10
Shinji Matsuda, Thomas Launey, Sumiko Mikawa and Hirokazu Hirai 1 Laboratory for Memory and Learning, RIKEN Brain Science Institute, 2-1 Hirosawa, Wako, Saitama 351-0198, Japan 1 Corresponding author e-mail: [email protected] Cerebellar long-term depression (LTD) is thought to play an important role in certain types of motor learn- ing. However, the molecular mechanisms underlying this event have not been clari®ed. Here, using cultured Purkinje cells, we show that stimulations inducing cerebellar LTD cause phosphorylation of Ser880 in the intracellular C-terminal domain of the AMPA receptor subunit GluR2. This phosphorylation is accompanied by both a reduction in the af®nity of GluR2 to glutamate receptor interacting protein (GRIP), a molecule known to be critical for AMPA receptor clustering, and a signi®cant disruption of postsynaptic GluR2 clusters. Moreover, GluR2 protein released from GRIP is shown to be interna- lized. These results suggest that the dissociation of postsynaptic GluR2 clusters and subsequent internali- zation of the receptor protein, initiated by the phos- phorylation of Ser880, are the mechanisms underlying the induction of cerebellar LTD. Keywords: AMPA receptor/cluster/GluR2/LTD/Purkinje cell Introduction Ionotropic glutamate receptors mediate fast excitatory synaptic transmission in the vertebrate central nervous system and have been implicated in neuronal development and synaptic plasticity, including learning and memory (Ito, 1989; McDonald and Johnston, 1990; Bliss and Collingridge, 1993). Based on pharmacological and mol- ecular biological studies, glutamate receptors are classi®ed into four distinct subfamilies: a-amino-3-hydroxy-5- methyl-4-isoxazole propionic acid (AMPA) receptors (subunits GluR1±4), kainate receptors (GluR5±7 and KA1±2), NMDA receptors (NR1 and NR2A±D) and d glutamate receptors (d1±2). AMPA receptors are tetramers composed of a combin- ation of the subunits GluR1±4, with their subunit stoichiometry depending on the expression level of the respective genes (Rosenmund et al., 1998) and, hence, differing between cell types. Cerebellar Purkinje neurons receive excitatory input from the granule cells; these synapses contain AMPA receptors with a high proportion of GluR2(/3) but few GluR1 subunits (Kano et al., 1996; Zhao et al., 1998). When Purkinje cells receive con- junctive inputs from parallel ®bers, axons of granule cells and climbing ®bers, i.e. axons of other afferent neurons in the inferior olive (Ito, 1989), neurotransmission at granule cell±Purkinje cell synapses exhibits a long-lasting depres- sion (long-term depression, LTD), which has been proposed to underlie several forms of motor learning (Thompson, 1986; Ito, 1989, 1990). Accumulating evi- dence has revealed that activation of protein kinase C (PKC) is essential for the induction of LTD (Crepel and Krupa, 1988; Ito, 1989; Ito and Karachot, 1989, 1990, 1992; Linden and Connor, 1991). Consequently, PKC- mediated phosphorylation of GluR2 (or GluR3), highly concentrated at the postsynaptic sites of Purkinje cell dendrites, has been hypothesized to play an important role in the induction of LTD by modulating AMPA receptor channel function. Recent studies have shown that the C-terminal region of glutamate receptor subunits constitutes the major intracellular domain of these transmembrane proteins (Hollmann et al., 1994; Bennet and Dingledine, 1995; Hirai et al., 1996). Based on this ®nding, we previously examined phosphorylation of the C-terminal domain of GluR2 and identi®ed Ser880 as the PKC phosphorylation site (Matsuda et al., 1999). Moreover, phosphorylation of Ser880 was found to prevent the C-terminus of GluR2 from binding to the glutamate receptor interacting protein (GRIP) both in vitro and in transfected human embryonic kidney (HEK) 293 cells (Matsuda et al., 1999). Since the interaction between GluR2 and GRIP is crucial for precise apposition of GluR2 to the postsynaptic membrane (Dong et al., 1997), phosphorylation of Ser880 in GluR2 affects GluR2 distribution and/or clustering in the postsynaptic membrane. We therefore proposed that cerebellar LTD might be caused by the disruption of postsynaptic AMPA receptor clusters that results from a loss of anchoring via GRIP. In the present study, we used cultured cerebellar Purkinje neurons to show that stimulations inducing LTD cause modulation of the postsynaptic GluR2 cluster density via PKC phosphorylation of Ser880. Our data provide strong evidence that cerebellar LTD results from a decrease in postsynaptic AMPA receptor density. Results Induction of LTD at granule cell±Purkinje cell synapses following PKC activation It has been shown that PKC activation by phorbol ester can induce LTD of glutamate responses of cultured Purkinje neurons (Linden and Connor, 1991). Since in these experiments glutamate was applied iontophoretically, we examined whether PKC activation could cause depression of synaptic transmission between granule cell axons and Purkinje cell dendrites. Excitatory postsynaptic current (EPSC) in a Purkinje cell was evoked by electrical stimulation of a single granule cell. As shown in Disruption of AMPA receptor GluR2 clusters following long-term depression induction in cerebellar Purkinje neurons The EMBO Journal Vol. 19 No. 12 pp. 2765±2774, 2000 ã European Molecular Biology Organization 2765

Disruption of AMPA receptor GluR2 clusters following long-term depression induction in cerebellar Purkinje neurons

  • Upload
    riken

  • View
    0

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

������ ����� ����� ������ ������ ������ ��� �������� ������

���������� �� ����� � � ���� � �� ����� ���� ���� �� � ����������� ������ �� !�"�� ������� #$��%�&'� (�)�

�*�����)� �� � ���+�������,- +����.)����� /��"� /��/0)

���������� ������ ��������� ����� �� ������ ������ � � ������ ���� � ������ ����� �� ���� ������� ������� ��� �������� ������ � ����������� ���� ���� �� ��� �����!��� ���� ��� ��������"��#�$� ����� �� ���� ���� ��� ������� ��������������� ��� ����� �������������� �� %��&&' ���� ������������ ����� ��� �� �� �� ��� ()"(�������� ������ *��+,� ���� �������������� ������ ����� �� ���� � �������� � ��� ��!��� ��*��+, �� ���� ��� �������� �������� �������*+-"� � ������� #�� �� �� �������� ��� ()"(�������� �������� �� � ���!��� ��������� ������������� *��+, ��������� )������� *��+,������ �������� ��� *+-" �� ���� �� �� ��������.��� ����� ������� ����� ���� ��� ����������� ������������� *��+, �������� �� �����/��� ��������.���� �� ��� �������� ������ �������� �� ��� ��������������� �� %��&&' ��� ��� ������ � ���������� ������� �� ���������� �����������- 121 ����)���3�,�����34,���3�5632��"� 0���,,

����������

�� ����)�� �,������� ����)���� ������� ��� �7���������� �)��� ��� ������� � �+� 8��������� �� ���, ��8��������� � � +�8� ��� ��),������ � ���� �, ��8�,�)�� �� � �� �)��� ),��������� � �,��� � ,��� � � � � ������9���� �&'&: �6� �,� � � (�+ ��� � �&&%: �,��� � �*�,,� ������� �&&#;/ ����� � )+������,�����, � � ��,����,�� ���,�����, �������� �,������� ����)���� ��� �,����<��� �� ��� ����� �� ������,���- ����� ��#�+����7��$����+�,�=����7�>�,� )��)�� �� ���� 9121; ����)����9���� ��� 4,���?=;� "�� ��� ����)���� 94,��$?@ � ��1�?�;� �61 ����)���� 9��� � � ���1?6; � � ��,������� ����)���� 9��?�;/121 ����)���� ��� ��������� ���)���� � � ����� �

���� � �+� ���� ��� 4,���?=� ��+ �+��� ���� �������+������� ��)� �� � � �+� �7)������ ,�8�, � �+����)����8� �� �� 9���� �� � � ��/� �&&'; � �� +� �������� � ��� �� ��,, ��)��/ *�����,,�� 2��"� 0� ���� ������8� �7�������� � )�� ��� �+� ��� �,� ��,,�: �+����� �)��� �� ��� 121 ����)���� ��+ � +��+ )��)����� � 4,���93#; ��� � 4,��� ���� ��� 9�� � � ��/� �&&A:B+�� � ��/� �&&';/ !+� 2��"� 0� ��,,� �����8� �� �0� ���8� � )��� ��� )���,,�, <����� �7� � � ��� �,� ��,,�

� � �,���� � <����� �/�/ �7� � � ��+�� ���� � ���� � � �+� � ����� �,�8� 9���� �&'&;� ������� ������� �� ��� �,���,,?2��"� 0� ��,, �� �)��� �7+����� � ,� ��,���� � ��)������� 9,� ������ ��)������ � �56;� +��+ +�� ��� )��)���� �� � ���,�� ��8���, ���� � ����� ,��� � �95+��)�� � �&'A: ���� �&'&� �&&%;/ 1�����,��� � �8���� �� +�� ��8��,�� �+�� ����8���� � )����� "� ��� *92�*; �� ���� ���, �� �+� � ������ � �56 9*��)�, � ����)�� �&'': ���� �&'&: ��� � � �����+��� �&'&� �&&%��&&�: �� �� � � *� ��� �&&�;/ *� ��C�� �,�� 2�*��������� )+��)+���,���� � 4,��� 9�� 4,��#;� +��+,��� �� ������ �� �+� )����� �)��� ����� � 2��"� 0� ��,,�� ������� +�� ��� +�)��+���>�� �� ),�� � ��)���� � ��,�� �+� � ������ � �56 �� ����,��� � 121 ����)����+� �, � ���� /���� � ������� +�8� �+� �+�� �+� *������ �, �����

