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06/12/2011
1
Usos benéficos de los
microorganismos en
alimentos
Microorganismos usados en fermentación
Cultivos iniciadores y bacteriófagos
Microbiología y producción de alimentos fermentados
Bacterias benéficas intestinales
Biopreservativos alimenticios de origen microbiano
Ingredientes y enzimas alimenticios de origen
microbiano
Microorganismos
usados en fermentación
Lactobacillus bulgaricus
Productos de la microbiología
IndustrialBioconversión
Producto
(bioconversión
de esteroides)
Sustrato
Productos de las Células
Enzimas
(Glucosa
Isomerasa)
Antibióticos
(Penicilina)
Aditivos
Alimenticios
(aminoácidos)
Alcohol
Productos
Químicos
(ácido cítrico)
Células
Levadura
Bioquímica y Microbiología Industrial 2º de Bioquímica Universidad de Zaragoza
Marcela Martínez M.Sc.
1. Rápido crecimiento debido a la favorable
relación área/volumen
2. Diversidad metabólica
3. Estabilidad genética
4. Crecimiento en gran escala y separación fácil
de productos y sustratos
Ventajas de los microorganismos
como unidades de producción (1)
Marcela Martínez M.Sc.
Ventajas de los microorganismos
como unidades de producción (2)
5. Adaptabilidad a distintos ambientes y condiciones
de crecimiento
6. Incremento de la productividad
7. Facilidad de manipulación genética
8. Modificación de los productos finales
9. Tecnologías limpias
Marcela Martínez M.Sc.
Origen de las cepas
industriales
1. Colecciones de cultivos
2. Cepas nativas
3. Organismos genéticamente
modificados (OGM)
Marcela Martínez M.Sc.
06/12/2011
2
Requerimientos de los
microorganismos industriales (1)
1. Producir la sustancia de interés
2. Estar disponible en cultivo puro
3. Ser genéticamente estable
4. Crecer en cultivo a gran escala
5. Mantenimiento en cultivos durante un período de
tiempo largo
6. Crecer y producir el compuesto deseado rápidamente Marcela Martínez M.Sc.
7. Crecer en un medio de cultivo líquido y relativamente
barato
8. No ser patógeno
9. Eliminación de las células microbianas del medio de
cultivo con relativa facilidad
10. Ser susceptible de manipulación genética
11. Que sea capaz de sufrir recombinación genética
Requerimientos de los
microorganismos industriales (1)
Marcela Martínez M.Sc.
Colecciones de cultivos que suministran
cultivos de microorganismos industriales
American Type Culture Collection (ATCC)
Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)
Fungal Genetics Stock Center (FGSC)
Microbial Strain Data Network (MSDN)
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSM)
Home Pages of Culture Collections in the World Marcela Martínez M.Sc.
Mejora de cepas
1. Selección de variantes naturales
2. Selección de mutantes inducidas
3. Obtención de recombinantes
Ingeniería genética
Modificación deliberada de la información genética de un
organismo cambiando directamente su genoma de ácido
nucleíco. Esto se puede lograr por métodos denominados
Tecnología del ADN Recombinante
Marcela Martínez M.Sc.
Mutación y selección
Hibridización y recombinación
Transformación, conjugación y
transducción (bacterias)
Clonado y expresión de genes
Mejoramiento de cepas de uso
industrial: métodos genéticos
Marcela Martínez M.Sc.
¿Para qué se hace
mejoramiento genético?
Aumentar los rendimientos: debe realizarse en forma
PERMANENTE.
Disminuir o eliminar co-metabolitos indeseables (ej.
pigmentos, otros productos, facilitar la purificación)
Estimular la utilización de fuentes de carbono o
nitrógeno mas baratas (ej. plásticos)
Alterar morfología o funciones para obtener
propiedades deseadas (ej. espuma, pellets, etc) Marcela Martínez M.Sc.
