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ii
Shirley Moreira Burburan AVALIAÇÃO DOS EFEITOS PULMONARES DOS ANESTÉSICOS INALATÓRIOS EM UM MODELO MURINO DE ASMA ALÉRGICA CRÔNICA Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Clínica Médica da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro
Orientador: Patricia Rieken Macêdo Rocco
Rio de Janeiro
2013
ii
Burburan, Shirley Moreira.
Avaliação dos efeitos pulmonares dos anestésicos inalatórios em um modelo murino de asma alérgica crônica / Shirley Moreira Burburan. Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2013.
xvi,111f. ; 31 cm.
Orientadora: Patrícia Rieken Macêdo Rocco
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, 2013.
Referências bibliográficas: f.62 – 78.
1. Anestésicos Inalatórios. 2. Éteres Metílicos. 3. Asma Fisiopatologia. 4. Mecânica Respiratória. 5. Resistência das Vias Respiratórias. 6. Complacência Pulmonar. 7. Biologia Molecular. 8. Estresse Oxidativo. 9. Epidemiologia Experimental. 10. Modelos Animais de Doenças. 11. Camundongos. 12. Clínica Médica - Tese. I. Rocco, Patrícia Rieken Macêdo. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Clínica Médica. III. Título.
iii
Shirley Moreira Burburan
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS PULMONARES DOS ANESTÉSICOS INALATÓRIOS EM UM MODELO MURINO
DE ASMA ALÉRGICA CRÔNICA
Rio de Janeiro, 20 de janeiro de 2013. _____________________________________________________________________ Patricia Rieken Macêdo Rocco, Ph.D - Orientadora Profa. Titular, IBCCFº, UFRJ _____________________________________________________________________ Marcus Conde, Ph.D Prof. Associado, Faculdade de Medicina, UFRJ _____________________________________________________________________ José Rodolfo Rocco, Ph.D Prof. Associado, Faculdade de Medicina, UFRJ _____________________________________________________________________ Wagner Baetas, Ph.D Prof. Adjunto, IBCCFº, UFRJ _____________________________________________________________________ Patrícia Machado Rodrigues e Silva Martins, Ph.D Pesquisadora Titular, FIOCRUZ _____________________________________________________________________ Lea Mirian Barbosa da Fonseca, Ph.D – Suplente Interno Prof. Titular, Faculdade de Medicina, UFRJ _____________________________________________________________________ Pedro Leme Silva, Ph.D – Suplente Externo Prof. Adjunto, IBCCFº, UFRJ
iv
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Investigação Pulmonar do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro,
na vigência de auxílios concedidos pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pelo Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e pelo Instituto Nacional de
Ciência e Tecnologia de Fármacos e Medicamentos (INCT-INOFAR).
v
Dedico este trabalho a algumas pessoas cuja participação
na minha vida me conduziram até aqui.
À minha professora do ensino fundamental, Sonia Maria
Zuchelli Gomes, que guiou meus primeiros passos no
caminho do saber e me ensinou que aprender coisas novas
é uma fonte inesgotável de alegrias e uma
enorme riqueza para o espírito.
Ao meu pai, João Dias Moreira, que foi sempre exemplo e
estímulo para que eu buscasse novos horizontes e
realizações pessoais e profissionais.
A Jamisson Melo, meu amor, parceiro de todos os sonhos,
que me motiva a tentar ser uma pessoa
melhor todos os dias.
vi
AGRADECIMENTOS
Desejo expressar a minha mais profunda gratidão a todos aqueles que
contribuíram direta ou indiretamente na elaboração deste trabalho e que foram
fundamentais para o desenvolvimento do mesmo. Destaco aqui, em especial, a
participação de algumas destas pessoas:
a) à Profa.. Dra. Patricia Rieken Macêdo Rocco, minha orientadora e querida amiga
desta e de outras vidas, que é um ser humano iluminado e o mais perfeito exemplo
de profissionalismo que conheço, e que me guiou pelos caminhos da teoria, da
técnica e da pesquisa. Meus profundos e sinceros agradecimentos por ter me
incentivado a crescer como pessoa e como profissional, mesmo nos momentos em
que duvidei que conseguiria;
b) à Profa. Dra. Letícia Maria Furlanetto, minha grande amiga de longa data, experiente
pesquisadora e revisora de publicações científicas, pelo seu suporte de todas as
horas e suas inestimáveis sugestões na elaboração e publicação deste trabalho;
c) aos colegas e parceiros do Laboratório de Investigação Pulmonar, Johnatas Dutra
Silva, Soraia Carvalho Abreu, Cynthia Santos Samary, Isabela Henriques Lucas
Guimarães, Debora Gonçalves Xisto e Marcelo Marcos Morales, que constituem
uma equipe internacionalmente reconhecida por sua excelência. Seu esmero e a
capacidade ímpar de superar obstáculos e dificuldades técnicas, que surgiram no
decorrer do estudo, foram cruciais para que pudéssemos viabilizar o presente estudo;
d) ao Sr. André Benedito da Silva, técnico do Laboratório de Investigação Pulmonar,
pelo seu zelo no cuidado com os animais envolvidos na nossa pesquisa;
vii
RESUMO
BURBURAN, Shirley Moreira. Avaliação dos efeitos pulmonares dos anestésicos
inalatórios em um modelo murino de asma alérgica crônica. Tese (Doutorado em
Clínica Médica) - Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, 2013.
O papel protetor dos anestésicos voláteis na síndrome do desconforto respiratório
aguda vem sendo intensamente estudado, entretanto, até o presente, nenhum estudo
avaliou seus efeitos imunomodulatórios na asma. O presente estudo analisou os
efeitos dos anestésicos isoflurano, halotano e sevoflurano sobre os aspectos
morfofuncionais pulmonares, bem como sobre o processo inflamatório e o estresse
oxidativo na asma alérgica experimental. Para tal, 56 camundongos BALB/c foram
sensibilizados e desafiados com ovalbumina e anestesiados com isoflurano (ISO), o
halotano (HALO), sevoflurano (SEVO) ou pentobarbital sódico (CTRL) durante 60
minutos. Foram avaliadas a resistência das vias aéreas, a elastância estática do
pulmão e a morfometria pulmonares. Além disso, quantificou-se a expressão de
mediadores envolvidos na inflamação [fator de necrose tumoral (TNF)-α], fibrogênese
[fator transformador do crescimento (TGF)-β], angiogênese [fator de crescimento
vascular endotelial (VEGF)] e também no processo oxidativo [fator nuclear eritróide 2
relacionado ao fator 2 (Nrf2), Sirtuína (Sirt)-1, catalase e glutationa peroxidase (GPx)].
ISO, HALO e SEVO reduziram a resistência das vias aéreas (-37%, -35% e -52%), a
elastância estática do pulmão (-16%, -19% e -22%) e a fração de alvéolos colapsados
(-25%, -48% e -57%) em relação ao CTRL (p < 0,001). SEVO diminuiu também a
broncoconstrição (-22%), a infiltração de células polimorfonucleares (-39%) e a
expressão de TNF-α (-71%), TGF-β (-63%), VEGF (-50%), Sirt-1 (-80%), catalase (-
76%) e GPx (-69%) e aumentou significativamente o Nrf2 (+579%). A anestesia com
sevoflurano melhorou a função pulmonar e a fração de área de alvéolos colapsados,
reduziu processo inflamatório e minimizou o stress oxidativo no presente modelo
murino de asma.
viii
Palavras-chave: ANESTÉSICOS INALATÓRIOS, ASMA ALÉRGICA; VIAS AÉREAS;
RESISTÊNCIA; ELASTÂNCIA; MECÂNICA PULMONAR; HISTOLOGIA PULMONAR;
BIOLOGIA MOLECULAR; MEDIADORES INFLAMATÓRIOS; ESTRESSE
OXIDATIVO; MODELO ANIMAL.
ix
ABSTRACT
BURBURAN, Shirley Moreira. Lung effects of inhalational anesthetics in a murine
model of allergic asthma. Tese (Doutorado em Clínica Médica) - Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2013.
Investigations have reported a protective role of volatile anaesthetics in acute
respiratory distress syndrome protocols. Nevertheless, so far, no studies have
examined the immunomodulatory effects of these agents in asthma. Thus, we
evaluated whether isoflurane, halothane and sevoflurane improve lung
morphofunction, and attenuate the inflammatory response in experimental asthma.
Fifty-six BALB/c mice were sensitized and challenged with ovalbumin and
anaesthetized with isoflurane (ISO), halothane (HALO), sevoflurane (SEVO) or
pentobarbital sodium (CTRL) during one hour. Airway resistance, static lung elastance
and lung morphometry were evaluated. Gene expression of pro-inflammatory [tumour
necrosis factor (TNF)-α], profibrogenic [transforming growth factor (TGF)-β], and
proangiogenic [vascular endothelial growth factor (VEGF)] mediators, and also the
oxidative process [nuclear factor erythroid-2 related factor 2 (Nrf2), Sirtuin (sirt)-1,
catalase, and glutathione peroxidase (GPx)] were analysed. ISO, HALO, and SEVO
reduced airway resistance (-37%, -35%, and -52%), static lung elastance (-16%, -19%,
and -22%), and the fraction area of alveolar collapse (-25%, -48%, and -57%)
compared to CTRL (p < 0.001). Sevoflurane anaesthesia minimized
bronchoconstriction (-22%) and polymorphonuclear cell infiltration (-39%) and
decreased TNF-α (-71%), TGF-β (-63%), VEGF (-50%), Sirt-1 (-80%), catalase (-76%),
and GPx (-69%), while increasing Nrf2 expression (+579%). Sevoflurane down-
regulated inflammatory, fibrogenic, and angiogenic mediators, and also the oxidant-
antioxidant imbalance, improving lung mechanics and histology in the present model
of asthma.
Keywords: INHALATIONAL ANESTHETICS, ALLERGIC ASTHMA, AIRWAYS;
RESISTANCE; ELASTANCE; LUNG MECHANICS; LUNG HISTOLOGY;
xi
LISTA DAS ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Caracterização dos grupos experimentais 34
Figura 2. Modelo de indução de asma alérgica crônica 35
Figura 3. Montagem experimental 38
Figura 4. Método da oclusão ao final da inspiração 40
Figura 5. Fórmulas utilizadas na medida da mecânica pulmonar 41
Figura 6. Retículo para quantificação dos parâmetros morfométricos 43
Figura 7. Mecânica pulmonar 47
Figura 8. Morfometria pulmonar 48
Figura 9. Fotomicrografias das vias aéreas e parênquima pulmonar 50
Figura 10. RT-PCR em tempo real 51
Figura 11. RT-PCR em tempo real 52
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Propriedades físico-químicas dos anestésicos inalatórios 19
Tabela 2. Primers utilizados na RT-PCR 45
Tabela 3. Morfometria pulmonar 49
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
BALF - fluido do lavado broncoalveolar
CAM - concentração alveolar mínima
CO2 - dióxido de carbono
EPM - erro padrão da média
ERA - elementos de resposta a antioxidantes
ERNs - espécies reativas de nitrogênio
EROs - espécies reativas de oxigênio
Est,L - elastância estática do pulmão
FR - frequência respiratória
GABAA - receptor do ácido gama-aminobutírico do tipo A
GPx - glutationa peroxidase
IB - índice de broncoconstrição
IL - interleucina
IP - intraperitoneal
IT - intratraqueal
LPA - lesão pulmonar aguda
MN - células mononucleares
N2O - óxido nitroso
NADPH - nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NI - número de interceptos das linhas
NP - número de pontos incidentes no lúmen da via aérea
Nrf2 - fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2
NO - óxido nítrico
PaCO2 - pressão parcial de dióxido de carbono no sangue arterial
PaO2 - pressão parcial de oxigênio no sangue arterial
PEEP - pressão expiratória positiva final
Pel - pressão pulmonar de retração elástica
Pi - pressão pulmonar no ponto de inflexão
Pmax - pressão pulmonar máxima atingida
PMN - células polimorfonucleares
Ptr - pressão traqueal
xiv
Raw - resistência das vias aéreas
Req - resistência total do equipamento
RNAm - ácido ribonucleico mensageiro
Rrs - resistência do sistema respiratório
RT-PCR - reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa
SDRA - síndrome do desconforto respiratório agudoSirt-1 - Sirtuína-1
SOD - superóxido dismutase
TGF-β - fator transformador do crescimento
Th1 - linfócitos T-helper tipo 1
Th2 - linfócitos T-helper tipo 2
TNF-α - fator de necrose tumoral- α
V’ - fluxo inspiratório
VEGF - fator de crescimento endotelial vascular
VT - volume corrente
ΔPeq - variação de pressão determinada pelo equipamento
xv
SUMÁRIO
FOLHA DE ROSTO ii
FICHA CATALOGRÁFICA ii
FOLHA DE APROVAÇÃO iii
AGÊNCIAS FINANCIADORAS iv
DEDICATÓRIAS v
AGRADECIMENTOS vi
RESUMO vii
ABSTRACT ix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES xi
LISTA DE TABELAS xii
LISTA DE ABREVIATURAS xiii
SUMÁRIO xv
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1.1 Asma: Definição e Patogênese
1.1.2 Fisiopatologia da Asma
1.1.3 Mediadores na Asma
1.1.4 Papel do Estresse Oxidativo na Asma
1.1.5 O Modelo Murino de Asma Crônica
1.1.6 Anestésicos Inalatórios na Asma
3
3
4
7
9
15
16
2 JUSTIFICATIVA 28
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
31
31
31
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS UTILIZADOS
4.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
4.3 SENSIBILIZAÇÃO
4.4 DESAFIO INTRATRAQUEAL
4.5 MEDIDA DA MECÂNICA PULMONAR
32
32
32
33
34
35
xvi
4.6 ANÁLISE DA HISTOLOGIA E MORFOMETRIA PULMONARES
4.7 ANÁLISE DA RT-PCR EM TEMPO REAL
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
41
44
45
5 RESULTADOS 46
6 DISCUSSÃO 53
7 CONCLUSÕES 61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 62
APÊNDICES 79
1
1 INTRODUÇÃO
A asma é um importante problema de Saúde Pública em todo o mundo. Sua
prevalência vem aumentando nos últimos 20 anos tanto nos países desenvolvidos
como naqueles em desenvolvimento, afetando pessoas de todas as idades e grupos
étnicos (BATEMAN et al., 2008; GINA, 2012). De acordo com a Organização Mundial
de Saúde, a asma atinge cerca de 240 milhões de pessoas no mundo e promove cerca
de 250 mil mortes/ano (BATEMAN et al., 2008; GINA, 2012). A asma alérgica é o tipo
mais comum e acomete aproximadamente 80% dos pacientes asmáticos (COHN et
al., 2004). Segundo dados do International Study for Asthma and Allergies in
Childhood (ISAAC), a prevalência da asma no Brasil é de aproximadamente 20%
(SOLE et al., 2006; SOLE et al., 2007). A asma é responsável, no nosso país, por
mais de 350 mil internações hospitalares por ano constituindo-se na quarta causa de
hospitalização pelo Sistema Único de Saúde, sendo a terceira causa entre crianças e
adultos jovens (IV Diretrizes Brasileiras para o Manejo da Asma, 2007).
Tudo isso, aliado ao fato da asma ser uma doença comumente
subdiagnosticada em grande número de casos e da baixa adesão ao tratamento
(GINA, 2012), faz com que os anestesiologistas se deparem com situações
desafiadoras e complicações devidas à asma na sua prática diária (BURBURAN et
al., 2007b).
Isoflurano, halotano e sevoflurano são anestésicos inalatórios halogenados de
uso rotineiro e em larga escala na prática clínica anestesiológica. São
tradicionalmente conhecidos por sua ação broncodilatadora (FLETCHER et al., 1968;
HIRSHMAN et al., 1982; EGER, 1984), por diminuírem a reatividade das vias aéreas
e por atenuarem a broncoconstrição induzida pela histamina (BROWN et al., 1993;
KATOH & IKEDA, 1994; JAGODA et al., 1997; BURBURAN et al., 2007b). Há também
relatos do uso benéfico dos halogenados em pacientes com asma refratária (mal
asmático) ao tratamento convencional (ROSSEEL et al., 1985; BIERMAN et al., 1986;
ECHEVERRIA et al., 1986; PARNASS et al., 1987; JOHNSTON et al., 1990;
SAULNIER et al., 1990; GONZALEZ MARTIN et al., 1992; TAKISE et al., 1992;
SHIBATA et al., 1993; MALTAIS et al., 1994; MORI et al., 1996; JAGODA et al., 1997;
MIYAGI et al., 1997; PADKIN et al., 1997; QUE & LUSAYA, 1999; WHEELER et al.,
2000; REVICH et al., 2001; MUTLU et al., 2002; BAIGEL, 2003; RESTREPO et al.,
2
2005; SCHULTZ, 2005; SHANKAR et al., 2006; WATANABE et al., 2008). Além disso,
os efeitos anti-inflamatórios dos anestésicos inalatórios têm sido demonstrados em
modelos de lesão pulmonar aguda (LPA) ou na síndrome do desconforto respiratório
agudo (SDRA) (GIRAUD et al., 2000; PLACHINTA et al., 2003; HOFSTETTER et al.,
2005; BOOST et al., 2007; HOFSTETTER et al., 2007; DE CONNO et al., 2009; LI et
al., 2009; STEURER et al., 2009; CASANOVA et al., 2011; MAHMOUD & AMMAR,
2011; SCHILLING et al., 2011; URNER et al., 2011; FORTIS et al., 2012), situações
que diferem da asma, onde a fisiopatologia é distinta e o processo inflamatório é
crônico.