� �,������� ����)��� ���� ��� �� �������� �+� ��0��� �����,,�,�� ����� � �+��� ��� ������� � )����� �9��,,�� � ��/� �&&=: �� �� � � 6� �,��� �� �&&$:����� � ��/� �&&A;/ ����� � �+�� < �� �� � )��8����,��7��� �� )+��)+���,���� � �+� *������ �, ����� �4,��� � � ��� ��<�� ���''% �� �+� 2�* )+��)+���,���� ���� 9������ � ��/� �&&&;/ ����8��� )+��)+���,���� ����''% �� �� � �� )��8� � �+� *������ �� � 4,������ �� �� � �� �+� �,������� ����)��� � ������� � )����� 94��2; ���+ � � �� � � � ��� ������ +��� ������ ��"�� �� 9���; �&# ��,,� 9������ � ��/� �&&&;/ �� �� �+�� �������� ��� �� 4,��� � � 4��2 �� ������, �� )�������))������ � 4,��� �� �+� )����� �)��� ������ � 96� �� ��/� �&&@;� )+��)+���,���� � ���''% � 4,��� �����4,��� ����������� � �3�� �,������ � � �+� )����� �)��������� �/ !� �+������ )��)���� �+�� ������,,�� �56���+� �� ������ �� �+� �����)��� � )����� �)��� 121����)��� �,������ �+�� ����,�� ��� � ,��� � � �+��� � 8��4��2/ � �+� )���� � ������ � ���� ��,����� ������,,��2��"� 0� ���� � �� �+� �+�� �����,���� � � ���� � �56����� ����,���� � �+� )����� �)��� 4,��� �,������� ���� 8�� 2�* )+��)+���,���� � ���''%/ D�� ����)��8��� ���� � �8��� �� �+�� ������,,�� �56 ����,�� ��� ��������� � )����� �)��� 121 ����)��� �� ����/

����

�������� �� �� ������� ������������� ������������ ������ ��� ����������� +�� ��� �+� �+�� 2�* ����8���� �� )+����, ����� �� � ���� �56 � �,������� ���)� ��� � ��,����� 2��"� 0� ���� � 9�� �� � � *� ��� �&&�;/ �� �� � �+����7)����� �� �,������� �� �)),��� �� ��)+�������,,�� ��7��� �� +��+�� 2�* ����8���� ���,� ����� ��)������ � �� �)��� ��� ������� ��� �� ��� �,� ��,, �7� � � �2��"� 0� ��,, �� ������/ �7�������� )����� �)��� ����� �9�2�*; � � 2��"� 0� ��,, �� �8�"�� �� �,�������,�����,���� � � �� �,� ��� �,� ��,,/ 1� �+� �

�������� � !�"! ������� #���$ ����� �������% ���%&��� �������� �������� ������'����� "������� ������

��� (�)* +������ ���� �� ��� � � �� ����� ���

�������� ��������� ������� �������� ��� ��

E����� �� ���+��)),������ � ������������ ��, )+����, �#�������� 9521; ,�� �� � ��� �<�� � �������� � �+� �2�*��),������ �� F=%G � ��� ����� �, ,�8�, ���� �% �� �������� �/ 5+�� � ������� �+�� 2�* ����8���� � ����� �56� �� �)��� ��� ������� ��� �� ��,����� ��� �,� ��,,�� � 2��"� 0� ��,,�/

��������� ���� �����!���� �� "#� $% �����H�� � +�����,����� �7)������ � � +�8� �+� )��8����,��+�� 2�* )+��)+���,���� ���''% � �+� *������ �, ����� � 4,���� � � �+�� �+�� )+��)+���,���� ������� �+��< ��� � �+� ����)��� �� �+� 4��2 ����� � �� ��� � �26B =?$ 9��� � ����� =�&?A@#; 94��2=�&?A@#; 9������� ��/� �&&&;� � ����� ���� ���, � � ��<��� � �� �� �� � ��4,��� 96� � � ��/� �&&@;/ 5+��� ����,�� ������� �+��)+��)+���,���� � ���''% � 4,��� ��� ����,��� �+�)����� �)��� ,���,�>���� � 121 ����)���� �� � +����� �4��2 �� �� �/ ����� � �7��� �� �+� ���� � ���''%)+��)+���,���� � �+� ��,,�,�� ,���,�>���� � 4,��� ���7)����� � 4,��� � � 4��2=�&?A@# � ��� ������ ��� �&#��,,�/ !+� ���+�� 4,��� ���� �� �� � ����������4��2=�&?A@# �� �7)������ �� �,� � ��� �&# ��,,���� ���, ��������)� ��8��,�� �+�� �+� ���� �������8�����)��� )����� �� �����,� ����������� � �+� ������,9E����� �1;� +����� �+�� � 4��2=�&?A@# ���������� � ����),����� ������,������ 9E����� ��;/ *���7)������ �4,��� ��+ 4��2=�&?A@# ������ �,������ � � �+� 4,���)����� �� �+� ����� � ���������� � 4��2=�&?A@#

9E����� �*;/ 5+�� ���,���,�>���� � 4,��� ��+4��2=�&?A@# �� )��8� ��� �)� ����8���� � � ���� ���2�* ��+ �%% 521 �� �% �� 9E����� �6;/ 5+� ����� 521 �� ���),���,� �,��"�� �� ����)),������ � ���,����8� 2�* � +������� 4E�%&�%#I 9�%% ; 9E�������;/ ����8��� ����������� � �+� ���''% ������� � 4,��� �� ��)������� +��+ �����"� )+��)+���,���� �)��8� ��� �+� ���,���,�>���� ��+ 4��2 9E����� �E;/5+��� ����,�� � ������ �+�� )+��)+���,���� � ���''%����,���� �+� �����,,�,�� ,���,�>���� � 4,��� �� �� ����,,� � ��� �� �� � �� 4��2/

��������� ����������� ���� �������� ��������� ���� ���������5+� 4,��� )����� � � 4��2 ��� " � �� ���,���,�>� � �+� �� ������ �)� �� � 2��"� 0� ��,,� 9!��>� �"� � ��/��&&': ������� � ��/� �&&&;/ D �+� ��+�� +� �� ���� �������+�����, �7��� ���� ��+ � ���4,��� ������� �,� � � ����� �)��)+��� � �������� 9E����� #1; ��8��,���+�� ���� � �+� 4,��� ���� �������8� �,������ ��� ���,���,�>�� ��+ �+��� � �� �)��)+��� 9'A/@ � #/�G� #%%�,������ � �+��� ��,,� �7��� ��;/ 5+�� � ������� �+�� �+���0����� � �+� 4,��� �,������ ��� ,���,�>�� �� �7��������)����� �)��� �����/ 5� �7��� � +��+�� ���''% � 4,��� ��)+��)+���,���� �)� 2�* ����8���� � ���8� 2��"� 0� ���� �� � � +��+�� �+�� )+��)+���,���� �����)�� �+��,������ � 4,��� � �+� �)� � ������ �� � ���������,����� 2��"� 0� ��,,� ��+ 521 9�%% � �% �� ;�,,� �� �� ���� � � ��+ � ���4,��� ������� �, � ���������/ � �+� �� ���, ��,������ 4,��� ���� �������8��,������ ��� �����8�� �,� � �+� �� ������ 9E����� #���,�� )� �,;/ D �+� ��+�� +� �� �+� J������� �� � �� ������� �+� 4,��� �,������ � 521������,���� ��,,� ������"��,� ������� ��+��� � ������)� �� � �������� � �� �)��)+��� ���� �������8��� 9E����� #��� ���+�)� �,;/ � ����� �� �� <�� �+� ���� � 521 � 4,����,������ ����������,,�� �+� ������ ��� <,����� � � 4,����,������ ��< �� �� �+���+�,�� �� �,,� �� �� ���������� � � �+� ��7���� � �� ���� � ���+ �,����� ��� ��2��� ����� � ��� ��� 9��� �,������ � �/;/ E����� #���+� � �+� ����,���8� ),�� � �+� ��7���� � �� ������� �+� 4,��� �,������/ 5+� � �� ������ � �+� 4,����,������ ��� ��� �<�� �,� ������� �� 521 �����,���� 9��,������8?���� �8 ����� � K%/%%%�;/ 5+� � ��� ������)+ � E����� #�� �+� � �+� ��� � �+� ��7�����,����� � �� ������� ������� �� �� ��������� � ������,�� � ���+���� ���� � ������ � � ��� �<�� � ���������,,� � � 521 ������� �/ 1 ����,�� � �,���� � J�������� �� ������ ����� �� �� ���� � � ��+ �+����� �?)+�,,���� ��8��,�� �+�� E����� �,������ � �+� �� �������)� �� ��� �� ��� �<�� �,� ������ �)� 521 �)),������� 9E����� #*� � � �;/ 5+��� ����,�� � ������ �+�� 2�*�����,���� ��+ 521 ������ �� �������,� �����)��� �4,��� �,������ ��+��� ��� �<�� � ����� � �+� �)� ����)+�,���/���� ��,�� � �,���� ��� � )�,��,� �, � ��������

�)���<� �� �+� )+��)+����� � �� )������ ''% � 4,���9� ���2����''% � ��������; ��8��,�� �+�� 521 ������� ���� �<�� �,� � ������� �+� ,�8�, � 4,��� )+��)+���,����� 9E����� #6�;/ ���� ��,���� � ��+ � ���4,���������� �, � �������� ��8��,�� �+�� ����,�� ���� �� �4,��� )����� ��� ,����� 9E����� #6�;/ 5+� ,� ��)����� � E����� #6� �+� � � C�� ������8� � �,���� 9� L #;

0�� 1� � ������ � ������,,�� �56 �� 2�* ����8���� / !+�,����,,8�,������,��) ������� � �� )������� ��� � 2��"� 0� ��,, �� �$ ���� � � ��/ �2�* �� �8�"�� �� �7�����,,�,�� �����,���� � � �� �,���� �,� ��,,/ 9(; 1�),������ � �+� �8�"�� �2�*� ),����� �� � � ���� � ���� ��,���8� �� �+� ���� � � � 521 �)),������ 9�%% 521 ��% �� ;/ ���+ ���� )�� � ��)���� �� �+� ��),����� � � � �8�"�� �2�*��� � )���� ���� � �+� �� ���, ��),�����/ 5+� �8����� � �+� �2�*��),����� ����� 521 �)),������ �� ��� �� �%%G/ � ���� �+� �+� ��)���� ����8� ����� � ������ ��"� �� ����� 9�;� 9�; � � 9�;����)����8�,�/ 92; ���+ )�� � ��)���� �� �+� ����,�>�� �2�*��),����� ��� <8� 2��"� 0� ��,,� 9������� � �� ����� �� ���8�;/ 5+��2�* ��),������ ��� �8������ �8�� � � �� ���� � �� / ����� ������ �6/

�,����� �� ��,

���

� )+��)+����� � � ������ �� �� � ����,�>�� �� �+����� � � 4,��� )����� � � ������ � � F=��,� � ������ � )+��)+���,���� ,�8�,� �)� 521 ������� �/ 2���,,�,���� �)����)������ �7)����� �� ��+ � ���4��2 � ��������� ��8��,�� � ��� �<�� � �������� � �+� ���� � �������� �)����)������ 4,��� �� F=%G � �+�� �����8�� � �+� ���� � � �������� �� ���, ��,����� 9E����� #�;/ 5+�� ���,���,� � ������8� � ������� 4,��� �� �� � �� 4��2/*�,,����8�,�� �+��� ����,�� ������� �+�� �+� �����)��� �4,��� �,������ �� 521� 8�� 2�* )+��)+���,���� ����''%� ����,�� ��� � ,��� � � �+��� � 8�� 4��2/

�&� ����������� ���� '(�' � ��')*����������� ������������ ��� ���� +��,,-�&��&�������D�� ���� �+� �+�� 2�* ����8���� �� 521 �� �% �� ������ �����)��� � )����� �)��� 4,��� �,������/ 5�������� � �+� ������� �� +��+ 4,��� )+��)+���,���� � � ���,������ � �� ��� ��� �� ���� ����8�, � �+� ������ � +��+�� ��)+��)+���,���� � � ���,������ � � 4,��������� � �7��� �� ���+ �+� ����������� � 4,������� �������8��� � �� ������ � � �+� )+��)+���,���� � ���''% ���� ��+� � ��� 521/ *+� ��� � ����)����,������ � ��� �8�,����� <��� �� ��,��,��� � �+� ��� � ��+� ��7���, �,����� � �� ������/ 1� �+� � E����� =1��,������ � � 4,��� �� ���),���,� �������� #% �� ��������8�, � 521/ 1 )��8���� ����� ���� ������� �+��������� � � ��,����� 2��"� 0� ��,,� ��+ )+����, �����

�,� � �� ,��� �����8� �� � ���� � �56 �+� �� 0� ���8������,���� � 521 ��+ 121 9�� �� � � *� ����&&�;/ !� �+������ ����)),��� 121 9�%% �� � �� ; ���+� ����� � 521 9�%% � �% �� ; ������� �/ 5+�� �������<��� � �����)��� � �+� 4,��� �,������� ��+ � ��������� �+� ��� �,����� � �� ���� �� � ,�8�, ����,�� �� �+�� � ��,,� ������� ��+ 521 �,� �/ �� �8��� � �� ����� �� �+���,,� ������� ��+ 521 �,� �� �+� �������� � ��� 4,����,����� � �� ����� �/�/ �+� �����)��� � 121 ����)����,������� )�������� �� M� + �8� �+���+ ������� � � �+���,,� ��+ 121 �,� � +�� � ���� 9E����� =1;/�����C�� �,�� �+� ,�8�,� � ���''% )+��)+���,���� �,�,� � � �����,���� ��+ 521� 121 � � 521N121 ��� �7��� ��/ 5+� ����,�� ����� �� �+� �� ���������,���� ��+ �+� �����8�� �+� ��� � 4,��� �,������ �� ����/ 5+� )+��)+���,���� ,�8�,� +��+ � ��������,,� � � 521 �����,���� � ����� �� �� ��� ����, ,�8�, ��+� #% �� : ������� � ��+ 121 �,� � +�� � ����/� �� ������ ���� ����� �� �)),������ � 121 � �521� )+��)+���,���� �� ��� ��� �� �� M� + 9E�����=�;/ 5+��� ����,�� ��� �� ����� � ��+ �+��� � �� �� � �*� �� 9�&&�;� +� ���� ������� �+�� �)),������ �121� � ������� �� )+����, ����� �����,���� � ����,�� � �<��� � � ������ � �56 � ��,����� 2��"� 0� ��,,�/ �� ��121 �����,���� �� �� ������� �� ��)�,���>� 2��"� 0���,,� � � �� ��C�� �,� �� � ������ � �����,,�,�� *��N

�� �� ������ 8�� �+� �)� � � � 8�,���������� *��N

�+� �,� 9O4**�;� �+� �,�8���� � �����,,�,�� *��N �� �

0�� ,� ���� � 2�* ����8���� � �+� ���,���,�>���� � 4,��� � � 4��2 � ��� ������ ��� �&# ��,,�/ 91 � � �; ��� ��,,� �7)����� � ���+��4,��� 9E�5* ,���,��; 9(; �� 4��2=�&?A@# 9�+����� � ,���,��; 92;/ 9* � � 6; ��� ��,,� ����,�� ����,� �7)����� � 4,��� � � �+� 4��2 ����� �)���� �� 9�; � � ���� 9�; 521 �����,���� 9�%% � �% �� ;/ 93; 1 ��,, �7)����� � 4,��� � � �+� 4��2=�&?A@# �% �� ���� ������� � ��+ 521 � �4E�%&�%#I 9�%% ;� � ��,����8� 2�* � +������/ 90; 1 ��,, �7)����� � ���� � 4,��� 9�''%6; � � 4��2=�&?A@#/

�������� � #���$ ����� '� ��� ��������

���

�� ������ �+����+ �+�� )��+ �� ���+� ),�� � ��)���� ���,� � )��8� �� � �+� ���,������ � �� �,, �� �+� ��)+���)+���,���� � 4,���/ 5+� � � �7��� �� +��+�� ����)),������ � O4** � ���� ���� ��+ 521N121�� ��,�� �+� ���� � 121 � �+��� � � )���������/�� �8��� �)),������ � ���+ 8���)���, 9�% �; � ��������7� 5� 9$% ;� +��+ +�� ��� �+� ���,��" M&%G � �+� *��N ����� �� 8�� O4**� � ���2��"� 0� ��,,� 9���� � �&&�: � �> � � ��� � �&&#;� ��� �� ��� �<�� �,� ���� �+� ����,�� ������ �� 521N1219E����� =*;/ 5+��� ����,�� ������� �+�� O4**� �� ���� ������� �� �+� 121�� ����� )��� ������ �� �+� ����

� O4**� �� ���)� ����� �� � �����,,�,�� *��N � ������8�� � ����� � )��+ ��/

�������� ���� �������� ��� ���� +��,,-�&��&������� .� � ������� ����� ������������.����� �� 1 ��+�� ����) +�� ���� ������� �+�� ����8���� ��,������� ����)���� �����+�� ��+ ��)�,���>���� � ������� �*, �,�� �<��� �,� � ����� �56 � ��,����� 2��"� 0���,,� 9�� ���"� � ��/� �&&&;/ 5� �,������� +��+����,���,�� �8� �� ����,�� �� �+��� �����8�� ���� �����,����� ��+ 121 � � 521 � ���,�� �56 � ������ ��

0�� 4� 6����)��� � 4,��� �,������ � ���)� �� �� 2�* ����8���� / 1 ������,,�� ���� �, ��,���� �� �= 6�O �� ���� �� �+� �,,� � � � �,����/9(; *��,���,�>���� � 4,��� � � � )���� �)��� ���"�� �� �)��)+��� / 5+� ������,,�� ���� �, ��,���� �� ����,� ���� ����� �� ��+ � ���4,���������� �, 9,��; � � � ����� �)��)+��� 9���+�; � ��������/ 1��� � � ������ �+� �)��� ��)���� �� � ���� �������8��� �� ���+ � ��������/ 1��� +����� ������ �+� 4,���� ��� �� �� �)��)+��� ����� �������8� �)���/ 9� � � *; 6����)��� � �+� )����� �)��� 4,��� �,������ �,,� � � 521 �)),������ /2��"� 0� ��,,� ��� ������� ��+ �%% 521 �� �% �� � �,,� �� �� ���� � � ��+ � ���4,��� ������� �, � �������� 92; �� �+����� �?)+�,,���� 9�;/ 5+� 4,��� � � E����� �,������ ��� ��< �� ���� <,���� � �+� ������� �,,� �� �� C�� ��<����� � �+� ��7���� � �� ���� � ���+�,����� 9��� ������,� � � ���+���;/ ������ ��� ����� �� ��� �+� �� ������ ����� � � �� ���, 9,��; � � 521�������� 9���+�; ��,,� 9���,� ���� $ ��;/� ���� � 9��; �+� J������� �� ������ �� �� �)��)+��� / 4��)+� 9��; ��� ����,���8� ),��� � �+� ��7���� � �� ������ �� 4,��� 9�; � � E����� 9*; �,������/ ��,�� � � ���+�� ,� �� ��)���� � �+� ����,�� ��� �� ���, � � 521�������� ��,,�� ���)����8�,�/ 5+� ��,������8?���� �8 ���� ��8��,�� ���� �<�� � �������� � �+� � �� ���� � 4,��� �,������ �,,� � � 521 �����,���� 9� K%/%%%�;/ ��� ���)+� � �+� � ��� �+� �+� ��� � ��7�����,����� � �� ������ ����� �� ��� <8� ����� � ��,,�/ 5+� � �� ���� � �+� �� ���, ��,���� �� ��"� �� �%%G/ 1������"� � ������ �+�� �+� ��� � �� ����� �+� 4,��� �,������ � 521�������� ��,,� �� ��� �<�� �,� ,� �� �+� �+�� � �� ���, ��,,� 9PP� K%/%�;/ 9�; 2+��)+���,���� � ���''% � 4,����,,� � � �)),������ � 521/ 5+� ������ � ������ � ��,����� 2��"� 0� ��,,� ������� �� �� ������� ��+ 521 9�%% � �% �� ; �� ���0����� ���6�?214� � � ���� ��,���� � ��+ � ���4,��� ������� �, � �������� 9�; �� � �������� �)���<� �� �+� )+��)+����''% ������� � 4,��� 9� ���2����''% � ��������; 9�;/ 93; 2���,,�, �������� � �+� �< ��� � 4,��� �� 4��2/ ���� �)����)������ �� )������� ��� � )�,��,� �,� ���4��2 � ��������/ ���� �)����)������ 4��2 9�; � � ������� �)����)������ 4,��� 9�; ��� �������� �� ���� ��,���� � ��+ � ���4��2 � �� ���4,��� ������� �, � ��������� ���)����8�,�/ ��� ���)+� � 96; � � 9�; �+� �+� ��� � �+� �� � � �� ������ 9� L #;/ ����� ���� � ������ �6/

�,����� �� ��,

��!

�,������� � � �*,� ��,����� 2��"� 0� ��,,� ��� ������� ��+ �% � �,������� � � $% � �*, �� = �� / 5+��������� � �,�� ����,��� � � ,� ��,���� � �����)��� �4,��� �,������ 9E����� $1; � ���������� ��+ )������� �)+��)+���,���� � ���''% 9E����� $�; �� �) �� � + �����+� ����8�, � �+� �����/ !� �+������ �� �,��� �+��)+��)+���,���� � ���''% �� 2�* )��8���� � �� ���,���+� ��� �� �56 � ������ /

���������!���� ���� ������ �� �������� ����������� ��� ���������!+��� �� 121 ����)���� �+�� +�8� ,��� � �+��� � ��Q5� �+� �7����� �)��� ���� �,� � �+� ),���� ������ � ��� �� �+� ����),��� �� � ��� �,�>���� Q 5� � � �� �+���C������ �� � �8�,����� �+� �+� �� � � �����,,�,�� 4,������� �������8��� �� �� ���, ��������)�/ 1� �+� � E����� A1� � �����,,�,�� 4,��� ���� �������8����� ������ �<�� �,� � ������� �)� 521 �����,���� � �������� ��+� � ��� �,�>���� � 4,��� )����� �,,� � � 2�*����8���� / 5+�� ���� �� ��))����� �� � � ����� �����+�����, � �,����/ D � �� ��,, ������ ����� �,���� �

+��+ �,,� � �+� ������� ���� � �+� ��,���8� ���� �� ��7�����,,�,��,� �7)������ 4,��� )����� �� �+� �,,� � �)��������/ *�,, ������ )����� � ��� ����� �,����� � � ����,4,��� �� ���� �)����)������ ��+ � ���4,��� *������ �,� ��������/ 5+� � �+� ��,���8� ���� �� � ����� �,����� ���,� �7�����,,�,��,� �7)������� 4,��� ��� C�� ��<�� ������ ��,���� � ��+ ����)��8��� / E����� A� �+� � �+�4,��� ����� �,���� ,�8�, +� �+� 8�,�� � � ����������,,� �� ������� �� �� �%%G/ 1 ��� �<�� � �������� ��7�����,,�,��,� �7)������ 4,��� �� F=%G �� �����8���)� �����,���� ��+ 521/ 1 ��+�� ����� �� �����,,�,�������� ���� 96�,� � ��/� �&&@;/ 1��� 521 �����,���� ��+� ��,����� ��,,�� � ������ 9�$% %%% � ������ ; �� ��� �� � � ��������� �,��+�� ������� 8����,�� �� ���,����� � ��+� ��,���8� ���� � � 4,��� )����� � �+�� ������ ��������� �� �� ���� ��,���� � �� 4,���/ 1� �+� � E����� A*� �+� ���� � � 4,��� �� ��� �<�� �,� � ��������,,� � � 521 �����,���� / 1,�+���+ 4,��� �� �7)������ �� � ,� � 2��"� 0� ��,,�� ��� �,�� � ��� �,� ��,,�� �)��8���� ���� �+�����+�����, ����� 9������� � ��/��&&&; � � ��� ���� ������+�����, ������� 9���� ��

0�� 5� �� ��,���� � �����)��� � 4,��� �,������ � ���������� ��+ )������� � )+��)+���,���� � �+� ���''% ������� � 4,��� �,,� � � �� 0� ���8������,���� ��+ 521 � � 121/ 9(; 5��� ������ � �+� ��� � �+� �� ���� � 4,��� �,������/ *�����,,�� ���� �, ��,����� ��� �����,���� ��+521 9�%% � �% �� ;� 121 9�%% �� � �� ; �� 521N121� � � � ������� �� %� #% � � ��% �� ���� �+� ����8�, � �+� �����/ 5+� � �+� ��,,� ��� <7�� � � ���� ����� �� �� 4,���/ H))�� )� �,� � ������ �+� �����)��� � 4,��� ���� �������8��� � 2��"� 0� ��,, �� ������ �� #% �� ��������8�, � �+� ����� 9���,� ��� $ ��;/ E�� C�� ������8� � �,���� � �+� ���� � 521 � 4,��� �,����� �� ����� �+� ��� � �+� ��7���� �,������ �� ������ �� ��,��,���� ��� <8� ����� � ��,,�/ 5+� ����,�� ��� ),����� � �+� ���)+� ��+ �+� ��� � �� ���� � �+� �� ���, ��,���� ��� � �%%G/92; 5��� ������ � �+� ��� � ���''% )+��)+���,���� ,�8�,� �,,� � � 8������ �����,���� �/ *�����,,�� ���� �, ��,����� ��� ������� �� ������������8�/ 1��� � ��� )����� � � ������� � �+� ��,,� ��� ��,���,�>��� � � �+� ������ � ������ � ��� ���0����� �� �6�?214�� �,,� �� �� ���� ���,���� � ��+ � ���2����''% � �������� 9� ����;/ 5+� ��� � � �+� �� � � �� ������ ��� �+��� � ��)� �� � �7)����� �� ��� ),����� � �+� ���)+/ 5+��� � � �� ������ ����� �� ��� 521�������� ��,����� ��+��� ���+�� � ������� ��� ��< �� �� �%%G/ ����� ���� � ������ �6/ 9�; �� ��� �<�� � ����� O4** �,��"��� � 521N121 � ����� �����)��� � �+� 4,��� �,������ � � )+��)+���,���� � ���''% � 4,���/ 521N121 �����,���� ���)),��� � �+� )���� �� �� ���� �� � O4** �,��"���� 8���)���, 9�% �; � � �������7� 5� 9$% ;� � � � ������� �� ������� ��� �� #% �� ���� �+� ����8�, � �����/ 5+� � ��� �,����� � �� ���� 9�; � � �+� )+��)+���,���� ,�8�, 9�; � 4,��� ��� C�� ��<��/ 1������"� � ������ �+���� �<�� � ����� �� �� ���)���� ��+ �� ���, ���),�� 9P� K%/%$� PP� K%/%�;/