06/12/2011
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Modificación de cepas microbianas
por ingeniería genética
1. Identificación y aislamiento del DNA responsable de
un determinado fenotipo
2. Purificación del gen
3. Fusión del gen con otros fragmentos de DNA
formando moléculas recombinantes
4. Inserción del DNA recombinante dentro de otro
organismo
5. Clonación del genMarcela Martínez M.Sc.
Cultivos iniciadores y
bacteriófagos
Cultivos iniciadores “starters”
Microorganismos que se
emplean en la
producción de
productos fermentados
sabor, aroma, y producción
de etanol
actividad proteolítica y
lipolítica
inhibición de
microorganismos
indeseables
Marcela Martínez M.Sc.
Los cultivos iniciadores pueden ser
categorizados en mesófilos o termófilos:
• Lactococcus lactis subsp. cremoris
• L. delbrueckii subsp. lactis
• L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis
• Leuconostoc mesenteroides subsp. cremorisMesófilos
• Streptococcus salivarius subsp. thermophilus
• Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
• L. delbrueckii subsp. lactis
• L. casei
• L. helveticus
• L. plantarum
Termófilos
Marcela Martínez M.Sc.
Requisitos de los cultivos
iniciadores
Marcela Martínez M.Sc.
Las etapas de propagación que deben realizarse
para llegar a la producción comercial de cultivos
iniciadores son:
1. Cultivo madre: corresponde la primer inoóculo del cual se originaran todas las preparaciones.
2. Cultivo intermedio: preparación en mayor volumen originada de la primera.
3. Cultivo de producción masiva: esta etapa corresponde a la preparación del producto.
Marcela Martínez M.Sc.
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Alimentos Cultivos iniciadores
Carnes
Pediococcus acidilactici
Lactobacillus plantarum
Micrococcus varians
Staphylococcus carnosus
Staphylococcus xylosus.
Lácteos
Lactococcus lactis
Lactococcus cremoris
Streptococcus thermophillus
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus casei
Propionibacterium shermani
Vinos Leuconostoc oenos
Panificación Lactobacillus sanfransciscus
Lactobacillus plantarum
Alimentos
funcionales
Lactobacillus acidophilus
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium infantis
Streptococcus thermophilus
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus casei subsp. Rhamnosus
Streptococcus faecium
Marcela Martínez M.Sc.
Bacteriófagos
Son virus parásitos
bacterianos
No pueden crecer ni replicarse
sino están dentro de una
célula bacteriana
Atacan y destruyen a la
mayoría de las bacterias
lácticas
Impiden el proceso normal de
maduración o bien tornándolo
lento e ineficiente
Marcela Martínez M.Sc.
Reproducción de los fagos
1. El fago ataca la superficie de su huésped
2. El ADN es inyectado en el interior de la célula
3. La “maquinaria” celular produce ADN y proteínas fágicas
4. Los nuevos fagos se ensamblan en el interior de la célula
5. Los fagos maduros lisan la célula y salen al exteriorMarcela Martínez M.Sc.
Influencia de los fagos sobre
cultivos iniciadores
Los bacteriófagos pueden ser inactivados por
medio de los tratamientos térmicos (63-88 C
por 30 min.), o por el uso de desinfectantes.
Marcela Martínez M.Sc.
Resistencia a los fagos
Evitando que el virus se
adose a la célula
Evitando que inyecte su
ADN
Digiriendo el ADN una vez
inyectado
Abortando la infección para
que no haya multiplicación
y diseminación viral
Marcela Martínez M.Sc.
Bacteriófagos benéficos
Marcela Martínez M.Sc.
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Reducción de bacterias
por fagos a diferentes
concentraciones
Marcela Martínez M.Sc.
Microorganismos
objetivo
Listeria monocytogenes
Salmonella
Campylobacter
E. coli
Marcela Martínez M.Sc.
Listeria: tratamiento con fagos
Listeria coloniza las
instalaciones de las plantas y
por tanto es capaz de
contaminar el alimento mucho
después del proceso de
producción
Aplicar el tratamiento con
fagos en la etapa en donde
surge la contaminación:
antes del empacado
durante la etapa de maduración
Marcela Martínez M.Sc.
Microbiología y producción
de alimentos fermentados
Industria de alimentos
fermentados: pasado y presente
Tradicional
• Pequeña escala (artesanal)
• Medios no estériles
• Abierta
• Exposición significativa a contaminares
• Calidad variable
• Seguridad un asunto secundario
Moderna
• Gran escala (industrial)
• Medios pasteurizados o tratados con calor
• En contenedores
• Mínima exposición a contaminantes
• Calidad constante
• Seguridad un asunto prioritario
Marcela Martínez M.Sc.