De fato, novos conhecimentos sobre a fisiopatologia da asma, adquiridos na
última década, revelaram que o processo inflamatório é persistente e extenso,
cursando com remodelamento não somente das vias aéreas centrais, mas também
das vias aéreas periféricas e do parênquima pulmonar (LAZAAR & PANETTIERI,
2003; TULIC & HAMID, 2003; CHEN et al., 2004; COHN et al., 2004; RAMOS-
BARBON et al., 2004; HOMER & ELIAS, 2005; XISTO et al., 2005; VAN HOVE et al.,
2008). O envolvimento de várias células inflamatórias do sistema imune e das células
constitutivas das vias aéreas na asma tem sido documentado (COHN et al., 2004;
BERRY et al., 2006; BABU et al., 2011; GINA, 2012; PELAIA et al., 2012). Ademais,
o papel do estresse oxidativo na patogênese e na progressão da asma tem se
mostrado cada vez mais relevante (LI et al., 2003; MAK & CHAN-YEUNG, 2006;
RIEDL & NEL, 2008; DOZOR, 2010; MICHAELOUDES et al., 2011a;
MICHAELOUDES et al., 2011b; PELAIA et al., 2012). O estresse oxidativo pode
ocorrer como consequência do processo inflamatório e, concomitantemente,
promover ativação de genes pró-inflamatórios que, por sua vez, perpetuam e
amplificam a resposta inflamatória na asma (PELAIA et al., 2012). A hiper-reatividade
das vias aéreas característica do paciente asmático e a gravidade das manifestações
da doença estão diretamente relacionadas com a reduzida resposta antioxidante e
com a elevada produção das espécies reativas de oxigênio e de radicais livres nesses
pacientes (RIEDL & NEL, 2008; KIM, J et al., 2010).
Todavia, estudos descrevendo os efeitos dos anestésicos inalatórios sobre vias
aéreas e parênquima cronicamente inflamados e remodelados pela asma, ainda são
bastante escassos (BURBURAN et al., 2007a). Com o presente estudo visamos
preencher tal lacuna analisando os efeitos pulmonares da anestesia com isoflurano,
halotano e sevoflurano no que tange aos aspectos morfofuncionais,
3
imunomodulatórios e ao estresse oxidativo. Para isso, utilizamos um modelo murino
de asma alérgica crônica, no qual foram reproduzidas alterações inflamatórias e
ultraestruturais similares às observadas na asma humana (XISTO et al., 2005).
1.1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1.1 Asma: Definição e Patogênese
Definir asma tem sido sempre objeto de discussão e várias tentativas foram
feitas ao longo dos anos para definir o conceito de asma a partir do seu impacto sobre
a função pulmonar, ou seja, através da limitação do fluxo aéreo e da reversibilidade e
da hiper-reatividade brônquica. Entretanto, tais tentativas se mostravam infrutíferas
devido ao limitado conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na fisiopatologia
da doença. Foi somente a partir de uma melhor compreensão desses mecanismos,
sobretudo no que concerne às manifestações inflamatórias da doença, suas
consequências e sua correlação com as alterações evidenciadas na função pulmonar,
que o conceito de asma foi redefinido (BUSSE & LEMANSKE, 2001; GINA, 2012).
Mais recentemente, os consensos têm definido a asma de forma mais
cuidadosa e elaborada, mas a falta de um marcador biológico ou fisiológico exclusivo
da doença, ou ainda a inespecificidade dos sintomas e a variabilidade da expressão
clínica da asma entre os pacientes, ou até em um único indivíduo, tornam tais
definições ainda insatisfatórias, por serem essas muito mais descritivas do que
assertivas (GINA, 2012). As dificuldades na definição da asma explicam em grande
parte os problemas em se investigar a epidemiologia da doença.
A asma é uma doença de grande complexidade genética, com caráter
hereditário entre 36% e 94%, e que conta com a participação de mais de 100 tipos de
genes já identificados nos diversos e heterogêneos mecanismos fisiopatológicos
observados na doença (ANDERSON, 2008). Conceitua-se como uma doença
inflamatória crônica do sistema respiratório na qual grande variedade de células e
elementos provenientes do metabolismo das mesmas encontram-se envolvidos
(BROIDE, 2008). A inflamação crônica acarreta um aumento na reatividade das vias
aéreas que se manifesta através de episódios recorrentes de broncoespasmo,
dispneia, opressão torácica e tosse, principalmente durante a noite (TILLIE-LEBLOND
et al., 2009). Tais episódios estão geralmente associados com um grau variável de
4
obstrução ao fluxo aéreo que é frequentemente reversível espontaneamente ou com
tratamento específico (TLIBA et al., 2008; TILLIE-LEBLOND et al., 2009). Contudo, a
completa reversibilidade do quadro não ocorre, ou se faz apenas parcialmente, em
pacientes portadores de quadros mais graves de asma (BOUSQUET et al., 2000;
VIGNOLA et al., 2003; BUSSE et al., 2004). Por conseguinte, o papel que a reação
inflamatória crônica desempenha na patogênese da asma tem sido alvo de vários
estudos (BERRY et al., 2006; BROIDE, 2008; TLIBA et al., 2008; BURGESS, 2009).
A inflamação é um achado sempre presente em todos os pacientes asmáticos, seja
na asma considerada leve, moderada ou grave. As respostas inflamatórias, porém,
sofrem variações de acordo com a gravidade, com o tratamento e com o tempo de
duração da doença (BOUSQUET et al., 2000; TANAKA et al., 2001; VIGNOLA et al.,
2003; BUSSE et al., 2004; COHN et al., 2004; BROIDE, 2008; BURGESS, 2009;
TILLIE-LEBLOND et al., 2009; GINA, 2012; PELAIA et al., 2012).
1.1.2 Fisiopatologia da Asma
A Inflamação na asma crônica é muito complexa e envolve a ativação de todas
as células das vias respiratórias, incluindo as células T, eosinófilos, mastócitos,
macrófagos, células epiteliais, fibroblastos e as células musculares lisas dos
brônquios. Os eosinófilos desempenham um papel crucial na liberação de mediadores
pró-inflamatórios, resultando no aumento da permeabilidade vascular, hipersecreção
de muco, contração do músculo liso, descamação epitelial e hiper-responsividade
brônquica. Essas células atuam também promovendo a modulação da inflamação das
vias aéreas e iniciando o processo de remodelamento pela liberação de citocinas e
fatores de crescimento.
O termo citocina é usado genericamente para um grande grupo de proteínas
solúveis que agem como reguladores humorais em concentrações nano ou
picomolares. Tanto em condições normais como nas patológicas, elas modulam as
atividades funcionais de células e de tecidos através de receptores específicos na
superfície das células-alvo. As citocinas também têm a capacidade de mediar
interações diretas entre células e de regular processos que ocorrem no ambiente
extracelular, bem como de atuar como fator de sobrevivência celular, prevenindo a
apoptose (morte celular programada). Elas agem em células-alvo modulando uma
ampla gama de funções celulares, que incluem ativação, proliferação, migração,
5
imunomodulação, liberação de outras citocinas ou mediadores, crescimento e
diferenciação celular, e apoptose.
Durante muitos anos considerou-se que as células epiteliais brônquicas agiam
essencialmente como uma barreira participando do transporte mucociliar e remoção
de agentes nocivos. Atualmente, sabe-se que tais células também participam
ativamente nas reações inflamatórias (COHN et al., 2004). Na asma, o epitélio
apresenta-se parcialmente desnudado, as células ciliadas edemaciadas, vacuolizadas
e com perda dos cílios (BOUSQUET et al., 2000).
Todas as características observadas na inflamação pulmonar e a desregulação
fisiológica observada na asma são o resultado final dos eventos moleculares e
celulares envolvidos na sensibilização, da ativação dos linfócitos T-helper do tipo 2
(Th2), da elaboração de citocinas Th2 e dos mecanismos efetores dessas citocinas.
A resposta inflamatória alérgica ocorre a partir da interação dos alérgenos com os
linfócitos Th2, com a consequente liberação de diversos mediadores químicos que
são responsáveis pelo início e perpetuação do processo inflamatório (COHN et al.,
2004; BERRY et al., 2006; BABU et al., 2011; GINA, 2012; PELAIA et al., 2012). Vários
mediadores inflamatórios são liberados pelos mastócitos (histamina, leucotrienos,
triptase e prostaglandinas), pelos macrófagos [fator de necrose tumoral-alfa (TNF)-α,
interleucina (IL)-6, óxido nítrico (NO)], pelos linfócitos T [IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, fator de
crescimento de colônia de granulócitos], pelos eosinófilos (proteína básica principal,
mediadores lipídicos e citocinas), pelos neutrófilos (elastase) e pelas células epiteliais
(endotelina-1, mediadores lipídicos, NO). O acúmulo desses mediadores nos tecidos
promove dano e ruptura do epitélio das vias aéreas, expondo as terminações nervosas
dendríticas que liberam neurotransmissores como a substância P e a neurocinina que,
por sua vez, aumentam a reatividade do músculo liso e o tônus da via aérea, elevando
a permeabilidade vascular e a secreção de muco (BOUSQUET et al., 1990;
BOUSQUET et al., 2000). A hiperplasia e hipertrofia da musculatura lisa dos
brônquios, a metaplasia de células caliciformes e o aumento da angiogênese e da
inervação brônquicas também são achados frequentes (BOUSQUET et al., 2000;
BUSSE et al., 2004; TLIBA et al., 2008; BURGESS, 2009; TILLIE-LEBLOND et al.,
2009).
A persistência do processo inflamatório resulta em profundas alterações na
geometria das vias aéreas, alterações estas que, em conjunto, denominam-se
remodelamento. O remodelamento é um processo dinâmico que interpõe lesão
6
inflamatória e reparo tecidual pela produção de matriz extracelular, resultando em
alteração irreversível das vias aéreas dos indivíduos asmáticos. Essas modificações
podem decorrer da interação de estímulos mecânicos sobre a via aérea
(TSCHUMPERLIN et al., 2003) e também de fatores genéticos envolvidos na asma
(DAVIES et al., 2003; TLIBA et al., 2008). O remodelamento das vias aéreas é
considerado um fator determinante da irreversibilidade do padrão obstrutivo
respiratório na asma (TANAKA et al., 2001; VIGNOLA et al., 2003; VAN HOVE et al.,
2008; BURGESS, 2009).
Nos últimos anos surgiram novas evidências sugerindo que a inflamação e o
remodelamento que caracterizam a asma ocorrem não somente nas vias aéreas
centrais, mas acometem também as vias aéreas periféricas e o parênquima pulmonar
(LAZAAR & PANETTIERI, 2003; TULIC & HAMID, 2003; CHEN et al., 2004; COHN et
al., 2004; RAMOS-BARBON et al., 2004; HOMER & ELIAS, 2005; XISTO et al., 2005;
VAN HOVE et al., 2008; BURGESS, 2009). Há evidências de que a inflamação das
vias aéreas distais é ainda mais grave do que aquela observada nas vias aéreas
centrais (TULIC et al., 2001; TULIC & HAMID, 2003). À luz desses novos
conhecimentos, a asma passou a ser compreendida como uma doença inflamatória
crônica que compromete todo o trato respiratório e não somente as vias aéreas
centrais. Destarte, a tentativa de qualquer ação terapêutica eficaz na doença, não
deve prescindir do uso de drogas que atuem modulando o processo inflamatório
também nas vias aéreas distais pulmonares (HANANIA, 2008).
A exposição ao alérgeno é um importante componente na asma e resulta em
resposta imunológica cuja fisiopatologia ainda não é totalmente conhecida. O
conhecimento dos mediadores envolvidos nessa resposta imune permite delinear
potenciais alvos terapêuticos para minimizar ou abolir os sintomas da asma. O
bloqueio de mediadores específicos se mostra particularmente interessante quando
comparado com o bloqueio inespecífico proporcionado pela imunossupressão obtida
com os corticosteroides, rotineiramente empregados no tratamento da asma e cujos
efeitos colaterais limitam bastante o seu uso.
Como vimos anteriormente, as citocinas atuam em várias etapas do processo
inflamatório na asma e uma rede imbricada de interações celulares mediadas por
citocinas é responsável pelo cenário observado na asma (GINA, 2012). Por este
motivo, tais mediadores têm sido objeto de muitas investigações. Aparentemente, há
grande pleiotropia e elementos de redundância na família das citocinas, de modo que
7
cada citocina tem muitas funções superponíveis, ao mesmo tempo em que cada
função pode ser potencialmente mediada por mais de uma citocina. A seguir
enumeraremos sucintamente alguns dos mediadores cujo envolvimento na asma já
está bem estabelecido e que, por este motivo, estão diretamente relacionados com o
presente estudo.
1.1.3 Mediadores na Asma
O TNF-α é uma citocina que desempenha um papel primordial em diversas
condições inflamatórias e sua atividade biológica foi inicialmente descrita no plasma
de animais submetidos à injeção de endotoxinas indutoras de necrose tumoral
(lipopolissacarídeos de bactéria gram-negativa ou LPS), daí advindo sua
denominação (CARSWELL et al., 1975). O TNF-α é um dos primeiros mediadores
produzidos na vigência de um estímulo de origem inflamatória (KIM & REMICK, 2007)
e subsiste como uma molécula biologicamente ativa na superfície das células. Uma
enzima, a TNF-α convertase, é responsável pela sua clivagem da superfície da célula
para a sua forma circulante. A ação do TNF-α na iniciação e na manutenção do
processo inflamatório já está bem documentada, inclusive na asma grave (SHAH et
al., 1995; THOMAS, 2001; HOWARTH et al., 2005; ERZURUM, 2006).
O TNF-α é produzido principalmente pelos macrófagos, apesar de outras
células inflamatórias (mastócitos, neutrófilos e eosinófilos) e estruturais (células
epiteliais, fibroblastos e fibras musculares lisas) também estarem envolvidas na sua
síntese (BABU et al., 2004). Além disso, outras citocinas pró-inflamatórias, incluindo
o próprio TNF-α, induzem a expressão do TNF-α.
Os níveis de TNF-α encontram-se significativamente aumentados nas vias
aéreas de pacientes alérgicos com asma (SHAH et al., 1995), particularmente
naqueles com asma grave (BABU et al., 2004; HOWARTH et al., 2005) e estudos
clínicos já demonstraram uma relação direta entre os níveis de TNF-α e a gravidade
do quadro clínico da doença (HOWARTH et al., 2005; BERRY et al., 2006).
Na asma alérgica, os alérgenos se ligam à Imunoglobulina E (IgE), ativam os
mastócitos que, na sequência, se degranulam e liberam o TNF-α previamente
armazenado (GORDON & GALLI, 1991).
Nas vias aéreas, o TNF-α desempenha vários e relevantes papéis na
fisiopatologia da doença: 1) aumento da reatividade das vias aéreas (THOMAS et al.,
8
1995; CHEN et al., 2003); 2) infiltração das vias aéreas pelos neutrófilos (LUKACS et
al., 1995); 3) recrutamento pulmonar e ativação de eosinófilos (LUKACS et al., 1995;
CASALE et al., 1996); 4) ativação dos miofibroblastos (THOMAS, 2001) e das fibras
musculares lisas das vias aéreas (AMRANI et al., 2000; CHEN et al., 2003); e 5)
aumento da permeabilidade vascular através do recrutamento de moléculas de
adesão (THORNHILL et al., 1991; TOSI et al., 1992)
A ativação crônica de células inflamatórias e constitutivas da via aérea está
intimamente ligada ao aumento da concentração das espécies reativas de oxigênio
(EROs) e de nitrogênio (ERNs), que vão ocasionar lesão e mudanças estruturais
irreversíveis, o chamado remodelamento (BABU et al., 2004; ERZURUM, 2006). O
TNF-α também contribui para o remodelamento ao induzir proliferação e ativação de
fibroblastos, aumento da expressão de glicoproteínas da matriz extracelular, fibrose
subepitelial, e hiperplasia das células caliciformes (THOMAS, 2001; ERZURUM,
2006).
Conforme o exposto, devido ao seu papel crítico na asma, o TNF-α é hoje
considerado um importante alvo terapêutico, sobretudo na asma grave, e estudos
sobre o assunto têm mostrado resultados promissores até o presente (HOWARTH et
al., 2005; BERRY et al., 2006).
O remodelamento brônquico resulta de uma variedade de alterações estruturais
nas vias aéreas dos asmáticos, principalmente hiperplasia e hipertrofia das células
musculares lisas dos brônquios (BOUSQUET et al., 2000). Ainda não se conhece
completamente o mecanismo envolvido na hiperplasia da musculatura brônquica, mas
estudos in vitro sugerem que muitos mediadores participam no processo (HIRST et
al., 2004). Nos indivíduos asmáticos observou-se o aumento da expressão gênica do
fator transformador do crescimento (TGF)-β no epitélio e submucosa dos brônquios
(VIGNOLA et al., 1997; XIE et al., 2007), além da elevação dos seus níveis no fluido
do lavado bronchoalveolar (BALF) (REDINGTON et al., 1997).
O TGF-β é uma citocina fibrogênica multifuncional capaz de modular a
proliferação, a diferenciação, a apoptose e a migração de vários tipos de células, bem
como a produção de proteínas da matriz extracelular, sendo muito importante na
imunidade adaptativa e crucial no remodelamento da via aérea (VIGNOLA et al., 2003;
XIE et al., 2007).
Nas vias aéreas, o TGF-β é produzido pelas células epiteliais, fibroblastos,
eosinófilos e macrófagos e tem potente ação pró-fibrogênica induzindo a síntese de
9
colágeno tipos I e III, fibronectina e proteoglicanos, além de transformar fibroblastos
em miofibroblastos (MORISHIMA et al., 2001). O TGF-β não age diretamente sobre
as células musculares lisas das vias aéreas, mas o faz através da ativação do fator
de crescimento dos fibroblastos (BOSSE et al., 2006) que estimula da proliferação de
tecido conjuntivo e o estabelecimento progressivo da fibrose.
O TGF-β também tem ação pró-inflamatória ao induzir a liberação de IL-6, a
qual, por sua vez, estimula a síntese do fator de crescimento vascular endotelial
(VEGF) pelas células musculares lisas (SHIN et al., 2009). Outrossim, o TGF-β age
sobre diferentes tipos de células promovendo a formação de radicais livres e,
concomitantemente, inibindo a resposta antioxidante. Tal desequilíbrio aumenta o
estresse oxidativo e potencializa ainda mais a resposta inflamatória
(MICHAELOUDES et al., 2011b).
O VEGF é conhecido como um dos mais potentes indutores da angiogênese,
pois atua promovendo neovascularização e aumentando a permeabilidade vascular,
duas situações características do remodelamento da via aérea na asma. O VEGF é
produzido pelas células musculares lisas dos brônquios, mas este processo não foi
ainda completamente elucidado (SHIN et al., 2009). A neovascularização observada
na asma é dependente do VEGF e da expressão do receptor do fator de crescimento
endotelial vascular-1 e -2 (HOSHINO et al., 2001a). A angiogênese ocorre como
consequência da replicação dos angioblastos residentes nas vias respiratórias e
também do recrutamento de células mesenquimais.