�������� � #���$ ����� '� ��� ��������

���

�+� ; �+� �+�� � ��0����� � �+� 4,��� )����� � � �+�������,,�� ��� �7)������ � 2��"� 0� ��,,�/ 5+� � �+�������� �������� � �+� C�� ���� � ��,,���������7)������4,���� � � �+� ������)� �� � � ������ � �+� ���� � �4,��� � � �$% %%% � ������ � ��� �� ������� �� ����,���� ,� ��� �+� � ��� �,�>���� � 4,��� )����� � 2��"� 0� ��,,�/ *�,,����8�,�� �+��� ����,�� ���� �,� ��������+�� � ��� �<�� � ���� � � 4,��� )����� �� � ��� �,�>��

� 2��"� 0� ��,,� 8�� �,��+�� ��������� � �����������,,� � � �+� �����,���� � ���� � ������,,�� �56/

�������

5+� ��0�� < �� � � �+�� ��" �� �+�� �����,���� �� ���� � �56 �� ��� �,� ��,,?2��"� 0� ��,, �� �)�������� )+��)+���,���� � ���''% � �+� *������ �, ����� � 4,��� � � �+����� ������ �+� �� �� � �< ��� � 4,����� 4��2� � )����� " � �� �� ��)���� � �� 121����)��� �,������ �/ ����8��� )+��)+���,���� � ���''%� 4,��� �� �+� �� �����,��� �,, ��+ �����)��� �)����� �)��� 4,��� �,������ � ��,����� 2��"� 0� ��,,�/D�� ���� �� �� �������>�� � � ����, �+�� �7),�� �

+� �+� ����� � )����� �)��� 121 ����)���� �� ���� � � �+� 4,��� ���� �� �� �� ����,���� 9E����� @;/5+� *������ �� � 4,��� �� � �+���� �� 4��2� � )����� ���)� � � � �+� )����� �)��� �� ���� 9E����� @� ,��;/H)� �56 � ������ � ���''% � 4,��� �� )+��)+���,������ 2�*� ,���� � �� ����������� � 4,��� ��� 4��2 � � ���������� �� ���� � 4,������ ��� � � 121 ����)������ �+� )����� �)��� ������ � 9E����� @� ���+�; ��� ��� �,�>���� � �+� ����)��� )����� / 6���� � ����,���,�� ��))��� �+� � ��� �,�>���� +�)��+����/ E����� � �+��7)����� �� � ������,,�� �56 �� �� �� � � ��,,������9�� �� � � *� ��� �&&�: �� �� � �&&$;� 2��"� 0� ��,,���)� ��� ��� ��)��,� � ����� �� �� ��)+������ �)),������� � �,�������: �+� �������� � �+� ��� ����� ���������� � �� �+������ ���� ,�"�,� �� �� ������ ��� ��� �,�>���� � �+� ����)���� ���+�� �+� ,�����, ������� / ���� �,�� �� +�� ��� ���� ������� �+�� �� �)���121 ����)���� ��� �����,�� � +�))����)�, ���� � ��+ � ���� ������ � �� ���� ��� � �7�������� � �� ��������� )��+ ���� � � �+�� �,��"��� � �7�������� ������� � )+������,�����, ������� �� ������ ��)������ ��+� 121 ����)������������ �2�*�/ 1��� �����,�>���� � �+� )+������,�����, ��)������ � �+� �2�*�� �56 �� � ,� ��� �� �,������� �������� � �+� ���,���� � �+��� � ��8� �� 9��R��+�� � ��/� �&&&;/ D �+� ��+�� +� �� ���� ���� �)��� �����,���� � ���� � �52 +�� ��� �+� �����,����� ��,�8��� � �+� 4,��� ����)��� )����� �� �+�)����� �)��� ������ � � +�))����)�, *1� ���� � 9�+�� ��/� �&&&;/ 5+��� ����,��� �����+�� ��+ ��� )���� � ������������ �+�� �,��+�� ��������� 121 ����)��� � ���������� � ���,��� �+� � ������ � �56 �� )���,,�, <���?2��"� 0� ���� �� �)���/5+� ����, ��)����� � E����� @ �� �+���+� �� �� ��

� ����,� �)),����,� �� �56 � ��+�� ���� ����� � �� �� �+����� �� ���)������ � 121 ����)���� � � �+� �������)� �� � � �+��� � )����� � �7)������ ���� ��� ����� �� ����� - �+� ���������� ��� �� � ����)��� ���� �� � �� � �+��� � )����� ��� �� �� ������ �� 2�*)+��)+���,���� / � ������� � � )��8���� ���� �+������+�����, ����� ��8��,�� �+� ����������� � 4��2 � �4,��� ����������� � �+� )�������, ���� � � �+��������, �����7� �,�+���+ )����� ���,���,�>���� � 4��2� � 4,��� �� �����8�� � �+� �� ������ � 2��"� 0� ��,,�9������� � ��/� �&&&;/ 5+��� ������� �+�� 4��2 �� ��������,���,� �� �+� )����� �)��� 4,��� �,������ � � �+� �������, ���� � � �� +� ��� ��� ����, ���� �� ���� �� �)),� ���+�� ���� ��)�/ �� �8��� � ������ �+�� �+� ���+� ���� 8�,8�� � �+� ����,���� � �� �)��� �<���� �� �+��� ���� �+� �� � )����� �)��� ����)��� �� ���� �� ��

0�� 6� 6����)��� � 4,��� �,������ �� ����� �,� ��+ )+��)+���,���� � �+� ���''% ������� � 4,��� �,,� � � �*, N �,������� �����,���� /1 ������,,�� ���� �, ��,���� �� �����,���� ��+ $% � �*, �����+�� ��+ �% � �,������� �� = �� / 5+� � �+� ����� ��� ����8�� � ����� �� �����C�� � � �,���� ���������,� �� ���� � + � � ������� /9(; S�� ������8� � �,���� � 4,��� �,����� � �� ������/ 5+� ���)+ �+� ��+� ��� � � �+� ��7���, �,����� � �� ������ ����� �� ��� <8������ � ��,,� <7�� ���������,� �� � + ���� �*, N �,������������,���� 9 +��� ��,�� �;/ �,��" ��,�� � �+� �+� ����,�� ����� ���, ���),��/ 5+� ��� �,����� � �� ������ ����� �� ��� �� ���,��,����� ��� ��< �� �� �%%G/ 1������"� � ������ �+�� �+� ��� � �� ���� � �+� 4,��� �,������ � �+� �����,���� ��,,� �� ����������,,���� �<�� �,� ��"�� �+� �+�� � �� ���, ��,,� 9P� K%/%$;/92; 2+��)+���,���� � �+� ���''% ������� � 4,��� �,,� � � �*, N�,������� �����,���� / *�����,,�� ���� �, ��,����� ������� 9 +�����,�� �; �� �� ������� 9�,��" ��,�� �; ��+ �*, N �,�������� � �� ������� �� % �� ��% �� ���� ����8�, � �+� �����/ 5+� ������ ������� � ��� ���0����� �� �6�?214� � � ���0����� �� ���� ���,���� � ��+ � ���2����''% � �������� 9� ����;/ 5+� ,� �� ���)+ �+� ��+� ��� � �+� �� � � �� ������ ���� ����,�>���� ��+ ,����� 4,���)����� 9� L #;/ ����,�� �7)����� �� ��+ 521 �����,���� 9�%% ��% �� � � ���+�� � ������� ; ��� )������� ����,�� ����,� � � �+��� � � �� ������ ��� ��"� �� �%%G/ ����� ���� � ������ �6/

�,����� �� ��,

���

,������ �� )���,,�, <���?2��"� 0� ��,, �� �)���� � � ��+���� �)��� � ����� � ���� ����� � ���,�>� ����,�� ���+� ����� � 8�,8� � �,��+�� ��������� � ���������� �� ���� �,����� ������� � �+� +�))����)�� 9��R��+�� � ��/� �&&&:�+� � ��/� �&&&;/D�� ����,�� ����������� �+� ��)���� �� � 121

����)��� �����,���� �� �+� �����8� � ������ �������,,�� �56 � � ��� �,,� �� ����� � ��+ �+� ����,��� � )��8���� ����� �� �� �� � � *� �� 9�&&�;� � +��+�56 �� �����8�,� � ����� �)� ��������,���� ��+���+ 121 � � )+����, ������ �,�+���+ � ��,����� ������� ��+ )+����, ����� �,� �� F@%G � �+� ��,,� ��,�� �� �+� ��)������ � �+� �,������� ����� � �% �� ���� ����8�,� �+� ����/ 5+� ��,���,�� ���+� ���� �+�� �� ������� ���56 �� ������ � 121 ����)��� ����8���� ���� " � / �,��"��� � O4**� �� �+� �� ����� �

��� �<�� � ���� � 121�� ����� )��� ������ 9E�����=*;/ �� �8��� �� �� 121 �����,���� ������ � J�7 ���N� �+�� ,���� � �� � � ������ � �+� � �����,,�,�� ��,������ �� ������ 8�� � +������ � �+� ��N?*��N �7�+� ����� � )�����,� ��,� � 121 � �56 � ������ ��� �� ����))���� �+� ����8��� � )+��)+������ �� �,,� �+� )+���)+���,���� � ���''% � 4,��� �� �� ��� ��� ��/ 5+������ �� ��))����� �� )��8���� ��)���� �+� � � �+���,���� � <��� � )��� +��+ ������ ���� � ��)�,���>���� � �+� 2��"� 0� ��,,�� ��� � ������� �� )���,,�, <��������,���� � ���� ���, �� �+� �,�������, � ������ � �569���� �&'&;/ 1,��� �)),������ � �+� )����� )+��)+������ +������� ��,���,� 1 �� ����������� ��� +�� ��� �+� �� � ���� �56 � ������,,�� �,���� � ���)� ���� )���,,�, <��� �����,���� �,� � � �� �+��� �� ������������ �+� �,���� � <��� ��� �,� 910��� � � ���� �&&$;/

0�� 7� � ��� �,�>���� � 4,��� )����� �,,� � � 2�* ����8���� / 9(; � ������ � � �� ���� � ���� �������8� � ����� ������ 4,���/ H))�� )� �,��+� ���)����8� �� ���, �)����, ������ � � �+� �� ������ ����� � � �� ���, � � 521�������� 2��"� 0� ��,,� ���� ����� �� ���� )�������,�>���� ������� � ��+ � ���4,��� ������� �, � �������� 9���,� ��� $ ��;/ !+��� ���� � ������ �+� ����� +��� ���� �������8� � �� ������ ��� C�� ��<��/5+� ���)+ � ������� ����,�� � �+� C�� ������8� � �,���� � � �����,,�,�� ���� �������8� � �� ������ 9<8� ��,,�� ����, F��% �� �� ������ ,� ��+;/ 5+���� � �����,,�,�� � �� ������ ����� �� ��� �� ���, ��,����� ��� ��< �� �� �%%G/ 92; 6������� � �+� ���� � � �7�����,,�,��,� �7)������ 4,����,,� � � 521 �����,���� / *�,, ������ )����� � ��� ����� �,���� �,,� �� �� ���� �)����)������ �� 4,���/ 5+� � �+� ����� �,���� 4,��� )����� �� �������� �� ���� ��,���� � ��+ ��2��� 0������ ����)��8��� / � ��� ���)+ � ������� �+� ����, ���� � � ���� �)����)������ 4,��� )����� /9�; � ������ � �+� ���� � � 4,��� )����� �� ��� �� � �+� �$% %%% � ������ �,,� � � 521 �����,���� / 1 �$% %%% � ������ �� ��� � � �,��+�� ������� 8����,�� �� ����� �� �� ��������� � ������,� � � ���+���/ 5+� ���� � � 4,��� � �+�� ������ �� C�� ��<�� �� ���� ��,�� � �,������� � � ���4,��� ������� �, � ��������/ 5+� � ��� ���)+ � ������� �+� ����,�� � �+� C�� ������8� � �,���� � ����, 4,��� )����� �� ��� �� � ���)����8���,�����/ 5+� �� � � �� ������ ����� �� ��� �� ���, 9�; �� 521�������� 9*; ��,����� ��� ��"� �� �%%G/ 1������"� � 91;?9*; � ������ �+�� �+������ �� � 4,��� ���� �������� ��� �� �� ���, � � 521�������� ���),�� �� ����������,,� ��� �<�� � 9P� K%/%$� PP� K%/%�;/

�������� � #���$ ����� '� ��� ��������

���

1,��� ���8�,�� �� �������� � +� ���� � � 2�* ����8��� ��� ��������� ���� ����� ���+ �� ����+��� ��� � � �,�������+� �� � 8�,8�� � �+� ���+� ���� �+�� � ���,�� �������56 � ������ �� 121 � � )+����, ������ �� ��)+��)+�,�)��� 1� �� �� ����8���� �� �+� *��N � J�7�,,� � � 121 �����,���� : �+� ����8� � >��� �+� �,��8�� ������ � )+��)+�,�)��� �� )������ � ������������� ����� 96� �� � ��/� �&&�;/ 1����,,�� �+� �� �������� � �+�� )+��)+�,�)��� 1���������� )��+ �� �� �+� � ������� � �56 � ��,����� 2��"� 0� ��,,� +�� ��� ���� �������� )��8����,� 9�� �� � �&&$;/5+� )���� � ����,�� ���� �� �7),�� �,���,� �+�

��,���,�� �8� �� �+�� ����� ���� � �+� ���,� )+��� 9F� +;� ������,,�� �56/ �� �8��� ��+�� ���+� ���� ���+ ��)����� �� �+���� �� ����8���� � *���O +�8� ��� �+� �� �� ���� ���, �� �+� ��� �� � �� � ,����)+����56 9�� �� � �&&A: 1+ � ��/� �&&&;/ 5+������� �+�)������,��� �+�� ����8���� 2�* �������� � ����� � )��+ ���� �+� ��� ����� ��� ���,�� �� ,����)+��� �56 �� �� ���7�,����/ 5+�� �� � ��)�� �� ���+�� �����/6��� � �+� )��)������ � �+�� �� �����)�� � )�)�� ��

)��,��+�� �� !� � � � �� �� 9�%%%;� +� �+� �� ��� ��,�����)+����,��� �+�� �+� �7)������ � ������,,�� �56��C����� � �,��+�� ��������� � ��������� )������/ 5+���< �� � ���� �,� ��))���� ��� �� �,���� �+�� 121����)���� �+�� ,��� �+��� � �+��� � �� 4��2 ��� � ��� �,�>��8�� �+� �,��+�� ��������� � ��������� )��+ ��/����� � +�8� ���� ������� � ��� �<�� � �����,����

��� �� 4,��� ���''% )+��)+���,���� � � �+� �����)��� � 4,��� �,������ � 2��"� 0� �� ������ �,,� � ������,���� � � ���� � �56/ 1 ��� �<�� � ���� � � �+�����)��� )����� �� �� ������� �� �� � ��� �,�>��/ D������,�� )��8��� � ����� �� �,������� � � ������� �����, �+���,���,�� ���+� ��� � ���,�� � ������,,�� �56/

������� ��� �����

#������&������5+� �7)����� �� ��� ������� ��� ��+ #� �� =� ��" ��,�����/ 5+�������� � �+����� �� �,��)�� � �+� ����� � � ��"� 5�#%% � 8�������������)� � � �����8�� ��+ )+������ ����� �)����/ 5+� )��)������ � ��� �� �� ����,� ��)������ ��+ � �7�����,,�,�� ��,���� / 5+�

�7�����,,�,�� ��,���� �� ��� �� 9� �; ��*, �=%� �*, #� *�*,� #��*,� �/$� �,����� �%� ��2�� �%� )���8�� ���� #� )������7� %/%# � �6��12O %/%# 9)� @/#$� ##% �D��3"�� #��*;/ !+�,����,, 8�,������,��)������� �� ��� ����� �� ��� 8����,,� ��� ��<�� 2��"� 0� ��,,�/ 2���+)�)��� ��� )�,,�� ��� ������,����� �,��� ��)�,,����� 9�/$ �� D6�%/'A �� �6: *,��" �����, � ������ ��; � � <���)�,��+�� �� ��+��8� �������� �� � #?A ! +� <,,�� ��+ � ��,���� �� ��� � � 9� �; ��,��� ��� A%� � ���+� ���,� ��� A%� �*, �%� A��DT�*,� �/%� ���152=/%� ��452 %/�� ��2�� #%� �451 �%� *�*,� %/' � � ������� �,����+�� ��/% 9)� @/=� #�% �D��3"�;/ 5+� ������ ������� �� �� ��+��8� � +�,����,, �� <������� �� @?�$ ! � � �� �� ���)� �����/ 5� �8�"��2�* ��� 8�,������,��)�� 2��"� 0� ��,,� 9?A$�O;� � )�)�� 9%/$?�!;�� ��� � � �7�����,,�,�� ��,���� �� )������ �� ���8� �+� ���� � � ����� ��� �,� ���� / �7�����,,�,�� �����,���� 9�?$ O; �� ��,�8�����8��� $ � 8�� � ���,���� � �� 9����%�(: ��+� ��+�� ;/ ������� �� ������� ��� � � 17�)���+ �6 ��),�<�� 917� � ������ ��� E����� *����*1;/ ��� �,� ��� <,����� �� $ "�>� ������>�� �� �% "�> 96������� ��%%;� � ������ � � ���)����/ 5+� �2�* ��),����� � � � )�� ������� �� ����� �� ����,� �� ������ ��� � 2�,��) @/� 917� � ������ ��;/ 5�����8��� 2�*� �%% 521 �� ����� �� �+� ��)������ ��,� �� ���% �� /

