivo Model Arterioscler Thromb Vasc Biol 22: 623-629, 2002. 52. Vinogradova O, Haas T, Plow EF, and Qin J. A structural basis for integrin activation by the cytoplasmic tail of the alpha IIb-subunit. PNAS 97: 1450-1455, 2000. 53. Wozniak MA, Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P.J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochim Biophys Acta 1692: 103-119, 2004. 54. Wu C, Keivens V, O'Toole T, McDonald J, and Ginsberg M. Integrin activation and cytoskeletal interaction are essential for the assembly of a fibronectin matrix. Cell 83: 715-724, 1995. 55. Zeng L, Xu H, Chew T-L, Chisholm R, Sadeghi MM, Kanwar YS, and Danesh FR. Simvastatin Modulates Angiotensin II Signaling Pathway by Preventing Rac1-Mediated Upregulation of p27. J Am Soc Nephrol 15: 1711-1720, 2004.

25

Page 25 of 40

FIGURE LEGENDS 

Figure 1: Graph illustrating the effects of VEGF and SMV on [3H]‐proline 

incorporation. MCs were exposed to various concentrations of VEGF for 24 hrs. [3H]‐

proline incorporation was measured as previously described in Materials & Methods. 

The amount of [3H]‐proline incorporation was measured in a scintillation counter 

and corrected for the cellular protein content. The results are expressed as 

percentages of the control and the mean±SE of three independent experiments. 

*p<0.05, **p<0.01 vs. control. SMV: simvastatin, MEV: mevalonate, GGPP: geranyl 

geranyl pyrophosphate, SQ: squalene. 

Figure 2: (a) The protein levels of cell‐layer type IV collagen were assessed by 

Western blot analysis. Cells exposed to incremental concentrations of VEGF exhibited 

significant increase in cell‐layer collagen type IV protein levels. Co‐treatment of 

VEGF‐stimulated cells with SMV abrogated the effect of VEGF on cell‐layer collagen 

type IV protein levels, and addition of MEV reversed the inhibitory effect of SMV. (b) 

Densitometric analysis of cell‐associated type IV collagen synthesis (n=3, *p<0.05 vs. 

control) 

Figure 3: (a) RhoA‐GTP was pulled down using the fusion protein GST‐RBD, and 

samples were then subjected to Western blot analysis using a monoclonal anti‐RhoA 

antibody. RhoA activity significantly increased in cells exposed to VEGF (50 ng/ml) 

for 20 minutes. Co‐treatment of VEGF‐stimulated cells with SMV significantly 

attenuated the effect of VEGF on RhoA activity, and the addition of MEV reversed 

26

Page 26 of 40

the inhibitory effect of SMV. (b) Densitometric analysis of GTP‐RhoA (n=3, *p<0.05 vs. 

control) 

Figure 4: (a) MCs were transfected with wild type (wt), and dominant negative 

mutants of RhoA (N19RhoA). Exposure to VEGF (50 ng/ml) in N19RhoA transfected 

cells caused a significant reduction in VEGF‐induced collagen IV protein levels. 

However, VEGF stimulation in transfected MCs with wtRhoA did not significantly 

alter type IV collagen protein levels. (b) Densitometric analysis (n=4, *p<0.05 vs. 

control) 

Figure 5: Confocal microscopy of the actin cytoskeleton network in MCs. Panel a: 

Control cells. Panel b: MCs exposed to VEGF exhibited significant stress fiber 

formation. However, in cells co‐treated with SMV (Panel c) as well as in dominant 

negative RhoA‐transfected cells (Panel d), VEGF stimulation failed to induce actin 

cytoskeletal remodeling and significant stress fiber formation. The figure is 

representative of 3 separate experiments. 

Figure 6: FAK‐phosphorylation (Tyr397) was evaluated by laser scanning confocal 

immunofluorescent microcopy. Panel a: Control cells. Panel b: MCs stimulated with 

VEGF exhibited significant increase in FAK tyrosine phosphorylation. However, co‐

treatment of cells with SMV prevented VEGF‐induced FAK phosphorylation (Panel 

c). MCs transfected with N19RhoA also showed a significant decrease in VEGF‐

induced FAK phosphorylation (Panel d).  