As alterações na microcirculação das vias respiratórias, decorrentes do
fenômeno de angiogênese, contribuem para o edema da parede das vias aéreas
enquanto a densidade de vasos relaciona-se com a gravidade da manifestação da
doença sendo determinante no grau de hiper-reatividade das vias aéreas (HOSHINO
et al., 2001b).
1.1.4 Papel do Estresse Oxidativo na Asma
O estresse oxidativo consiste no desequilíbrio entre a formação e a remoção de
agentes oxidantes no organismo, proveniente da geração excessiva de EROs e/ou da
diminuição da produção ou ação dos antioxidantes endógenos. Os radicais livres, como
o ânion superóxido, hidroxila, alcoxila, peroxila e hidroperoxila, são elementos químicos
que contêm um ou mais elétrons não emparelhados em seu orbital eletrônico mais
10
externo, ao passo que as EROs são quaisquer espécies oxidantes altamente reativas,
inclusive os radicais livres. Exemplos de EROs são o peróxido de hidrogênio, ácido
hipocloroso, ozônio, oxigênio singlete e peróxidos lipídicos: todos capazes de induzir a
produção de radicais livres no nosso organismo.
A ocorrência de um estresse oxidativo moderado, usualmente está associada ao
correspondente aumento das defesas antioxidantes enzimáticas, visando ao
restabelecimento do equilíbrio entre oxidação-antioxidação. O radical superóxido, o
primeiro produto da redução da molécula de oxigênio, tem um elétron desemparelhado
em sua órbita externa e isso resulta em uma fonte importante de hidroperóxidos e de
radicais livres tóxicos. Uma célula normal tem a habilidade de detoxificar radicais
superóxido por meio de enzimas como a superóxido dismutase (SOD) que converte o
ânion superóxido em peróxido de hidrogênio, o qual, através da ação da catalase e da
glutationa peroxidase (GPx), será posteriormente transformado em uma molécula de
água e oxigênio. A SOD, a catalase e a GPx, ajudam a manter a concentração de
nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) necessária para a ótima função
dos mecanismos de defesas antioxidantes. Todavia, há situações nas quais o processo
oxidativo supera a ação antioxidante e a presença de uma grande quantidade de EROs
e radicais livres pode ocasionar danos estruturais variáveis nas biomoléculas de DNA,
lipídios, carboidratos, proteínas e outros componente celulares, levando a dano
mitocondrial e morte celular.
Recentemente, a importância do estresse oxidativo na patogênese e progressão
da asma tem despertado cada vez mais o interesse da comunidade científica (LI et al.,
2003; MAK & CHAN-YEUNG, 2006; RIEDL & NEL, 2008; DOZOR, 2010;
MICHAELOUDES et al., 2011a; MICHAELOUDES et al., 2011b; PELAIA et al., 2012).
Altas concentrações de EROs como ânions superóxidos, peróxido de hidrogênio e
radicais hidroxila já foram demonstradas no plasma e nas células pulmonares de
pacientes asmáticos (MAK et al., 2004; RIEDL & NEL, 2008; AHMAD et al., 2012).
As EROs reagem com as ERNs aumentando a concentração do NO exalado nos
pacientes asmáticos. De fato, o controle seriado da fração expirada de NO vem sendo
utilizado no acompanhamento do grau de inflamação presente nas vias aéreas desses
pacientes e para avaliar a resposta à terapêutica instituída (KHARITONOV et al., 1997).
Do mesmo modo que o estresse oxidativo resulta do processo inflamatório e da
produção de radicais livres pelos macrófagos, neutrófilos e eosinófilos, ele também tem
o poder de deflagrar e potencializar a reação inflamatória, ao alterar a função das células
11
T e a relação Th1/Th2 ao desviar a resposta imune do fenótipo Th1 para o Th2. O
predomínio das células Th2 acarreta ativação de genes pro-inflamatórios e a liberação
de citocinas, induzindo alterações fisiopatológicas que, por sua vez, também amplificam
e perpetuam a resposta inflamatória na asma (PELAIA et al., 2012). Além disso, os
indivíduos asmáticos são incapazes de desenvolver uma resposta antioxidante
adequada perante o estresse oxidativo e a elevada concentração tissular dos radicais
livres mantém relação direta com o grau de hiper-reatividade das vias aéreas e com a
gravidade do quadro clínico desses pacientes (RIEDL & NEL, 2008).
Na asma, os altos níveis de TGF-β também respondem pela inibição da
expressão de várias enzimas antioxidantes como a glutaredoxina, catalase, SOD e
GPx e reduzem a concentração da glutationa livre intracelular, o mais abundante
antioxidante, levando, por conseguinte, ao aumento dos níveis de EROs/ERNs nos
tecidos pulmonares (LIU & GASTON PRAVIA, 2010).
O atual conhecimento sobre a relevância do papel do estresse oxidativo na asma
alimenta a hipótese de que a terapia antioxidante possa ser de utilidade na prevenção e
no tratamento da doença (DOZOR, 2010). Vários fatores envolvidos no processo
oxidativo têm sido investigados neste sentido e novas pesquisas detalhando seus
mecanismos moleculares subjacentes ao processo inflamatório e ao estresse oxidativo
poderão indicar novas possibilidades terapêuticas para a asma. Alguns desses fatores
têm se destacado no equilíbrio oxidativo na asma e por esta razão foram também
avaliados no presente estudo.
O fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2 (Nrf2) é um fator de transcrição
reconhecido como um fator-chave na ativação de centenas de genes responsáveis pela
transcrição de mais de 200 enzimas antioxidantes, citoprotetoras, anti-inflamatórias e
detoxificadoras, defendendo as células de agressões endógenas e exógenas (ISHII et
al., 2000; CHO et al., 2004; REDDY et al., 2007; REDDY et al., 2009). O Nrf2
desempenha um papel protetor em muitas doenças, tais como o câncer, doenças
neurodegenerativas, doenças cardiovasculares, doenças autoimunes e inflamatórias,
além das lesões pulmonares agudas e crônicas (RANGASAMY et al., 2005; KIM, J et
al., 2010).
Sob condições fisiológicas normais, a transcrição do fator Nrf2 encontra-se inibida
pela proteína repressora Keap1, localizada no citoplasma das células. A proteína Keap1
contém resíduos conservados de cisteína, os quais desempenham um papel crítico na
manutenção do Nrf2 no citoplasma. Entretanto, um aumento na produção de EROs no
12
organismo promove a dissociação desse complexo, fazendo com que o Nrf2 fique
ativado, sendo transportado para o núcleo. No núcleo das células, esse fator de
transcrição se liga a elementos de resposta a antioxidantes (ERA) na região promotora
dos genes que transcrevem enzimas antioxidantes endógenas. A ativação Nrf2-ERA
induz a produção da SOD, catalase, GPx, glutationa reduzida, peroxiredoxinas, NADPH,
quinona oxidoredutases e hemoxigenases. Juntas, essas enzimas e peptídeos
respondem por um dos mais potentes mecanismos de defesa contra o estresse oxidativo
celular. Uma vez restabelecido o balanço redox da célula, o Nrf2 é dissociado do núcleo
pelo Keap1 e subsequentemente transportado para o citoplasma, onde é degradado
(KENSLER et al., 2007; KIM, J et al., 2010).
Variações genéticas conferem diferenças na expressão do Nrf2, que se apresenta
normalmente deficiente nos indivíduos asmáticos. Na vigência da deficiência de Nrf2, in
vitro, observou-se a reduzida proliferação dos pneumócitos tipo II e maior sensibilidade
da célula à ação dos oxidantes acarretando dano e morte celular (REDDY et al., 2007).
Em camundongos com deleção gênica do Nrf2, foram observadas reduzida
capacidade antioxidante acompanhada do aumento da expressão de citocinas Th2 (IL-
4 e IL-13) no BALF, grande hiper-responsividade das vias aéreas, que se apresentaram
infiltradas com eosinófilos e células de muco hiperplásicas (RANGASAMY et al., 2005),
maior susceptibilidade à asma alérgica induzida por ovalbumina (RANGASAMY et al.,
2005) e à lesão pulmonar aguda induzida por hiperóxia (REDDY et al., 2009; CHO et al.,
2010). Além disso, camundongos com deficiência do Nrf2 submetidos à lesão pulmonar
aguda, apresentam maior grau de inflamação e fibrose pulmonares, indicando a ação
protetora do Nrf2 contra a fibrogênese (CHO et al., 2004).
A acetilação de proteínas é uma modificação pós-translacional e um importante
regulador da transcrição. As sirtuínas são uma classe de enzimas que constituem uma
família de moléculas regulatórias e desempenham um papel fundamental na reversão
da acetilação regulatória das proteínas do tipo histona ou a atividade da
monoribosiltransferase. A Sirtuína (Sirt)-1 pertence à família das sirtuínas e é uma
histona desacetilase classe III com atividade reguladora transcricional, metabólica e de
apoptose. O estresse oxidativo pode aumentar ou diminuir os níveis da Sirt-1,
dependendo do grau e do tempo de exposição ao fator estressor (ABDELMOHSEN et
al., 2007; KIM et al., 2007; PROZOROVSKI et al., 2008). No endotélio vascular, a Sirt-1
atua por mecanismo dependente da óxido nítrico-sintetase endotelial (eNOS) que
aumenta a produção de NO e induz vasodilatação. A Sirt-1 desacetila a eNOS in vitro,
13
cuja forma acetilada é inversamente proporcional à atividade e/ou à expressão da Sirt-1
(MATTAGAJASINGH et al., 2007).
Na asma, ocorre a redução da atividade da histona desacetilase aliada ao
aumento da atividade da histona acetiltransferase nos tecidos pulmonares (ITO et al.,
2002; COSIO et al., 2004), porém, o mecanismo regulatório da Sirt-1 sobre os processos
inflamatórios ainda não é completamente conhecido. Em 2010, Kim e colaboradores
(KIM, S R et al., 2010) verificaram aumento significativo dos níveis da Sirt-1 e VEGF nos
tecidos pulmonares de camundongos sensibilizados e desafiados com ovalbumina.
Porém, após administração de um inibidor da Sirt-1, tais níveis diminuíram
significativamente e se associaram à redução do número de células inflamatórias nas
vias aéreas, menor reatividade, menor concentração de citocinas Th2 e menor
permeabilidade vascular. Kim e colaboradores sugeriram que os inibidores da Sirt-1
atenuam a reação inflamatória e a hiper-reatividade das vias aéreas através da
modulação do VEGF. Similarmente, Legutko et al. (LEGUTKO et al., 2011) demostraram
que a inibição da Sirt-1 acarretou redução da maturação e migração das células
dendríticas pulmonares, levando à diminuição da concentração de citocinas Th2 e,
consequentemente, à atenuação do processo inflamatório nos camundongos com
inflamação alérgica induzida por ovalbumina.
Contrariamente, recentemente, Ichikawa e colaboradores (ICHIKAWA et al.,
2013), utilizando-se também o modelo murino de asma alérgica induzida por
ovalbumina, verificaram menor expressão gênica da Sirt-1 nos pulmões dos animais
asmáticos. Nesse modelo experimental, após a administração de duas substâncias
ativadoras da Sirt-1, o resveratrol e o SRT1720, observou-se inibição significativa da
produção das citocinas Th2 no plasma e no BALF e atenuação da hiper-responsividade
das vias aéreas, da infiltração eosinofílica e da hipersecreção de muco (LEE et al., 2009;
ICHIKAWA et al., 2013), sugerindo que a Sirt-1 teria ação benéfica na asma.
Portanto, o atual conhecimento sobre o papel da Sirt-1 nos processos
inflamatórios e no estresse oxidativo ainda é inconclusivo e são necessários novos
estudos para que possamos elucidar os mecanismos de ação da Sirt-1 na vigência de
processos inflamatórios crônicos nos tecidos pulmonares e dirimir as controvérsias sobre
o assunto. Destarte, incluímos a avaliação da Sirt-1 no presente estudo.
O estresse oxidativo pode ser avaliado por meio da atividade de enzimas
envolvidas no balanço redox da célula, tais como a SOD, a catalase, a GPx e a glutationa
redutase. A GPx é uma enzima essencial na remoção de produtos tóxicos derivados da
14
peroxidação lipídica que são produzidos continuamente como resultado do processo
inflamatório nos pulmões dos asmáticos. A GPx age eliminando os radicais peróxido e
mantendo a integridade das membranas celulares, pois catalisa a redução do peróxido
de hidrogênio e peróxidos orgânicos para seus correspondentes álcoois às custas da
conversão da glutationa reduzida à glutationa oxidada. A conversão de peróxido de
hidrogênio resulta na formação de água e oxigênio pela GPx. Embora a GPx tenha ação
fundamentalmente citosólica, in vitro ela é capaz de reduzir também hidroperóxidos de
membrana.
Nos indivíduos asmáticos o estresse oxidativo encontra-se aumentado e há
elevada produção de peróxidos o que se reflete na concentração aumentada dos
peróxidos de hidrogênio no ar expirado dos pacientes asmáticos (FENECH & ELLUL-
MICALLEF, 1998). O selênio é importante cofator para a ação da GPx e para a defesa
antioxidante e evidências revelaram que o selênio encontra-se diminuído nos asmáticos
(KADRABOVA et al., 1996)
Os níveis plasmáticos da GPx podem sofrer aumento ou diminuição, dependendo
das condições em que o estresse oxidativo se estabelece. A atividade da GPx mostrou-
se reduzida no sangue total, no plasma e nas plaquetas de pacientes asmáticos
(KHARITONOV et al., 1994; ANTCZAK et al., 1997; KELLY et al., 1999). Recentemente,
Ahmad e colaboradores (AHMAD et al., 2012) também reportaram que pacientes
asmáticos apresentavam atividade total antioxidante muito comprometida, redução na
atividade da GPx nos eritrócitos e aumento da peroxidação lipídica e relacionaram a
baixa concentração de GPx naqueles pacientes estaria relacionada com a apresentação
clínica da doença. Eles concluíram que os pacientes com quadro de asma grave
persistente apresentavam maior concentração de peróxidos lipídicos e baixas
concentrações plasmáticas de antioxidantes no plasma e também que a concentração
de peróxidos se relacionava diretamente com o grau de obstrução das vias aéreas
(AHMAD et al., 2012).
A catalase é uma hemeproteína citoplasmática e um importante componente
do sistema de defesa antioxidante endógeno do pulmão, sendo responsável pela
redução do peróxido de hidrogênio a água e oxigênio, em condições fisiológicas. É
encontrada no sangue, na medula óssea, nas mucosas, nos rins e no fígado. A
suplementação de catalase exógena previne a oxidação da glutationa mediada pelo
peróxido de hidrogênio e inibe as lesões oxidativas do DNA.
15
Há evidências de que a atividade da catalase encontra-se atenuada nos
pulmões de camundongos com inflamação alérgica das vias aéreas e no BALF de
pacientes com asma leve (AHMAD et al., 2012) evidenciaram um aumento expressivo
na atividade da catalase nos eritrócitos de indivíduos com asma moderada e grave.
Todavia, Reynaert e colaboradores (REYNAERT et al., 2007) observaram que
camundongos transgênicos, com capacidade de expressar concentrações elevadas
da catalase de modo sistêmico apresentavam aumento na produção de muco e maior
reatividade das vias aéreas.
É importante reiterar que os peróxidos de hidrogênio são apenas algumas das
numerosas substâncias oxidantes implicadas no processo inflamatório alérgico
pulmonar e que múltiplas EROs e ERNs são produzidas concomitantemente e
interagem entre si, originando novas espécies reativas com propriedades e ações
distintas, numa cadeia de eventos complexos e muitas vezes pouco conhecidos. Por
exemplo, sabe-se que nos pacientes com asma os níveis do NO encontram-se
elevados no ar exalado devido ao aumento da expressão dos iNOS, que mantêm
relação direta com o grau de broncoconstrição (AHMAD et al., 2012). Contudo, há
ainda várias controvérsias sobre o papel dos nitritos e sua participação no
desenvolvimento da doença alérgica inflamatória pulmonar. Alguns relatos sugerem
uma ação anti-inflamatória para o NO enquanto outros apontam para o oposto. De
fato, ao se avaliar a produção ou detoxificação de um único oxidante ou antioxidante
que acarreta mudanças no equilíbrio e formação de novos oxidantes e do sistema de
defesa antioxidante como um todo, dificulta-se portanto a interpretação correta dos
resultados obtidos e a elucidação dos mecanismos de ação e da contribuição de cada
oxidante-antioxidante na etiopatogenia da doença.
Por conseguinte, os conhecimentos sobre as alterações resultantes da ação
integrada da intrincada rede de mediadores inflamatórios e oxidantes-antioxidantes
que atuam na asma visando a homeostasia foram apenas vislumbrados até o presente
(KELNER & BAGNELL, 1990; CEBALLOS et al., 1991; COMHAIR et al., 2001) e
despertam grande interesse da comunidade científica.
1.1.5 O Modelo Murino de Asma Crônica
Os modelos experimentais desenvolvidos in vivo têm sido fonte de valiosas
informações no que tange à fisiopatologia e ao tratamento da asma, uma vez que tais
16
estudos possibilitam a análise de diversos fenômenos dinâmicos observados na
doença além da correlação dos aspectos funcionais com os estruturais pulmonares
(KIPS et al., 2003). Ademais, ensaios clínicos nem sempre são passíveis de realização
em humanos asmáticos por questões éticas e/ou por dificuldades técnicas na
abordagem não invasiva das estruturas pulmonares.
Sabe-se que a asma cursa com comprometimento inflamatório das vias aéreas
centrais e distais, bem como do parênquima pulmonar (TULIC & HAMID, 2003; XISTO
et al., 2005). Nos modelos de broncoconstrição aguda induzida, somente hiper-
reatividade brônquica e um aumento transitório da celularidade nos tecidos
pulmonares têm sido observados (WAGERS et al., 2004). Entretanto, em 2005, Xisto
e colaboradores (XISTO et al., 2005) reproduziram o presente modelo murino de asma
alérgica crônica, no qual camundongos isogênicos da linhagem BALB/c foram
cronicamente sensibilizados e repetidamente desafiados com ovalbumina. Os autores
observaram desnudação do epitélio das vias aéreas, infiltração de eosinófilos,
macrófagos e linfócitos T nas mucosas e no lúmen das vias aéreas, bem como
hipertrofia e hiperplasia da musculatura lisa das vias aéreas, das células caliciformes
e das glândulas submucosas (XISTO et al., 2005). Xisto e colaboradores também
verificaram a deposição de fibras colágenas nas vias aéreas centrais e nos ductos e
paredes alveolares, que acarretaram elevação significativa da resistência e da
elastância do parênquima pulmonar.