Fermentación de alimentos
Procesos en los cuales alimentos crudos son transformados
a alimentos fermentados por el crecimiento y las actividades
metabólicas de microorganismos deseablesMarcela Martínez M.Sc.
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Alimentos crudos
que se pueden
fermentar
Leche
Carne
Pescado
Vegetales
Frutas
Granos de cereal
Semillas
JudíasMarcela Martínez M.Sc.
Alimentos fermentados
Son aquellos donde los microorganismos provocan
cambios controlados.
Existen mas de 3500 alimentos fermentados
tradicionales.
Europa y América del norte: pan, yogures y queso
África: féculas fermentadas (mandioca)
Asia: derivados de semillas de soja o de pescados fermentados.Marcela Martínez M.Sc.
La fermentación puede ser:
Natural Controlada
población microbiana deseable
presente naturalmente cultivos iniciadores
Marcela Martínez M.Sc.
Propiedades de los alimentos
fermentados
1. Preservación
2. Valor nutritivo
3. Funcionalidad
4. Digestibilidad
5. Características
organolépticas
6. Valor agregado
7. Alimentos únicos
Marcela Martínez M.Sc.
Bacteria usadas en la producción
de alimentos fermentados
Protecobacteria
Bacterias Gram (-) vinagre
Firmicutes
Bacterias acido lácticas
Bacillus
Brevibacterium
Actinobacteria
Bifidobacterium
Kocuria
Staphylococcus
MicrococcusMarcela Martínez M.Sc.
Bacterias ácido lácticas (BAL)
Gram positivas
Fermentativas
Catalasa negativa
Anaerobias facultativas
No formadoras de
esporas
No móviles
Acido tolerantes
Marcela Martínez M.Sc.
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Fermentación láctica
homofermentativa
Marcela Martínez M.Sc.
Grupo homofermentativo
Marcela Martínez M.Sc.
Fermentación láctica
heterofermentativa
Marcela Martínez M.Sc.
Grupo heterofermentativo
Marcela Martínez M.Sc.
Los géneros de BAL
1. Lactococcus
2. Leuconostoc
3. Pediococcus
4. Streptococcus
5. Lactobacillus
6. Enterococcus
7. Aerococcus
8. Vagococcus
9. Tetragenococcus
10. Carnobacterium
11. Weisella
12. Oenococcus
Marcela Martínez M.Sc.
Propiedades de los géneros de
BAL
Marcela Martínez M.Sc.
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Lactococcus
Lactococcus lactis
Lactococcus se emplea en la industria
láctea en la manufactura de fermentados
como quesos o yogures.
Puede usarse en cultivos iniciadores de
cepas únicas o en cultivos de distintas
cepas o con otras bacterias ácido lácticas
como Lactobacillus y Streptococcus.Marcela Martínez M.Sc.
Productos lácteos fermentados
con Lactococcus lactis
Product Principal acid producers Secondary microflora
Cheese
Colby, Cheddar,
cottage, cream
Lactococcus lactis ssp. cremoris None
Lactococcus lactis ssp. lactis
BlueLactococcus lactis ssp. cremoris
Citrate+ Lactococcus lactis ssp.
lactis
Penicillium roqueforti
Lactococcus lactis ssp. lactis
Fermented milk
ButtermilkLactococcus lactis ssp. cremoris
Leuconostoc spp. Citrate+
Lactococcus lactis ssp. lactis
Lactococcus lactis ssp. lactis
Sour cream
Lactococcus lactis ssp. cremoris None
Lactococcus lactis ssp. lactis Marcela Martínez M.Sc.
Streptococcus
No móviles
Anaerobios facultativos
Homofermentativos
St. thermophilus
St. Lactis (Leuconostoc)
St. cremoris (Leuconostoc)
Streptococcus thermophilusMarcela Martínez M.Sc.
Leuconostoc
Marcela Martínez M.Sc.
Pediococcus
Pediococcus pentosaceusMarcela Martínez M.Sc.