Figure 7: (a) VEGF‐induced total and phosphorylated FAK protein levels were 

27

Page 27 of 40

assessed by Western blot analysis. VEGF stimulation significantly increased 

phospho‐FAK protein levels. Cells co‐treated with SMV and MCs transfected with 

N17RhoA exhibited significant decrease in phospho‐FAK in response to VEGF. 

However, total FAK protein levels were unchanged. (b) Densitometric analysis (n=3, 

*p<0.05 vs. control) 

Figure 8: Effect of cytochalasin D (cyto D) on cell‐layer collagen IV protein levels. 

Cells were treated with either DMSO as control or 1.0 μg/ml of cyto D. VEGF (50 

ng/ml) stimulation failed to increase collagen type IV protein levels in MCs treated 

with Cyto D. The figure is representative of 3 separate experiments. 

Figure 9: (a) Flow‐cytometric analysis of the active conformation of β1 integrin 

activity in MCs. Flow cytometry was performed by using HUTS‐21, an antibody 

specific for the active conformation of β1 integrin. Mean fluorescence intensity (±SE) 

are calculated from three independent experiments (*p<0.05 vs. control unstimulated 

cells). (b) Flow‐cytometric analysis of the total β1 integrin levels. Taken together, 

these data show that VEGF (50 ng/ml) caused a significant increase in both β1 

integrin activity and the total β1 integrin levels, and SMV reversed the β1 integrin 

activation without significantly changing the total β1 integrin levels (**p<0.001 vs. 

control unstimulated cells). (c) Quantification of integrin‐ligand occupancy when 

cells were incubated with HUTS‐4 antibody. Bound antibody was assessed by 

Western blotting. VEGF stimulation failed to increase β1 integrin activity in cells co‐

treated with SMV and in cells transfected with N17RhoA. (d) Densitometric analysis 

28

Page 28 of 40

(n=3, *p<0.05 vs. control) 

Figure 10: (a) β1 integrin activation was blocked by a functional blocking antibody. 

MCs were treated with either IgG as control or with anti‐β1 functional blocking 

antibody. MCs stimulated with VEGF failed to increase cell‐layer collagen type IV 

protein levels when β1 integrin activation was blocked as well as in cells treated with 

SMV. (b) Densitometric analysis (n=3, *p<0.05 vs. control) 

29

Page 29 of 40

Figure 1: Graph illustrating the effects of VEGF and SMV on [3H]-proline incorporation. MCs were exposed to various concentrations of VEGF for 24 hrs. [3H]-proline

incorporation was measured as previously described in Materials & Methods. The amount of [3H]-proline incorporation was measured in a scintillation counter and corrected for

the cellular protein content. The results are expressed as percentages of the control and the mean±SE of three independent experiments. *p 0.05, **p 0.01 vs. control. SMV:

simvastatin, MEV: mevalonate, GGPP: geranyl geranyl pyrophosphate, SQ: squalene.

Page 30 of 40

Figure 2: (a) The protein levels of cell-layer type IV collagen were assessed by Western blot analysis. Cells exposed to incremental concentrations of VEGF exhibited significant increase in cell-layer collagen type IV protein levels. Co-treatment of VEGF-stimulated

cells with SMV abrogated the effect of VEGF on cell-layer collagen type IV protein levels, and addition of MEV reversed the inhibitory effect of SMV. (b) Densitometric analysis of

cell-associated type IV collagen synthesis (n=3, *p 0.05 vs. control)

Page 31 of 40

Figure 3: (a) RhoA-GTP was pulled down using the fusion protein GST-RBD, and samples were then subjected to Western blot analysis using a monoclonal anti-RhoA antibody.