Por reproduzir tais padrões específicos da asma crônica, padrões estes
comumente evidenciados em humanos, o presente modelo murino de asma vem
sendo cada vez mais frequentemente utilizado para avaliar os efeitos e locais de ação
de fármacos na asma alérgica crônica (MALIK et al., 2008).
1.1.6 Anestésicos Inalatórios na Asma
O aumento da prevalência da asma em todo o mundo nas últimas décadas tem
elevado o número de pacientes asmáticos que se submetem à anestesia para
procedimentos diagnósticos e terapêuticos.
Apesar dos avanços no diagnóstico e tratamento dos pacientes asmáticos,
estes ainda representam um grande desafio para o anestesiologista (BURBURAN et
al., 2007b). A hiper-reatividade brônquica associada à asma é um importante fator de
risco para broncoespasmo per-operatório, que é uma complicação potencialmente
17
perigosa e de alta morbidade (WARNER et al., 1996) para a qual o anestesiologista
deve estar sempre atento.
A resposta broncoconstritora pode ser evocada a partir de uma grande
variedade de estímulos. Dentre outros, podemos citar a liberação de histamina,
estímulos vagais, hiperventilação com ar frio e seco e inalação de aerossóis hipo ou
hipertônicos.
Além disso, na anestesia geral ocorre estimulo da mucosa brônquica, que
consiste num dos maiores fatores desencadeantes de broncoespasmo (TO et al.,
2002). Durante a indução anestésica até 45% dos pacientes asmáticos apresentam
sibilos, contra 16% dos não-asmáticos (OLSSON, 1987). Ademais, as drogas
administradas durante a anestesia podem promover a liberação de histamina através
de mecanismos envolvendo ou não anafilaxia.
A intubação traqueal acarreta a liberação de acetilcolina pelos terminais
nervosos colinérgicos pós-ganglionares e induz broncoconstrição por estimulação
vagal direta (BARNES, 1986). Um anestesiologista experiente deve reduzir tal
estimulação ao proceder a intubação traqueal com o paciente em plano anestésico
profundo e ao executar as manobras de intubação de forma minimamente traumática.
Entre as drogas utilizadas na anestesia geral nos asmáticos, a preferência recai
sobre os anestésicos inalatórios, uma vez que numerosos estudos têm demonstrado
seu potencial para prevenir a broncoconstrição (HERMENS et al., 1984; SHAH &
HIRSHMAN, 1986; WARNER et al., 1989; WARNER et al., 1990; BROWN et al., 1993;
KATOH & IKEDA, 1994; MITSUHATA et al., 1994; SATO et al., 1995; HABRE et al.,
1997; HABRE et al., 2001; BURBURAN et al., 2007b).
O mecanismo de ação dos anestésicos inalatórios ainda não é completamente
conhecido. Estima-se que promovam broncodilatação através de uma variedade de
efeitos diretos e indiretos, incluindo estimulação de receptores β-adrenérgicos
(HIRSHMAN et al., 1982; JONES et al., 1994; WIKLUND et al., 1999), que levaria ao
aumento do AMP-cíclico intracelular. Esse último, por sua vez, se ligaria aos íons de
cálcio livres no citoplasma das células musculares lisas dos brônquios, acarretando o
relaxamento das mesmas. Além de inibir a liberação de acetilcolina e a degranulação
dos mastócitos (SHAH & HIRSHMAN, 1986), os anestésicos voláteis podem impedir
a formação dos complexos antígeno-anticorpo (ENRIGHT, 2004), atuar diretamente
sobre as fibras musculares lisas, induzindo seu relaxamento, e atenuar o reflexo
broncoconstrictor na vigência de hipercapnia (HIRSHMAN et al., 1982). O efeito dos
18
halogenados no sistema respiratório é dose-dependente (MERCIER et al., 1995;
CHOI et al., 1997; ROOKE et al., 1997). A broncodilatação está associada a uma
melhor distribuição da ventilação, menor aprisionamento de ar e com a redução da
resistência pulmonar nas vias aéreas dos asmáticos.
Por todas as razões supracitadas, os anestésicos inalatórios envolvidos no
presente estudo e cujas características primárias estão resumidas na Tabela 1, têm
sido utilizados para anestesia geral em pacientes portadores de doenças pulmonares
obstrutivas há vários anos, sendo inclusive eventualmente empregados como
alternativas terapêuticas na asma refratária ao tratamento convencional (COLACO et
al., 1978; O'ROURKE & CRONE, 1982; SCHWARTZ, 1984; BAYLIFF et al., 1985;
ROSSEEL et al., 1985; BIERMAN et al., 1986; ECHEVERRIA et al., 1986; PARNASS
et al., 1987; REVELL et al., 1988; JOHNSTON et al., 1990; SAULNIER et al., 1990;
GONZALEZ MARTIN et al., 1992; TAKISE et al., 1992; SHIBATA et al., 1993;
MALTAIS et al., 1994; PEDERSEN et al., 1994; SADA-CIESLAR et al., 1995; JAGODA
et al., 1997; MIYAGI et al., 1997; PADKIN et al., 1997; RICE et al., 1998; QUE &
LUSAYA, 1999; WHEELER et al., 2000; REVICH et al., 2001; MUTLU et al., 2002;
BAIGEL, 2003; MAZZEO et al., 2004; RESTREPO et al., 2005; SCHULTZ, 2005;
SHANKAR et al., 2006; WATANABE et al., 2008).
Asma refratária, estado asmático ou “status asmaticus” consiste numa
exacerbação aguda, intensa e contínua do estado de asma que não responde ao
esquema terapêutico usual após 30 a 60 minutos, tendendo a evoluir
progressivamente para insuficiência respiratória grave. O termo estado asmático ou
asma refratária relaciona-se àqueles casos nos quais a condição do paciente se
deteriora continuamente, a despeito da implementação de medidas farmacológicas
agressivas, e persiste por mais de 24 horas (JAGODA et al., 1997). Os termos
descritivos do estado de mal asmático incluem "asma com risco de morte" ou asma
"quase fatal".
Asma refratária, estado asmático ou “status asmaticus” consiste numa
exacerbação aguda, intensa e contínua do estado de asma que não responde ao
esquema terapêutico usual após 30 a 60 minutos, tendendo a evoluir
progressivamente para insuficiência respiratória grave. O termo estado asmático ou
asma refratária relaciona-se àqueles casos nos quais a condição do paciente se
deteriora continuamente, a despeito da implementação de medidas farmacológicas
agressivas, e persiste por mais de 24 horas (JAGODA et al., 1997). Os termos
19
descritivos do estado de mal asmático incluem "asma com risco de morte" ou asma
"quase fatal".
Tabela 1. Propriedades físico-químicas dos anestésicos inalatórios
Propriedades Físico-químicas
Isoflurano Halotano Sevoflurano
Peso Molecular 184.5 197.4 200.05
Ponto de Ebulição (°C) 48.5 50.2 58.5
Pressão de vapor (mmHg 20°C)
295 242 160
λ * sangue/gás 1.48 2.4 0.65
λ * óleo/gás 91 224 53
λ * cérebro/gás 3.65 4.08 1.7
λ * fígado/gás 3.5 7.24 1.8
λ * rim/gás 1.98 4.02 1.2
λ * músculo/gás 5.58 6.72 3.1
λ * gordura/gás 94.5 185 48
% biodegradação 0.17 20 4.65
**CAM50 (%) 1.15 0.75 2.0
λ*= Coeficiente de partição a 37°C. **CAM50 = Concentração alveolar mínima que extingue o movimento em resposta a uma incisão cirúrgica em 50% dos pacientes. Valores médios usados para fins de comparação.
Em tais situações críticas, a anestesia inalatória e sedação profunda são
recursos que têm sido utilizados com sucesso desde o início da década de 1950, na
terapia intensiva de crianças e adultos, por atenuarem a broncoconstrição
(SCHWARTZ, 1984; BAYLIFF et al., 1985), melhorarem a ventilação e oxigenação,
20
facilitarem a remoção de secreções das vias aéreas (MERCIER et al., 1995) e por
reduzirem o metabolismo cerebral (MAZZEO et al., 2004). Vários casos têm sido
reportados na literatura, evidenciando os efeitos benéficos dos anestésicos inalatórios
sobre o volume corrente, o pH e a PaCO2 (ROSSEEL et al., 1985; BIERMAN et al.,
1986; ECHEVERRIA et al., 1986; PARNASS et al., 1987; JOHNSTON et al., 1990;
SAULNIER et al., 1990; GONZALEZ MARTIN et al., 1992; TAKISE et al., 1992;
SHIBATA et al., 1993; MALTAIS et al., 1994; JAGODA et al., 1997; MIYAGI et al.,
1997; PADKIN et al., 1997; QUE & LUSAYA, 1999; WHEELER et al., 2000; REVICH
et al., 2001; MUTLU et al., 2002; BAIGEL, 2003; RESTREPO et al., 2005; SCHULTZ,
2005; SHANKAR et al., 2006; WATANABE et al., 2008).
O isoflurano [2-cloro-2-(difluorometoxi)-1,1,1-trifluoro-etano] é um éter
halogenado não inflamável nem explosivo utilizado na anestesia por inalação. Seu
coeficiente de partição sangue/gás permite indução e despertar rápidos, embora seu
odor pungente e algo irritante seja desvantajoso neste sentido. O isoflurano deprime
a ventilação, porém menos do que halotano, reduz o volume corrente e aumenta a
frequência respiratória (MILLER, 2010). A sua mais marcante característica em
relação ao aparelho cardiovascular é a estabilidade conferida ao ritmo cardíaco,
mesmo na presença de catecolaminas. Reduz a pressão arterial sistêmica, pois
diminui a resistência periférica total, mas em contrapartida, promove elevação da
frequência cardíaca. O isoflurano reduz o consumo de oxigênio pelo miocárdio, mas
a "perfusão luxuriosa" pode estar presente nos coronariopatas (MILLER, 2010). A
vasodilatação produzida pelo isoflurano aumenta o fluxo sanguíneo cerebral e a
pressão intracraniana. Deprime a transmissão neuromuscular e a contratilidade da
musculatura esquelética, produzindo relaxamento muscular adequado para os
procedimentos cirúrgicos com uso mínimo de bloqueadores neuromusculares. Sua
biotransformação é mínima e seu grau de toxicidade renal ou hepática é baixo
(MILLER, 2010).
O isoflurano possui propriedades broncodilatadoras e tem sido utilizado como
adjuvante no tratamento da asma refratária ao tratamento convencional (BIERMAN et
al., 1986; REVELL et al., 1988; JOHNSTON et al., 1990; MALTAIS et al., 1994;
MIYAGI et al., 1997; RICE et al., 1998; WHEELER et al., 2000; SHANKAR et al.,
2006).
Johnston et al. (JOHNSTON et al., 1990) observaram quatro pacientes, dois
adultos e duas crianças, com quadro de asma grave e que não respondiam
21
satisfatoriamente ao tratamento com doses elevadas de broncodilatadores. Eles
relataram rápida melhora clínica após a instauração da ventilação com isoflurano em
concentrações que variaram de 0.5 a 2%.
Em 1994, Maltais e colaboradores (MALTAIS et al., 1994) descreveram os
efeitos do isoflurano sobre a mecânica ventilatória de três pacientes adultos com mal
asmático. Após a ventilação mecânica com isoflurano eles observaram queda da
resistência ins e expiratória, da hiperinsuflação pulmonar e da pressão expiratória
positiva final (PEEP) intrínseca. Também Wheeler et al. em 2000 (WHEELER et al.,
2000), e Shankar et al., em 2006 (SHANKAR et al., 2006), demonstraram que, em
crianças internadas na unidade de tratamento intensivo (UTI) com mal asmático e sem
resposta terapêutica ao tratamento clínico convencional, a ventilação com o isoflurano
em concentrações variáveis entre 0.5 e 1.5%, produzia uma rápida melhora nos
parâmetros ventilatórios, com redução da pressão máxima das vias aéreas, da PaCO2
e elevação do pH. A terapia com isoflurano evitou complicações como barotrauma,
hiperinsuflação dinâmica, deterioração cardiovascular e o tratamento com circulação
extracorpórea. O único efeito colateral observado em alguns dos pacientes foi a
hipotensão arterial, decorrente da vasodilatação induzida pelo isoflurano, facilmente
corrigida com a administração de inotrópicos e soluções cristalóides (WHEELER et
al., 2000; SHANKAR et al., 2006). Já Miyagi et al. (MIYAGI et al., 1997) não
evidenciaram quaisquer efeitos colaterais, nem mesmo após tratamento prolongado
(202 h) com isoflurano a 1% em um adolescente com “status asmaticus”.
O halotano (2-bromo-2-cloro-1,1,1-trifluoretano) é um halogenado e derivado
alcano. Apresenta-se sob a forma de um líquido incolor, volátil e de odor agradável,
cuja associação com o oxigênio permite seu uso como anestésico inalatório,
promovendo indução e despertar rápidos da anestesia (MILLER, 2010). Foi
introduzido na prática anestesiológica na década de 60 e durante muito tempo foi
amplamente utilizado por ser um anestésico inalatório não inflamável, substituindo
anestésicos inflamáveis que existiam na época, como o éter etílico.
O halotano é um anestésico potente e a sua administração deve ser controlada
com precisão, pois até mesmo nas concentrações anestésicas normais produz
depressão miocárdica e respiratória, bradicardia e vasodilatação, com consequente
queda da pressão arterial (MILLER, 2010). O halotano pode deflagrar a hipertermia
maligna e seu uso está também relacionado com toxicidade hepática (MILLER, 2010).
22
Desde 1978, Hirshman e Bergman (HIRSHMAN & BERGMAN, 1978) já haviam
demonstrado que o halotano atenuava o broncoespasmo e reduzia a resistência
pulmonar em cães com hiper-reatividade brônquica. Mais tarde, Shah e Hirshman
(SHAH & HIRSHMAN, 1986), estudando cães com broncoconstrição induzida pela
histamina, revelaram que o halotano promovia broncodilatação através da inibição do
reflexo vagal e Warner e Vetterman (WARNER et al., 1989) comprovaram que, na
vigência de estimulação vagal, o halotano atuava não só reduzindo a resistência das
vias aéreas, mas também diminuindo a resistência nos tecidos pulmonares.
A partir daí, buscando a melhoria dos parâmetros ventilatórios nos pacientes
asmáticos e uma resposta clínica satisfatória nos casos de asma refratária, aliada a
menor incidência dos efeitos adversos do halotano, surgiu a ideia da terapia inalatória
com baixas doses de halotano. Observou-se que concentrações subanestésicas (0.2
a 0.5%) de halotano administradas sob máscara a pacientes com mal asmático eram
capazes de evitar a intubação traqueal e a ventilação mecânica (PADKIN et al., 1997;
BAIGEL, 2003). Além disso, o uso bem sucedido do halotano na asma aguda grave
em concentrações entre 0.5 e 2%, em pacientes sob regime de ventilação mecânica
também foi reportado em alguns relatos de casos (COLACO et al., 1978; O'ROURKE
& CRONE, 1982; SCHWARTZ, 1984; BAYLIFF et al., 1985; ROSSEEL et al., 1985;
ECHEVERRIA et al., 1986; SAULNIER et al., 1990; PADKIN et al., 1997; REVICH et
al., 2001; BAIGEL, 2003; RESTREPO et al., 2005). Hipotensão arterial consequente
à depressão miocárdica induzida pelo halotano e irritabilidade miocárdica, sobretudo
na presença de acidose e em associação com β-agonistas e teofilina, deflagrando
arritmias cardíacas potencialmente graves foram alguns dos efeitos colaterais
observados. Nesse contexto, DeNicola e Aboudan observaram grande instabilidade
hemodinâmica em uma criança, com grave insuficiência respiratória, ventilada com
halotano associado ao isoproterenol e teofilina (DENICOLA & ABOUDAN, 1990).
Em virtude das limitações no que tange às suas propriedades
farmacodinâmicas e após o advento do sevoflurano, cujo perfil farmacológico é bem
mais favorável e seguro, a utilização do halotano na anestesiologia sofreu expressiva
redução nas últimas décadas, já tendo sido o seu uso completamente abandonado
em diversos países (MILLER, 2010). Todavia, no Brasil o halotano continua a ser
utilizado em muitos locais e ainda é bastante presente na clínica veterinária, devido
principalmente ao seu baixo custo comparativamente aos outros agentes halogenados
hoje disponíveis no mercado.
23
O sevoflurano [fluorometil 2, 2, 2 trifluoro-1-(trifluorometil)] é um potente
anestésico inalatório halogenado, derivado do éter metilpropil que foi desenvolvido no
final da década de 60 nos Estados Unidos, mas somente a partir de 1992 foi
comercializado para o resto do mundo, sendo hoje o anestésico inalatório mais
amplamente utilizado na prática clínica anestesiológica.
Comparando-se os custos, observa-se que, embora a concentração alveolar
mínima (CAM) do sevoflurano seja maior (potência menor) que a do isoflurano, a baixa
solubilidade no sangue reduz o consumo, além de permitir um melhor controle da
profundidade do plano anestésico (MILLER, 2010).
Apresenta excelente estabilidade hemodinâmica (BERNARD et al., 1990;
FRINK et al., 1992), indução rápida e despertar precoce pela sua baixa solubilidade
tissular e sanguínea, baixa irritabilidade de vias aéreas (DOI & IKEDA, 1993) e
também a sua utilização segura e eficaz como anestésico inalatório na população
pediátrica (LERMAN et al., 1994), na qual sua aceitação tem se tornado cada vez mais
frequente pela sua combinação de características que tornam a indução inalatória
mais suave e fácil (baixa solubilidade tissular e sanguínea, baixa irritação de vias
aéreas e odor agradável).