Lactobacillus
Lactobacillus bulgaricus Marcela Martínez M.Sc.
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Productos cárnicos y BAL empleadas
durante su elaboración
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Otras bacterias importantes
en fermentación de alimentos
Bacterias Gram (-)
Bacilos productores de ácido
acético por oxidación del etanol.
Aerobias obligadas
Mesófilas 25-30°C
Acetobacter
Gluconacetobacter
Gluconobacter
Marcela Martínez M.Sc.
Bifidobacterium
Bacterias Gram
positivas
Anaeróbicos
No móviles
Con frecuencia
ramificadas
Saprófitas de la flora
intestinalMarcela Martínez M.Sc.
Utilidades de las bifidobaterias
Ayudan en la digestión
Menor incidencia de
alergias
Previenen algunas formas
de crecimiento de
tumores
Algunas bifidobacterias se
usan como probióticos
Marcela Martínez M.Sc. Propionibacterium
Propionibacterium
Bacilos Gram +
Anaerobios o
aerotolerantes
Catalasa + (o variable)
No motiles
Mesófilos y neutrófilos
Producción de Quesos tipo
Suizo
Marcela Martínez M.Sc.
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Brevibacterium
Brevibacterium
Bacilos Gram +
No móviles
No esporulados
Aerobios estrictos
Catalasa +
Mesofilos 20-35°C
B. linens importante en
alimentos fermentados:
quesos maduradosMarcela Martínez M.Sc.
Levaduras
Fermentación de
alimentos y alcohol
Producción de enzimas
para uso en alimentos
Proteína Unicelular
Aditivos para impartir
sabores deseables a
alimentos
Saccharomyces cerevisiae
Marcela Martínez M.Sc.
Mohos
Producción de
alimentos
Producción de aditivos
y enzimas
Aspergillus
Penicillium
Rhizopus
Mucor
Marcela Martínez M.Sc.
Bacterias benéficas
intestinales
Prebióticos
Los prebióticos son
un ingrediente
alimentario no
digerible que
benefician al huésped
estimulando
selectivamente el
crecimiento y /o
actividad de bacterias
en el colon.
Marcela Martínez M.Sc.
Vía metabólica
1. Ingesta de un prebiótico.
2. Los prebióticos no se
digiere en el estómago ni
en el intestino delgado.
3. Es fermentado por la flora
intestinal benéfica.
4. Nutren a las bacterias
benéficas.
5. Se producen AGCC.
Marcela Martínez M.Sc.
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Marcela Martínez M.Sc.
Efecto de las bacterias
benéficas en el colon
Marcela Martínez M.Sc.
Categorías de Prebióticos
Fructooligosacaridos (FOS)
Inulina
Cadena larga de fructosa (n: 2-60) con una glucosa terminal
Oligofructosa
Inulina hidrolizada (n=2-8)
FOS de cadena corta
Cadena corta de fructosa (n=2-4)con una glucosa terminal
Galacto-oligosacaridos
Marcela Martínez M.Sc.
Estructura de los Prebióticos
Marcela Martínez M.Sc.
Probióticos
“Microorganismos vivos que, al ser ingeridos en
cantidades adecuadas, le confieren beneficios de
salud al anfitrión”
FAO/WHO 2002
Marcela Martínez M.Sc.
Probióticos
Son un suplemento
alimenticio: cultivo puro o
compuesto de
microorganismos vivos.
Están formados por distintas
cepas de bacterias y
levaduras fundamentalmente.
Tienen la capacidad de
instalarse y proliferar en el TGI
y actuar como de promotores
de crecimiento.
Marcela Martínez M.Sc.
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Marcela Martínez M.Sc.
Diferenciación de cepas
- Lactobacillus
- Bifidobacterium
- Streptococcus
- Bacteroides
- Enterococcus
- Bacillus
- Eubacterium
- Sacharomyces*
Marcela Martínez M.Sc.
Composición & Efectos de las Bacterias
Predominantes en el Intestino
Marcela Martínez M.Sc.
Factores que afectan el equilibrio
de la Microflora Intestinal Humana
Enfermedades
Estrés
Cambios en la dieta
Edad
Consumo de antibióticos
Consumo de probióticos
Marcela Martínez M.Sc.