"#� $% ������6�1� � ���� � �,,�,� ��+ 4,��� � � �+� �4����� 4��2 ����� � ��� �,� �� � �� )�6�1 #/� 9N; � � ��� ������ � �� ��� �&# ��,,� ��� ��+� ��,���� )+��)+��� )����)������ ���+�� 9!��,�� � ��/� �&@&;/ 1���=' +� �+� ��,,� ��� <7�� ��+ =G )�������,��+��� �,,� �� ��� ������� ��+ )������ � ��������� 8����,�>�� ��+ J�������� ����+������ ��� 9E�5*;� �� �+����� ���� 0������ ���� ���� � ��������� � �� �,�>�� �� �� ���, ��������)� 9�*��%%%: �������;/

�������� �������� �����6���������� ������,,�� ���� �, ��,����� ��� )��)���� ��� �+� ���� � ��%� �� ��������,� !����� ��� ������ ������� � �� � )��8����,� ��)��������+�� 9E����� � ��/� �&&';/

�**������&�*�����*�,,� ��� <7�� �� ��������� )��8����,� 9���� � ��/� �&&&; 9�� 4,������� � �; �� �� � ������� ��+ =G )�������,��+��� � )+��)+���������� ��,� � 92��; �� � + �� =�* 9�� E����� ���� � �;� �,,� �� �� ��+� � �+��� ����� ��+ 2��/ � ����� �� ���� 4,��� � � �� �)��)+��� ��+� ��,����� ��� � ������� ��+ � �,��"� � ��,���� U�G ��8� � ������,���� 9��1; � � �%G ����, ���� ����� � 2��V � � �+� ��+)������ � ��������� � � 8����,�>�� ��+ �+����� ���� 0������ ���� ����� ��������/ E�� E����� ���� � �� ��,����� ��� � ������� ��+ � �,��"� ���,���� �� ��� � � �G 5���� I��%%� � � � ������� ��+ �+����� �?)+�,,���� 9�,���,�� 2�����;/ ���� �� ��,,� ��� � �,�>�� �� J�������� �� ��������)� 9�IA%: D,��)��;/ E�� ���)���� � �,���� � �+��,������� J������� �� ������ ��� ��C����� ��� � � ���,�� **6 ������ ��+ $ � �7)����� ����/ 5+� ������ ��� )�������� ��� � ,� ��� <,���� � �C�� ��<�� ��� � �2��� ����� � ��� ��� 9��� �,������ � �/; �� ��)�����

0�� 8� 1 ����, ��)���� � �56 � 121 ����)��� ���)� �� �� )���,,�, <���?2��"� 0� ��,, �� �)���/ 5+� ,�� )��� � �+� <���� �+� � �+� ����, ����� ��+� �� �)��/ 5+� � �����,,�,�� *������ �, ���, � 4,��� �� ��� � �� 4��2� � � �+�� ������,�>�� �� �+� )����� �)��� ������ �/ 5+� ���+� )��� � �+�<���� �+� � �+� �� �)�� ���� � ������ � �56/ ���''% � �+� *������ �, ����� � 4,��� �� )+��)+���,����� +��+ ������ ����������� � 4,������ 4��2� ����,�� � � � �������� � �+� �� ���� � � ���� �, 121 ����)���� � �+� )����� �)��� ������ �/ 2�6� )����� �)��� �� ����: 4��2��,������� ����)��� � ������� � )����� /

�,����� �� ��,

��

)��8����,� 9������ �%%%;/ 5+� �+� �� � �+� �,������ �,,� � � 8�����������,���� � �� �8�,����� �� �,,� �- �+� ��7���� � �� ���� � ���+�,����� �� �������� � � �+� ��� � �� ���� � �+� �,������ )�� ��,, ����,��,����/ E�8� ����� � 2��"� 0� ��,,� ��� � �,�>�� � � �+���� � �6� �+� �,����� � �� ������ �� ������� ��/ *,������ 9�$%%?�%%%; ��� <8�2��"� 0� ��,,� ��� C�� ��<��/

�**��.������ ��� �**��������������*�,,�� �����,���� �� � �����,����� ��� ��,���,�>�� � ,���� ���� U$% ���E� �$ � ���2�D@� �%% � ���,�����)+��)+��� ���� $ � �451�$ � �651� � � ��#OD=� � � )+� �,���+�,��,� �, J������92�E;� �$ � �� >����� �� �% �"����� ����� � ��3�, �+�������� �� ��3�, )�)����� 1� $ ��3�, ,��)�)�� � �% ��3�, �)���� � � # ��3�,� ��)�� � $% � 2��V/ 5+� � ��,��,� ������ �� �����)� ��� � �+����� ���� ��)),��� ��� ��+ �G 5���� I��%%/ 5+� ��)�� ��� �� ������� �� �����C�� � ���� ��,���� � ��+ � ���2����''% � �������� � ����� �)����)������ / E�� ���� �)����)������ � � ���4��2 � ��������9� ��; ��� ��� � �� �% �, � )����� 4 ���� 92+�������; � ,���� ����/5+� � ���������� � )����� 4 ���� �� ��+�� �+��� ����� ��+ ,��������/ ���),�� )��)���� ��� �)),��� �� �+� � ���������� � )����� 4���� � � � ������� �� � + �� =�*/ 1��� ��+� � ��� ����� ��+ ,��������� �6�?214� ���),� ���� �� ����� � � � ������� �� ���������� �� $ �� �� &@�*/ 1��� �� ��������� � �+� ��)�� ��� � �� � �,�>���� ���� ��,���� � ��� � � ���4,��� ������� �, � �������� � � � � +� ��� �+���,��� ���� �� 9�*�; "�� 91����+��;/ 5+� �*� J�������� �� �� C�� ��<�� ��� � � ����� � �,�>�� 9����� S�� ��<��: (�)� ��� ������ ���;/ �7)����� �� ��� )������� � ��)� �� �,� � ���),�����/

����� �������� �������������� ���� �**������������*�����,,�� ���� �, ��,���� �� ������� �� �� ������� ��+ 521� � ����� ����� �� ���� )�������,�>���� ������� � ��+ � ���4,���������� �, � ��������/ 6� ������ � �+� 2��"� 0� ��,,� ��� ��� �� ���� ���, ��������)� 9�*�%%%: �������; ��� �+� ,� �� �� �+� �))������� �� %/$ �� � ���8�,�/ 5+� ����,� ������ � � �+� �� ������ �����,����� � � � �� ������ � ���� �������8� � �����,,�,�� 4,��� �����������/ E�8� ����� � ��,,�� ����,� � F��% �� �� ����� ,� ��+� ����7��� �� � � �+� ��� � �� ���� �� ������� �� �� � )���� ���� ��� ���, ���),��/

���� ����������*�,, ������ ���� �� ������� ��� �� ��������� �� 6�,� � ��/ 9�&&@;/����J�� ��,,� ��� +����� �>�� � +����� ���� ���� 9�$% ��������� �% � 5���?�*, )� @/=� � � �651� � � 2�E� � ��� >����� �; �� �% )������� �+����+ � �=�4 ���,�/ *�,, +����� ��� �� �� ������� �� �% %%% � �� �� �� �� =�* � � �+� ��)�� ��� � ����,,�����/ 5+� ��)�� ��� � �� ���� �� ������� �� �$% %%% � �� #% �� �� =�* � � �+� )�,,�� �� ���� �� �+� �$% %%% � ������ /

���� ������ .����������*�,, ������ ����� �,���� �� ������� ��� ��� � � �*� )����� ������ �,���� ����,� 91����+��; � ������� �� ��+ �+� ���+�� ����������� �+� �� ��������/ 5+� � �+� 4,��� )����� �� ���� �)����)��������� � � ���4,��� *������ �, � �������� 9*+����� ; � � �+� )����)������)����� �� � �,�>�� �� ���� ��,���� �/ 5���, 4,��� � � ����� �,����9��,,���������7)������; 4,��� )����� ��� �������� �� � ���4,���������� �, � �������� � � +���������+ )���7����� 9��2;��� 0����������)��8��� � ���)����8�,�/

'���.����2�,��,� �, � ���4,��� ������� �, � ��������� � ���4��2 � �������� � �� �������� �)���<� �� �+� )+��)+����''% ������� � 4,��� ����� ������ �� � 0���� � �� �+���� )�)����� � �� �������� �� ��)�����)��8����,� 9������ � ��/� �&&&;/ 2�,��,� �, � ���4,��� *������ �,� �������� ��� ����� �� ��� *+����� � � �� ��,� �, � ����� �)��)+��� � ������ ��� �����/

!��������%����

!� ��,� ,�"� �� �7)���� ��� ��������� �� 2������� ���� ���� � +���,��������� �+��� �7)����� �� ��� )�������� �� +�� ��8��� � �� ��������� �/ !� �+� " 6� 5�"�� �/�� ��+ �� �������, ����� � ��+� �� �����)�� � 5�"��+� 5����+��� �� �7)��� ���+ ���, ������� �� � ��+� ,��������� � ���, �������+ �� ��� � ����� �� �+��� +�,) ��+ �+��� ������ � )�,��,� �, � ��������/

�� ������

1+ ��/� 4� ���6/6/ � � �� �� �6/(/ 9�&&&; 1 ,��� )+��� � ������,,��,� ������ ��)������ ��C����� ����8���� � *���O � � *���/������� ,4� $$&?$A'/