O sevoflurano assegura indução inalatória rápida. Sabe-se que a velocidade de
indução anestésica depende de fatores ligados ao paciente (ventilação alveolar,
débito cardíaco), ao anestésico (baixa solubilidade tissular e sanguínea), ao valor da
CAM e ao modo como o anestésico é administrado durante a indução anestésica
(concentração inspirada máxima ofertada, taxa de aumento da concentração
inspirada) (MILLER, 2010). O sevoflurano tem se mostrado um agente anestésico
adequado para indução inalatória rápida com capacidade vital forçada, mostrando-se
de especial utilidade nas crianças e sua tolerância é muito boa quando administrado
sob máscara (NAITO et al., 1991; LERMAN et al., 1994; SARNER et al., 1995). Tosse
e apneia voluntária ocorrem infrequentemente; laringoespasmo e broncoespasmo são
raros. Movimentos involuntários transitórios como excitação e agitação podem ocorrer
durante a indução, mas a incidência destes efeitos se reduz quando se associa o N2O
ao sevoflurano (SARNER et al., 1995).
A biotransformação de anestésicos voláteis é de considerável interesse porque
há associações conhecidas entre o metabolismo de certos anestésicos e toxicidades
orgânicas conhecidas. Como todos anestésicos voláteis fluorinados, o sevoflurano
sofre biotransformação, dando origem a metabólitos orgânicos e inorgânicos
24
fluorados. É metabolizado no fígado pelo citocromo P450, dando origem a
hexafluoroisopropanol e fluoreto inorgânico (KHARASCH & THUMMEL, 1993) que
são estáveis e não parecem ser reativos. O hexafluoroisopropanol é rapidamente
conjugado e somente detectado na urina de adultos; entretanto, fluoretos inorgânicos
têm sido quantificados em crianças e adultos.
Do ponto de vista cardiovascular, o sevoflurano mantém parâmetros
hemodinâmicos bastante estáveis (débito e frequência cardíacos) e arritmias são
raras, resolvendo-se espontaneamente (NAITO et al., 1991; LERMAN et al., 1994;
SARNER et al., 1995). Suas propriedades vasodilatadoras no território coronariano
parecem ser menores que as do isoflurano e não foram relacionadas com a
redistribuição de fluxo coronariano (síndrome do roubo coronariano). O sevoflurano
reduz a contratilidade miocárdica de maneira similar ao isoflurano, mas não
potencializa as arritmias cardíacas induzidas pela epinefrina. Ele reduz também as
respostas barorreflexas de maneira similar aos outros anestésicos voláteis.
O sevoflurano, como a maioria dos anestésicos inalatórios, deprime a função
ventilatória (aumenta a PaCO2 e reduz o volume minuto) e, na ausência de dor ou
qualquer estímulo, a anestesia profunda pode levar à hipoventilação e apneia.
Kochi e colaboradores (KOCHI et al., 1991), avaliaram os efeitos do sevoflurano
e do halotano sobre o centro respiratório. Para tal finalidade, pacientes submetidos a
procedimentos cirúrgicos de curta duração foram anestesiados com 1 CAM de
sevoflurano ou halotano. Eles observaram que a duração do ciclo respiratório foi maior
com sevoflurano do que com halotano, sugerindo que tais anestésicos atuavam de
maneira diferente sobre os músculos do diafragma e da caixa torácica. Postulou-se
então, que o halotano e o sevoflurano teriam efeitos diferentes sobre o controle
respiratório central.
Mitsuhata e colaboradores, em 1994 (MITSUHATA et al., 1994), constataram
que o aumento de resistência pulmonar induzido pela anafilaxia era atenuado pela
anestesia com sevoflurano. Nesse contexto, Park e colaboradores, em 1998 (PARK
et al., 1998), observaram que o efeito broncodilatador do sevoflurano dependia
apenas em parte da integridade do epitélio brônquico, que se mostrava diminuído
quando o epitélio se apresentava alterado.
Em um estudo envolvendo 66 pacientes não-asmáticos, Rooke e colaboradores
(ROOKE et al., 1997) compararam o grau da broncodilatação produzida pela
anestesia com halotano, isoflurano e sevoflurano. Eles examinaram o efeito dos
25
referidos anestésicos na broncoconstrição provocada pela intubação traqueal durante
a indução da anestesia. Para tal, Rooke e colaboradores mediram a resistência do
sistema respiratório (Rrs) 10 minutos após a intubação traqueal. Os autores
concluíram que a Rrs foi significativamente menor (p < 0,05) após a anestesia com o
sevoflurano do que com o isoflurano ou com o halotano (sevoflurano = 58 ± 14%,
isoflurano = 75 ±- 13% e halotano = 69 ± 20%).
Seguindo a mesma linha de investigação, Goff e colaboradores (GOFF et al.,
2000) mediram a Rrs em 50 indivíduos não-asmáticos submetidos à intubação
traqueal, após 10 minutos da anestesia com sevoflurano ou desflurano. Eles
verificaram que o sevoflurano reduziu a Rrs em 15%, produzindo broncodilatação,
enquanto que o desflurano elevou a Rrs em 5%.
Em contrapartida, Habre e colaboradores (HABRE et al., 1999) estudaram a
função pulmonar de 44 crianças asmáticas e não-asmáticas, submetidas à anestesia
geral com sevoflurano em diferentes concentrações. As crianças foram mantidas em
ventilação espontânea durante todo o procedimento. A mensuração da Rrs foi
efetuada antes e imediatamente após a inserção do tubo traqueal com sevoflurano na
concentração de 3%. Sob tais condições, os autores evidenciaram um aumento da
Rrs nas crianças asmáticas (18%), enquanto que nas crianças não-asmáticas, a
variação da Rrs não se mostrou estatisticamente significativa. Quando a concentração
do sevoflurano foi aumentada, a queda na Rrs foi similar nos dois grupos estudados.
Devemos, porém, tecer alguns comentários sobre a metodologia da investigação
desenvolvida pelo grupo de Habre:
a) a medida dos parâmetros mecânicos foi realizada somente durante a fase
expiratória do ciclo respiratório;
b) as crianças estudadas possuíam idades diferentes, o que, sabidamente, influencia
na CAM do anestésico;
c) a medição da Rrs foi realizada imediatamente após a intubação traqueal e sabe-
se que a instrumentação da via aérea é causa comum e frequente de
broncoconstrição mediada pelo sistema nervoso parassimpático e também pela
ativação das fibras C aferentes (BARNES, 1996), mesmo em indivíduos não-
asmáticos;
d) os autores não subtraíram da Rrs os valores relativos à resistência do tubo
traqueal, cujo diâmetro variou entre os indivíduos estudados.
26
Por conseguinte, os resultados obtidos por Habre e colaboradores, devem ser
considerados com extrema cautela e o aumento da Rrs observado não deve ser
imputado unicamente ao sevoflurano.
Em 2001, Correa e colaboradores (CORREA et al., 2001) realizaram um estudo
no qual as propriedades mecânicas do sistema respiratório foram subdivididas nos
seus componentes resistivo, elástico e viscoelástico/inomogêneo, a fim de delinear os
efeitos e os locais de ação do sevoflurano no pulmão de ratos Wistar normais. Seus
resultados indicaram que, diferentemente do que já fora previamente reportado com
outros anestésicos halogenados, como o halotano e isoflurano, o sevoflurano agia não
somente nas vias aéreas, mas também na periferia do pulmão. Entretanto, com
relação aos efeitos do sevoflurano sobre a mecânica pulmonar, Correa e seus
colaboradores não detectaram variações na resistência das vias aéreas, mas
observaram um aumento na viscoelastidade/inomogeneidade e na elastância dos
tecidos pulmonares. A análise da histologia revelou um aumento das áreas de colapso
e hiperinsuflação alveolares, além da presença de grande quantidade de secreção
nas vias aéreas centrais e periféricas em comparação com os controles por eles
estudados, o que poderia justificar o aumento das inomogeneidades pulmonares
observado pelo grupo de Correa nos ratos anestesiados com sevoflurano, se
contrapondo a uma queda presumível na resistência das vias aéreas.
Em 2004, Takala e colaboradores (TAKALA et al., 2004) quantificaram alguns
mediadores inflamatórios no fluido do lavado broncoalveolar de porcos anestesiados
com o sevoflurano. Eles observaram aumento nos leucotrienos, principalmente do
leucotrieno C4, bem como uma elevação nos compostos nitrogenados (nitratos e
nitritos), sugerindo que a anestesia com o sevoflurano ocasionava uma resposta
inflamatória. Além do mais, constataram diminuição significativa na contagem de
leucócitos no sangue periférico dos animais estudados.
Em 2007, nosso grupo (BURBURAN et al., 2007a) estudou os efeitos do
sevoflurano sobre a mecânica e histologia pulmonares em um modelo murino de asma
crônica, reportando que a anestesia com o sevoflurano induzia broncodilatação e
diminuía a pressão resistiva pulmonar nos camundongos asmáticos e também nos
controles normais. Nos animais asmáticos, o sevoflurano foi capaz também de diminuir
as inomogeneidades e a elastância estática do pulmão. Essas alterações funcionais
decorreram da dilatação das vias aéreas distais e das unidades contráteis do
parênquima pulmonar. A análise da morfometria confirmou menor índice de
27
broncoconstrição e da fração de colapso alveolar nos animais que receberam anestesia
com o sevoflurano, indicando que este agente pode ser útil para diminuir as
inomogeneidades presentes na asma crônica. Além disso, nas análises histológicas
efetuadas, contrariando os achados de Correa e colaboradores (CORREA et al., 2001),
não detectamos a presença de secreções nas vias aéreas centrais ou distais, nem
mesmo nos espécimes asmáticos.
Além do isoflurano e do halotano, relatos de casos clínicos envolvendo o uso
do sevoflurano no tratamento da asma refratária também têm sido documentados
(MORI et al., 1996; QUE & LUSAYA, 1999; MAZZEO et al., 2004; SCHULTZ, 2005;
WATANABE et al., 2008; NADAUD et al., 2009; SCHUTTE et al., 2013). Nesse
contexto, a terapia inalatória com sevoflurano se mostrou eficaz e segura, mesmo
quando instituída por períodos prolongados (MORI et al., 1996; WATANABE et al.,
2008).
A eficácia da inalação do sevoflurano associado à mistura de hélio e oxigênio
(Heliox) na reversão do mal asmático foi descrita por Nadaud et al. (NADAUD et al.,
2009) que relataram o caso de uma paciente de 46 anos com asma grave, a qual, a
despeito do tratamento clínico convencional em doses máximas e até mesmo após a
instituição da ventilação mecânica com Heliox, continuava a apresentar progressiva
deterioração dos parâmetros ventilatórios e hemodinâmicos. Após a introdução do
sevoflurano na concentração de 0.6% na mistura de Heliox, observou-se pronta
reversão do broncoespasmo, normalização do volume minuto e correção da acidose
respiratória.
Mais recentemente, Schutte et colaboradores (SCHUTTE et al., 2013)
reportaram a inalação de sevoflurano em 7 crianças, entre 4 e 13 anos de idade, com
asma grave refratária ao tratamento clínico usual, intubadas e ventiladas
mecanicamente na UTI pediátrica. Seis das crianças apresentaram melhora imediata
dos parâmetros ventilatórios e gasométricos. Hipotensão arterial foi a única alteração
hemodinâmica observada em 5 crianças, mas que foi prontamente revertida com
drogas vasoativas. Apenas uma criança, diagnosticada posteriormente com quadro
de pneumonia associada à SDRA, não evidenciou melhora após o tratamento com
sevoflurano.
28
2 JUSTIFICATIVA
A asma representa um grande problema de saúde pública tendo taxas de
prevalência bastante elevadas e crescentes (GINA, 2012), sendo a doença crônica
mais frequente na população pediátrica (ARIF et al., 2004; GINA, 2012).
Apesar de grandes avanços na compreensão da importância da inflamação
crônica e do remodelamento como componentes-chave da asma e dos diversos
mecanismos fisiopatológicos envolvidos na redução do calibre das vias aéreas, o
conhecimento atual se revela insuficiente no que concerne aos mecanismos e locais
de ação dos anestésicos voláteis no pulmão do paciente asmático.
Diversos estudos relataram o uso bem sucedido dos anestésicos halogenados
em pacientes com doenças pulmonares obstrutivas e no tratamento da asma refratária
(ROSSEEL et al., 1985; BIERMAN et al., 1986; ECHEVERRIA et al., 1986; PARNASS
et al., 1987; JOHNSTON et al., 1990; SAULNIER et al., 1990; GONZALEZ MARTIN et
al., 1992; TAKISE et al., 1992; SHIBATA et al., 1993; MALTAIS et al., 1994;
PEDERSEN et al., 1994; SADA-CIESLAR et al., 1995; JAGODA et al., 1997; MIYAGI
et al., 1997; PADKIN et al., 1997; QUE & LUSAYA, 1999; WHEELER et al., 2000;
REVICH et al., 2001; MUTLU et al., 2002; BAIGEL, 2003; MAZZEO et al., 2004;
RESTREPO et al., 2005; SCHULTZ, 2005; SHANKAR et al., 2006; WATANABE et al.,
2008). Ademais, os efeitos de anestésicos halogenados foram avaliados em modelos
de hiper-reatividade da via aérea ou broncoconstrição aguda (HERMENS et al., 1984;
SHAH & HIRSHMAN, 1986; WARNER et al., 1989; WARNER et al., 1990; BROWN et
al., 1993; KATOH & IKEDA, 1994; MITSUHATA et al., 1994; SATO et al., 1995;
HABRE et al., 1997; HABRE et al., 2001; BURBURAN et al., 2007b). Entretanto, tais
modelos não acarretam remodelamento, o que não reproduz as condições
verdadeiramente encontradas na asma crônica. Neste contexto, e com relação aos
efeitos respiratórios dos anestésicos voláteis e a sua adequação para uso em
pacientes asmáticos crônicos, cujas vias aéreas apresentam-se remodeladas, a
literatura até o presente se mostra bastante limitada e os poucos estudos realizados
apresentam resultados controversos que sugerem que os anestésicos halogenados
atuam de modo distinto nos sítios pulmonares (BURBURAN et al., 2007a).
Recentemente, nosso grupo estudando os efeitos do sevoflurano sobre a
mecânica e histologia pulmonares em um modelo murino de asma alérgica crônica
29
(BURBURAN et al., 2007a) observou que o sevoflurano induziu broncodilatação e
redução do colapso alveolar associado à diminuição da resistência de vias aéreas
centrais e periféricas.
Entretanto, até o momento, nenhum estudo comparou o efeito do sevoflurano
com outros halogenados frequentemente utilizados (halotano e isoflurano) em modelo
murino de asma alérgica crônica.
Outrossim, sabe-se que a reação inflamatória crônica é um achado sempre
presente nos pacientes asmáticos crônicos, sendo um fator determinante na
fisiopatologia da doença. A infiltração do trato respiratório por células inflamatórias
associa-se à ativação dos mastócitos e linfócitos Th2, com a consequente liberação
de diversos mediadores químicos como a histamina, leucotrienos, citocinas e
interleucinas. (BOUSQUET et al., 2000; BUSSE et al., 2004; TLIBA et al., 2008; VAN
HOVE et al., 2008; TILLIE-LEBLOND et al., 2009; WOODRUFF et al., 2009).
Em 2004, Takala e colaboradores (TAKALA et al., 2004) quantificaram alguns
mediadores inflamatórios no BALF de porcos normais anestesiados com o sevoflurano
e relataram aumento nos leucotrienos bem como redução significativa na contagem
de leucócitos no sangue periférico dos animais estudados, sugerindo que o
sevoflurano ocasionava uma resposta inflamatória. Todavia, mais recentemente,
outros estudos in vitro envolvendo modelos de lesão alveolar aguda e sevoflurano
foram descritos (SUTER et al., 2007; YUE et al., 2008; STEURER et al., 2009) e,
contrariando os resultados obtidos pelo grupo de Takala e colaboradores, revelaram
um efeito citoprotetor e imunomodulador do sevoflurano sobre os tecidos pulmonares
lesados. Similarmente, Hofstetter et al. (HOFSTETTER et al., 2005; HOFSTETTER et
al., 2007), estudando ratos endotoxêmicos, observaram redução significativa nos
níveis de TNF-α, IL-1β e dos nitritos após a inalação com isoflurano e com sevoflurano.
De Conno e colaboradores (DE CONNO et al., 2009) verificaram queda significativa
dos mediadores inflamatórios no BALF de pacientes anestesiados com sevoflurano
durante ventilação pulmonar seletiva para cirurgia torácica.
Os estudos supracitados demonstraram efeitos controversos dos halogenados
em pulmões normais e em modelos de inflamação aguda, que em tudo difere da
complexidade do processo inflamatório presente na asma alérgica crônica. Neste
contexto, a literatura ainda se mostra escassa, não existindo, até momento, estudos
analisando os efeitos dos anestésicos voláteis sobre o processo inflamatório e o
estresse oxidativo em modelo de asma crônica.
30
Por conseguinte, no presente estudo avaliaram-se os efeitos moleculares do
isoflurano, halotano e do sevoflurano sobre a expressão gênica de mediadores
associados à inflamação, fibrogênese, angiogênese e ao estresse oxidativo em
modelo murino de asma alérgica crônica.
31
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Comparar os efeitos da anestesia inalatória com isoflurano, halotano e
sevoflurano sobre a mecânica e histologia pulmonares e a expressão de mediadores
associados a inflamação, remodelamento e estresse oxidativo em modelo murino de
asma alérgica crônica.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A fim de atingirmos o supracitado objetivo, adotamos as seguintes ações:
a) estudo do comportamento da resistência das vias aéreas e elastância
estática do pulmão;
b) análise da morfometria pulmonar;
c) mensuração dos níveis relativos do RNAm e a expressão gênica dos
mediadores TNF-α, TGF-β e VEGF, bem como do Nrf2, da Sirt-1, da
catalase e da GPx no tecido pulmonar com o intuito de avaliar os possíveis
mecanismos de ação do isoflurano, halotano e sevoflurano.
32
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS UTILIZADOS
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética com Uso de Animais do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (CEUA-019), do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Todos os animais receberam
atenção e cuidados em concordância com os “Princípios do Cuidado em Animais de
Laboratório” da Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e pelo “Guide for the Care
and Use of Laboratory Animals” elaborado pela Academia Nacional de Ciências, EUA.