RhoA activity significantly increased in cells exposed to VEGF (50 ng/ml) for 20 minutes. Co-treatment of VEGF-stimulated cells with SMV significantly attenuated the effect of

VEGF on RhoA activity, and the addition of MEV reversed the inhibitory effect of SMV. (b) Densitometric analysis of GTP-RhoA (n=3, *p 0.05 vs. control)

Page 32 of 40

Figure 4: (a) MCs were transfected with wild type (wt), and dominant negative mutants of RhoA (N19RhoA). Exposure to VEGF (50 ng/ml) in N19RhoA transfected cells caused a

significant reduction in VEGF-induced collagen IV protein levels. However, VEGF stimulation in transfected MCs with wtRhoA did not significantly alter type IV collagen

protein levels. (b) Densitometric analysis (n=4, *p0.05 vs. control)

Page 33 of 40

Figure 5: Confocal microscopy of the actin cytoskeleton network in MCs. Panel a: Control cells. Panel b: MCs exposed to VEGF exhibited significant stress fiber formation. However, in cells co-treated with SMV (Panel c) as well as in dominant negative RhoA-transfected

cells (Panel d), VEGF stimulation failed to induce actin cytoskeletal remodeling and significant stress fiber formation. The figure is representative of 3 separate experiments.

Page 34 of 40

Figure 6: FAK-phosphorylation (Tyr397) was evaluated by laser scanning confocal immunofluorescent microcopy. Panel a: Control cells. Panel b: MCs stimulated with VEGF exhibited significant increase in FAK tyrosine phosphorylation. However, co-treatment of cells with SMV prevented VEGF-induced FAK phosphorylation (Panel c). MCs transfected with N19RhoA also showed a significant decrease in VEGF-induced FAK phosphorylation

(Panel d).

Page 35 of 40

Figure 7: (a) VEGF-induced total and phosphorylated FAK protein levels were assessed by Western blot analysis. VEGF stimulation significantly increased phospho-FAK protein

levels. Cells co-treated with SMV and MCs transfected with N17RhoA exhibited significant decrease in phospho-FAK in response to VEGF. However, total FAK protein levels were

unchanged. (b) Densitometric analysis (n=3, *p 0.05 vs. control)

Page 36 of 40

Figure 8: Effect of cytochalasin D (cyto D) on cell-layer collagen IV protein levels. Cells were treated with either DMSO as control or 1.0 µg/ml of cyto D. VEGF (50 ng/ml)

stimulation failed to increase collagen type IV protein levels in MCs treated with Cyto D. The figure is representative of 3 separate experiments.

Page 37 of 40

Figure 9: (a) Flow-cytometric analysis of the active conformation of 1 integrin activity in MCs. Flow cytometry was performed by using HUTS-21, an antibody specific for the active conformation of 1 integrin. Mean fluorescence intensity (±SE) are calculated

from three independent experiments (*p 0.05 vs. control unstimulated cells). (b) Flow-cytometric analysis of the total 1 integrin levels. Taken together, these data show that VEGF (50 ng/ml) caused a significant increase in both 1 integrin activity and the total

1 integrin levels, and SMV reversed the 1 integrin activation without significantly changing the total 1 integrin levels (**p 0.001 vs. control unstimulated cells). (c)

Quantification of integrin-ligand occupancy when cells were incubated with HUTS-4 antibody. Bound antibody was assessed by Western blotting. VEGF stimulation failed to increase 1 integrin activity in cells co-treated with SMV and in cells transfected with

N17RhoA. (d) Densitometric analysis (n=3, *p 0.05 vs. control)

Page 38 of 40

Figure 10: (a) 1 integrin activation was blocked by a functional blocking antibody. MCs were treated with either IgG as control or with anti -1 functional blocking antibody. MCs stimulated with VEGF failed to increase cell-layer collagen type IV protein levels

when 1 integrin activation was blocked as well as in cells treated with SMV. (b) Densitometric analysis (n=3, *p 0.05 vs. control)1 integrin activation was blocked by a functional blocking antibody. MCs were treated with either IgG as control or with anti-

1 functional blocking antibody. MCs stimulated with VEGF failed to increase cell-layer collagen type IV protein levels when 1 integrin activation was blocked as well as in

cells treated with SMV. (b) Densitometric analysis (n=3, *p 0.05 vs. control)

Page 39 of 40

Page 40 of 40