Sistemas de defensa del
intestino
Marcela Martínez M.Sc.
La Flora Gastrointestinal
Efecto de barrera - protección contra
infecciones
Competencia por
substratos
Competencia por sitios
receptores
Creación de un
ambiente hostil
Producción de
sustancias
antimicrobianas
Marcela Martínez M.Sc.
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Efectos de la flora
gastrointestinal
Marcela Martínez M.Sc.
Criterios de selección
Médicamente seguros.
Sobrevivir en el medio en el que se encuentran.
Sobrevivir al pH del ácido gástrico.
Resistir a las sales biliares.
Efectos positivos sobre la salud (demostrado
clínicamente).
Caracterización segura.
Marcela Martínez M.Sc.
Tipos de probióticos
Marcela Martínez M.Sc.
Biopreservativos
alimenticios de origen
microbiano
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
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Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Cultivos protectores para
alimentos
Deben ser seguros (de grado alimentario)
Adaptarse a un sistema alimentario.
No modificar las características
sensoriales del alimento.
Marcela Martínez M.Sc.
Mecanismo antagonista de las
bacterias ácido lácticas
Marcela Martínez M.Sc.
Aspectos relevantes de las bacteriocinas
de las BAL
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
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Criterios que debe cumplir una
bacteriocina para su aplicación en un
alimento
Marcela Martínez M.Sc.
Aplicación en alimentos de bacteriocinas o
de las cepas productoras
Marcela Martínez M.Sc.
Marcela Martínez M.Sc.
b) PEDIOCINA
Marcela Martínez M.Sc.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
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Actividad antimicrobiana de diversas
cepas de BAL frente a bacterias patógenas
y no patógenas
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Ingredientes y enzimas
alimenticios de origen
microbianoCasi todas las
reacciones en células
vivas son catalizadas
y controladas por
enzimas.
Catalizadores
biológicos,
convirtiendo
sustancias en otros
productos sin sufrir
cambio alguno.
Enzimas
Marcela Martínez M.Sc.
Producción de grandes cantidades a
bajo coste
Microorganismos como fuentes de
enzimas
Uso de mutantes y procesos de
selección que aumentan la
producción
Producción de enzimas hechas a
medida a través de ingeniería
genética y diseño de proteínasMarcela Martínez M.Sc.
Microorganismos como fuentes de
enzimas
Enzimas hidrolíticas simples como:
proteasas, amilasas, pectinasas
Degradan polímeros naturales como
proteínas, almidones o pectina
Enzimas extracelulares
Fácil extracción
Bajo coste
Poco específicas
Marcela Martínez M.Sc.
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Amilasas
Almidón
Compuesto de almacenamiento de
energía en plantas (maíz, arroz, patata,
trigo).
Fuente de nutrición muy importante en
animales y humanos (70-80%).
Amilasas
Degradación del polisacárido almidón.
Últimos 20 años las amilasas han reemplazado la hidrólisis ácida.
a-amilasa de Bacillus y glucoamilasa de Aspergillus.
Sacarificación genera mucha dextrosa, degradación de almidón
más corta, sin tratamiento ácido.Marcela Martínez M.Sc.
Amilasas
Producción de Cerveza
Reemplazo de malta por granos sin
germinar de maíz o arroz, prácticamente
no contienen enzimas.
Se añaden enzimas, amilasas,
glucanasas y proteasas, de hongos y
bacterias.
Almidón a azúcares que sufren
fermentación alcohólica por levaduras.
Marcela Martínez M.Sc.
Amilasas
Hornear pan
El uso de enzimas en panadería se
ha vuelto popular.
Las amilasas aceleran la
degradación del almidón, y así
aumenta el contenido de azúcar en
la masa, acelerando el proceso de
fermentación.
El volumen del pan preparado con
enzimas aumenta.
Marcela Martínez M.Sc.
Enzima Fuente Aplicación industrial Industria
Proteasa Hongos Pan Panadera
Bacterias Eliminación de manchas Limpieza en seco
Bacterias Ablandador de la carne Cárnica
Bacterias Limpieza de las heridas Medicina
Bacterias Eliminación de revestimientos Textil
Bacterias Detergente doméstico Lavandería
Aplicaciones de las Enzimas
Microbianas
Marcela Martínez M.Sc.