Foram utilizados cinquenta e seis camundongos saudáveis da linhagem
BALB/c, do sexo masculino, oriundos do Laboratório de Investigação Pulmonar do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Todos os animais tinham 6 semanas de idade e peso entre 15 e 20 g. Durante 47 dias,
os camundongos foram mantidos em estantes ventiladas com gaiolas microisoladoras
com o intuito de inibir a propagação de agentes infecciosos entre eles, bem como
entre os pesquisadores e os animais, e vice-versa. Além disso, a fim de evitar
contaminação e infecções pulmonares, todos os materiais e substâncias utilizados
foram adequadamente esterilizados. Os cuidados e o manuseio para todos os animais
foram idênticos, assim como a alimentação, a água e o ciclo dia/noite de 12 horas.
4.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Inicialmente, os 56 camundongos foram divididos, aleatoriamente, em dois
grupos experimentais:
a) Grupo ASMA: 28 camundongos. Os animais foram sensibilizados e desafiados
com ovalbumina;
b) Grupo SALINA: 28 camundongos. Os animais foram submetidos ao mesmo
protocolo aplicado no grupo ASMA, porém receberam apenas solução salina.
Vinte e quatro horas após o último desafio, os animais dos grupos descritos
acima foram submetidos à anestesia com pentobarbital sódico (CTRL), isoflurano
(ISO), halotano (HALO), ou sevoflurano (SEVO), constituindo então os seguintes
grupos:
33
Grupo ASMACTRL: 7 camundongos. Os animais foram sensibilizados e
desafiados com ovalbumina e anestesiados com pentobarbital sódico;
Grupo ASMAISO: 7 camundongos. Os animais foram sensibilizados e
desafiados com ovalbumina e anestesiados com isoflurano;
Grupo ASMAHALO: 7 camundongos. Os animais foram sensibilizados e
desafiados com ovalbumina e anestesiados com halotano;
Grupo ASMASEVO: 7 camundongos. Os animais foram sensibilizados e
desafiados com ovalbumina e anestesiados com sevoflurano;
Grupo SALCTRL: 7 camundongos. Os animais receberam solução salina
obedecendo ao mesmo protocolo dos animais do grupo ASMA, sendo
posteriormente anestesiados com pentobarbital sódico.
Grupo SALISO: 7 camundongos. Os animais receberam solução salina
obedecendo ao mesmo protocolo dos animais do grupo ASMA, sendo
posteriormente anestesiados com isoflurano;
Grupo SALHALO: 7 camundongos. Os animais receberam solução salina
obedecendo ao mesmo protocolo dos animais do grupo ASMA, sendo
posteriormente anestesiados com halotano;
Grupo SALSEVO: 7 camundongos. Os animais receberam solução salina
obedecendo ao mesmo protocolo dos animais do grupo ASMA, sendo
posteriormente anestesiados com sevoflurano;
Na Figura 1 encontram-se representados, de modo esquemático, os grupos
experimentais obtidos.
4.3 SENSIBILIZAÇÃO
Nos grupos ASMACTRL, ASMAISO, ASMAHALO e ASMASEVO, os animais
foram sensibilizados através de sete injeções intraperitoneais (IP) de 10 g de
ovalbumina diluída em 0.1 ml de solução salina durante sete dias alternados. Por sua
vez, os camundongos dos grupos SALCTRL, SALISO, SALHALO e SALSEVO,
receberam sete injeções IP de 0.1 ml de solução salina estéril durante sete dias
alternados (XISTO et al., 2005).
34
Figura 1. Caracterização dos grupos experimentais.
4.4 DESAFIO INTRATRAQUEAL
Quarenta dias após o início da sensibilização, o desafio intratraqueal foi
realizado de acordo com o seguinte protocolo padrão adotado para este modelo de
experimentação (XISTO et al., 2005):
a) três instilações intratraqueais com 0.1 ml de solução de ovalbumina (20 g
de ovalbumina diluídos em 20 l de solução salina estéril) com um intervalo
de 3 dias entre cada instilação (grupos ASMA) ou
b) três instilações com 0.1 ml de solução salina estéril com um intervalo de 3
dias entre cada instilação (grupos SAL).
Para tal, inicialmente os camundongos foram anestesiados com sevoflurano
inalatório e sua traqueia exposta através de uma incisão longitudinal mediana de 0.5
cm na região cervical anterior. Imediatamente após a instilação, efetuou-se a sutura
da incisão cervical com fio de seda 5.0. Somente depois de totalmente recuperados
da anestesia os animais foram devolvidos às suas gaiolas microisoladoras de origem.
35
Na Figura 2 encontra-se uma representação esquemática do modelo de
indução de asma alérgica crônica.
Figura 2. Modelo de indução de asma alérgica crônica.
4.5 MEDIDA DA MECÂNICA PULMONAR
Vinte e quatro horas após o último desafio, os animais foram pesados (balança
Filizola, modelo BR, fabricada por Indústrias Filizola S.A., SP, Brasil). Posteriormente,
21 animais do grupo ASMA (grupo ASMAISO n=7, grupo ASMAHALO n=7, grupo
ASMASEVO n =7), e 21 animais do grupo SAL (grupo SALISO n=7, grupo SALHALO
n=7, grupo SALSEVO n=7) foram anestesiados com isoflurano, halotano ou
sevoflurano, respectivamente, administrados sob máscara. Para tal finalidade, foram
utilizados vaporizadores calibrados específicos para cada agente (HB, RJ, Brasil).
Além disso, 7 animais do grupo ASMA (grupo ASMACTRL) e 7 do grupo SAL
(grupo SALCTRL) foram sedados com diazepam (1 mg IP) e anestesiados com
pentobarbital sódico (70 mg/kg IP).
Durante a fase inicial do procedimento, e com o animal ainda respirando
espontaneamente, a aferição do nível da anestesia foi feita através da verificação do
diâmetro pupilar e do reflexo fotomotor, além da resposta motora à estimulação do
terço médio da cauda do camundongo. Nos casos em que o nível da anestesia se
mostrou insuficiente ou excessivo, efetuaram-se pequenos incrementos ou
36
decrementos, respectivamente, na concentração do anestésico até adequação do
plano anestésico.
Depois de anestesiados, os animais foram colocados em uma pequena mesa
sob foco cirúrgico, em decúbito dorsal, sendo seus membros fixados por esparadrapo.
Os membros superiores foram mantidos estendidos a 90 graus em relação ao corpo
e os membros inferiores estendidos em diagonal.
Após o posicionamento cirúrgico, foi realizada uma pequena incisão
longitudinal mediana de 0.5 cm na região anterior do pescoço do animal. Os tecidos
adjacentes foram divulsionados até que a traqueia ficasse exposta, quando então se
realizou uma incisão transversal entre dois anéis fibrosos para que se pudesse
introduzir uma cânula de traqueostomia para pequenos animais (cânula com 32 mm
de comprimento e 0.8 mm de diâmetro interno), sendo a mesma fixada à traqueia por
meio de fios de algodão. A partir deste momento, um conector em forma de T, que
não promove alterações significativas na pressão traqueal, foi acoplado à cânula
traqueal a fim de manter a administração do anestésico para o animal.
Os animais foram paralisados com injeção intravenosa de brometo de
vecurônio (0.05 mg/kg). Após a obtenção do relaxamento muscular completo, os
camundongos foram acoplados à prótese ventilatória através de um ventilador (Samay
VR15, Universidad de la Republica, Montevideo, Uruguai) no qual o fluxo (V’ = 1 ml/s),
a frequência respiratória (FR = 100 IPM) e o volume corrente (VT = 0.2 ml) foram
mantidos constantes durante todo o experimento para abolir a interferência de
diferentes fluxos, volumes e tempos inspiratórios nas variáveis mecânicas estudadas
(KOCHI et al., 1988a, 1988b).
Outrossim, atentou-se para a manutenção de um adequado plano anestésico
com o animal sob efeito do bloqueador neuromuscular. Logo, a avaliação do nível da
anestesia passou a ser efetuada através da análise dos diâmetros e reflexos
pupilares. Doses adicionais de anestésico e vecurônio foram administradas a cada 30
minutos e a concentração do anestésico foi ajustada, sempre que necessário, de
acordo com a resposta do animal.
Os animais permaneceram em plano anestésico adequado durante o período
de 60 minutos, após o qual procedeu-se a incisão cirúrgica por tesoura na linha média
do abdome logo abaixo do apêndice xifoide. A incisão foi estendida, superficialmente,
ao longo da parede torácica sobre o esterno, sendo, então, a pele do animal retirada
por tração lateral. A seguir, a incisão abdominal foi estendida lateralmente, para
37
esquerda e para direita, seguindo o bordo inferior das costelas até atingir a linha axilar
anterior, bilateralmente. Com a cavidade abdominal aberta, foi possível visualizar o
diafragma, que foi perfurado e secionado segundo a mesma orientação da abertura
da parede abdominal. No instante da perfuração do diafragma foi estabelecida uma
pressão expiratória positiva final (PEEP) de 2 cmH2O. Após a retirada do diafragma,
a parede torácica foi removida por cortes longitudinais bilaterais ao nível da linha axilar
anterior, em toda sua extensão, e corte superior, abaixo da clavícula.
O tubo traqueal foi conectado a um pneumotacógrafo para pequenos animais
(diâmetro de 1,5 mm; comprimento = 4,2 cm; distância entre as saídas laterais = 2,1
cm) (MORTOLA & NOWORAJ, 1983), para medida do fluxo aéreo. O respirador foi
acoplado à outra extremidade do pneumotacógrafo que consistia de uma cânula
metálica com duas saídas laterais conectadas a um transdutor diferencial de pressão
SCIREQ (SC-24, Montreal, Quebec, Canadá).
Devido ao baixo fluxo e pela reduzida dimensão da traqueia, o fluxo existente
era laminar e, como tal, pode ser medido pela Lei de Poiseuille. O volume corrente foi
obtido através da integração do sinal de fluxo. Uma vez que modificações abruptas no
diâmetro não existiram no nosso circuito, erros de medida da resistência ao fluxo
(LORING et al., 1979; CHANG & MORTOLA, 1981) foram evitados.
Através de outra saída lateral, a via aérea foi conectada a outro transdutor
diferencial de pressão SCIREQ (SC-24, Montreal, Quebec, Canadá) para medida da
pressão traqueal (Ptr).
A resistência total do equipamento (Req), incluindo a da cânula traqueal, foi
previamente determinada através da aplicação de fluxos de ar no sistema, com
concomitante registro das variações de pressão (ΔP). Visto que R = ΔP / V’, a
resistência do equipamento corresponde ao coeficiente angular da curva ΔP x V’. A
Req, constante para fluxos até 26 ml/s, foi igual a 0.12 cmH2O/ml/s. A variação de
pressão determinada pelo equipamento (ΔPeq = Req.V’) foi subtraída da pressão
resistiva pulmonar de modo que os valores apurados representassem unicamente as
propriedades mecânicas intrínsecas.
O espaço morto do equipamento foi de 0.05 ml. Os sinais foram filtrados (100
Hz), amplificados e condicionados através de um condicionador de 4 canais SCIREQ
(SC-24, Montreal, Quebec, Canadá). Em seguida, os sinais de V’ e pressão foram
filtrados (200 Hz) e convertidos de analógicos 12-bits para digitais (conversor
DT2801A, Data Translation, Marlboro, MA, EUA), e armazenados num
38
microcomputador. Todos os dados foram coletados usando o software LABDAT (RHT-
InfoData Inc., Montreal, Quebec, Canadá). Uma representação simplificada da
montagem experimental realizada está representada na Figura 3.
Figura 3. Montagem experimental.
1 Cilindro de ar comprimido
2 Rotâmetro de agulha
3 Ventilador de fluxo inspiratório constante composto por duas válvulas solenoides
4 Pneumotacógrafo
5 Conector em T para medida de pressão nas vias aéreas
6 Cânula traqueal
7 Mesa cirúrgica
8 Transdutor de pressão traqueal
9 Transdutor diferencial de pressão para medida de fluxo
10 Condicionador de 4 canais
39
11 Conversor analógico-digital de 12 bits
12 Microcomputador.
Durante os experimentos evitou-se ao máximo a manipulação da cânula
traqueal com aspirações e insuflações, para eliminação de possíveis interferências
nos parâmetros medidos.
Após o período de ventilação de 60 minutos foram mensuradas a resistência
das vias aéreas (Raw) e a elastância estática do pulmão (Est,L). A mecânica
respiratória foi avaliada pelo método da oclusão ao final da inspiração (BATES et al.,
1985; BATES et al., 1988).
No animal com o tórax aberto, a Ptr é, na realidade, a pressão transpulmonar
(P). Após a oclusão das vias aéreas ao final da inspiração, sob fluxo constante, ocorre
uma queda súbita da pressão máxima (Pmax) até um ponto de inflexão (Pi) a partir
do qual o decaimento da pressão assume caráter mais lento, atingindo um platô em
sua porção terminal. Esta fase de platô corresponde à pressão de retração elástica do
pulmão (Pel). A diferença entre a Pmax e o Pi caracteriza a queda rápida de pressão
inicial, correspondendo ao componente viscoso pulmonar. (Figura 4)
40
Figura 4. Método da oclusão ao final da inspiração. Registros dos sinais de volume,
fluxo aéreo e pressão traqueal em função do tempo. Os pulmões foram ventilados
com volume corrente (VT) de 0.2 ml e fluxo aéreo de 1 ml/s. O platô foi alcançado após
uma pausa inspiratória de 5 s. Após a oclusão das vias aéreas, observou-se uma
queda rápida na pressão traqueal que corresponde à Pmax - Pi, pressão dissipada
para vencer o componente resistivo pulmonar. Em seguida registrou-se uma queda
lenta até um ponto de equilíbrio elástico (Pel). A linha de base do registro de pressão
corresponde à pressão expiratória positiva final (PEEP) igual a 2 cmH2O.
41
O cálculo da Raw foi obtido através da subtração do valor de Pi da Pmax e
dividindo-se o resultado pelo V’. A Est,L foi calculada subtraindo-se a PEEP do valor
da Pel, e dividindo-se o valor apurado pelo VT (Figura 5).
Figura 5. Fórmulas utilizadas na medida da mecânica pulmonar. Est,L = elastância estática do pulmão; Pmax = pressão pulmonar máxima; Pi = pressão pulmonar no ponto de inflexão; Pel = pressão pulmonar de retração elástica; PEEP = pressão expiratória positiva final; Raw = resistência das vias aéreas; V’ = fluxo inspiratório; VT = volume corrente.
Os parâmetros da mecânica pulmonar foram obtidos através da captação de
10 ciclos respiratórios em cada camundongo. Para análise dos dados foi utilizado o
software ANADAT (RHT-InfoData, Inc., Montreal, Quebec, Canadá).
A duração total dos experimentos não excedeu os 80 minutos para cada animal.
4.6 ANÁLISE DA HISTOLOGIA E MORFOMETRIA
Ao término da medição da mecânica pulmonar, administrou-se heparina 1000
UI por via intravenosa e a traqueia foi ocluída ao final da expiração com um fio de
algodão, sendo o animal imediatamente sacrificado por seção da aorta abdominal e
da veia cava inferior. A porção abdominal do esôfago foi identificada e isolada, sendo
presa por uma pinça hemostática. As estruturas do pescoço foram dissecadas com
liberação das vias aéreas. A pinça que prendia o esôfago foi suavemente tracionada
para cima, permitindo separá-lo das estruturas aderidas à parede torácica posterior.
Com todas as estruturas individualizadas, a traqueia foi secionada acima do local
42
ligado pelo fio e, posteriormente, o esôfago foi separado do conjunto por leve tração.
Então, os pulmões foram removidos “en bloc” sendo os pulmões esquerdos
rapidamente resfriados por imersão em nitrogênio líquido por 3 minutos, retirados e
mantidos em solução de Carnoy (etanol 60%, clorofórmio 30% e ácido acético 10%)
a -70º C por 24 h. Após este período, o material foi desidratado progressivamente
através de imersão em soluções com concentrações crescentes de etanol, conforme
discriminado abaixo:
a) MC-1: etanol 70%, clorofórmio 22,5% e ácido acético 7,5%, a - 20oC, durante
1 hora;
b) MC-2: etanol 80%, clorofórmio 15% e ácido acético 5%, a - 20oC, durante 1
hora;
c) MC-3: etanol 90%, clorofórmio 7,5% e ácido acético 2,5%, a - 20oC, durante 1
hora, e
d) etanol a 100%, a -20oC durante 1 h e, em seguida, a - 4oC, durante 24 horas.
Depois da fixação, o material foi embebido em parafina, obtendo-se cortes
histológicos com 4 m de espessura através de um micrótomo.
As lâminas contendo os cortes pulmonares foram coradas com hematoxilina e
eosina e analisadas por microscopia ótica (Axioplan, Zeiss, Oberkochen, Alemanha)
quanto aos seus aspectos qualitativos e quantitativos. Dois investigadores que
desconheciam a origem do material procederam à análise microscópica das amostras.
Para a análise descritiva, toda a superfície da lâmina foi observada com todas as
estruturas pulmonares representadas, em aumentos de 100x e 400x e 1000x. As
frações de área de colapso alveolar, a celularidade total e o número de
polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) foram analisados.
A análise quantitativa foi realizada através da técnica convencional de
contagem de pontos (“point-counting”) (WEIBEL, 1990), utilizando-se uma ocular
acoplada ao microscópio contendo um sistema de referência de 100 pontos e 50
segmentos de reta, de comprimento previamente determinado, dispostos em paralelo
(Figura 6).
Em um aumento de 200x foram avaliados dez campos aleatórios e não
coincidentes por lâmina. Foram quantificadas a fração de área ocupada por alvéolos
colapsados (WEIBEL, 1990). O número de pontos que caíram em área de alvéolos
colapsados foi dividido pelo total de pontos contados em cada campo analisado e
expresso sob a forma de percentual.
43
Figura 6. Retículo para quantificação dos parâmetros morfométricos (100 pontos e 50 linhas).
O diâmetro interno das grandes e das pequenas vias aéreas foi computado
contando-se o número de pontos que incidiram sobre a luz da via aérea, no músculo
liso da via aérea e no epitélio sob aumento de 400x. O perímetro das vias aéreas foi
estimado através da contagem do número de interceptos de linhas com a membrana
basal epitelial. Uma vez que o número de interceptos das linhas (NI) com a membrana
basal epitelial é proporcional ao perímetro da via aérea e o número de pontos
incidentes no lúmen da via aérea (NP) é proporcional a área da via aérea, a
intensidade da broncoconstrição, determinada pelo índice de broncoconstrição (IB),
pode ser computada pela seguinte equação: IB = NI/√NP (JAMES et al., 1988; SAKAE
et al., 1994).