10����1/ � � ����/ 9�&&$; 1 � �C�� ��,� � )����� )+��)+������ � ������,,�� ,� ������ ��)������ / ����������� 7� �&@?#%%/

�� ���(/1/ � � 6� �,��� ���/ 9�&&$; 5�)�,��� )��<,� �� � �,�����������)���- 5+��� ��� ������� � � � � �+� �,� � ��� ��� � ������ �,��)/ ������� 15� #@#?#'=/

�,����5/O/2/ � � *�,,� �������4/�/ 9�&&#; 1�� �)��� ����, � ������-,� ������ )��� ������ � �+� +�))����)��� ������ 471� #�?#&/

��������1/� !��>� �"��/� O�,���+� ��(/4/� �+� ��/ � � !�� ������/(/ 9�&&&; *+��������>���� � �,������� ����)��� � ������� � )����� ���� �)�����8� ���� � � ������,,�� � � �������, �����7 � �,�� ����/ �� ����� �������� 511� A%�?A��/

*��)�,�E/ � � ���)��/ 9�&''; 1���8���� � )����� "� ��� * � ����� �,� ������ ��)������ � �,������� �� ����8��� � ������,,�� 2��"� 0���,,�/ 1 � � �� �����/ ��� � ���� 56&� #&@?=%�/

6�,���/O/� ��+����+���*/� �����!/� O��",��0�1/ � � 8� ����� � �� ���� � �2//2/ 9�&&@; 1��������� � � ��,���,�>���� � �)� �$ ��+ ���)��� )����� �� � � �,��+�� / �� ���� � ���� 147� '��?'��/

6� ����/1/� �+����/4/� ��,,�+�// � � �� � �W/1/ 9�&&�; ��,� �)+��)+�,�)��� � �� ����� � ,�)�� ���� � ����� ���� � ��� �,��� ������� / ����� ��� 6� �%A'?�%@@/

6� ���/� DX���� ��/(/� E� ���/5/� �� �+� �1/1/� !��,���2/E/ � ����� ����/�/ 9�&&@; 4��2- � �� �)��� 26B ����� ��� ��� � �)����� �+�� � ������� ��+ 121 ����)����� ������ 4&7� �@&?�'=/

E�������/� �"� ��1/ � � ���������+��W/ 9�&&'; 1 ��)��8�� ���+���� ��,���� � ������,,�� 2��"� 0� ��,,� ��+ ����� ������ �� ������� ��� � ��7�� �� �,���� ����� �/ ��� � ��� ��� � ��� ������� 4��&�?�&'/

�������/ 9�%%%; *,������ � � � �,������� ����)��� �� ����,���� �� �+����� �����"�,��� � �+� �� ������ �)� �� � ��,����� ��� 2��"� 0� ��,,�/���� �� ������ �� 1,� $A#?$@%/

�������/� �����+�(/� �������/� ���>��/ � � ��+���(/ 9�&&A; 5+� �,��� ��� �� � ���� � �+� �����+�,���)������ ����)��� ���� �� ���-��� ��<����� � �8�, ������� � �� � ���� ���� ��� )��� ������ � �+� �7�����,,�,�� #?= ,��) ����� / ����� ��� ����� �� � ��� 94�A%#�?A%#A/

��,,�� �/� ��� �*/ � � ��� ��� ��/ 9�&&=; ���,�����,���� ��������� � �������� � �+��� ��� ������� � ����� ��)�,��� �� �+��,������� ����)��� 4,���/ ������� 14� �##�?�#=#/

����/ 9�&'&; �� ������ ��)������ / ����� ���� ������ �� 1,� '$?�%�/����/ 9�&&%; �� ������ ��)������ � �+� ������,,��/ ��� �� ������ ��

,� #'�?#&%/����/ � � �����+����/ 9�&'&; �� ������ ��)������ � C���C��,�����)���<� �,������� ����)���� � 2��"� 0� ��,,� � 8��������� ��+ ����������� � ��� ��� ������,,�� �,����/ ������ � ���� 8� �A'?�@�/

����/ � � �����+����/ 9�&&%; ���� ���� ������� � ,� ���������� ����>���� � ������,,�� 2��"� 0� ��,,�/ ����������� 1� ��&?�#�/

����/ � � �����+����/ 9�&&�; 2����� "� ���� � � )+��)+����� � +�������������� � ,� ������ ���� ����>���� � �,������� ����)���� � ������,,�� 2��"� 0� ��,,�/ ������ � ���� 15� �@?#'/

�� ��/� �����/� E�"� �����/ � � �� ���+�1/ 9�&&A; *��N�� ���������� � )��� ������ � ���� �������� ������������� ����� ����C����� ����8���� � *��N3��,����,� ���)� �� � "� ���/ ����� �������� �� � ��� 94� �##$�?�##$A/

�� ���"���/� E�0����/� 4���+�W/� ����"��5/� �+���+�����/� ���+�����/� � ���� ��5/ 9�&&&; ��C������ � �� ������ �����8���� )����� "� ��� � ������,,�� ,� � ���� ��)������ / �� � ��� �!���� ,85� �#=&'?�#$%�/

�����6/� B+� ��I/� DX���� ��/� �+,����/6/ � � ���� ����/�/ 9�&&&;����,���� � ���)+�,�����, )����� �)��� ��,� � �� �)��� � ��8�,�)� � +�))����)�, ���� �/ ����� ������ �� ,� #@?=#/

�� �� �6/(/ 9�&&$; 2+��)+�,�)��� 1� �� ���,� �+� � ������ � �+�������� 8����� ,� ������ ��)������ � �+� ������,,�� 2��"� 0� ���� � ��,����/ ������� 16� �#&#?�=�%/

�� �� �6/(/ 9�&&A; 1 )����� �� �+�������)� �� � ,��� )+��� �������,,�� ,� ������ ��)������ / ������� 18� ='#?=&%/

�� �� �6/(/ � � *� ���(/1/ 9�&&�; 2������)���� � )����� �)��� 2�* � ������,,�� ,� ������ ��)������ � ��,����� �� ����� ,65� �A$A?�A$&/

��R��+���*/� I����/� ���������/*/� *����,��/*/� B����� �/� �,� "� �/*/� � ����,,��/1/ 9�&&&; ��,� � 121 ����)��� ���,� � � �� �)������ ������� � � ),��������/ ������� ,5� A=&?A$'/

��������/� �"� ���/ � � �������/ 9�&&&; 2+��)+���,���� � ���� ��''% � 4,��� �� )����� "� ��� * )��8� �� ��� * ����� �� ���

�������� � #���$ ����� '� ��� ��������

��"

�� �� � ��+ �,������� ����)��� � ������� � )����� / �� ������!����84� �@A$?�@A'/

�6� �,��(/!/ � � (�+ ��� �/O/ 9�&&%; 2+����,�����, � �)��+�)+����,�����, ��,�� � �7�������� ��� � ����� ���� � �� ���, ��8��� ������ ��8�,�)�� �/ ��� � ��� ����� 16� =�?@%/

� �>��// � � ��� ��/2/ 9�&&#; �,��" � ��,���� �+� �,� � ��� ���� � �� �� �+���� ��1����O1/ ������!����������� 4,� ��A�?��A&/

���� ��/(/ 9�&&�; O�,�������)� �� � ��,���� ����� � � 2��"� 0� ��,,���� ��� ������,,�� 8�����/ �� ������ �� 11� ��$&?��A&/

���� �� ��*/� ���� ����+�W/ � � ���8� ��*/E/ 9�&&'; 5+� ������������������� � � �,������� ����)��� �+� �,� �� ����� ,&'� �$&A?�$&&/

�+���/��/� �����+��W/� 2����,����/�/� B��� ��/�/� !� �+�,���/(/��8�������/ � � �,� � ��/ 9�&&&; ��)�� �)� � ��,�8��� � �������������� � 121 ����)���� ���� �� �)��� �61 ����)�������8���� � �� ����� ,&5� �'��?�'�A/

5+��)�� ��/E/ 9�&'A; 5+� �������,��� � ,��� � � � � ��������� ����� ,44� &=�?&=@/

!� ��W/5/ � � �� �� �6/(/ 9�%%%; �7)������ � ������,,�� ,� ��������)������ ��C����� )����� �)��� �,��+�� ��������� � ���������/������� ,6� A#$?A=@/

!��,���/� � �����/� ����4/�/� !�,���/� 2�,,�����1/� ������/�� ������5/� ��,8������ ��/ � � 17�,��/ 9�&@&; 5�� �������� ������,�� ��,,� ��+ �� �� ��� )���������� � � ����������� �����17� @@@?@'$/

!��>� �"��/� �����/� W� ��E/�*/ � � �+� ��/ 9�&&'; ����+�����,� � ���� ������+�����, �+��������>���� � 4��2� � )�����8� 121����)��� � �+��� � )����� � � ��� ���� / ������!����������� 48��##$?�#==/

B+����//� !� �+�,��!/ � � 2����,����/�/ 9�&&'; 4,������� ����)���������� � �� �� �)��� )�)�,���� � 2��"� 0� ��,,� �� ��8�,�)�� ��,,�����,����/ �� ������ �� 1&� $$�@?$$�'/

���� ��� ��"����� #$% #&&&' ��� �� ��� � $#% #&&&'������� ��� � $(% #&&&

�,����� �� ��,

���