Proteasas
Ablandan la carne
La papaya contiene altas
concentraciones de las proteasas
papaina y quimiopapaina.
Degradan el tejido conectivo de la
carne, como el colágeno y la elastina,
haciéndola más tierna.
Marcela Martínez M.Sc.
Proteasas
Ablandan la carne
Se usan toneladas de papaina en polvo cada año para
ablandar la carne en muchos países.
Ficina del árbol de higos y bromelaina de la planta de
piña.
Se frota la carne y se deja a temperatura ambiente
varias horas.
Marcela Martínez M.Sc.
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Proteasas
Hornear pan
El gluten se degrada por proteasas
obtenidas de hongos para hacer la
masa más fácil de manejar y aumenta
su capacidad para retener burbujas
de aire.
El gluten se une parcialmente al agua
y tiene consistencia de gel.
Las proteasas degradan las proteínas
pegajosas (gluten) en la masa.
Marcela Martínez M.Sc.
Enzimas microbianas y sus aplicaciones
Enzima Fuente Aplicación industrial Industria
Invertasa Levadura Relleno de caramelos Confitería
Glucosa Oxidasa Hongos Eliminación de glucosa y oxígeno,
papeles para pruebas de la
diabetes
Alimentaria
Farmacéutica
Glucosa Isomerasa Bacterias Jarabe de cereales rico en glucosa Bebidas refrescantes
Pectinasa Hongos Prensado, clarificación del vino Zumos de frutas
Renina Hongos Coagulación de la leche Quesera
Celulasa Bacterias Suavizante y abrillantador de
tejidos; detergente
Lavandería
Lipasa Hongos Degradar la grasa Lechería, lavandería
Lactasa Hongos Degradar la lactosa a glucosa y
galactosa
Lechería, alimentos
DNA polimerasa Bacterias;
Archea
Replicación del DNA por PCR Investigación biológica
y forense.
Marcela Martínez M.Sc.
Pectinasas
Producción de zumo de frutasAl prensar fruta y vegetales para la
obtención de jugo, las pectinas de alto
peso molecular reducen la producción.
Se pica la fruta y se añaden pectinasas
para degradar las pectinas de larga
cadena.
Pectinasas procedentes de cultivos
sumergidos de Aspergillus y Rhizopus.
Se reduce la viscosidad del zumo,
facilitando la filtración y se obtiene más
cantidad.
Alimentación de bebés, las pectinasas
maceran las fruta y los vegetales para
hacerlos más suaves y fáciles de comer.Marcela Martínez M.Sc.
Detergentes biológicosLa aplicación más importante de las enzimas hidrolíticas
+ Las manchas que contienen proteínas son
difíciles de remover. Proteínas no se disuelven
fácilmente en agua.
+ A altas temperaturas, la proteína se cuaja en
las fibras textiles y es más difícil de eliminar.
+ Polvo, hollín y materia orgánica como
grasas, proteínas, carbohidratos y pigmentos.
Las grasas y las proteínas actúan como
pegamento.
+ Los detergentes sueltan la grasa de la tela,
las proteínas permanecen en el material.
Marcela Martínez M.Sc.
Detergentes biológicosLa aplicación más importante de las enzimas hidrolíticas
Descubrimiento de la subtilisina de Bacillus
lincheniformis.
Producción a gran escala de detergentes biológicos
1960.
Enzimas pancreáticas poco estables y muy caras.
Activa bajo condiciones alcalinas.
Marcela Martínez M.Sc.
Detergentes biológicosLa aplicación más importante de las enzimas hidrolíticas
Poca especificidad. Omnívoros.
Proteasas 1:50, actividad óptima
durante el proceso de lavado.
Detergentes biológicos usados
ampliamente, desde mediados 1960.
Degradan proteínas pegadas en
aminoácidos y péptidos de cadena
corta.
Las proteínas son desprendidas de
las fibras textiles y eliminadas.Marcela Martínez M.Sc.
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“Solo una cosa vuelve un sueño imposible: el miedo a
fracasar”
Paulo CoelhoMarcela Martínez M.Sc.