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raffaele-nardella
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I topi transgeniciI topi transgenici
Erika AspergesErika Asperges4°D a.s. 08/094°D a.s. 08/09
Liceo Scientifico S. AllendeLiceo Scientifico S. Allende MilanoMilano
IndiceIndice
Introduzione all’ingegneria geneticaIntroduzione all’ingegneria genetica Introduzione ai topi transgeniciIntroduzione ai topi transgenici
Ottenere cellule knockoutOttenere cellule knockoutSelezionare cellule knockoutSelezionare cellule knockout
Ottenere una generazione knockoutOttenere una generazione knockoutKnockout condizionatoKnockout condizionato
La bioingegneria geneticaLa bioingegneria genetica
Insieme di tecniche che Insieme di tecniche che isolano, clonano, introducono isolano, clonano, introducono e esprimono genie esprimono geni in un ospite eterelogo. in un ospite eterelogo.
Altera le sequenze originali Altera le sequenze originali in favore di altre più in favore di altre più adatteadatte..
Esprimere nuove proteine.Esprimere nuove proteine. Creare gli OGM, guarire malattie genetiche.Creare gli OGM, guarire malattie genetiche.
I topi transgeniciI topi transgenici
Topo in cui viene soppressa l’espressione Topo in cui viene soppressa l’espressione di un determinato gene di un determinato gene (gene knockout)(gene knockout)..
Usati per lo studio di disordini genetici.Usati per lo studio di disordini genetici.Creati negli anni ’80, nel 2007 hanno Creati negli anni ’80, nel 2007 hanno
guadagnato il Nobel ai loro inventori.guadagnato il Nobel ai loro inventori.
Ottenere cellule knockoutOttenere cellule knockout
Studio approfondito del gene da Studio approfondito del gene da disattivare.disattivare.
Disattivazione del gene.Disattivazione del gene.Scelta del vettore (spesso plasmidi)Scelta del vettore (spesso plasmidi) Inserimento del gene per elettroporazione.Inserimento del gene per elettroporazione.Ricombinazione omologa in cellule Ricombinazione omologa in cellule
staminali.staminali.
Selezionare cellule knockoutSelezionare cellule knockout
Raramente la ricombinazione avviene
correttamente!!!
Per selezionare le cellule correttamente transfettate si usano vettori che contengono
marker di selezione.
Primo marker:Primo marker:
È un plasmide resistenzaÈ un plasmide resistenza
che contiene il gene knockoutche contiene il gene knockoutSi aggiunge l’antibioticoSi aggiunge l’antibiotico
È avvenuta la ricombinazione omologa:
la cellula sopravvive
Non è avvenuta la ricombinazione:
la cellula muore
Secondo marker:Secondo marker:È una sequenza per la TK che rende È una sequenza per la TK che rende
tossico il Ganciclovir.tossico il Ganciclovir.
Ricombinazione omologa: la TK non
viene prodotta
Ricombinazione non omologa: la TK viene
prodotta
Si aggiunge il GanciclovirSi aggiunge il Ganciclovir
Le cellule sopravvivono
Le cellule muoiono
Ottenere una generazione Ottenere una generazione knockoutknockout
Le cellule selezionate sono inserite nella Le cellule selezionate sono inserite nella blastocisti di una femmina di topo gravidablastocisti di una femmina di topo gravida Per controllare se le cellule knockout Per controllare se le cellule knockout attecchiscono si usa il colore del pelo: la attecchiscono si usa il colore del pelo: la
blastocistiblastocisti è per il è per il neronero, le , le cellule cellule staminali staminali knockoutknockout per il per il biancobianco..
Le chimere devono essere bianche e nere, i topi Le chimere devono essere bianche e nere, i topi knockout solo bianchi.knockout solo bianchi.
Legenda dei simboliLegenda dei simboli
♀♀……………………………………………………………………...Femmina...Femmina♂♂…………………………………………………………………….....Maschio.....MaschioNN.………..Allele dominante per il pelo nero.………..Allele dominante per il pelo neronn.……….Allele recessivo per il pelo bianco.……….Allele recessivo per il pelo biancoññ………………………………Allele recessivo transgenico Allele recessivo transgenico
per il pelo biancoper il pelo bianco ..……………………...…………………….NNon passa on passa ilil turno turno!! …………………………… ……………………………Passa il turnoPassa il turno!!
Fase 1Fase 1
Si impiantano cellule staminali knockout Si impiantano cellule staminali knockout per pelo bianco in blastocisti per pelo per pelo bianco in blastocisti per pelo nero.nero.
Cellule staminali con allele ñ
Blastocisti con alleli NN
NN ♂ o ♀
Nñ ♀ (chimera)
Nñ ♂ (chimera)
♀
♂
♂
♀
Le chimere maschio sono incrociate con Le chimere maschio sono incrociate con femmine bianche.femmine bianche.
Fase 2Fase 2
N
ñ
n n
Nn Nn
nñ nñ
Fase 3Fase 3
Gli eterozigoti knockout sono incrociati fra Gli eterozigoti knockout sono incrociati fra loro.loro.
♀
♂n
n ñ
ñ
nñ
nñ
nn
ññ
Omozigote non knockout o knockout
eteroziogote
Omozigote knockout
Per capire se un topo è eterozigote o Per capire se un topo è eterozigote o omozigote e/o maschio o femmina prima omozigote e/o maschio o femmina prima che nasca, si usa la che nasca, si usa la PCRPCR..
Se la Se la mutazionemutazione è è incompatibileincompatibile con la con la vita, vita, i knockouti knockout omozigoti ottenuti omozigoti ottenuti (l’ oggetto di studio) (l’ oggetto di studio) muoionomuoiono durante la durante la vita uterina o poco dopo la nascita.vita uterina o poco dopo la nascita.
Il knockout condizionatoIl knockout condizionato
Per evitare la morte precoce del topo, si Per evitare la morte precoce del topo, si usa il knockout condizionato, cioè si usa il knockout condizionato, cioè si sopprime il gene solo in un tessuto.sopprime il gene solo in un tessuto.
L’inattivazione avviene solo dopo il L’inattivazione avviene solo dopo il processo differenziativo, perché la processo differenziativo, perché la ricombinazione omologa avviene tardi solo ricombinazione omologa avviene tardi solo in alcuni tessuti.in alcuni tessuti.
FineFine