44
4.7 ANÁLISE DA RT-PCR EM TEMPO REAL
Cortes das porções centrais dos pulmões direitos foram coletados em
criotubos, rapidamente congelados por imersão em nitrogênio líquido e
acondicionados a - 80°C. O RNA total foi extraído dos tecidos congelados usando-se
o SV total RNA Isolation System (Promega Corporation, Fitchburg, Wisconsin, USA)
de acordo com as recomendações do fabricante. Após a extração, o RNA precipitado
foi solubilizado em 20 µl de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). A
concentração do RNA foi medida por espectofotometria com o Nanodrop ND- 1000.
O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total com o sistema GoTaq® 2-STEP RT qPCR
System (Promega Corporation, Fitchburg, Wisconsin, USA). A integridade das
amostras foi verificada através de eletroforese em gel de agarose 1% contendo 0.5
g/ml de brometo de etídeo.
Para transcrição reversa foi utilizado um kit de transcriptase reversa com
inibidores de RNAses (Superscript Reverse Transcriptase Kit and RNase OUT RNase
inhibitor, Invitrogen, Carlsbad, CA). Vinte μl da reação da transcriptase reversa (RT)
tem 1 μg de RNA total, 150 ng de hexâmetros randomizados, 2 μl de 10x RT buffer, 4
μl de 25 mM MgCl2, 2 μl de 0.1 M DDT, 1 μl de solução contra RNAses, 1 μl de 50
U/μl de Superscript II e água DEPC. O PCR foi realizado com SYBR green PCR
Master Mix (Biosystem Applied). A mistura do PCR foi pré-aquecida a 50°C por 2
minutos e então a 95o por 10 minutos para ativar a AmpliTaq Gold DNA polimerase,
seguido de 40 ciclos de amplificação (95°C por 15 seg; 60oC por 30 seg; 70°C por 40
seg). Ao final a reação foi aquecida a 60°C por 10 minutos. O produto do PCR foi
checado em gel de agarose a 3,5% (Cambrex Bio Science Rockland).
Os níveis relativos da expressão de TNF-α, TGF-β, VEGF, Sirt-1, NRF2,
catalase e GPx foram analisados. Os primers (Integrated DNA Technologies, San
Diego, California, USA) utilizados no corrente estudo estão detalhados na tabela 2.
Todas as amostras foram mensuradas em triplicadas e normalizadas para o
nível do gene residente 36B4. Em seguida, os resultados foram normalizados
relativamente aos respectivos grupos-controle.
45
Tabela 2. Primers utilizados na RT-PCR
Gene Primer Sequência do primer (5’-3’)
TNF-α DIANTEIRO TGA TCC CTG ACA TCT GGA ATC TGG
REVERSO TGG AAA CAT CTG GAG AGA GGA AGG
TGF-β DIANTEIRO ATA CGC CTG AGT GGC TGT C
REVERSO GCC CTG TAT TCC GTC TCC T
VEGF DIANTEIRO CCA CGA CAG AAG GAG AGC A
REVERSO AAT CGG ACG GCA GTA GCT T
Sirt-1 DIANTEIRO AGT GGC ACA TGC CAG AGT C
REVERSO TCC AGA TCC AGC ACA T
Nrf2 DIANTEIRO ATG GGG CTT TTT GAT GAC C
REVERSO GTG AGG GGA TCG ATG AGT AA
Catalase DIANTEIRO CCT CGT TCA GGA TGT GGT TT
REVERSO TCT GGT GAT ATC GTG GGT GA
GPx DIANTEIRO GGT TCG AGC CCA ATT TTA CA
REVERSO CAT TCC GGA AGG TAA AG -3
36B4 DIANTEIRO CAA CCC AGC TCT GGA GAA AC
REVERSO GTT CTG AGC TGG CAC AGT GA
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa estatístico
SigmaStat 3.0 (Jandel Scientific, San Rafael, CA, EUA). Todos os dados foram
submetidos ao teste de normalidade (teste de Kolmogorov-Smirnov com correção de
Lilliefors) e de homogeneidade das variâncias (teste de mediana de Levene). Os
grupos de animais analisados foram comparados através da análise de variância
(ANOVA). O teste de Tukey foi aplicado post hoc para múltiplas comparações entre
os grupos. Os valores finais foram expressos como média erro padrão da média
(EPM). Em todos os testes estabeleceu-se um grau de significância de 5% (p valor <
0,05) como significativo.
46
5 RESULTADOS
A asma acarretou anormalidades na mecânica pulmonar, na morfometria
e na expressão do RNAm
Os controles asmáticos (ASMACTRL) apresentaram maior Raw (+91%) e Est,L
(+38%) do que os controles não-asmáticos (SALCTRL) (Figura 7). Os grupos
ASMACTRL mostraram um acentuado processo de remodelamento e aumento das
frações de área de colapso alveolar (+227%), broncoconstrição (+35%), além da maior
número de células totais (+39%), dos PMN (+147%) e dos MN (+29%) em comparação
com os grupos SALCTRL (Tabela 3 e Figura 9). Os animais dos grupos ASMACTRL
também apresentaram elevada expressão de TNF-α (+425%), TGF-β (+554%), VEGF
(+308%), Sirt-1 (+787%), catalase (+631%) e GPx (+235%). Todavia, a expressão
gênica do Nrf2 se mostrou significativamente diminuída no grupo ASMACTRL (-64%)
em relação ao grupo SALCTRL (Figuras 10 e 11).
O sevoflurano reduziu a fração de área de alvéolos colapsados e a
infiltração de PMN nos animais normais
Nos camundongos não-asmáticos (SAL), os grupos SALISO, SALHALO e
SALSEVO exibiram menores frações de colapso alveolar (-34%, -44%, e -60%) em
comparação com o grupo SALCTRL (Figura 8). Além disso, o grupo SALSEVO
apresentou diminuição da contagem de células PMN no tecido pulmonar em
comparação com os grupos SALCTRL, SALISO e SALHALO (-58%, -61%, e -47%)
(Tabela 3).
Na asma, o sevoflurano melhorou os parâmetros da mecânica pulmonar
e reduziu a fração de área de alvéolos colapsados, a broncoconstrição e a
infiltração de PMN no tecido pulmonar
Dentre os asmáticos, os grupos ASMAISO, ASMAHALO e ASMASEVO
mostraram menores Raw (-37%, -35% e -52%, respectivamente) e Est,L (-16%, -19%
e -22%) em relação ao respectivo grupo controle. No grupo ASMASEVO observou-se
maior queda na Raw, comparativamente aos grupos ASMAISO e ASMAHALO (Figura
7). Menores frações de área de colapso alveolar foram evidenciadas no grupo
ASMASEVO (-57%) do que nos grupos ASMAISO (-25%) e ASMAHALO (-48%),
comparativamente ao grupo ASMACTRL. A broncoconstrição foi mais atenuada nos
47
animais do grupo ASMASEVO (-22%) do que nos grupos ASMAISO, ASMAHALO e
ASMACTRL (Figuras 8 e 9). A anestesia com o sevoflurano também reduziu
significativamente a infiltração de PMN (-39%) em comparação aos grupos
ASMACTRL e ASMAISO (Tabela 3 e Figura 9).
Na asma, o sevoflurano diminuiu a expressão gênica de mediadores pró-
inflamatórios, pró-fibrogênicos e pró-angiogênicos, reduziu o estresse oxidativo
e aumentou a resposta antioxidante
Os animais do grupo ASMASEVO exibiram reduzida expressão gênica de TNF-
α (-71%), TGF-β (-63%), VEGF (-50%), Sirt-1 (-80%), catalase (-76%), e GPx (-69%)
e aumentou significativamente a expressão do Nrf2 (+579%), quando comparado com
o grupo ASMACTRL. O grupo ASMASEVO também mostrou elevada expressão de
Nrf2 comparativamente aos grupos ASMAISO e ASMAHALO (Figuras 10 e 11).
Figura 7. Mecânica pulmonar. ANOVA com teste de Tukey post hoc. As barras representam a média + EPM de 7 animais por grupo (10 aferições por animal). Raw = resistência das vias aéreas. Est,L = elastância estática pulmonar. Nos grupos ASMA (), os animais foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina. Os animais dos grupos SALINA () receberam solução salina segundo o mesmo protocolo. Os camundongos foram em seguida anestesiados com pentobarbital sódico (CTRL), isoflurano (ISO), halotano (HALO) ou sevoflurano (SEVO). Os animais asmáticos anestesiados com ISO, HALO e SEVO apresentaram redução na resistência das vias aéreas (-37%, -35% e -52%) e na elastância estática (-16%, -19% e -22%) comparado com o grupo ASMACTRL. *p < 0,05 comparado ao grupo salina correspondente. **p < 0,05 comparado ao grupo ASMACTRL.
48
Figura 8. Morfometria pulmonar. ANOVA com teste de Tukey post hoc para múltiplas comparações entre os grupos. As barras representam a média + EPM de 7 animais por grupo. Os dados foram obtidos a partir da análise de 10 campos aleatórios e não coincidentes por animal estudado. Nos grupos ASMA (), os animais foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina. Os animais dos grupos SALINA () receberam solução salina segundo o mesmo protocolo. Os camundongos foram em seguida anestesiados com pentobarbital sódico (CTRL), isoflurano (ISO), halotano (HALO) ou sevoflurano (SEVO). Os animais asmáticos anestesiados com ISO, HALO e SEVO apresentaram menores áreas de atelectasia (-25%, -48% e -57%) em relação ao grupo ASMACTRL. O SEVO inibiu significativamente a broncoconstrição (-22%) em relação ao grupo ASMACTRL. *p < 0,05 comparado com o grupo salina correspondente. **p < 0,05 comparado com o grupo ASMACTRL. #p < 0,05 comparado com o grupo SALCTRL.
49
Tabela 3. Morfometria pulmonar
Grupos Cels Totais (%) PMN (%) MN (%)
SALINA
CTRL 41.8 ± 1.25 3.6 ± 0.76 38.2 ± 0.79
ISO 43.7 ± 2.23 3.8 ± 0.59 39.9 ± 2.14
HALO 44.1 ± 2.63 3.2 ± 0.42 40.9 ± 2.69
SEVO 40.2 ± 1.87 1.5 ± 0.30‡,¶ 38.6 ± 1.93
ASMA
CTRL 58.3 ± 1.83* 8.9 ± 0.74* 49.4 ± 1.76*
ISO 54.2 ± 2.79* 9.0 ± 1.19* 45.2 ± 2.79
HALO 56.6 ± 1.65* 8.1 ± 1.24* 48.4 ± 2.58
SEVO 50.1 ± 2.29* 5.4 ± 1.05*,†,§ 44.7 ± 2.51
Os valores representam a média EPM de 7 animais por grupo. Os dados referentes às células totais, polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) são oriundos da análise aleatória de 10 campos não coincidentes para cada animal estudado. Nos grupos ASMA os animais foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina. Os animais dos grupos SALINA receberam solução salina segundo o mesmo protocolo. Os camundongos foram em seguida anestesiados com pentobarbital sódico (CTRL), isoflurano (ISO), halotano (HALO) ou sevoflurano (SEVO). * p < 0,05 comparado ao grupo salina correspondente. † p < 0,05 comparado ao grupo ASMACTRL. ‡ p < 0,05 comparado ao grupo SALCTRL. § p < 0,05 comparado ao grupo ASMAISO. ¶ p < 0,05 comparado aos grupos SALISO e SALHALO.
50
Figura 9. Fotomicrografias representativas das vias aéreas (A, B, C, D, E, F, G e H) e parênquima pulmonares (I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, X e Y). Nos grupos ASMA os animais foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina. Os grupos SALINA receberam solução salina segundo o mesmo protocolo. Os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico (CTRL), isoflurano (ISO), halotano (HALO) ou sevoflurano (SEVO). As vias aéreas (Aw) se mostraram mais constritas e as áreas de colapso alveolar (setas) mais numerosas no grupo ASMACTRL. A
51
anestesia com o sevoflurano promoveu dilatação de vias aéreas centrais e periféricas e reduziu o acúmulo de células inflamatórias. Coloração pela HE. Aumentos: A, B, C, D, E, F, G e H = 400x; I, J, K, L, M, N, O e P = 200x; Q, R, S, T, U, V, X e Y = 1000x. Barras: A, B, C, D, E, F, G e H = 200 μm; I, J, K, L, M, N, O e P = 100 μm; Q, R, S, T, U, V, X e Y = 500 μm.
Figura 10. RT-PCR em tempo real para análise da expressão gênica do fator de necrose tumoral (TNF)-α, fator transformador do crescimento (TGF)-β e fator de crescimento vascular endotelial (VEGF). ANOVA com teste de Tukey post hoc. As barras representam a média + EPM de 5 animais por grupo. Nos grupos ASMA (), os animais foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina. Os animais dos grupos SALINA () receberam solução salina segundo o mesmo protocolo. Os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico (CTRL), isoflurano (ISO), halotano (HALO) ou sevoflurano (SEVO). As amostras foram mensuradas em triplicadas e normalizadas para o nível do gen residente 36B4. Os resultados foram expressos em número de vezes relativos ao CTRL. Nos animais asmáticos, a anestesia com sevoflurano reduziu significativamente a expressão de TNF-α (-71%), TGF-β (-63%), e de VEGF (-50%), em relação ao grupo CTRL. *p < 0,05 comparado ao grupo salina correspondente. **p < 0,05 comparado ao grupo ASMACTRL.
52
Figura 11. RT-PCR em tempo real para análise da expressão gênica do fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2 (Nrf2), Sirtuína (Sirt)-1, catalase e glutationa peroxidase (GPx). ANOVA com teste de Tukey post hoc. As barras representam a média + EPM de 5 animais por grupo. Nos grupos ASMA (), os animais foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina. Os animais dos grupos SALINA () receberam solução salina segundo o mesmo protocolo. Os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico (CTRL), isoflurano (ISO), halotano (HALO) ou sevoflurano (SEVO). As amostras foram mensuradas em triplicadas e normalizadas para o nível do gen residente 36B4. Os resultados foram expressos em número de vezes relativos ao CTRL. Nos animais asmáticos, a anestesia com sevoflurano aumentou significativamente a expressão do Nrf2 (+579%) e diminuiu a da Sirt-1 (-80%), catalase (-76%) e GPx (-69%) comparativamente ao grupo CTRL. *p < 0,05 comparado ao grupo salina correspondente. **p < 0,05 comparado ao grupo ASMACTRL.
53
6 DISCUSSÃO
O presente estudo apresenta evidências de que a anestesia com o sevoflurano
atua sobre o processo inflamatório e oxidativo modulando a expressão de mediadores
e aumentando a resposta antioxidante. O sevoflurano foi capaz de reduzir a
broncoconstrição, a fração de área de alvéolos colapsados, e a infiltração de células
inflamatórias, acarretando melhora dos parâmetros morfofuncionais na asma alérgica
experimental.
Estudos clínicos nem sempre são facilmente exequíveis em indivíduos
asmáticos, seja por questões éticas ou por dificuldades na abordagem invasiva que
requerem. Por este motivo, modelos experimentais vêm sendo cada vez mais
frequentemente utilizados para mimetizar os padrões específicos da doença
comumente evidenciados em humanos. Esses modelos fornecem preciosas
contribuições para a elucidação da fisiopatologia da asma, pois possibilitam analisar
os fenômenos dinâmicos da doença e correlacionar seus aspectos funcionais,
morfológicos e moleculares. É importante destacar, contudo, que nos modelos de
broncoconstrição aguda induzida, tão somente a hiper-reatividade brônquica e um
aumento apenas transitório da celularidade nos tecidos pulmonares têm sido
observados (WAGERS et al., 2004).
No nosso estudo, ao contrário, desenvolvemos um modelo de asma alérgica
crônica no qual os camundongos foram cronicamente sensibilizados e repetidamente
desafiados com ovalbumina. A instilação da ovalbumina foi realizada através da via
intratraqueal, ao invés da intranasal, como forma de precisar a quantidade do alérgeno
administrada em cada um dos animais estudados. O modelo murino reproduz diversas
características da asma humana, tais como a desnudação do epitélio, a infiltração e
ativação de eosinófilos, macrófagos e linfócitos T nas mucosas e no lúmen das vias
aéreas, bem como a hipertrofia e hiperplasia da musculatura lisa das vias aéreas, das
células caliciformes e das glândulas submucosas (BOUSQUET et al., 2000; XISTO et
al., 2005). Nesse modelo experimental, portanto, a inflamação crônica, a hiper-
reatividade das vias aéreas e o remodelamento estão comprovadamente presentes
(XISTO et al., 2005; BURBURAN et al., 2007a).
Corroborando o anteriormente exposto, no nosso experimento os controles
asmáticos (ASMACTRL) apresentaram expressivo comprometimento da mecânica e
54
da morfometria pulmonares, com aumento significativo na Raw, Est,L,
broncoconstrição, colapso alveolar e maior infiltração de células inflamatórias (Figuras
7-9 e Tabela 3). O processo inflamatório crônico e o remodelamento, levaram ao
estreitamento do diâmetro das vias aéreas e, consequentemente, ao aumento da Raw
(Figura 7 e 9E). Já o aumento da Est,L (Figura 7) foi resultado do aumento das áreas
de atelectasia (Figuras 8 e 9M).
Em estudos experimentais, o pentobarbital sódico tem sido considerado a
droga-controle ideal, uma vez que não promove alteração do tônus basal da
musculatura brônquica (CHIBA et al., 2004) não acarretando variações na mecânica
e na morfometria pulmonares (CORREA et al., 2001; CHIBA et al., 2004). Quanto ao
bloqueador neuromuscular, a nossa escolha recaiu sobre o vecurônio por este não
promover a liberação de histamina e, consequentemente, não provocar
broncoconstrição (JOOSTE et al., 2003; GROEBEN, 2004). Outro aspecto positivo
que torna o vecurônio uma droga bastante atraente para uso no presente modelo
experimental, diz respeito ao fato bem documentado do vecurônio não induzir
alterações hemodinâmicas significativas quando comparado aos outros bloqueadores
neuromusculares (ROBERTSON et al., 1994; CALDWELL et al., 1995; STEVENS et
al., 1997).
No nosso experimento, a mecânica pulmonar foi analisada pelo método da
oclusão ao final da inspiração descrito por Bates e colaboradores (BATES et al., 1985;
BATES et al., 1988). Tal método foi preferencialmente adotado por possibilitar a
decomposição da pressão do sistema respiratório nos seus componentes viscoso,
viscoelástico e elástico, nos permitindo proceder uma análise quantitativa do
envolvimento de cada um desses componentes na mecânica pulmonar.
Os anestésicos inalatórios halogenados são conhecidos por promoverem
broncodilatação, diminuírem reatividade das vias aéreas e por atenuarem o
broncoespasmo induzido pela histamina (BURBURAN et al., 2007b; MILLER, 2010).
Por todas estas razões, os anestésicos voláteis têm sido amplamente utilizados na
anestesia de pacientes com doenças pulmonares obstrutivas e até mesmo no
tratamento do estado de mal asmático. Todavia, seu mecanismo de ação, ainda não
foi esclarecido até o momento.
Nos animais não-asmáticos, a anestesia com isoflurano, halotano e sevoflurano
ocasionou dilatação das vias aéreas distais e dos alvéolos (Figuras 8 e 9), reduzindo
o colapso alveolar. O aumento da fração de área de colapso alveolar nos animais não-
55
asmáticos pode ser decorrente da anestesia que, por si só, ocasiona graus variáveis
de colapso alveolar. A atelectasia induzida pela anestesia está relacionada
primariamente com a perda do tônus muscular e com a redução da capacidade
residual funcional pulmonar, tendo como consequências: 1) atelectasia por absorção
que ocorre nas vias aéreas colapsadas; 2) compressão do parênquima pulmonar; e
3) disfunção ou perda do surfactante pulmonar (HEDENSTIERNA & EDMARK, 2010).
Além do mais, os animais foram mecanicamente ventilados com o tórax aberto,
condição que também pode provocar aumento da atelectasia (D'ANGELO et al., 2007;
D'ANGELO et al., 2008; PELOSI & ROCCO, 2008).
Nos animais asmáticos, a anestesia com isoflurano, halotano e sevoflurano
diminuiu a Raw e a Est,L e induziu dilatação das vias aéreas distais e das unidades
alveolares reduzindo as áreas colapsadas , mas somente o sevoflurano exerceu efeito
broncodilatador significativo (Figuras 7-9).
A diminuição na Raw (Figura 7), provavelmente decorreu do aumento no
diâmetro interno das vias aéreas centrais (Figuras 8 e 9). Segundo Park e
colaboradores (PARK et al., 1998), este achado pode ser justificado tanto por uma
resposta neural reflexa como por um efeito broncodilatador direto. Outrossim, não
podemos descartar que a broncodilatação induzida pelo sevoflurano seja consequente
à produção de NO (TAKALA et al., 2004).
No nosso estudo observamos que a Est,L decaiu durante a anestesia com o
isoflurano, o halotano e o sevoflurano (Figura 7). Essas alterações funcionais
decorreram da dilatação das vias aéreas distais e unidades contráteis do parênquima
pulmonar (Figura 8 e 9). As fotomicrografias confirmaram a presença de broncodilatação
e uma menor fração de colapso alveolar nos animais que receberam anestesia com o
sevoflurano (Figura 9H, P e Y), indicando que este agente pode ser útil para diminuir as
inomogeneidades presentes na asma crônica.
Estes resultados estão em conformidade com o demonstrado previamente pelo
nosso grupo (BURBURAN et al., 2007a), quando, no mesmo modelo murino de asma
utilizado neste estudo, observamos que a anestesia com o sevoflurano cursava com
melhora morfofuncional ao promover dilatação tanto as vias aéreas de maior calibre,
quanto das vias aéreas periféricas, reduzindo a Raw e Est,L.
Outros estudos em animais não-asmáticos, com broncoconstrição aguda
induzida, também demonstraram um declínio na resistência pulmonar total após a
administração do sevoflurano (KATOH & IKEDA, 1994; MITSUHATA et al., 1994;
56
ISHIKAWA et al., 1998). Seguindo o mesmo protocolo, Schutz et al. (SCHUTZ et al.,
2004) observaram que o sevoflurano reverteu a broncoconstrição de modo apenas
transitório, na vigência de lesão aguda do epitélio decorrente da sensibilização, uma
vez que o epitélio lesado pode interferir na manutenção do efeito broncodilatador do
sevoflurano (PARK et al., 1998; SCHUTZ et al., 2004).
Já em estudos clínicos com indivíduos normais, Rooke e colaboradores
(ROOKE et al., 1997) mediram a Rrs após a intubação traqueal, concluindo que a Rrs
foi significativamente menor após a anestesia com o sevoflurano do que com o
isoflurano ou com o halotano. Seguindo o mesmo protocolo, Goff e colaboradores
(GOFF et al., 2000) relataram queda na Rrs aliada à broncodilatação com sevoflurano,
enquanto que o desflurano elevou a Rrs. Já Habre e colaboradores (HABRE et al.,
1999) observando crianças asmáticas anestesiadas com sevoflurano, evidenciaram
aumento da Rrs após a intubação, que cedeu quando a concentração do sevoflurano
foi aumentada. Entretanto, como comentado anteriormente, este estudo apresenta
falhas metodológicas importantes dentre as quais o fato da medição ter sido efetuada
imediatamente após a intubação traqueal, causa comum e frequente de
broncoconstrição mediada pelo sistema nervoso parassimpático e pela ativação das
fibras C aferentes (BARNES, 1996), mesmo em indivíduos normais.
Ao contrário, no nosso estudo, após a intubação traqueal o animal permaneceu
ventilado mecanicamente com o anestésico por 60 minutos, somente após os quais
iniciamos a coleta dos dados da mecânica pulmonar. Além do mais, todos os cuidados
foram tomados no sentido de se evitar quaisquer manipulações da cânula traqueal
durante todo o procedimento.
Níveis elevados de eosinófilos ativados presentes nos pulmões de crianças
asmáticas já foram relacionados com o aumento da Rrs e da hiper-reatividade
brônquica (VON UNGERN-STERNBERG et al., 2006). No nosso estudo, dentre os
anestésicos por nós estudados, o sevoflurano foi o único capaz de reduzir
significativamente a infiltração de PMN nos animais asmáticos e também nos não-
asmáticos (Tabela 3 e Figura 9). Neste contexto, há evidências de que os anestésicos
voláteis podem reduzir a infiltração de leucócitos nos tecidos em protocolos de
LPA/SDRA (SUTER et al., 2007; CHIANG et al., 2008; YUE et al., 2008;
VOIGTSBERGER et al., 2009; CASANOVA et al., 2011) e de que o sevoflurano é
capaz de inibir a ativação e a aderência dos PMN (MOBERT et al., 1999; YUE et al.,
2008), suprimir o recrutamento de células inflamatórias (SUTER et al., 2007;
57
VOIGTSBERGER et al., 2009), diminuir a quimiotaxia e a hiperpermeabilidade
vascular na SDRA (SUTER et al., 2007; VOIGTSBERGER et al., 2009), e inibir a
produção das EROs, incluindo a produção de superóxido (CASANOVA et al., 2011).
Nos nossos espécimes asmáticos, também observamos a expressão
aumentada do TNF-, TGF-VEGF, Sirt-1, catalase, e GPx, enquanto a do Nrf2 foi
reduzida (Figuras 10 e 11).
Os níveis de TNF-α encontram-se significativamente aumentados nas vias
aéreas de pacientes alérgicos com asma (SHAH et al., 1995) e estudos clínicos já
demonstraram uma relação direta entre os níveis de TNF-α e a gravidade do quadro
clínico da doença (HOWARTH et al., 2005; BERRY et al., 2006).
Nos indivíduos asmáticos, o TGF-β apresenta tanto atividade pró-fibrogênica
(MORISHIMA et al., 2001) como ação pró-inflamatória ao estimular a síntese do VEGF
(SHIN et al., 2009). O TGF-β leva à formação de radicais livres e bloqueia a atividade
antioxidante através da inibição do Nrf2 (MICHAELOUDES et al., 2011b). O estresse
oxidativo leva à ativação de genes pró-inflamatórios induzindo alterações
fisiopatológicas no trato respiratório, perpetuando e amplificando a resposta
inflamatória (DOZOR, 2010).
Presentemente, sabemos que a reduzida atividade do Nrf2 que ocorre nos
asmáticos compromete a resposta antioxidante, elevando a susceptibilidade ao
processo inflamatório e a gravidade do quadro clínico da asma (LI & NEL, 2006; KIM,
J et al., 2010).
Rangasamy e colaboradores (RANGASAMY et al., 2005) analisaram
camundongos com deleção gênica do Nrf2 e observaram que sua capacidade
antioxidante era deficiente e se associava ao aumento da expressão de citocinas Th2
no BALF e à hiper-responsividade das vias aéreas, que se apresentaram infiltradas com
eosinófilos e células de muco hiperplásicas.
O Nrf2 desempenha um papel protetor nas lesões pulmonares agudas e crônicas
(RANGASAMY et al., 2005; KIM, J et al., 2010) defendendo as células de agressões
endógenas e exógenas (ISHII et al., 2000; CHO et al., 2004; REDDY et al., 2007; REDDY
et al., 2009). Neste contexto, também se observou que os animais com deficiência do
Nrf2 eram mais susceptíveis à asma alérgica induzida por ovalbumina (RANGASAMY et
al., 2005), às lesões pulmonares agudas induzidas por hiperóxia (REDDY et al., 2009;
CHO et al., 2010), bem como apresentavam maior grau de inflamação e fibrose
pulmonares, indicando também a ação protetora do Nrf2 contra a fibrogênese (CHO et
58
al., 2004; CHO et al., 2010). Recentemente, Park et al. (PARK et al., 2012)
corroboraram tais achados ao verificarem que alguns antioxidantes foram capazes de
reduzir o remodelamento induzido pela inflamação alérgica através de um mecanismo
de ação dependente do Nrf2.
No nosso modelo murino de asma, a anestesia com sevoflurano minimizou a
expressão de TNF-, TGF- e VEGF (Figura 10). Tais achados são corroborados por
estudos prévios que relatam a redução da expressão do TNF- após administração
do sevoflurano (HOFSTETTER et al., 2007; DE CONNO et al., 2009) e do isoflurano
(HOFSTETTER et al., 2005; LI et al., 2009; CASANOVA et al., 2011; SCHILLING et
al., 2011), exercendo ação protetora e anti-inflamatória em modelos de LPA/SDRA,
até mesmo após um breve período de exposição (HOFSTETTER et al., 2005).
Recentemente, Casanova et al. (CASANOVA et al., 2011) comprovaram que o
sevoflurano minimiza o estresse oxidativo e a resposta pró-inflamatória em porcos
submetidos à LPA.
Os efeitos imunomodulatórios do sevoflurano podem ser arrogados aos
seguintes mecanismos: 1) inibição da transmissão sináptica por ativação de
receptores do ácido gama-aminobutírico tipo A (GABAA) nos neurônios (SEBEL et al.,
2006), nas vias aéreas pulmonares, e nas células alveolares (XIANG et al., 2007),
promovendo melhora na oxigenação e atenuando o processo inflamatório pulmonar
(FORTIS et al., 2012); 2) redução da permeabilidade vascular induzida pelo TNF-α
(SUN et al., 2011); e 3) inibição da expressão do TNF-α e de citocinas pró-
inflamatórias através de mecanismos intracelulares (BOOST et al., 2009).
Entretanto, alguns estudos reportaram que os anestésicos voláteis atuaram
modulando a resposta inflamatória na direção oposta. Kotani et al. (KOTANI et al.,
1999) demonstraram expressão de citocinas inflamatórias aumentada em macrófagos
alveolares expostos ao isoflurano, halotano, enflurano e sevoflurano. Ainda, Takala e
colaboradores (TAKALA et al., 2004) verificaram elevada concentração de
leucotrienos no BALF de porcos anestesiados com o sevoflurano. Estes resultados
contraditórios podem ser devidos aos diferentes protocolos experimentais utilizados,
às diferenças entre as espécies de animais empregadas, bem como pela utilização do
BALF, cuja coleta pode, por si só, deflagrar resposta inflamatória.
Nos nossos controles asmáticos, verificamos evidente aumento do estresse
oxidativo e altos níveis de expressão da Sirt-1, da catalase e da GPx em relação aos
controles dos grupos salina. Entretanto, após a anestesia com o sevoflurano, a
59
expressão desses mediadores decaiu significativamente. Além do exposto,
observamos que o sevoflurano intensificou a resposta antioxidante ao aumentar de
modo notável a expressão do Nrf2, reduzindo o estresse oxidativo e, por conseguinte,
ocasionando menor expressão de Sirt-1, catalase e GPx (Figura 11).
Kim e colaboradores (KIM, S R et al., 2010) também verificaram níveis elevados
da Sirt-1 e VEGF nos pulmões de camundongos sensibilizados e desafiados com
ovalbumina. Quando eles associaram um inibidor da Sirt-1, tais níveis sofreram queda
significativa, assim como o infiltrado inflamatório nas vias aéreas, a hiper-reatividade
e as citocinas Th2. Os autores imputaram tais resultados à inibição do VEGF causada
pela Sirt-1. Similarmente, o grupo de Legutko (LEGUTKO et al., 2011) demonstrou
que a inibição da Sirt-1 acarretava diminuição de citocinas Th2 e atenuava o processo
inflamatório nos camundongos com inflamação alérgica induzida por ovalbumina.
Porém, bem recentemente, Ichikawa e colaboradores (ICHIKAWA et al., 2013),
utilizando-se também do modelo murino de asma alérgica induzida por ovalbumina,
verificaram menor expressão da Sirt-1 nos animais asmáticos do que nos animais não
asmáticos. Após a administração de duas substâncias ativadoras da Sirt-1, eles
observaram queda significativa da produção das citocinas Th2, no plasma e no BALF
e a atenuação da hiper-responsividade das vias aéreas, da infiltração eosinofílica e
produção de muco (LEE et al., 2009; ICHIKAWA et al., 2013), sugerindo que a Sirt-1
teria ação anti-inflamatória na asma. Porém, os resultados de Ichikawa não podem
ser comparados aos nossos, uma vez que mensuramos níveis de RNAm e expressão
da Sirt-1 nos pulmões e não níveis proteicos. Além do mais, não podemos descartar
que os ativadores de Sirt-1 utilizados, o resveratrol e o SRT1720, tenham agido
através de outros mecanismos antioxidantes.
A catalase e a GPx participam ativamente no balanço redox da célula e a
atividade dessas enzimas é diretamente proporcional ao grau do estresse oxidativo.
Ghosh et al. (GHOSH et al., 2006) evidenciaram atividade atenuada da catalase
nos pulmões de camundongos com inflamação alérgica aguda e no BALF de
pacientes com asma leve. Recentemente, Ahmad e colaboradores (AHMAD et al.,
2012) relataram que indivíduos asmáticos apresentavam reduzida atividade
eritrocitária da GPx e aumento expressivo da catalase, principalmente nos quadros
mais graves da doença. Já Reynaert et al. (REYNAERT et al., 2007) observaram que
camundongos com capacidade de expressar concentrações elevadas da catalase de
modo sistêmico apresentavam aumento na produção de muco e maior reatividade das
60
vias aéreas.
Estudos mostram também que os níveis plasmáticos da GPx podem variar,
dependendo das condições em que o estresse oxidativo se estabelece, tendo sido
identificados baixos níveis de GPx no sangue total, no plasma e nas plaquetas de
pacientes asmáticos (KHARITONOV et al., 1994; ANTCZAK et al., 1997; KELLY et al.,
1999). Comhair et al. (COMHAIR et al., 2001) relataram aumento tanto da expressão
gênica da GPx extracelular quanto dos seus níveis proteicos, nas células epiteliais
brônquicas dos asmáticos. Em contrapartida, outros autores observaram níveis
proteicos de GPx inalterados no BALF (FITZPATRICK et al., 2009) ou diminuídos no
plasma (MAK et al., 2004) de pacientes asmáticos.
Devemos salientar algumas limitações deste estudo. No nosso experimento
nós utilizamos um modelo murino de asma alérgica crônica e, por esta razão, os
resultados aqui obtidos não podem ser diretamente extrapolados para outras espécies
ou outros protocolos experimentais. Outrossim, o modelo murino de asma mimetiza,
mas não reproduz inteiramente as particularidades da asma que ocorre na espécie
humana.
Ademais, numerosos são os mediadores que participam do processo
inflamatório e oxidativo na asma. Neste estudo procedemos a análise da expressão
gênica de alguns desses mediadores, que foram mensurados no tecido pulmonar e
não no plasma ou no BALF.
Neste experimento os anestésicos foram administrados aos animais durante 60
minutos, que, como vimos, constituiu tempo suficiente para que detectássemos
mudanças nos níveis do RNAm através da RT-PCR, mas não para que pudéssemos
verificar alterações nos níveis proteicos dos mediadores estudados ou avaliar os
potenciais efeitos antifibrogênicos do sevoflurano sobre o remodelamento.
Como vimos, o panorama atual do nosso conhecimento, parece indicar que a
intrincada rede de eventos sobrepostos no processo inflamatório e no estresse
oxidativo ainda se revela hermética. O Nrf2 e vários outros mediadores envolvidos
neste processo e na transmissão não-adrenérgica/não-colinérgica podem ser
elementos-chave para que possamos abranger os complexos mecanismos
fisiopatológicos da asma. Para tal, novas pesquisas sobre o tema são imprescindíveis.
61
7 CONCLUSÕES
Dentre os anestésicos inalatórios estudados no presente modelo experimental,
o sevoflurano mostrou-se mais efetivo, pois promoveu melhora na função e histologia
pulmonares, além de reduzir o processo inflamatório e o estresse oxidativo, elevando
a resposta antioxidante.
O entendimento das alterações morfofuncionais e imunomodulatórias induzidas
pelos anestésicos inalatórios rotineiramente empregados na prática clínica pode ser
útil para o manejo dos pacientes e para o advento de novas possibilidades
terapêuticas na asma. Apesar dos nossos resultados não poderem ser diretamente
extrapolados para seres humanos, eles sugerem que, dentre os três anestésicos
voláteis aqui estudados, o sevoflurano seja mais vantajoso que o isoflurano e o
halotano para uso na anestesia de pacientes asmáticos e no tratamento da asma
refratária.
62
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